Cours ENSPC Paris
publicité
METABOLISME Recherche de métabolites réactifs Prévision des effets indésirables d ’une molécule par la prédiction de sa potentialité à former des métabolites réactifs XENOBIOTIQUE INTERMEDIAIRES REACTIFS ELIMINATION METABOLISME CUTANE DES XENOBIOTIQUES EXISTENCE D ’ UN « FIRST PASS EFFECT » Présence des principaux enzymes de métabolisation au niveau cutané Existence d ’un « first pass effect » , particulièrement pour les molécules ayant un flux de pénétration lent Peut entraîner une modulation de l ’activité/toxicité des molécules EFFETS SECONDAIRES DETOXIFICATION METABOLISME DES XENOBIOTIQUES ET THERAPIE: CONCEPTS Effet des inducteurs/inhibiteurs sur l ’activité des enzymes (interaction entre molécules actives) METABOLISME Métabolisme des composés utilisés en dermatologie Substrats THERAPIE LOCALE biodisponibilité locale élevée absorption systémique réduite THERAPIE SYSTEMIQUE biodisponibilité locale réduite absorption systémique élevée Propanolol Acide retinoique Clotrimazole Estradiol Hydrocortisone Progesterone, testostérone Vidarabine Peroxide de benzoyl Butyrate de Fluocortine Valerate de difluorocortolone Monoxil Androstane diol 17 valerate de betamethazone Enzymes Oxidoréductases Oxidoréductases Oxidoréductases Oxidoréductases Oxidodéductases 5 alpha réductases Hydrolases Hydrolases Hydrolases Hydrolases Transférases Transférases Isomérase Références Ademola, 1993 Duell, 1992 Merck, 1989 Weinstin, 1968 Hsia, 1966 Kao, 1900 Yu, 1980 Kao, 1900 Mûtzel, 1977 Tauber, 1977 Wong, 1993 Rittmaster, 1993 Cheng, 1983 METABOLISME CUTANE DES XENOBIOTIQUES ET THERAPIE LOCALE METABOLISME CUTANE ET THERAPIE LOCALE PRODRUG SOFTDRUG application locale d ’un composé inactif mais pénétrant métabolisation locale du composé inactif en en composé actif au niveau cutané ex :esters de théophylline, 5 fluorouracil, esters de corticoïdes… application locale d ’un composé actif à faible potentiel pénétrant et ayant une toxicité systémique métabolisation locale d ’un composé actif en un composé inactif au niveau sysmétique mais: mais possibilité de biotransformation incomplète de la softdrug dans la peau conduisant à un taux élevé du composé dans le sang si la métabolisation locale est incomplète possibilité de biotransformation de la prodrug dans la voie systémique conduisant à des effets secondaires METABOLISME METABOLISME CUTANE Principaux enzymes cutanés Enzymes Cytochrome P-450 Réactions OXIDATION hydroxylation aliphatique hydroxylation aromatique epoxidation N,O,S dealkylation déamination oxydative N, S oxydation désulfuration déhalogénation oxydative Flavine monooxygenase Identification des Cytochromes P-450 dans la peau et le foie OXIDATION Famille I II IID azoréduction nitroréduction HYDROLYSES Amidases HYDROLYSES Epoxydes hydrolases HYDRATION Alcool déhydrogénases OXYDOREDUCTION IIB1 and IIB2 IIC REDUCTION Estérases IA1 and IA2 IB1 N, S oxydation Réductases Sous famille II E1 III IV IIIA IVA Peau + + ? ? ? ? ? - HOMME Foie + ? + + + + + Peau + ? + ? ? + + - RONGEUR Foie + ? + + + + + + METABOLISME METABOLISME CUTANE Activité CYP-450 IA1 dans le foie et la peau Polymorphisme des enzymes de métabolisation Enzymes Espèces Subtrats associés Activité (nmol / min /mg de proteine) Peau Foie Références ENZYMES DE PHASE I CYP IA1 Rat 1,09+/-0,13 43,1+/-12,5 Muktar and Bickers 1981 Souris 0,06+/-0,01 35,0+/- 7 Lilienblum1985 Homme 0,58+/-0,06 ND Bickers et al1984 Amines