Les microbes et la santé : À la fine pointe du progrès scientifique
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Les microbes et la santé : À la fine pointe du progrès scientifique Todd R. Klaenhammer North Carolina State University Food, Bioprocessing & Nutrition Sciences Southeast Dairy Foods Research Center Colloque STELA 30-31 mai, 2011 Le laboratoire le plus malodorant Nombre total de cellules humaines – 1013 Nombre total de cellules microbiennes du corps humain – 1014 >1000 espèces microbiennes > 5 millions de gènes Diversité microbienne énorme Dirigeant des fonctions métaboliques similaires Immunomodulation Détoxification Sécrétion de mucine Protection contre des maladies entériques Pincock, The Scientist, 2005 …dans ce modèle, l’obésité affecte la variété de la flore intestinale et suggère que des manipulations intentionnelles de la structure des communautés seraient utiles pour régler le bilan énergétique chez les individus obèses % augmentation du gras corporel Une flore intestinale de type ob/ob favorise l’adiposité chez l’hôte Souris colonisées avec le type +/+ Souris colonisées avec le type ob/ob Pas de différence significative de prise alimentaire, de gras corporel initial ou de poids initial n = 9 ou 10 souris/groupe; *p < 0,05 La flore intestinale est un facteur environnemental qui peut contribuer à l’obésité Deux populations de Drosophila melanogaster, une nourrie de mélasse et l’autre d’amidon, furent mélangées ensemble. L’accouplement alors se produit de préférence entre les mouches venant de la même population d’origine. Cette préférence était apparente après seulement une génération et s’est maintenue pour au moins 37 générations. Un traitement antibiotique annula la préférence, suggérant que la flore microbienne de la mouche était responsable du phénomène. Ceci fut confirmé lors des essais d’infection avec une flore microbienne obtenue du milieu nutritionnel des mouches (avant le traitement antibiotique) ou une culture mixte de lactobacilles ainsi qu’une culture pure de Lactobacillus plantarum isolée des mouches à l’amidon. Les analyses suggèrent que les bactéries de symbiose peuvent influencer la PNAS November 16, 2010 vol. no. 46 20051-20056 préférence d’accouplement en modifiant la 107 production Les bactéries commensales jouent un rôle dans la préférence d’accouplement de Drosophila melanogaster «…L. plantarum (apparue dans la flore microbienne des mouches nourries de féculant) est un candidat principal pour l’induction du phénomène de préférence d’accouplement » La flore microbienne Cavité orale Estomac Espèces de Lactobacillus Espèces de Bifidobactérium Autochthone Abondante Colonisation permanente Normal Fréquemment présent Nombres variables Absences sporadiques Pathogènes Acquis périodiquement Allochthone D’une autre origine Présence temporaire Tannock, 1999 Le sort des probiotiques Lactobacillus ingérés Pendant l’alimentation Les probiotiques ingérés % de colonies probiotiques dans les fèces Apparition des bactéries dans les fèces Mangés Avant l’alimentation 2 semaines après que l’alimentation soit arrêtée Pas mangés Jours Colette Short, 1998 Klaenhammer et al, 1990 Rôles & effets bénéfiques des bactéries probiotiques dans le TGI Protection contre les infections (Corr et al., 2007) Incidence moins élevée de diarrhée (Lonnermark et al., 2009) Diminution des symptômes de rhumes et influenza chez les enfants et du nombre des jours d’école manqués (Leyer et al., 2009) Activité antimicrobienne (Ryan et al., 2009) Exclusion compétitive de pathogènes (Lee et al., 2003) Tolérance immunitaire (van