Étude de la différenciation in vitro de lymphocytes

Étude sur la différenciation in vitro de lymphocytes B
humains en plasmocytes
Microenvironnement et caractérisation des plasmocytes générés
Mémoire
Rayelle Itoua Maïga
Maîtrise en biochimie
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Rayelle Itoua Maïga, 2013
I
Résumé
Les plasmocytes, cellules responsables de la sécrétion d’anticorps, sont au cœur de la réaction immunitaire humorale.
Cette caractéristique en fait des cellules intéressantes en thérapie cellulaire pour offrir une protection humorale aux
patients immunosupprimés suite à une transplantation de cellules souches hématopoïétiques. Afin d’obtenir ces cellules,
notre équipe à Héma-Québec propose d’utiliser la capacité de différenciation des lymphocytes B mémoires in vitro. Notre
hypothèse est qu’il serait possible de différencier ces derniers en contrôlant leur microenvironnement de culture. Ce
projet porte donc sur l’étude de l’interaction cellulaire CD27-CD70 combinée aux facteurs de survie APRIL et CXCL12.
Les résultats montrent que cette interaction induit une différenciation rapide des lymphocytes B tandis que l’addition des
facteurs solubles n’a pas d’impact sur la survie cellulaire. De plus, l’utilisation des marqueurs de surface CD31 et CD39 a
permis de mettre en évidence l’hétérogénéité des plasmocytes générés in vitro et ceux retrouvés in vivo.
III
Table des matières
Résumé........................................................................................................................ III
Liste des figures ........................................................................................................... IX
Liste des abréviations ................................................................................................... XI
Remerciements .......................................................................................................... XIII
1. Introduction ............................................................................................................. 1
1.1 Les lymphocytes B humains ............................................................................................... 1
1.1.1 Développement et transition .................................................................................................... 1
1.1.2 Maturation des lymphocytes B et rencontre de l’antigène ............................................... 1
1.1.3 Activation extrafolliculaire des lymphocytes B .................................................................. 2
1.1.4 Activation folliculaire et formation du centre germinatif .................................................. 2
1.1.5 Formation du centre germinatif......................................................................................... 3
1.1.6 Différenciation terminale des lymphocytes B .................................................................... 5
1.1.7 Réponse immunitaire secondaire ...................................................................................... 6
1.1.8 Les populations de lymphocyte B du sang ......................................................................... 6
1.2 Les plasmocytes............................................................................................................... 7
1.2.1 Les immunoglobulines ....................................................................................................... 7
1.2.2 Le phénotype des lymphocytes B différenciés .................................................................. 8
1.2.3 Plasmocytes à courte vie.................................................................................................. 10
1.2.4 Les plasmocytes à longue vie ........................................................................................... 10
1.2.5 Niche de survie des plasmocytes ..................................................................................... 11
1.3 Les plasmocytes et la thérapie cellulaire ......................................................................... 13
1.3.1 Greffe de cellules souches hématopoïétiques ................................................................. 13
1.3.2 Les applications de la transplantation ............................................................................. 14
1.3.3 La reprise de greffe et la reconstitution du système immunitaire .................................. 14
1.3.4 Problèmes post-transplantation et vulnérabilité aux infections ..................................... 15
1.3.5 Traitement des problèmes post-transplantations ........................................................... 15
1.3.6 Introduction des plasmocytes générés in vitro ................................................................ 16
1.4 Modèles de culture développés jusqu’à présent ............................................................. 17
1.5 Expansion et différenciation in vitro de lymphocytes B humains ..................................... 17
1.5.1 Interaction CD40-CD154 .................................................................................................. 17
1.5.2 Interaction CD27-CD70 .................................................................................................... 18
2. Hypothèse ................................................................................................................ 19
3. Objectifs .................................................................................................................. 21
4 Méthodologie ........................................................................................................... 23
V
4.1 Cellules humaines ..........................................................................................................23
4.1.1 Participants à l’étude........................................................................................................ 23
4.1.2 Les cellules mononuclées du sang.................................................................................... 23
4.1.3 Lymphocytes B mémoires IgG+, IgA+, ou IgE+ ................................................................... 23
4.1.4 Les cellules mononuclées de la moelle osseuse............................................................... 24
4.2 Les lignées cellulaires humaines .....................................................................................24
4.2.1 Les cellules 3H7 et L4.5 .................................................................................................... 24
4.2.2 Ramos, RPMI-8226, U266, Jurkat ..................................................................................... 24
4.3 Culture de lymphocytes B humains .................................................................................25
4.3.1 Expansion des lymphocytes B .......................................................................................... 25
4.3.2 Transition.......................................................................................................................... 25
4.3.3 Différenciation des lymphocytes B................................................................................... 26
4.3.4 Survie des lymphocytes B et des plasmocytes ................................................................. 26
