Ecole doctorale Environnements-Santé

Ecole doctorale Environnements-Santé
Dossier de projet de thèse « Contrat doctoral des Universités »
ANNEE 2016
TITRE DU PROJET : Caractérisation des mécanismes régulant les modifications de la structuration
membranaire induites dans la signalisation des réponses de défense des plantes
- Equipe et lieu : UMR 1347 AgroécologieAgroSup/INRA/uB, Pôle Interaction Plantes Microorganismes (IPM)
ERL6300 CNRS 17 rue Sully BP 86510, 21065 Dijon
- Nom du directeur de thèse et du co-directeur : Françoise Simon-Plas et Patricia Gerbeau-Pissot
- Adresse courriel du contact scientifique : [email protected]
- Description du projet :
Au cours de l’évolution, les plante sont optimisé une réponse adaptative leur permettant de faire face aux stress,
biotiques ou abiotiques, auxquels elles sont continuellement soumises. La connaissance approfondie des dispositifs
par lesquels les cellules végétales perçoivent et identifient l’agression par un pathogène, puis initientla réponse
appropriée est un pré-requis indispensable pour limiter l’utilisation d’intrants phytosanitaires et satisfaire les enjeux
actuels d’une agriculture plus respectueuse de l’environnement. Le projet de thèse s’inscrit dans ces objectifs et se
propose de participer à la compréhension des mécanismes précoces mis en place au niveau du plasmalemme des
cellules végétales en réponse à l’élicitation de réactions de défense.
Un couple plante/micro-organisme caractéristique de ces interactions est le modèle tabac/cryptogéine (Blein et al.
La cryptogéine, petite protéine de 10 kDa, est secrétée par l’oomycète Phytophthora
cryptogea et capable de déclencher chez le tabac des réponses de défense manifestées par le développement d’une
réaction hypersensible (Billard et al. 1988 J Chromatogr 44:87-94) et d’une résistance systémique protégeant durablement la
plante contre un large spectre d’agents pathogènes (Ricci et al. 1989 Europ J Biochem 183:555-63). De fait, les divers
événements biochimiques typiques de la réaction hypersensible, tels que l’influx de calcium, les flux ioniques, la
production de formes actives de l’oxygène (FAO)…, ont été décrits chez le tabac en réponse à l’addition de
cryptogéine (Garcia-Brugger et al. 2006 Mol Plant Microbe Interact 19:711-24).
La plupart de ces activités sont portées par des protéines localisées ou liées au plasmalemme, laissant supposer
que cette membrane serait le siège privilégié de la reconnaissance et de la signalisation immunitaire qui en découle
(Frescatada-Rosa et al. 2015 Curr Opin Plant Biol 28:23-9). Nos travaux antérieurs, sur fractions membranaires purifiées,
indiquaient que certaines de ces protéines étaient, de manière dynamique, compartimentées dans des domaines
plasmalemmiques particuliers en réponse à la cryptogéine (Stanislas et al. 2009 Mol Cell Proteomics 8:2186-98). Ces domaines,
de composition lipidique spécifique, enrichis en stérols et en sphingolipides (Mongrand et al. 2004 J Biol Chem 279:36277-86),
présentent conséquemment un état d’ordre de leur agencement moléculaire plus important (Grosjean et al. 2015 J Biol
Chem. 290:5810-25). En utilisant les propriétés d’une sonde fluorescente sensible à l’état d’organisation de la membrane,
la di-4-ANEPPDHQ (Jin et al. 2005 Biophys J 89:04-06), associées à des techniques sophistiquées d’analyse d’image, nous
avons vérifié que le plasmalemme des cellules de tabac affichait in vivo une mosaïque de domaines plus ou moins
ordonnés et montré que cette distribution spatiale était modifiée en réponse à l’élicitation par la cryptogéine (GerbeauPissot et al. 2014 Plant Physiol 164:273-86), validant ainsi chez les végétaux la théorie de « radeaux membranaires » évoquée
dans les cellules animales (Simons et Ikonen 1997 Nature 387:569-72). De plus, nous avons démontré que l’abondance des
domaines ordonnés plasmalemmiques est augmentée, de manière FAO dépendante, par l’élicitation (Sandor et al. Soumis
J Exp Bot).
