Introduction et Historique : toxicité sélective
publicité
Cours de Microbiologie Générale LV342 Cours 5 Chimiothérapie anti-bactérienne Catherine Esnault, Maître de Conférences Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) UFR 927 Sciences de la Vie Licence de Sciences et Technologie Mention Sciences de la Vie L3 1 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Introduction et Historique : toxicité sélective • Paul Ehrlich (1854-1915) - colorants (Rouge Trypan) colore fortement les protozoaires infectant des cellules eucaryotes alors que les cellules ont peu d’affinité pour le colorant. - découverte d’un composé à pouvoir trypanocide : la suramine, actif sur le trypanosome, agent de la maladie du sommeil. 2 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Jacques et Thérèse Tréfouël 1937 : concept de prodrogue O H2N S N N NH 2 O Prontosil H2N O R HN S NH 2 O Sulfamides formule générale 3 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Recherche de produits d’origine naturelle à partir de micro-organismes • • • • • 1896 Ernest Duchene. Antagonisme entre les moisissures et les microbes. 1928 Résultat étrange d’Alexander FLEMING. Le premier antibiogramme.Pénicillum notatum contre Staphylocoques 1939 Howard FLOREY et Ernst CHAIN : purification de la pénicilline 1944 Selman WAKSMAN et beaucoup d’autres : test de 10 000 souches de bactéries du sol, les Streptomyces. Découverte de la streptomycine En parallèle, modification chimique de molécules d’origine naturelle 4 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Introduction des antibiotiques en clinique au cours du 20eme siècle C. Walsh, Antibiotics, 2003 Molécules d’origine naturelle : b-lactams, tetracyclines, aminoglycosides Molécules d’origine synthétique : sulfamides, quinolones Molécules conçues selon le concept de drug design: actuellement 5 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Les classes d’antibiotiques C. Walsh, Antibiotics, 2003 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 6 Effets bactéricide, bactériostatique C. Walsh, Antibiotics, 2003 7 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Mesure de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) CMI 0 Concentrations croissantes de l’agent inhibiteur Nombre de bactéries [inhibiteur] CMI LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 8 La Concentration Minimale Bactéricide (CMB) C’est la plus petite concentration d'antibiotique laissant 0,01% ou moins de survivants de l'inoculum initial après 18 heures de culture à 37 C. Le temps requis pour la lecture peut varier comme pour les CMI en fonction des souches. 9 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Antibiogramme standard : méthode des disques sur gélose • Un milieu solide est ensemencé avec la bactérie à tester • des disques en papier imprégnés chacun d'un antibiotique déposés stérilement. • La bactérie ne se développe que là où la concentration de l'antibiotique est inférieure à la CMI 10 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Index thérapeutique (IT) dose minimum induisant des effets secondaires IT = dose induisant un effet thérapeutique • On recherche les médicaments dont l’index thérapeutique est le plus élevé possible. 11 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Les cibles des antibiotiques C. Walsh, Antibiotics, 2003 12 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Le peptidoglycane : des chaines de N-acétyl glucosamine N-acétyl muramique reliées par des liaisons peptidiques 13 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Antibiotiques qui inhibent la synthèse de la paroi bactérienne Pénicillines et vancomycine inhibent la transpeptidase (6) qui permet de lier les oligopeptides des chaînes voisines de peptidoglycane. Réaction essentielle à la réticulation du peptidoglycane et à la rigidité de la paroi. C. Walsh, Antibiotics, 2003 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 14 Mécanisme d’action des antibiotiques de type b-lactame 15 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Biosynthèse du peptidoglycane N-acétylglucosamine acide N-acétylmuramique substitué H OH O HO N-acétylglucosamine acide N-acétylmuramique substitué H OH O HO H H O O NH H COCH 3 NH HC COOH CH2 CH2 CO meso-A2pm NH(L)H2 H2 H2 COOH CHC C CCH NH 2 CO NH H3C CH CO NH H3C CH COOH D-Ala O HO NH O H H HC CO H CH3 COCH3 NH CHCH3 CO O NH H COCH 3 L-Ala D-Glu L-Ala D-Ala H HO NH O H H CO HC H CH3 COCH3 NH CHCH3 CO D-Glu H H OH HO H OH HO NH HC COOH CH2 CH2 CO meso-A2pm NH(L)H2 H2 H2 COOH CHC C CCH NH 2 CO NH H3C CH CO NH H+ H3C CH COOH D-Ala D-Ala Transpeptidase LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 