Baarlen et al., 2009) Reduction des biomarqueurs du cancer colorectal (Rafter et al., 2007) Retour à la flore de base pre-antibiotique (Engelbrektson et al., 2009) Fonction de barrière épithéliale (Mennigen et al., 2009) Immunité cellulaire accrue (p. ex. Activité accrue des cellules tueuses) (Takeda and Okumura, 2007) Réponse humorale accrue (p. ex. Secrétion d’IgA) (Viljanen et al., 2005) Diminution du cholestérol sanguin (Ataie-Jafari et al., 2009) Diminution des symptômes du colon irritable (Macfarlane et al., 2009) Livraison de substances thérapeutiques (Wells and Mercenier, 2008) Photographie de Servin, Université de Paris-SUD O’Flaherty & Klaenhammer, Int. Dairy. J., 2009 Mécanismes des probiotiques Sherman et al. 2009. Nutrition in Clinical Practice 24(1):10-14 Résistance à la colonisation Effets métaboliques Maintient la fonction barrière Renforce la flore microbienne Immunomodulation adaptative/innée Modulation du signal de transduction Bifidobacterium longum (Nestle, 2002) Lb. plantarum (WCFS, 2003) Lb. johnsonii (Nestle, 2004) Lb. acidophilus (NCSU, 2005) Lb. salivarius (UCC, 2006) Lb. casei (LABGC, 2006) Lb. gasseri (LABGC, 2006) Lb. bulgaricus (INRA, 2006) St. thermophilus (INRA 2004) Génomique comparative et fonctionnelle Microbiologie générale Séquençage du génome/datamining Altermann et al., 2004 Destruction et suppression de gènes X Puces à ADN knock out Gène => fonction => environnement => mécanismes Protéines et structures d’attachement potentielles pour le genre Lactobacillus Protéines liant le mucus Protéines de la surface épithéliale intestinale L’acide lipoteichoique Paroi cellulaire bactérienne Gram positive Velez and others. 2007. FEMS Microbiol. Lett. La protéine de la couche superficielle Photographie de microscopie électronique de Lactobacillus acidophilus ATCC4356 Boot Ph.D Thesis, 1996 Les principales protéines de surface de paroi de L. acidophilus W+ Mutant SlpA, slpB, SlpX slpA, SlpB, SlpX Attachement de L. acidophilus NCFM à des cellules dendritiques immatures (rapport de 100:1) Vu sous microscopie à fluorescence, grossissement de 400X WT- slpA dominant MUTANT SlpB dominant Konstantinov et al. 2008 PNAS 105:19474-19479. 70% Grangette et al…Mercenier, 2005. Enhanced anti-inflammatory capacity of a Lactobacillus plantarum mutant synthesizing modified teichoic acids. PNAS 102:10321-10326. Mohamadzadeh et al., Klaenhammer. 2010. Regulation of induced colonic inflammation by Lactobacillus acidophilus deficient in lipoteichoic acid. PNAS, in press Illustrations tirées de nos articles de recherches: Les capacités anti-inflammatoires accrues chez un mutant de L. plantarum qui synthétise des acides teichoiques modifiés La régulation de l’inflammation du colon par une souche de L. acidophilus déficiente en production des acides lipoteichoiques Une suppression dans la région d’amorçage du gène de glycosyl-phosphotransferase est associée à une réduction de ~50% de l’adhérence aux cellules intestinales épithéliales Caco2 (expérience in vitro) 120 100 % adherence 80 60 40 20 0 NCK56 NCK2025 Bactérie probiotique Cytokines, facteurs protecteurs, mucines et jonctions serrées Couche dynamique de mucus Intestin grêle Lebeer, Vanderleyden and De Keersmaecker et al., 2010. Nature Reviews/Microbiology 8:171 Gros intestin Activation des TLR par des mutants de Lactobacillus Activation de NF-kB (multiple de la différence) W+ Protéine liant le mucus Mutant (acide lipoteichoique modifié) Figure 4. L’activation des récepteurs de type Toll (« Toll-like receptors » ou TLR) est différente chez les mutants de Lactobacillus. Les