1991 Plant Physiol 95:486-91).
Pour aller plus loin, le projet de thèse ambitionne d’utiliser ces acquis afin de décrypter les mécanismes
responsables de ces modifications de la structuration du plasmalemme en domaines ordonnés afin d’en établir le rôle
dans la cascade de signalisation en réponse à l’élicitation. Plusieurs modèles sont explicités dans la littérature pour
expliquer, notamment dans la réponse immunitaire animale, la formation de plateformes de signalisation
correspondant à des regroupements de domaines ordonnés d’une taille variant de quelques nm à plusieurs µm. L’un
d’entre eux propose l’arrivée de domaines spécifiques à partir de vésicules sous-jacentes. De fait, au moment de
l’infection par un pathogène, le trafic membranaire peut être mobilisé afin de spécialiser le plasmalemme (Caillaud et al.
2014 PLoS Pathogens 10:e1004496 ; Kim et al. 2014 Plant J 79:835-47). L’implication du cytosquelette dans ces réarrangements
membranaires (Yang et al. 2014 PNAS 111:13996-14001) comme dans la réponse à l’élicitation (Binet et al. 2001 Plant Physiol
125:564-72) a été démontrée.
Les travaux récemment initiés privilégiant ce modèle dans notre système, nous chercherons à suivre et
caractériser les déplacements des domaines ordonnés puis étudierons l’origine des vésicules impliquées dans ce
trafic membranaire. L’adressage de domaines ordonnés au plasmalemme sera évalué en quantifiant l’arrivée à cette
membrane de stérols, déterminants majeurs de la structuration membranaire en domaines ordonnés (Roche et al. 2008
FASEB J. 22:3980-91), des expériences préliminaires ayant montré leur enrichissement en réponse à la cryptogéine (Coll.
L. Bretillon). Pour définir les modes de régulation de ce mécanisme, des dosages des stérols plasmalemmiques
seront réalisés sur des cellules de tabac témoins et élicitées, en présence d’inhibiteurs de certaines étapes de la
réponse à l’élicitation, e.g. phosphorylation enzymatique, production de FAO... L’utilisation de lignées transformées
(dont une lignée inactivée dans l’expression de la NADPH oxydase responsable de la production des FAOs en
réponse à la cryptogéine) nous permettra de compléter ces approches pharmacologiques. Pour déterminer l’origine
des vésicules permettant l’augmentation des stérols plasmalemmiques, la responsabilité du recyclage cellulaire sera
testée en ajoutant des inhibiteurs de la polymérisation des filaments d’actine et des microtubules et d’en observer les
conséquences sur la structuration du plasmalemme induite en réponse à la cryptogéine. En parallèle, les membranes
cellulaires seront chargées en stérols fluorescents et leur (re)localisation en réponse à la cryptogéine sera suivie en
microscopie haute résolution couplée à de la microscopie électronique (microscopie corrélative, plateforme
DIMACell). Des approches de co-localisation utilisant des marqueurs des compartiments cellulaires, dont par exemple
les protéines de type R-SNARE, VAMP 721/722 associées aux vésicules spécifiquement engagées dans la réponse
immunitaire (Kwon et al. 2008 Nature 451:835-40) détermineront les voies de trafic membranaire engagées. Complétées par
la cartographie des domaines ordonnés, les sites plasmalemmiques de l’arrivée de ces vésicules devraient pouvoir
être identifiés.
Ce projet est basé sur un modèle original soutenu par la bibliographie récente, il est supporté par des techniques
novatrices et, pour partie, maitrisées au laboratoire. Enfin, bien que porteur d’avancées inédites et intéressantes, le
projet reste fondé sur des expériences préliminaires qui minimisent notre analyse du risque. Cependant, un deuxième
modèle sera rapidement considéré si nos premières données réfutent notre hypothèse de travail. La formation de
domaines ordonnés directement sur le plasmalemme pourrait permettre d’en modifier l’organisation latérale. Nous
avons montré que l’augmentation de l’abondance des domaines ordonnés induite par l’élicitation était dépendante
d’une production de FAOs (Sandor et al. Soumis J Exp Bot). Le fait que la NADPH oxidase responsable de cette activité
oxydante soit précisément localisée dans des domaines spécifiques (Morel et al. 2006 Mol Cell Proteomics 5:1396-1411) permet
de proposer que les FAOs produits puissent oxyder les molécules à proximité, modifier leurs propriétés structurantes,
et étendre ainsi la taille des domaines ordonnés les portant. Cet autre modèle sera, entre autres, exploré en suivant
sur cellules de tabac traitées par la cryptogéine l’apparition et la diffusion de(s) forme(s) efficace(s) de FAO, grâce à
des sondes fluorescentes spécifiques. Ces cinétiques spatialisées seront comparées à celle des domaines ordonnés,
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révélées par la di-4-ANEPPDHQ, et de l’oxydation de la membrane plasmique, observée à l’aide du bodipyC (Coll.