C. Walsh, Antibiotics, 2003 16 Inhibition de la trans peptidase par le b - lactame C. Walsh, Antibiotics, 2003 17 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Différences entre vancomycine et b-lactame • Vancomycine : molécule de grosse taille, inhibe la réaction de transpeptidation en se fixant par liaisons faibles sur l’aa terminal de l’oligopeptide. Ne peut pas accéder au peptidoglycane des bactéries GramC. Walsh, Antibiotics, 2003 b-lactame : inhibe l’enzyme. Molécule de petite taille, peut accéder au peptidoglycane des Gram+ et Gram- 18 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Antibiotiques impliqués dans la transcription et la réplication de l’ADN bactérien •Inhibition spécifique de la RNA-polymérase : la rifampicine. Trop toxique en clinique •inhibiteurs de la DNA gyrase, une ADN-topoisomérase : fluoroquinolones (ciprofloxacine), coumarines et novobiocine. Quinolones d’origine synthétique, largement utilisées en clinique. C. Walsh, Antibiotics, 2003 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 19 Modification de la topologie de l’ADN Pourquoi les 2 brins de la double hélice sont coupés : - Les 2 brins de la double hélice sont coupés : une brèche est créée. - Une autre partie de la double hélice passe à travers la brèche - La brèche est refermée. - Un super tour est ainsi créé Les réactions catalysées par la topoisomérase II -Relaxation et super enroulement - Nouage et dénouage - Caténation et décaténation 20 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Formation d’ADN caténé lors de la réplication Les 2 fourches de réplication se rencontrent Les molécules filles sont enchevêtrées A la fin de la réplication, les molécules filles sont caténées 21 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Création de super-enroulement négatif et positif lors de la transcription de l’ADN La RNA-polymérase (RNAP) se déplace et transcrit un ADN en ARN. Dans la bactérie, la traduction est couplée à la transcription. Un domaine topologique de l’ADN est symbolisé par les barres verticales. Lors du déplacement de la RNAP, la double hélice se tord et engendre un super-enroulement positif (SE +) devant l’enzyme. Derrière la RNAP, la double hélice est détordue et génère un super-enroulement négatif (SE-). La DNA-gyrase élimine le (SE+) La topoisomérase I élimine le (SE-) 22 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 TOPOISOMERASE II Bactérienne : DNA gyrase. Protéine tétramérique A2B2 Gène gyr A : sous unité A, 875 aa, responsable de la coupure/religature des brins de l’ADN, contient la tyrosine du site actif. Coupure des 2 brins car 2 sites de coupure, contient le site d’interaction avec les antibiotiques quinolones Gène gyr B : sous unité B, 804 aa , porte le site de fixation de ATP et le site d’interaction avec les coumarines A 1 B 875 Site coupure/religature : tyrosine en 122 1 804 Site d’interaction avec ATP Eucaryote : protéine dimérique A2, 2 sous unités de 1429 aa. Coupure des 2 brins car 2 sites de coupure. Le gène topoII contient les 2 domaines A et B. Pas de site de fixation aux antibiotiques. A 1 Site d’interaction avec ATP 1429 Site coupure/religature : tyrosine LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 23 Inhibiteurs du métabolisme des folates • • Le THF est un donneur de groupe méthyle indispensable à synthèse de la thymidine et donc de l’ADN Biosynthèse du THF. La première étape est la synthèse du dihydroptéroate à partir du GTP et de l'acide para-aminobenzoique. Cette étape peut être inhibée par un sulfamide. C. Walsh, Antibiotics, 2003 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 24 Mécanisme d'action d'un sulfamide. • Le sulfamide est un analogue structural du substrat, le PABA. Le produit formé GTP-sulfamide est un complexe non reconnu par l'enzyme de la voie de biosynthèse du DHF. C. Walsh, Antibiotics, 2003 25 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 La résistance bactérienne aux antibiotiques Ampleur du problème sanitaire Antibiotique Sulfamides Année de développement thérapeutique années 30 Année d'apparition de la résistance années 40 Penicillines 1943 1946 Streptomycine 1943 1959 Chhloramphénicol 1947 1959 Tétracycline 1948 1953 Erythromycine 1952 1988 Vancomycine 1956 1988 Methicilline 1960 1961 Ampicilline 1961 1973 début des années 60 fin des années 60 Céphalosporines LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 26 Mécanismes de résistance aux antibiotiques 1 imperméabilité, efflux 2 inactivation de l’antibiotique 3 modification ou substitution de la cible Antibiotique 1 2 Cible 3 27 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Modification de