4.3.5 Système de culture des lymphocytes B mémoires........................................................... 26
4.4 Mesure de la sécrétion d’immunoglobulines ...................................................................27
4.4.1 ELISA ................................................................................................................................. 27
4.4.2 Essai BioPlex ..................................................................................................................... 27
4.4.3 ELISPOT ............................................................................................................................. 28
4.5 Cytométrie en flux .........................................................................................................28
4.5.1 Marquage extracellulaire ................................................................................................. 28
4.5.2 Comparaison des clones d’anticorps anti-CD138............................................................. 30
4.5.3 Prolifération cellulaire ...................................................................................................... 30
4.5.4 Fluorescent Cell Barcoding ............................................................................................... 30
4.6 Immunofluorescence .....................................................................................................31
4.6.1 Microscopie à fluorescence .............................................................................................. 31
5. Résultats .................................................................................................................. 33
5.1 Étude comparative des anticorps monoclonaux anti-CD138 ............................................33
5.2 Différenciation des lymphocytes B avec l’interaction CD70 ..............................................37
5.2.1 Détermination du ratio de CD70 ...................................................................................... 37
5.2.2 Comparaison des interactions CD70 et CD154 ................................................................ 39
5.3 Amélioration de la viabilité des lymphocytes B ...............................................................47
5.3.1 APRIL ................................................................................................................................. 48
5.3.2 CXCL12 .............................................................................................................................. 54
5.3.3 IGF-R3 ............................................................................................................................... 56
5.3.4 Instabilité de la viabilité ................................................................................................... 57
5.4 Caractérisation des plasmocytes générés in vitro ............................................................57
5.4.1 Patron de sécrétion des cellules différenciées ................................................................. 58
5.4.2 Morphologie cellulaire ..................................................................................................... 59
5.4.3 Réponse intracellulaire des plasmocytes à des stimuli dans leur environnement .......... 60
5.4.4 Expression de CD31 et CD39 ................................................................................................ 62
6. Discussion ................................................................................................................ 67
VI
6.1 Le clone DL101 anti-CD138 détecte une nouvelle sous-population de plasmocytes in vitro
........................................................................................................................................... 67
6.2 L’interaction cellulaire induit une différenciation plus rapide .......................................... 69
6.3 Complexité du microenvironnement de survie des plasmocytes...................................... 70
6.4 Vers une meilleure caractérisation des plasmocytes générés .......................................... 70
7. Conclusion ............................................................................................................... 73
Références ................................................................................................................... 75
VII
Liste des figures
Figure 1.1 : Interaction cellulaire entre les lymphocytes T activés et cellules B avant le centre germinatif……..4
Figure 1.2 : Le centre germinatif…………………………………………………………………………………………5
Figure 1.3 : Réponse des lymphocytes B mémoires lors de la réaction immunitaire secondaire………………..6
Figure 1.4 : Niche de survie des plasmocytes à longue vie…………………………………………………………12
Figure 1.5 : Reconstitution des cellules immunitaires après une transplantation de CSH………………………15
Figure 4.1 : Système de culture des lymphocytes B mémoires…………………………………………………….26
Figure 5.1 : Marquage des cellules CD138+ générées in vitro……………………………………………………..34
Figure 5.2 : Marquage de lignées cellulaires avec des clones anti-CD138……………………………………….35
Figure 5.3 : Marquage de plasmocytes in vivo……………………………………………………………………….35
Figure 5.4 : Essai de compétition des clones anti-CD138…………………………………………………………..36
Figure 5.5 : Différenciation des lymphocytes avec l’interaction CD70……………………………………………38
Figure 5.6 : Émergence de cellules CD38hiCD138+ …………………………………………………………………30
Figure 5.7 : Sécrétion d’immunoglobulines………………………………………………………………………….41
Figure 5.8 : Expression de CD27………………………………………………………………………………………43
Figure 5.9 : Évolution de l’expression de CD27 et CD70……………………………………………………………44
Figure 5.10 : Croissance des cellules…………………………………………………………………………………46
Figure 5.11 : Dose-réponse d’APRIL…………………………………………………………………………………48
Figure 5.12 : Effet d’APRIL sur la viabilité cellulaire en interaction CD70 et CD154…..………………49
Figure 5.13 : Effet d’APRIL sur la fonction sécrétrice des lymphocytes B………………………………………50
Figure 5.14 : Effet de la présence simultanée d’APRIL et d’IL-10 sur la viabilité cellulaire……………………51
Figure 5.15 : Expression des récepteurs d’APRIL…………………………………………………………………52
Figure 5.16 : Expression de TACI et BCMA sur lignées cellulaires………………………………………………53
Figure 5.17 : Dose réponse de CXCL12………………………………………………………………………………54
Figure 5.18 : Influence de CXCL12 sur la viabilité cellulaire in vitro………………………………………………55
Figure 5.19 : Expression de CXCR4…………………………………………………………………………………56
Figure 5.20 : Effet d’IGF-R3 sur la viabilité cellulaire………………………………………………………………57
Figure 5.21 : Patron de sécrétion d‘IgG………………………………………………………………………………58
Figure 5.22 : Patron de sécrétion d’IgG de plasmocytes de la moelle osseuse…………………………………59
Figure 5.23 : Morphologie des cellules CD138+ ……………………………………………………………………60
Figure 5.24 : Patron d’activation des plasmocytes générés in vitro………………………………………………61
Figure 5.25 : Expression de CD31 et CD39 sur les lymphocytes B dans la phase d’expansion………………62
Figure 5.26 : Expression de CD31 et CD39 au début de la phase de différenciation……………………………63
IX
Figure 5.27 : Expression de CD31 et CD39 sur les plasmocytes in vivo………………………..………………64