L. Beney), de manière à corréler ces différents événements.
- Connaissances et compétences requises
Bases de biologie cellulaire et moléculaire, biochimie et biophysique, microscopie, physiologie végétale. Une
connaissance des interactions plante-microorganisme et des notions sur les techniques d’étude des membranes
seraient un avantage.
2) Publications des 3 dernières années (publications référencées ISI, avec indication du quartile de sa
catégorie ISI pour chaque journal).
Gerbeau-Pissot P., Der C., Grebe M., Stanislas T. (2016) Ratiometric fluorescence live imaging analysis of
membrane lipid order in Arabidopsis mitotic cells using a lipid order-sensitive probe Methods Mol. Biol. (Q3
Genetics, Q4 Molecular Biology) 1370:227-39.
Cacas J.L., Buré C., Grosjean K., Gerbeau-Pissot P., Lherminier J., Rombouts J., Maes E., Bossard C., Gronnier J.,
Furt F., Fouillen L., Germain V., Bayer E., Cluzet S., Robert F., Schmitter J.M., Deleu M., Lins L., Simon-Plas F.,
Mongrand S. (2016) Re-visiting plant plasma membrane lipids in tobacco : A focus on sphingolipids Plant
Physiol.(Q1 Physiology, Q1 Plant Science, Q1 Genetics) 170(1):367-84.
Grosjean K., Mongrand S., Beney L., Simon-Plas F., Gerbeau-Pissot P. (2015) Differential effect of plant lipids on
membrane organization: specificities of phytosphingolipids and phytosterols J Biol Chem. (Q1 Biochemistry, Q1
Cell Biology, Q1 Molecular Biology) 290(9):5810-25.
Kulik A., Noirot E., Grandperret V., Bourque S., Fromentin J., Salloignon P., Truntzer C, Dobrowolska G., Simon-Plas
F., Wendehenne D. (2015) Interplays between nitric oxide and reactive oxygen species in cryptogein signalling.
Plant Cell Environ. (Q1 Physiology, Q1 Plant Science) 38(2):331-48.
Coursol S., Fromentin J., Noirot E., Brière C., Robert F., Morel J., Liang Y.K., Lherminier J., Simon-Plas F. (2015)
Long-chain bases and their phosphorylated derivatives differentially regulate cryptogein-induced production of
reactive oxygen species in tobacco (Nicotiana tabacum) BY-2 cells. New Phytol. (Q1 Physiology, Q1 Plant
Science) 205(3):1239-49.
Gerbeau-Pissot P., Der C., Thomas D., Anca I.A., Grosjean K., Roche Y., Perrier-CornetJ.M., MongrandS., SimonPlas F. (2014) Modification of plasma membrane organization in tobacco cells elicited by cryptogein Plant
Physiol.(Q1 Physiology, Q1 Plant Science, Q1 Genetics) 164(1):273-86.
Noirot E., Der C., Lherminier J., Robert F., Moricova P., Kiêu K., Leborgne-Castel N., Simon-Plas F., Bouhidel K.
(2014) Dynamic changes in the subcellular distribution of the tobacco ROS-producing enzyme RBOHD in
response to the oomycete elicitor cryptogein. J Exp Bot. (Q1 Physiology, Q1 Plant Science) 65(17):5011-22
Guillier C., Cacas J.L., Recorbet G., Deprêtre N., Mounier A., Mongrand S., Simon-Plas F., Wipf D., Dumas-Gaudot
E. (2014) Direct purification of detergent-insoluble membranes from Medicago truncatula root microsomes:
comparison between floatation and sedimentation. BMC Plant Biol. (Q1 Plant Science) 30;14:255.
Anca I.A., Fromentin J., Bui Q.T., Mhiri C., Grandbastien M.A., Simon-Plas F. (2014) Different tobacco
retrotransposons are specifically modulated by the elicitor cryptogein and reactive oxygen species. J Plant
Physiol. (Q1 Agronomy and Crop Science, Q2 Physiology, Q1 Plant Science) 171(16):1533-40.
Les candidatures doivent être transmises à l’ED ES
[email protected]
avant le 19 mai 2016 – midi