aromatiques, hydrocarbures polycycliques Coumarine NAIS drug, phenytoine, tolbutamide Omprazol, Imipramine, diazepan Antidepresseurs tricycliques, β blockers Dapsone, carbamazepine, acetaminophene CYP 2A6 CYP 2C9 CYP 2C19 CYP 2D6 CYP 2E1 ENZYMES DE PHASE II N-acetyl transférase II Glutathion-S-transférase NAD(P)H-quinone réductase Phenol sulfotransférase (P-PST) METABOLISME METABOLISME Inducteurs et inhibiteurs des cytochromes P-450 utilisés en dermatologie Substrats Inhibiteurs Antihistamines Chloroquine Cyclosporine Charbon (PAH) Dapsone Glucocorticoides Griséofulvine Hydroxychloroquine Imidazoles Psoralènes Acide retinoique Stéroides Vit D Clotrimazole Griseofulvine Itraconazole Ketoconazole Liarazole Miconazole Psoralène Acide retinoique Isoniazide, dapsone Halotane Amino nitroaromatiques, quinones, azo Hydroxyamines aromatiques Inducteurs Cyclosporine Dexamethasone Charbon (PAH) Psoralène Acide retinoique Rifampicine Induction et inhibition des enzymes de Phase I (CYP-450) Enzymes Inducteurs Induction (%/ témoin) Cytochrome P-450 Benzo(a)pyrene PAH / PCB / BNF Ethoxycoumarine Ethoxycoumarine Ethoxycoumarine Aldrine Benzo(a)pyrene Ethoxyresorufine Benzo(a)pyrene Ethoxycoumarine Phenobarbital Steroides UV UV UV + charbon UV + charbon 150 - 1500 800 - 1000 400 500 800 200 250 850 1250 METABOLISME METABOLISME CUTANE Monooxydases flaviniques Activité FMO des microsomes cutanés et hépatiques Substrats Activité relativement élevée chez le rongeur Activité (nmol / min /mg de proteine) Peau Substrats: xenobiotiques contenant des groupements nitriques, soufrés, phosphorés (phorate, methimazole, thiobenzamine…) Substrats communs avec les Cytochromes P-450 Foie Peau / foie Methimazole 0,35+/-0,14 3,4+/-0,6 10 Thiobenzamidine 0,32+/-0,13 1,7 +/-0,2 19 Rôle dans les tissus d’activité P-450 peu élevée (poumon, peau, intestin) D ’après Venkatesh et al Pesticide Biochem Physiol 43, 53-56, 1992 METABOLISME METABOLISME Réactions de réduction Groupe chimique réduit Réactions Nitro -NO Azo R1-N=N-R Quinone Quinone Quinone Radicaux libres Enzymes -NHOH R1-NH2 + R2-NH2 O2, H2O2 Radical nitroxyde Principaux enzymes de Phase II et réactions Semiquinone Diol H2O NO2 Nitroreductase Azoreductase Cyt P450 reductase Quinone reductase Carbonyl reductase SOD, catalase Thioredoxine reductase Enzymes Réactions UDP-glucuronyl transférase O,N,S,C glucuronidation Sulfotransférase Sulfatation N-acétyl transférase Acétylation Glutathion transférase Glutathion conjugaison Amino acide tranférase A. acide conjugaison Métyl tranférase Méthylation METABOLISME METABOLISME Glutathion-S-transférase N-acetyl transférases Activité relativement importante au niveau cutané (15-40% du foie) Forte activité au niveau cutané (supérieure à celle du foie) Substrat : acide p aminobenzoïque (PABA), 2 aminofluorène (AF) Substrat : oxyde de styrène, 4,5 oxyde de benzo(a)pyrene Localisation: épiderme humain et de rongeurs, follicules pileux culture de kératinocytes Localisation: épiderme humain et de rongeurs, follicules pileux culture de kératinocytes Rôle substantiel dans le métabolisme des arylamines Differentes formes: π > α, µ Forte variabilité inter-individuelle, polymorphisme génétique Forte variabilité inter-individuelle Par de différences intersexe chez le rat, pas de différence fumeurs/ non-fumeurs METABOLISME METABOLISME CUTANE Principaux inducteurs des enzymes Phase II cutanés Enzymes NADP Quinone réductases Inducteurs