Figure 5.28 : Expression de CD31 et CD39 sur les plasmocytes…………………………………………………65
Figure 7.1 : Modèle proposé pour l’évolution de la différenciation des lymphocytes B mémoires en
plasmocytes in vitro………………………………………………………………………………………………………73
X
Liste des abréviations
ACD : Acid–Citrate-Dextrose
APRIL: A Proliferation Inducing Ligand
ARN: Acide ribonucléique
ARNm: Acide ribonucléique messager
BAFF-R : B cell activating factor receptor
BAFF: B-cell activating factor
Bcl-2 : B-cell lymphoma protein 2
Bcl-6 : B-cell lymphoma protein 6
BCMA: B-cell maturation antigen
BCR: B-cell receptor
Blimp-1 : B-lymphocyte-induced protein 1
BSA : Bovine serum albumin
CAR cells : CXCL12-abundant reticular cells
CD: Cluster of differentiation, marqueurs de surface
CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité
CSH: Cellule souche hématopïétique
CXCL: CXC chemokine ligand
CXCR: CXC chemokine receptor
DMSO : Diméthysulfoxyde
DZ : Dark zone
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
ELISPOT: Enzyme-linked immunosorbent spot
ENTPD1, NTDPase-1 : ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1
ERK1-2 : Extracellular signal-regulated kinases
FBS : Fetal bovine serum
FCB : Fluorescent cell barcoding
G-CSF: Granulocyte-Colony Stimulating Factor
ICOS : inducible co-stimulator
Ig: Immunoglobuline
IGF-1 : Insulin-like growth factor
IL : Interleukine
IMDM : Iscove’s modified Dulbecco’s medium
XI
iNOS : inducible-nitric oxide synthase
IRF: Interferon-regulatory factor
JAK : Janus tyrosine kinase
LFA-1 : Leukocyte function-associated antigen-1
LPS : Lipopolysaccharide
LZ : Light zone
MALT : Mucosa-associated lymphoid tissues
MAPK : Mitogen-activated protein kinases
MFI: Median fluorescence intensity
NF-B : Nuclear factor-B
NK: Natural Killers
Pax5 : Paired protein box 5
PBMC: Peripheral blood mononuclear cells
PBS: Phosphate buffered saline
PE : Phycoerythrin
PECAM-1 : Platelet-endothelial cell adhesion molecule-1
PSG-1 : P-selectin glycoprotein ligand-1
RPMI : Roswell Park Memorial Institute
SDF-1 : Stromal derived factor-1
STAT : Signal transducer and activator of transcription
TACI: Transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor
TGF : Tumor growth factor
TMB : Tétraméthylbenzidine
TNF : Tumor necrosis factor
TRANCE : Tumor-necrosis factor-related-TNF- activation-induced cytokine
Treg : T régulateurs
UPR : Unfolded protein response
VEGF : Vascular endothelial growth factor
VLA-4 : Very late activation antigen-4
XBP-1 : X-box binding protein
XII
Remerciements
Déjà deux ans qu’a débuté ma belle aventure chez Héma-Québec. Je profite de cette occasion pour remercier
toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à la réussite de ce projet de maitrise. Je tiens tout
d’abord à dire un énorme merci à ma directrice Dr Sonia Néron, pour m’avoir acceptée dans son laboratoire,
tout d’abord comme stagiaire en 2010 et ensuite comme étudiante graduée. Je lui suis reconnaissante pour sa
grande disponibilité ainsi que pour nos discussions si enrichissantes. Je la remercie également du fond du
cœur pour son grand intérêt non seulement pour mon projet de maitrise, mais aussi pour mes projets futurs et
de m’avoir donné l’occasion d’accomplir plusieurs tâches qui me seront d’une grande utilité dans ma carrière
scientifique.
Je tiens à remercier chaleureusement mon co-directeur Dr André Darveau pour ses conseils, ses
commentaires ainsi que sa disponibilité qui m’ont été fort utiles durant ma maitrise et qui le seront surement
dans le futur. Je remercie également les autres membres de mon comité d’encadrement, soit les Drs Renée
Bazin et Daniel Grenier pour leur disponibilité, leurs commentaires constructifs, ainsi que l’intérêt qu’ils ont
montré envers mon projet.
Je voudrais également remercier la formidable équipe du Dr Néron, qui a rendu mon séjour chez HémaQuébec si enrichissant et agréable, soit Marc Cloutier, Carl Simard, Guillaume Bonnaure, Catherine GervaisSt-Amour ainsi que Jennifer Lemieux. J’ai grandement apprécié votre esprit d’équipe, votre disponibilité ainsi
que votre support. Je tiens également à remercier Annie Roy et Josiane Tremblay Rochette de m’avoir initiée
à la culture cellulaire et appris les rudiments de nombreuses méthodes d’immunologie.
Je remercie également tout le personnel d’Héma-Québec pour leur gentillesse et disponibilité durant tout mon
parcours au sein de l’organisme. J’ai une pensée particulièrement pour les étudiants de la R&D, que je
remercie pour les discussions aussi enrichissantes qu’hilarantes.
Je ne peux terminer sans remercier ma famille et mes amis, d’ici ou de l’autre côté de l’Atlantique, pour leur
support constant et inconditionnel depuis le début de cette aventure.
XIII
1. Introduction
1.1 Les lymphocytes B humains
1.1.1 Développement et transition
La réponse immunitaire humorale est la ligne de défense de l’hôte faisant intervenir les anticorps ou
immunoglobulines présents dans le plasma et la lymphe. Elle permet une protection contre les agents
pathogènes et implique les lymphocytes B qui sont les seules cellules capables de se différencier en cellules
sécrétrices d’anticorps. Chez les humains, le développement de ces cellules se déroule dans la moelle
osseuse, à partir des cellules progénitrices lymphoïdes [1, 2]. Cette différenciation des cellules souches donne
lieu aux pro-B. Un réarrangement réussi des segments des gènes des chaines lourdes (H) des
immunoglobulines (Ig) permet à ces cellules pro-B de devenir des cellules pré-B. Ces dernières expriment la
forme transmembranaire de la chaine lourde d’immunoglobuline  (M). L’expression de cette protéine
constitue le premier point de contrôle pour la sélection des lymphocytes B sains. Les cellules ayant passé ce
point subissent une expansion clonale et le réarrangement des chaines légères des Ig [1, 3]. Elles acquièrent
aussi l’expression à leur surface d’un BCR (B cell receptor) complet de type IgM. Les cellules subissent
ensuite un second point de contrôle constitué d’une sélection négative des cellules qui auraient à leur surface
des IgM reconnaissant des auto-antigènes. À ce stade, les cellules auto-réactives peuvent être éliminées, se
retrouver dans un état anergique ou subir une réédition de leur récepteur. Dans ce dernier cas, elles subissent
à nouveau des réarrangements génétiques permettant de modifier leur récepteur afin que celui-ci ne
reconnaisse plus d’anticorps du soi [4]. À la suite de cette étape, les lymphocytes B, dits immatures ou
transitionnels, quittent la moelle osseuse vers la rate, où ils vont terminer leur maturation. Ces cellules dans la
circulation sanguine représentent environ 2 % des lymphocytes B [5]. Une fois arrivées à destination, elles
subissent des étapes supplémentaires de maturation en plus d’acquérir l’expression d’IgD [6, 7]. Pendant ces
étapes, elles peuvent encore subir des sélections négatives afin d’écarter les cellules autoréactives. Une
partie de ces cellules demeure dans la zone marginale de la rate en tant que cellules naïves non circulantes
tandis que l’autre se développe en lymphocytes B matures naïfs (folliculaires) circulant dans le sang à travers
les ganglions lymphatiques, jusqu’à ce qu’elles rencontrent un antigène spécifique à leur BCR [3, 8].
