1. services proposes 2. preparation des echantillons par le porteur
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DOC-20 FICHE PRODUIT : RE-SEQUENÇAGE DE REGIONS CIBLEES Date de mise à jour : 28/08/2013 Le re-séquençage de régions ciblées combine des techniques d’enrichissement par capture d’hybrides (SureSelect d’Agilent, …) et de séquençage haut débit. Il permet d’analyser, chez des patients, des régions génomiques d’intérêt (exome, gènes cibles,…) afin d’y détecter des variations génétiques par rapport à un génome de référence. 1. SERVICES PROPOSES La plateforme réalise le séquençage des échantillons avec la technologie HiSeq2500 d’Illumina. La prestation comprend : 1) Vérification des échantillons Quantification de l’ADN génomique par spectrophotométrie (Nanodrop) ou fluorimétrie (Qubit, Invitrogen) Vérification de l’intégrité de l’ADN par électrophorèse 2) Préparation des librairies Fragmentation de l’ADN par sonication (Covaris, KBiosciences) Les fragments d’ADN sont ligués à des adaptateurs de séquençage possédant un index (code barre de ≥ 6nt). Vérification de la quantité de l’ADN fragmenté par fluorimètrie (Qubit) et du profil par électrophorèse capillaire (Bioanalyzer, Agilent) Capture des fragments d’ADN couvrant les régions d’intérêt du génome Validation de la librairie par électrophorèse capillaire 3) Séquençage Chargement des librairies sur la flowcell et génération de clusters avec la Cbot (Illumina) Séquençage double 2x100 bases (paired-end) 4) Analyse primaire des données Effectuée avec RTA/CASAVA (Illumina) : extraction des intensités des clusters à partir des images, base calling, filtrage des séquences en fonction de leur qualité et suppression des dimères d’adaptateur. 5) Analyse ultérieure (optionnelle) 2. PREPARATION DES ECHANTILLONS PAR LE PORTEUR DE PROJET Le porteur de projet réalise la préparation de l’ADN génomique et nous le fournit pleine taille ou fragmenté. Caractéristiques de l’ADN à fournir Quantité d’ADN minimale requise Conditions d’envoi 3 μg quantifiés avec un fluorimètre. À une concentration ≥ 100 ng/μl dans un volume de 20 μl minimum. En solution dans de l’eau sur de la carboglace. Les tubes doivent être clairement identifiés et accompagnés d’une fiche descriptive indiquant le volume de chaque ADN. Nous ne commençons un run de séquençage que lorsque la Flowcell (8 pistes) est complète avec des échantillons dont la longueur de lecture est similaire. Néanmoins, il nous est possible de réaliser des runs rapides sur une seule piste de la flowcell moyennant un surcoût. 3. CONTROLES QUALITÉ RÉALISÉS PAR LA PLATEFORME Les contrôles qualité listés ci-dessous, sont effectués par la plateforme et les résultats sont envoyés par e-mail au porteur de projet à l’issue de chacune des étapes. Plate-forme BIOPUCES et SEQUENCAGE IGBMC – 1, rue Laurent FRIES – 67404 ILLKIRCH CEDEX- France http://www-microarrays.u-strasbg.fr/ DOC-20 FICHE PRODUIT : RE-SEQUENÇAGE DE REGIONS CIBLEES Date de mise à jour : 28/08/2013 1) Vérification des échantillons Quantité d’ADN génomique (mesurée au fluorimètre) Qualité ≥ 3μg DO260/DO280 ≥ 1,8 - ADN génomique pleine taille : absence de signe de dégradation sur un gel d’agarose - ADN fragmenté : taille moyenne ≤ 500 pb Les images de l’ADN avant fragmentation sont demandées 2) Préparation des librairies Profil de la librairie (électrophorèse capillaire) Pureté de la librairie (électrophorèse capillaire) Pic(s) compris entre 200 et 800pb. Présence minoritaire de dimères d’adaptateur (bande à 120-130pb) 3) Séquençage et analyse primaire des données Moyenne des scores de qualité (Phred score). Les moyennes sont calculées pour ≥ 30 pour 95% des positions chaque position (~base) sur l’ensemble des séquences*. Nombre total de séquences* par ≥ 75 millions** échantillon * passant le filtre qualité et ne correspondant pas à des dimères d’adaptateur ** pour un échantillon séquencé sur une piste entière. Pour le reséquençage d’exome humain nous multiplexons généralement deux échantillons par piste permettant d’obtenir une couverture nucléotidique moyenne supérieure à 40X dans les régions capturées. 4. LIVRAISON DES RESULTATS Pour chaque échantillon les résultats suivants sont mis à la disposition du porteur du projet : - données brutes de séquençage (contient les séquences nucléotidiques au format fastq ayant passé le filtre qualité et ne correspondant pas à des dimères d’adaptateur). Le porteur de projet peut télécharger ses données de séquence sur le serveur FTP de la plateforme. Un login et un mot de passe sont attribués par la plateforme et envoyé par courriel. Conformément aux « Conditions Générales de la Plate-forme Biopuces et Séquençage », il est rappelé que le porteur du projet est responsable de la sauvegarde et de l’archivage de ses données. La plateforme ne s’engage à les conserver que pour une durée limitée de 6 mois après leur mise à disposition. 5. ANALYSE ULTERIEURE [OPTIONNEL] L’analyse ultérieure des données n’est pas prise en charge dans la prestation standard, mais elle peut être réalisée sous la forme d’une collaboration avec des membres de la plateforme. Elle comprend notamment l’alignement des séquences sur le génome de référence, l’évaluation de l’efficacité de la capture, la recherche de variants (variation ponctuelle (Single Nucleotide Variant, SNV), petites insertions, délétions). La localisation des variants par rapport aux annotations fonctionnelles du génome sont données (ex : 3’UTR, exon etc…) de même que leur impact (synonyme, non-synonyme, codon stop, variant d’épissage…). Les variants détectés sont Plate-forme BIOPUCES et SEQUENCAGE IGBMC – 1, rue Laurent FRIES – 67404 ILLKIRCH CEDEX- France http://www-microarrays.u-strasbg.fr/ DOC-20 FICHE PRODUIT : RE-SEQUENÇAGE DE REGIONS CIBLEES Date de mise à jour : 28/08/2013 également annotés avec des banques de données publiques comme dbSNP. Les variants de plusieurs individus peuvent être comparés entre eux. Une analyse permettant la détection des remaniements chromosomiques peut également être réalisée. Plate-forme BIOPUCES et SEQUENCAGE IGBMC – 1, rue Laurent FRIES – 67404 ILLKIRCH CEDEX- France http://www-microarrays.u-strasbg.fr/