PAH / PCB Important facteur de sensibilité individuelle aux xénobiotiques, en particulier les haptenes Induction (%/ témoin) Prostaglandines synthétases Présence de cyclooxygénase et de lipoxygénase dans la peau humaine (Zibih et al, 1984, Grabbe et al, 1985) 200 - 400 Epoxydes hydrolases PCB 100 Glutathion-S-tranferases PCB 100 Les cellules de Langerhans métabolisent l ’acide arachidonique (act. spéficique > kératinocytes (Ruzika et Aubrock, 1987) UDP-Glucuronyl transférases 2 aminophenol B(a)P 7,8 dihydrodiols PAH / PCB 200 300 Les kératinocytes basaux de la souris hairless métabolisent l ’acide arachidonique à une vitesse supérieure à celle des kératinocytes différenciés (Henke et al, 1986) METABOLISME METABOLISME CUTANE Autres activités oxidoréductases dans la peau Comparaison des activités métaboliques à celles du foie Substrats Enzymes Références Enzymes / substrats Retinol Geraniol (?) Alcool cinnamique Alcool déhydrogénases Rétinaldéhyde Citronellal Valinine Aldéhyde déhydrogénases Théophylline Xanthine oxydase Nor-adrenaline Amines oxydase Cytochrome P-450 Boehlein et al, 1994 Activité spectrale Aniline Benzo(a)pyrène Coumarine 7-PROD Cytochrome P-450 réductase 2-6 6 0,1-12 <1 20 - 27 24 Ademola et al, 1992 Epoxyde hydrolase Cytosolique Mitochondriale Activités AHH Polyphénols.... Risques carcinogènes Activités 5α reductase Acnée, séborrhée, hirsutisme 24 - 27 3 - 11 (% de l ’activité hépatique) UDP glucuronyltranférase Dérivés B(a)P 1-Naphtol Imidazoles.... Activité de RA 0,6 - 5 2 - 50 Sulfotransférase 0,8 - 3 Glutathion-S-tranférase 14 - 49 N-acetyl tranférase 6 - 18 ROLE DANS LA GENESE DES REACTIONS D ’HYPERSENSIBILITE DE CONTACT Xénobiotique Métabolites réactifs Conjugués xénobiotique - Proteine Immunogène Inflammation Activités spécifiques METABOLISME CUTANE Métabolites inactifs Imidazoles.... Activités 4OH de RA (% de l ’activité hépatique) Boehlein et al, 1994 METABOLISME CUTANE DES XENOBIOTIQUES ET THERAPIE LOCALE : EXAMPLES Activités PG synthetase Activités spécifiques Enzymes / substrats Antigène Anticorps / Lymphocytes T Lésions tissulaires Iiiarozoles.... Réactions d ’hypersensibilité METABOLISME CUTANE METABOLISME CUTANE Localisation des activités enzymatiques de métabolisme des xénobiotiques SYSTEMES D ’EVALUATION Fraction subcellulaire Enzyme purifiée Culture monocouche Microsomes Mitochondries Levures Bacteries cDNA codant Primoculture de kératinocytes Lignées de kératinocytes Métabolisme Etudes spectrales Fixation covalente Etude de phénotypage Métabolisme Métabolisme Etudes spectrales Fixation covalente Fixation covalente Etude de phénotypage Stress oxydatif METABOLISME CUTANE METABOLISME CUTANE Difficultés d’évaluation du métabolisme cutané ET EPIDERMES / PEAUX RECONSTRUITES Système 3D Epidermes reconstruits Métabolisme In vivo (Homme, animal) Forte activité métabolique du foie, du rein et des poumons par rapport à la peau Variabilité inter espèces Difficulté d ’adapter la méthode « skin flaps » à l ’homme (raisons éthiques) Ex vivo (Homme, animal) Les épidermes humains reconstruits possèdent des capacités de métabolisme des xénobiotiques comparables à ceux de la peau humaine normale Les activités métaboliques peuvent être inhibées / induites de façon comparable à la peau humaine normale Besoin de biopsies, maintien des capacités métaboliques de la peau en survie ? In vitro - culture de cellules (Homme, animal) Différenciation incomplète des kératinocytes