1.1.2 Maturation des lymphocytes B et rencontre de l’antigène
Les cellules B naïves qui entrent dans un ganglion lymphatique migrent vers la zone des lymphocytes T et y
restent environ 24h, avant de retourner dans la circulation sanguine [9] si elles ne rencontrent pas d’antigène
pour lequel leur BCR est spécifique. Un lymphocyte B naïf peut ainsi rester en circulation de 80 à 120 jours,
1
après quoi il mourra par apoptose [10]. La rencontre de l’antigène se fait dans les ganglions lymphatiques [3].
Les antigènes de petite taille (<70 kDa) sont acheminés vers les follicules des ganglions lymphatiques à
travers des canaux folliculaires. Les petites molécules peuvent aussi entrer dans les follicules à travers les
espaces au niveau du sinus du ganglion et se lier par la suite aux lymphocytes B réactifs. Un autre modèle de
contact implique les molécules plus grosses (>70 kDa). Celles-ci sont présentées aux lymphocytes B par des
macrophages de la région subcapsulaire du sinus des ganglions lymphatiques. Il a aussi été suggéré que les
cellules dendritiques circulantes peuvent transporter des antigènes dans les organes lymphoïdes secondaires
[11][12][13][14].
1.1.3 Activation extrafolliculaire des lymphocytes B
Les lymphocytes B se trouvant dans la région extrafolliculaire des ganglions lymphatiques sont activés
indépendamment des lymphocytes T. Les antigènes qui sont impliqués dans ce type de réaction sont appelés
des antigènes T indépendants. Ils sont divisés en deux catégories, soit les types 1 et 2 [1][15]. Les premiers
agissent indépendamment du BCR et induisent la prolifération et la différenciation des cellules B. Le LPS
(lipopolysaccharide) retrouvé dans la membrane externe des bactéries à Gram négatif fait partie de ce groupe
d’antigènes [16]. Le deuxième type d’antigène T-indépendants agit à travers le BCR. Ces antigènes sont
souvent de haut poids moléculaire. Il peut s’agir notamment de polysaccharides provenant de la paroi
cellulaire de bactéries encapsulées telles que le Streptococcus pneumoniae [17]. La différenciation induite par
ces antigènes est plus complexe et nécessite plusieurs signaux en plus de la multimérisation du BCR. Ces
signaux proviennent notamment de la reconnaissance de l’antigène à la surface des lymphocytes B par des
molécules telles que les TLR (Toll-like receptors). L’antigène T indépendant de type 2 peut aussi induire la
sécrétion de cytokines par d’autres cellules de l’environnement du lymphocyte B. Ces facteurs solubles
agissent sur la prolifération et la différenciation de la cellule B. La survie et la différenciation des cellules B se
trouvant dans la zone extrafolliculaire sont dépendantes de la présence de facteurs tels que BAFF (B cell
activating factor), sécrété notamment par les cellules dendritiques [18]. Les lymphocytes B naïfs rencontrant
ces types d’antigènes prolifèrent rapidement et se différencient tout aussi rapidement en cellules sécrétrices
d’anticorps. Le stade final de différenciation des cellules B est le plasmocyte. Dans le cadre de l’activation Tindépendante, les plasmocytes générés sont dits à courte vie et sécrètent des anticorps, surtout de type IgM,
ayant une faible affinité pour l’antigène. Une petite population de ces plasmocytes sécrète aussi des IgG
[11][1].
1.1.4 Activation folliculaire et formation du centre germinatif
La plupart des antigènes induisant la production d’anticorps ont besoin de la collaboration des lymphocytes T.
Ces antigènes sont connus comme antigènes T dépendants et sont de nature protéique [15]. Les lymphocytes
B dans les follicules sont activés par la présentation antigénique par des macrophages du sinus subcapsulaire
2
des ganglions lymphatiques [19]. Les cellules dendritiques peuvent aussi présenter des antigènes aux
lymphocytes B naïfs [20]. En fait, dans les ganglions lymphatiques, on retrouve deux régions : l’une
concentrée en lymphocytes T (zones des T) et l’autre en lymphocytes B (zones des B) [21]. Les lymphocytes
sont activés dans leur zone respective par la rencontre d’une cellule présentatrice d’antigène (CPA)
présentant à sa surface l’antigène spécifique au lymphocyte T à travers son complexe d’histocompatibilité de
type II. Les cellules T CD4+ ainsi activées prolifèrent et expriment le récepteur de chimiokine CXCR5. Cela a
comme conséquence d’attirer ces cellules à l’interface de la zone des lymphocytes B. Ces derniers, une fois
qu’ils ont été activés par le même antigène dans leur zone respective, expriment à leur tour le récepteur de
chimiokine CXCR7 et se retrouvent à l’interface des deux zones [21][15]. Suite à leur activation, les deux types
de lymphocytes expriment plusieurs molécules de surface, permettant une meilleure interaction lors de leur
rencontre. Les lymphocytes T expriment le CD154 ou encore ICOS (inducible co-stimulator). Ils peuvent aussi
sécréter des cytokines telles que l’interleukine (IL-4), l‘interféron- ou encore l’IL-21 [22][23] (Fig. 1.1). C’est à
cet endroit qu’a lieu la rencontre des lymphocytes B et T activés par un antigène spécifique. L’interaction avec
les lymphocytes T induit l’activation des lymphocytes B. Ces cellules peuvent ensuite rester dans la zone
extrafolliculaire ou former un centre germinatif. Cette décision est dépendante de la force d’interaction entre
l’antigène et le BCR. Une forte liaison entre le BCR et l’antigène induit une différenciation des lymphocytes B
en dehors du centre germinatif tandis que les lymphocytes ayant une plus faible affinité pour l’antigène
formeront un centre germinatif [24].