souches 1377, 1398, 1660 et 1661 ont toutes des mutations dans les protéines ou structures de la surface cellulaire qui interagissent avec les cellules épithéliales. Une approche à la modification des interactions entre bactéries et TLR serait donc de modifier les protéines liant le mucus, les protéines de la couche superficielle ou les acides lipoteichoiques. Dean et al. and Klaenhammer, pas publié WT Lta- Untreated Non traitées WT + DSS Pre-feedingavec of L. Pré-nutrition L.acidophilus acidophilus DSS LTAMohamadzadeh et al., Klaenhammer, PNAS In Press 2010 Post-nutrition avec L. acidophilus Mohamadzadeh et al., Klaenhammer, PNAS In Press 2010 Mécanismes des probiotiques Sherman et al. 2009. Nutrition in Clinical Practice 24(1):10-14 Résistance à la colonisation Effets métaboliques Maintient la fonction barrière Renforce la flore microbienne Immunomodulation adaptative/innée Modulation du signal de transduction Isle de pili G+ unique chez L. rhamnosus GG SpaC SpaC SpaB SpaA Sortase SpaB SpaA sortase Étiquettage immuno-Or Anti-SpaC L. rhamnosus GG possède des pili Kankainen et al PNAS 2009 Adhésion (%) au mucus intestinal humain Adhésion de Lactobacillus GG avec antisérum SpaC Kankainen M et al. PNAS 2009;106:17193-17198 ©2009 by National Academy of Sciences LGG exclut les pathogènes grâce à ses pili SpaC Reetta Satokari & Ingemar von Ossowski Displacement of E. faecium intestinal Déplacement de E. faecium par LGGfrom ou sahuman protéine SpaC surmucus une by LGG or its SpaC protein surface de mucus intestinal humain 1,80 1,60 Adhesion % 1,40 * 1,20 * 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 E. faecium E. faecium + LGG E. faecium + SpaC Exclusion compétitive – Un mécanisme probiotique à distance Mécanismes des probiotiques Sherman et al. 2009. Nutrition in Clinical Practice 24(1):10-14 Résistance à la colonisation Effets métaboliques Maintient la fonction barrière Renforce la flore microbienne Immunomodulation adaptative/innée Modulation du signal de transduction Lactobacillus salivarius Mégaplasmide de 242 kb Une bactériocine à deux composants, de classe IIb Tue Listeria monocytogenes Corr C. et al. , O’Toole (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 7617-7621 UFC au foie relatives au placebo (%) Figure 4. La production de bactériocine explique la protection fournie par Lactobacillus salivarius UCC118 contre l’infection par Listeria monocytogenes chez la souris A/J Corr, Sin&eacute et al., Hill (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 7617-7621 Copyright ©2007 by the National Academy of Sciences Déterminer quels caractères génétiques des cultures de Lactobacillus sont responsables des activités probiotiques Examiner l’effet de « l’environnement » sur l’expression de ces gènes Lait/produits laitiers Acide Bile Lait Yaourt Faire le lien Fonctionnement et efficacité probiotiques SDFRC L. acidophilus NCFM - Génome et transcriptome global Altermann et al., PNAS 2005 Barrangou et al., PNAS 2006 Expression des gènes durant la croissance dans le lait Système protéolytique: Protéinases et peptidases transporteurs d’acides aminés/oligopeptides 11% lait écrémé Synthèse des protéines AI-21/LuxS Systèmes de réglage à deux composants Gènes associés au stress Métabolisme des sucres: lactose/galactose fructose maltose N-acetylglucosamine Facteurs d’adhérence/protéines de surface: protéines liant le mucus Facteurs putatifs promoteurs d’agrégation Azcarate-Peril et al., J. Dairy Sci. 2009 Le gène apf chez NCFM Putative Ser/Thr Hyp. Hyp. protein protein protein phosphatase 0488 0490 0489 Cellobiose PTS