Maintien des capacités métaboliques ? Difficultés de tester des composés non-hydrophiles Absence de fonction de barrière Ils permettent l’évaluation de l’effet de la molécule mère et de ses métabolites en terme de: cytotoxicité - phototoxicité irritation cutanée sensibilisation effets thérapeutiques ETUDE EUROPEENNE DG XII ETUDE EUROPEENNE DG XII « Testing and improvement of reconstructed skin kits in order to elaborate European standards » « Testing and improvement of reconstructed skin kits in order to elaborate European standards » Métabolisme cutané (1) Métabolisme cutané (2) Activités de Phase I : activités cytochrome P-450 dépendantes Démonstration de la présence des activités de Phase I et II dans les kits d ’épidermes reconstruits _ Activité basale EROD non détectable _ Activité basale ECOD détectable Concordance quantitatives entre certaines activités enzymatiques testée sur les kits d ’épidermes reconstruits et sur la peau humaine ex vivo ou sur les follicules pileux _ Induction des activités EROD et ECOD par le 3-MC reproductible à l ’intérieur d ’un lot mais variable suivant les lots pour les trois modèles testés _ Induction coordonnée des activités ECOD et EROD _ Inhibition par le Chlotrimazole des activités EROD et ECOD induites par le 3-MC _ Activités basales et induites comparables quantitativement à celles de l ’épiderme humain normal METABOLISME CUTANE ETUDE EUROPEENNE DG XII ET EPIDERMES / PEAUX RECONSTRUITES « Testing and improvement of reconstructed skin kits in order to elaborate European standards » Enzymes P-450 dependants : Activités ECOD et EROD Métabolisme cutané (3) Activité de Phase II : GST _ Activité basale GST détectable, faible variabilité intra et inter lots _ Activité basale GSH d ’Episkin® similaire à celle de l ’épiderme humain normal _ Inhibition de l ’activité GST par l ’acide ethacrynique testée sur la fraction cytosolique _ Absence d ’inhibition de l ’activité GST par la sulphobromophthaleine ou la tetrachlorobenzoquinone. ETUDE EUROPEENNE DG XII « Testing and improvement of reconstructed skin kits in order to elaborate European standards » Métabolisme cutané (4) AVANTAGES ET LIMITES DES MODELES D’EPIDERMES ou de PEAUX RECONSTRUITES POUR L’EVALUATION DES COSMETIQUES AVANTAGES _ Activité Basal NQR basale similaire à celle de l ’épiderme humain normal chez certains modèles (Episkin® model) • Modèle pertinent de peaux/épiderme humain normal • Possibilité d ’évaluer des paramètres /dommages pertinents • Possibilité d ’évaluer des ingrédients ou des formulations complexes • Présence d ’une fonction de barrière • Présence des enzymes de métabolisation des xénobiotiques _ Inhibition de l ’activité NQR par le dicoumarol • Reproductibilité des modèles _ Induction de l ’activité NQR par la β-naphthoflavone • Validation (pour certaines applications) Activités de Phase II : NQR _ Activité NQR basale détectable, utilisant la menadione comme substrat avec des activités quantitativement différentes suivant les modèles. Faibles variabilité intra lots mais variabilité élevée inter lots LIMITES • Fonction de barrière imparfaite • Absence d ’annexes cutanées • Follicules pileux • Glandes sébacées • Glandes sudoripares • Absence de desquamation • Absence d ’innervation MODELES DE PEAUX/EPIDERMES RECONSTRUITS QUESTIONS ? Systèmes reproduisant la peau humaine normale (ou éventuellement pathologique) Modèles bien caractérisés et fonctionnels REPONSES ?