1.1.5 Formation du centre germinatif
Le centre germinatif est une structure transitoire et dynamique dans laquelle on retrouve des lymphocytes B, T
ainsi que des cellules dendritiques folliculaires [25]. Des études ont aussi révélé la présence de lymphocytes B
naïfs dans cette structure [26].
3
Cellule TAF pré-GC
Cellule B activée
Récepteur de
cytokine
Peptide
CMH-II
Figure 1.1: Interaction cellulaire entre les lymphocytes T activés et cellules B avant le centre
germinatif. Cette figure a été traduite de [27] où TAF sont les lymphocytes T auxiliaires folliculaires et GC est
le centre germinatif.
L’interaction de l’ensemble de ces cellules à travers des interactions cellulaires ainsi que la sécrétion de divers
facteurs solubles induit la prolifération et la différenciation des lymphocytes B présents. Parmi ces interactions,
on retrouve celui entre le récepteur CD40, exprimé par les lymphocytes B et son ligand CD154 exprimé par les
lymphocytes T activés. Cette interaction est d’autant plus importante qu’il a été rapporté que les personnes
ayant une mutation dans la molécule CD154 ou CD40 étaient incapables de former des centres germinatifs,
menant au syndrome d’hyper IgM (X-linked hyper IgM syndrome) [28]. De plus, l’interaction entre le CD27 et le
CD70 est aussi connue comme ayant un rôle dans la formation du centre germinatif et la différenciation des
lymphocytes B [29][30].
La structure du centre germinatif est composée de deux régions, soit la zone claire (Light zone, LZ) et la zone
foncée (dark zone, DZ). Cette dernière est située près de la zone des cellules T. On y retrouve principalement
des lymphocytes B en prolifération, appelés centroblastes. Il a été rapporté que c’est à cet endroit que les
cellules subissent des hypermutations somatiques ayant pour but d’augmenter leur spécificité pour l’antigène.
Le cycle cellulaire de ces cellules est par la suite arrêté et elles migrent vers la zone claire. À cet endroit, les
lymphocytes B testent leur capacité à reconnaitre de manière spécifique l’antigène en question. Les cellules
subissent une sélection négative pour le recrutement de celles ayant la meilleure affinité pour l’antigène. Les
cellules dont le BCR ne reconnait pas l’antigène reçoivent des signaux induisant leur apoptose [31][32]. Il a été
rapporté récemment que les cellules pouvaient circuler entre la zone claire et foncée [25]. En effet, suite à la
sélection positive dans la zone claire, les cellules favorisées retournent dans la zone foncée, après leur
interaction avec des lymphocytes T auxiliaires, où elles subissent une seconde ronde de prolifération et
4
d’hypermutation somatique [25][31]. Ce processus de sélection favorise la production de lymphocytes ayant
une très grande affinité pour l’antigène et à la sortie du centre germinatif, on retrouve des plasmablastes
CD38++, CD138+/- et des lymphocytes B mémoires (CD19+, CD27+, CD38+/-) [33][34].
Figure 1.2 : Le centre germinatif. Résumé de différentes étapes menant à la génération de lymphocytes B
mémoires et de plasmablastes. Tirée de [27].
1.1.6 Différenciation terminale des lymphocytes B
Les plasmocytes représentent le stade final de différenciation des lymphocytes B en cellules sécrétrices
d’anticorps [11][1]. Cette différenciation débute par une activation du gène PAX5 (Paired Box Protein 5). Cette
étape marque un état de développement permettant l’expression de quelque 170 gènes nécessaires à la
signalisation, à la différenciation, à la migration et à l’adhésion des lymphocytes B matures [1][33, 35].
Plusieurs facteurs de transcription sont aussi impliqués dans cette progression complexe dont les facteurs
IRF4, IRF8, STAT3, STAT5, Blimp-1 et Bcl-6. Ces changements sont induits dès l’initiation du centre
germinatif et à la sortie, on retrouve les lymphocytes B à mémoire et les plasmablastes sécrétant des
anticorps, mais qui, contrairement aux plasmocytes, sont capables de proliférer [15, 36]. Une partie de cette
population de plasmablastes se différenciera en plasmocytes à courte vie tandis qu’une autre migrera vers des
niches de survie se trouvant notamment dans la moelle osseuse et dans les organes lymphoïdes secondaires
où ils deviendront des plasmocytes à longue vie. Ces plasmocytes à longue vie survivront durant plusieurs
années ou même la vie entière de l’individu [37, 38] grâce à des facteurs solubles ou des interactions
intercellulaires se trouvant dans leur environnement. Cette séquence assure donc une production maximale
d’anticorps au pic de la réponse immunitaire tout en maintenant une concentration protectrice d’anticorps dans
le sérum [39][40].