la cible Diminution de l'affinité de l'érythromycine pour sa cible, l'adénine 2058. • L'Adénine 2058 de l'ARN 23S de la sous unité 50S du ribosome bactérien est méthylée par la méthyltransférase porté par le gène Erm. • Erm, gène présent dans le génome de l'organisme producteur. • SAM : S-adénosyl méthionine, SAH : S-adénosylhomocystéine. C. Walsh, Antibiotics, 2003 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 28 Production d’une forme inactive, efflux, sécrétion d’une forme active à l’extérieur • • • • • • • Le précurseur actif est glycosylé par OleI R1 : monomère de N-acetyl glucosamine. R2 : dimère de N-acetyl glucosamine-glucose. Le donneur de glucose est l’UDP-glucose Efflux vers le périplasme. Gène OleB OleR est une glycosidase. OleR et OleI , Ole B: génes présents sur le chromosome de la bactérie 29 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 30 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Analogie entre les mécanismes de résistance des bactéries productrices et des bactéries pathogènes C. Walsh, Antibiotics, 2003 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 31 Résistance par modification de l'antibiotique •par une b-lactamase pour les b-lactames L’acide clavulanique est inhibiteur de la blactamase (associé à l’amoxicilline dans l’augmentin) •par des enzymes de modification des aminoglycosides C. Walsh, Antibiotics, 2003 32 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Exemple de résultat d’antibiogramme d’une bactérie prélevée chez un patient hospitalisé. Germe : Staphylococcus aureus Antibiotique Antibiogramme en solide Diamètre mesuré (mm) Liquide Résultat interprété Cible de l’antibiotique OXACILLINE 6 Seuil Diamètre (mm) 20-20 CMI (µg/mL) Seuil CMI (µg/mL) >2 2-2 Résistant Peptidoglycane TOBRAMYCINE 6 14-16 128 4-8 Résistant Ribosome GENTAMICINE 9 14-16 >32 4-8 Résistant Ribosome AMIKACINE 10 15-17 >32 8-16 Résistant Ribosome ERYTHOMYCINE 6 17-22 >64 1-4 Résistant Ribosome PRISTINAMYCINE 40 19-22 <0,03 1-2 Sensible Ribosome TRIMETHOPRIME 30 10-16 <0,125 2-8 Sensible Folates + SULFAMIDES OFLOXACINE 6 16-22 >32 1-4 Résistant DNA gyrase RIFAMPICINE 12 14-29 >16 0.5-16 Résistant RNA polymérase ACIDE FUSIDIQUE 16 15-22 >8 2-16 Intermédiaire Ribosome FOSFOMYCINE 31 14-14 <32 32-32 Sensible Peptidoglycane VANCOMYCINE 27 17-17 <4 4-16 Sensible Peptidoglycane TEICOPLANINE 26 17-17 <4 4-16 Sensible Peptidoglycane Conclusions : Bactérie résistante aux b-lactamines : phénotype Methicilline Resistant Staphylococcus Aureus : MRSA 33 Bactérie résistante aux aminosides : phénotype résistant Kanamycine Tobramycine Gentamycine : KTG LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Streptomyces -Bactéries du sol, Gram-plus, filamenteuses. -Génome linéaire, haut pourcentage en G+C -Cycle de vie complexe. 34 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Production de métabolites secondaires colorés par différents Streptomyces. Les antibiotiques sont des métabolites secondaires synthétisés par des bactéries à différentes étapes de la croissance, mais généralement en état de stress, carence en C ou P ou N. Observation de colonies de différentes espèces produisant des métabolites secondaires colorés. En (b) : Streptomyces coelicolor et production d’actinorhodine. Organisme modèle des Streptomyces. 35 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Biosynthèse des antibiotiques peptidiques non ribosomiques Exemple de la pénicilline Utilisation d’acides aminés conventionnels et non conventionnels Double cyclisation de l'ACV pour obtenir le noyau b-lactame de l'isopenicilline N C. Walsh, Antibiotics, 2003 36 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Système général de régulation chez les bactéries : système à 2 composants S et R Le domaine extra cytoplasmique est un senseur de l’environnement : concentration en nutriments, densité cellulaire (quorum sensing) La transmission du signal par le domaine transmembranaire au domaine cytoplasmique provoque une auto phosphorylation des histidines avec des molécules d’ATP. Le régulateur sous une forme non phosphorylée n’a pas d’affinité pour l’ADN. Le régulateur est phosphorylé par transfert du phosphate du senseur vers le régulateur. Sous forme phosphorylée, le régulateur acquiert une affinité pour l’ADN, en particulier pour la région promotrice d’un gène. Cette fixation empêche la fixation de la RNA-polymérase et inhibe l’expression de ce gène. 37 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012 Biosynthèse des antibiotiques en relation avec le développement du mycélium bactérien et la disponibilité des sources nutritionnelles 38 LV342 cours 5 Catherine Esnault 2012