IIC component Putative phosphomutaselike protein 0491 0492 99% Aggregationpromoting protein apf 98% Hyp. protein Putative phosphoglycerate mutase 0494 0495 0496 Putative phosphoglycerate mutase 99% LBA0493 696 bp / 231 ac. aminés Masse molaire de l’Apf secrété 21 kDa pI 9.0 % ac. aminés hydrophobes Expression 46.1% Augmentée de 5X dans le lait Goh & Klaenhammer, 2010 L’épreuve de la survie dans les sucs gastriques et intestinaux 3 g/L pepsine 1 g/L pancréatine amylase protease lipase Suc intestinal simulé Suc gastrique simulé, pH 2.0 0.5% NaCl 0.5% NaCl pH 8 + 0.3% Oxgall 1000 1000 100 % su rvival Survie (%) % survival Survie (%) 100 10 1 10 1 0.1 0.01 0.001 0.1 0.0001 0 10 20 30 40 50 Temps d’exposition Exposure tim e (m(min) in) NCFM apf- 60 70 0 1 2 3 Temps d’exposition Exposure time (hr)(h) NCFM 4 apf- Goh & Klaenhammer, 2010 5 La survie dans la bile % survival Survie(t2/t0*100) (%) 100 10 4.18 1 0.15 0.1 NCFM upp- apfΔapf • des cellules au début de la phase logarithmique (OD600 0.25-0.3) furent exposées à la bile dans le bouillon MRS + 2.5% Oxgall (pH ∼ 6.5) • les survivants après 2h à 37°C furent dénombrés sur gélose MRS Goh & Klaenhammer, 2010 Adhérence aux glycoprotéines de mucine % R elative ad h eren ce 120 100.00 100 80 63.50 60 40 20 0 NCFM apf- Goh & Klaenhammer, 2010 Adhérence aux cellules intestinales épithéliales % Relative adherence 120 100 100 80 67.22 60 40 20 0 NCFM apf- Goh & Klaenhammer, 2010 Rôles fonctionnels du produit Apf Promouvoir l’interaction avec les cellules épithéliales, la couche de mucus, la fibronectine In vitro Fortement induit pendant la croissance dans le lait ou sur le lactose Apf Augmente la tolérance à la bile Phénotype SANS agrégation NCFM Promouvoir la survie dans les milieux gastrique et intestinal Goh and Klaenhammer, AEM, 2010 Beau de l’extérieur, ! Mais la différence se trouve à L’INTÉRIEUR Bactéries Gram positives Glycoprotéines Autres protéines de la surface cellulaire et protéines secrétées Lipoprotéine Probiotiques – Matrices alimentaires/laitières pour leur livraison intestinale Mary Ellen Sanders and Maria L Marco FOOD FORMATS FOR EFFECTIVE DELIVERY OF PROBIOTICS Les microbes et la santé: À la fine pointe du progrès scientifique Les bactéries lactiques – Des véhicules oraux de livraison Les peptides bio-actifs Antimicrobiens Antiviraux Enzymes Vaccins Des protéines de fusion de l’antigène protecteur contre l’Anthrax Peptide de contrôle ou de ciblage PA 1-765 Signal de sécrétion Peptide ciblant les cellules dendritiques Peptide de contrôle FYPSYHSTPQRP EPIHPETTFTNN Lactobacillus Surnageant 1838 1839 1895 Culot rPA 1838 1839 1895 83 kDa 0,2 μg 1838 – Peptide constitutif de contrôle rPA 1839 – Peptide constitutif de cellule dendritique rPA 1995 – Vecteur vide 10 μg de protéine totale de surnageants et culots 0,2 μg de rPA (protéine pure) comme témoin 2010 Future Microbiol. (8):1289-96. O'Sullivan, D.J.and T.R. Klaenhammer. 1993. High- and low-copy number Lactococcus shuttle cloning vectors with features for clone screening. Gene 137:227-231. Expression ciblée de l’antigène protecteur contre l’anthrax par Lactobacillus gasseri agissant à titre de vaccin anti-anthrax Remerciements Eric Altermann M. Andrea Azcarate- Peril Olivia McAullife Jun Goh Richard Tallon Sarah O’Flaherty Dan O’Sullivan Rosemary Dawes Evelyn Durmaz Tri Duong Rodolphe Barrangou Allison Dobson Erika Pfeiler Mike Russell Logan Buck Grace Douglas Gregg Dean Sylvie Lortal MaryEllen Sanders M. Mohamadzedeh Sergey Konstantinov Remerciements NC State Genomic Sciences North Carolina Dairy Foundation graduate program