5
1.1.7 Réponse immunitaire secondaire
Comme il a été mentionné précédemment, en plus de la génération de cellules sécrétrices à la sortie du
centre germinatif, les lymphocytes B se différencient aussi en cellules mémoires. Ces dernières sont en fait
des cellules non sécrétrices, mais ayant une forte affinité pour l’antigène étant donné qu’elles ont subi les
différentes mutations somatiques dans le centre germinatif pour améliorer leur affinité. Suite à leur sortie du
centre germinatif, ces cellules demeurent en périphérie du centre germinatif ou se retrouvent dans la
circulation sanguine [41][42]. Tel que résumé à la figure 1.3, lors d’une seconde rencontre avec l’antigène, ces
cellules l’internalisent rapidement et le présente dans le contexte de leur CMH-II aux lymphocytes T mémoires
préalablement activés. Cette interaction induit la prolifération massive des lymphocytes B. Une partie de ces
cellules forme un centre germinatif (CG secondaire) comme lors de la première rencontre de l’antigène tandis
que l‘autre subit une différenciation extrafolliculaire en cellules sécrétrices d’anticorps [27].
Figure 1.3: Réponse des lymphocytes B mémoires lors de la réaction immunitaire secondaire. Image
traduite de [27], où CG est le centre germinatif et CD sont les cellules dendritiques.
1.1.8 Les populations de lymphocyte B du sang
Les lymphocytes B représentent environ 5 à 15 % des lymphocytes du sang. Ils sont caractérisés par la
présence d’immunoglobulines à leur surface qui sont les récepteurs spécifiques à un antigène. Chez l’humain,
les lymphocytes B du sang se divisent en deux sous-populations : soit les lymphocytes B naïfs (60 %) et les
lymphocytes B mémoires (40 %) [43]. Ces deux populations sont hétérogènes et se distinguent toutefois par la
6
présence de marqueurs de surface. Les B naïfs sont identifiables par leur phénotype IgD+IgM+CD27- tandis
que les B à mémoire peuvent être de type IgD+IgM+CD27+, IgD-IgM+CD27+ ou suite à un changement de
classe, IgG+/IgA+CD27+ [43]. De plus, des études ont démontré l’existence d’une sous-population,
représentant environ 20 %, de lymphocytes B à mémoire IgG+ ou IgA+, « switched-memory », n’exprimant pas
le CD27 [44]. La présence des cellules mémoires IgE est longtemps demeurée un mystère. Un modèle chez la
souris avait été proposé selon lequel, ces cellules proviendraient de la différenciation supplémentaire des
cellules mémoires IgG1+ [45]. Une étude récente a toutefois été capable de démontrer la présence de cellules
mémoires IgE+ dans le centre germinatif, dont la présence n’avait aucun lien avec des cellules IgG1+ [46, 47].
1.2 Les plasmocytes
Les plasmocytes sont au cœur de la réaction immunitaire humorale, car il s’agit des cellules sécrétrices
d’anticorps. Leurs précurseurs, les plasmablastes, sécrètent aussi des anticorps tout en gardant la capacité de
proliférer [48][49]. Dans la circulation, on retrouve très peu de ces cellules, soit environ 2/L [50]. La moitié
(49 %) des plasmocytes et plasmablastes se trouvant dans le sang ont des IgA à leur surface. La fréquence
des cellules IgM+ est de 18 % et seulement 11 % expriment les IgG. Environ 14 % des plasmocytes et
plasmablastes en circulation n’ont aucune immunoglobuline à leur surface [47, 50, 51]. La majorité des
plasmocytes se retrouvent dans la muqueuse gastro-intestinale, où 80 à 90 % des cellules sécrétrices
d’anticorps produisent des IgA tandis que le reste produit des IgM et des IgG. Ce dernier est sécrété par 0 à
2 % des cellules dans cette région [52]. En plus de la sécrétion d’immunoglobulines, il a récemment été
rapporté que les plasmocytes IgA+ des muqueuses pouvaient sécréter des molécules pro-inflammatoires telles
que le TNF- [tumor-necrosis factor-] et iNOS [inducible-nitric oxide synthase], afin d’assurer l’homéostasie
au niveau des muqueuses de l’intestin [53]. Le reste des cellules sécrétrices sont localisées dans les organes
lymphoïdes et la moelle osseuse.
1.2.1 Les immunoglobulines
Les immunoglobulines sont formées par l’assemblage de deux chaines légères de type kappa ou lambda et de
deux chaines lourdes de types , , , ou , reliées par des ponts de disulfure et donnant respectivement les
isotypes : IgG, IgA, IgM, IgD et IgE. Chez l’humain, les IgG forment environ 85 % des immunoglobulines
présentes dans le sang d’un adulte alors que les IgA et IgM composent chacun entre 5 à 10 %, le reste étant
des IgE et des IgD en quantités négligeables (<1 %) Les IgG ont une très grande affinité pour l’antigène et ont
une demi-vie de 23 jours. Les IgG peuvent être divisées en sous-classes soit IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4 où les
IgG1 sont les plus abondants [54-56]. Les IgA quant à eux sont les immunoglobulines prédominantes dans les
muqueuses. On retrouve deux sous-classes de cette immunoglobuline, soit les IgA1 et IgA2, dont la fréquence
varie selon le tissu observé [57]. La différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d’une classe
7
ou l’autre d’immunoglobuline dépend des signaux qu’ils reçoivent de leur environnement lors de leur
différenciation, que ce soit dans le centre germinatif ou dans la zone extrafollicullaire [58]. L’IL-4 est connu
pour réguler le changement de classe des lymphocytes B vers IgG1 et IgE. L’interféron- quant à lui stimule le
changement de classe vers IgG2 [59]. L’IL-21 promeut l’apparition de cellules la classe IgG1 et IgG3 [60]
tandis que l’IL-10 est un facteur important pour le changement en IgG1 et IgG2 [61]. Le changement de classe
vers IgA est favorisé par la présence de TGF  [62].
1.2.2 Le phénotype des lymphocytes B différenciés
Les lymphocytes B, les plasmablastes et les plasmocytes possèdent à leur surface plusieurs marqueurs, dont
les CD « clusters of differentiation », les molécules d’adhésion ou les récepteurs de chimiokines qui
permettent de les distinguer les uns des autres. Le phénotype des plasmocytes est souvent basé sur la
présence de CD138. À ce marqueur s’ajoute une expression élevée de CD27 et CD38 et une faible
expression de CD19 [50]. Cependant, plusieurs autres marqueurs dont CD20, CD31, CD39, CD126 et les
récepteurs de chimiokines CCR2 et CCR1 peuvent aider à les distinguer des cellules matures et des
plasmablastes [50][63][64][65]. Les méthodes de cytométrie en flux permettant la visualisation de plusieurs
marqueurs de surface en simultanée ont fait avancer nos connaissances du phénotype des plasmocytes du
sang, des organes lymphoïdes et de la moelle osseuse, mais ne permettent cependant pas encore de
distinguer les plasmocytes à courte vie des plasmocytes à longue vie. Cependant, il existe tout de même des
marqueurs intéressants pour la distinction des plasmocytes des autres populations de lymphocytes B.
1.2.2.1 CD138
Jusqu’à présent, le CD138 [syndecan-1 ou SDC-1] est l’unique marqueur de surface permettant la
reconnaissance de plasmocytes matures sains ou malins [66], bien que l’existence de plasmocytes CD138- ait
été rapportée dans la littérature [50]. Il s’agit d’un protéoglycane transmembranaire de type 1, dont la majorité
du poids moléculaire provient des molécules de sulfates d’héparane qui y sont liées. Cette molécule joue un
rôle dans l’adhésion cellulaire en provoquant une agrégation homotypique des cellules [67]. En plus de cela, le
CD138 est un facteur dans plusieurs voies de signalisation où il se lie à des facteurs liant des sulfates
d’héparane, ce qui a pour conséquence d’augmenter la disponibilité de ces molécules pour la cellule
l’exprimant. Plusieurs molécules connues comme étant importantes pour la survie ou l’engagement des
lymphocytes B dans la voie lymphoïde telles que le CXCL12, le CXCL13, l’IL-4 et l’IL-6 possèdent des
domaines de liaison aux protéoglycanes de sulfate d’héparane [68][69][70]. Récemment, il a été montré que
APRIL (A Proliferation Inducing Ligand) était aussi séquestrée par le CD138. En fait, le CD138 agirait comme
plateforme de multimérisation de cette molécule et faciliterait ainsi son cross-linking avec les récepteurs de
cette dernière [71].
8
Ces caractéristiques du CD138 assurent également la survie de plasmocytes cancéreux dans le cas des
myélomes multiples [68]. Il s’agit d’un cancer incurable caractérisé par une expansion non contrôlée des
plasmocytes au niveau de la moelle osseuse [72]. Ces cellules cancéreuses perturbent l’homéostasie de la
moelle osseuse et sécrètent diverses cytokines et facteurs solubles indispensables pour leur survie, leur
prolifération et leur rétention dans la moelle osseuse tels que l’IL-6, IGF-1 (Insulin-like Growth Factor),
TRANCE (Tumor-necrosis Factor-related-TNF-activation-induced cytokine), VEGF (Vascular Endothelial
Growth Factor), TNF, CXCL12, APRIL ou BAFF [68]. Ces molécules agissent en induisant l’activation de
diverses voies de signalisation à l’intérieur des cellules comme NFB, AKT, ou encore les MAPK [73][68].
D’ailleurs, une étude récente porte sur le diagnostic de cette maladie à travers la capacité des cellules
cancéreuses à répondre à divers stimuli par l’activation de certaines voies de signalisation [74].
1.2.2.2 CD31 et CD39
Le CD31 ou PECAM-1 (Platelet-endothelial cell adhesion molecule-1) est une glycoprotéine appartenant à la
superfamille des Ig. Il est impliqué dans plusieurs processus tels que la migration cellulaire, l’angiogenèse et
l’adhésion cellulaire [75]. Il accomplirait notamment ces fonctions par sa liaison au CD38 qui est un de ces
ligands [76]. Il a aussi été montré que cette molécule pourrait être un acteur important dans la régulation de
l’activation cellulaire induite par un antigène chez les lymphocytes [77]. Il est exprimé par les plaquettes, les
neutrophiles, les monocytes, les lymphocytes T naïfs ainsi que les cellules endothéliales [78]. Ce marqueur est
aussi retrouvé sur les lymphocytes B naïfs et les plasmocytes dans les amygdales humaines [75, 79].
Le CD39 (ENTPD1, NTDPase-1, ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1) quant à lui est une
ectoenzyme membranaire métabolisant l’ATP et l’ADP en AMP [80][81][82]. Il est retrouvé à la surface des
cellules NK (Natural Killers), de certaines sous-populations de lymphocytes T, sur des cellules dendritiques,
des macrophages ainsi que des cellules endothéliales vasculaires [82]. Chez les leucocytes, cette molécule
est connue comme ayant un rôle dans la modulation de sécrétion de cytokines, dans la réponse inflammatoire
ainsi que dans l’adhésion cellulaire [83]. Une étude menée sur les lymphocytes du sang de volontaires adultes
en santé a démontré la présence de CD39 sur 94.5 % des lymphocytes B en circulation [83].
Une autre étude menée par plusieurs groupes travaillant sur les plasmocytes a décortiqué à l’aide du
microarray, la présence différentielle d’ARN messager de plusieurs molécules exprimées par les populations
de lymphocytes B différenciés, soit les B mémoires, les plasmablastes ainsi que les plasmocytes [64]. Ces
groupes ont répertorié le niveau d’expression de plusieurs dizaines de cibles incluant des facteurs de
transcription, des marqueurs de surface, des récepteurs de chimiokines, des sélectines et des molécules
d’adhésion, des facteurs de croissance et des récepteurs de facteurs de croissance, des marqueurs
d’apoptose ainsi que des gènes liés à la réponse de protéines mal repliées (UPR, unfolded protein response).
Cette étude exhaustive a montré la présence différentielle des marqueurs de surface CD31 et CD39 dans les
lymphocytes B mémoires, les plasmablastes et les plasmocytes. L’ARNm de CD31 était en plus grande
9
quantité dans les plasmocytes comparativement aux autres sous-populations. Quant au CD39, la quantité
relative d’ARNm codant pour cette protéine était la plus élevée dans les plasmablastes [64].
Malgré l’identification de plusieurs marqueurs tels que ceux décrits ci-haut, la distinction entre les plasmocytes
à longue vie et à courte vie demeure toujours un mystère.
1.2.3 Plasmocytes à courte vie
Tel que décrit plus haut (section 1.1.6), cette sous-population de plasmocytes peut provenir de la réponse T
dépendante ou indépendante, sécrétant des anticorps ayant beaucoup ou peu d’affinité pour l’antigène. Les
plasmocytes générés lors de la réponse T-indépendante sécrètent principalement des anticorps de type IgM,
ayant peu d’affinité pour l’antigène [3][84]. Ces cellules demeurent principalement dans les ganglions
lymphatiques, près de leur lieu de formation [3]. La principale caractéristique de ces cellules est leur grande
capacité de sécrétion d’immunoglobulines. Cette grande sécrétion et donc de production de protéines induit un
stress au niveau du réticulum endoplasmique des cellules et une réponse de protéine mal repliée (UPR,
unfolded protein response) chez les cellules en activant des facteurs de transcription tels que XBP-1, ce qui
résulte en l’apoptose de la cellule [85]. Une étude récente a démontré qu’il y avait un blocage actif des
caspases apoptotiques, ce qui avait pour conséquence d’assurer la survie des plasmocytes à courte vie face à
la réponse du réticulum endoplasmique. Ce même mécanisme permet donc la régulation de la durée de vie
des plasmocytes à courte vie [86].
1.2.4 Les plasmocytes à longue vie
Une autre sous-population de cellules sécrétrices d’anticorps émerge lors de la réponse T dépendante, soit les
plasmocytes à longue vie. Le centre germinatif donnant lieu à l’émergence des cellules mémoires et des
plasmablastes, une partie de ces cellules se différencie en plasmocytes à courte vie tandis que l’autre prend la
circulation sanguine, à la recherche d’une niche où ils pourront survivre. La quantité de cellules générées de
cette population à la suite de la réaction du centre germinatif est estimée entre 10 à 20 % [35]. Ces cellules,
malgré le stress endoplasmique causé par la sécrétion pouvant aller jusqu’à 10 000 à 20 000 molécules
d’immunoglobulines par seconde, réussissent tout de même à survivre plusieurs années et parfois même,
toute la vie de l’individu [87][88]. Ainsi, les plasmocytes à longue vie continuent à sécréter des anticorps bien
après la rencontre de l’antigène afin de garder un niveau d’anticorps protecteur dans le sérum. Un bel
exemple de ce phénomène se trouve dans une étude sur le suivi de la vaccination. En effet, la persistance ans
le sang d’un niveau protecteur d’anticorps spécifiques contre le tétanos est de 11 ans, de 19 ans contre la
diphtérie et de 3013 ans pour la rougeole [37]. Plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer la capacité
de sécrétion des plasmocytes durant d’aussi longues périodes. Le modèle le plus accepté est basé sur la
compétition pour les niches de survie [37][39]. En effet, pour assurer leur survie, les plasmocytes doivent se
retrouver dans un microenvironnement spécialisé qui se trouve dans des organes précis tels que la moelle
10
osseuse. Ce type d’organe fournit au plasmocyte un nid protecteur. Étant donné que chaque nouvelle infection
menant à l’émergence de plasmocytes à longue vie génère de 10 000 à 100 000 cellules, l’espace dans la
moelle osseuse devient un facteur limitant pour la survie de ces cellules sécrétrices [15]. Ce modèle propose
donc une compétition entre les nouveaux plasmablastes et les plasmocytes résidents des niches. Les
plasmocytes ainsi dégagés se retrouvent dans la circulation sanguine et finissent par mourir, faute
d’environnement adéquat [37][15][89].
La biologie des plasmocytes soit encore peu connue, plusieurs études sont menées afin de déterminer des
marqueurs de surface propres à ces cellules ou d’autres caractéristiques qui pourraient les distinguer des
autres populations de lymphocytes B [90]. Il a récemment été rapporté que le CD28, bien qu’exprimé sur les
plasmocytes à courte et longue-vie, était un facteur important pour la survie des plasmocytes à longue vie de
la moelle osseuse [91].
Les niches permettant la survie des plasmocytes à longue vie se trouvent dans les tissus lymphoïdes associés
aux muqueuses (MALT, mucosa-associated lymphoid tissues), dans les amygdales ainsi que dans la moelle
osseuse [92][93][94]. Les plasmocytes et les niches retrouvés dans la moelle osseuse sont cependant les plus
étudiés étant donné que cet organe contient 80 à 90% de la réserve de plasmocytes dans le corps [15].
1.2.5 Niche de survie des plasmocytes
1.2.5.1 Composition des niches
La moelle osseuse est à la croisée des chemins du sang et de l’immunité [95]. Malgré qu’il s’agisse du site par
excellence où on retrouve des plasmocytes, ces cellules ne représentent pas plus de 0,5-1 % des cellules
mononuclées de cet organe [15][39][96][65][97]. Il a été démontré que la sécrétion de la chimiokine CXCL12
au niveau de la moelle osseuse avait pour cause d’attirer les plasmablastes nouvellement générés dans la
moelle osseuse [98]. La niche des plasmocytes est en fait un microenvironnement, où la synergie de plusieurs
facteurs dont les cytokines, chimiokines, et molécules d’adhésion assurent la survie de ces cellules centrales
de la mémoire immunologique humorale [99]. La composition des niches des plasmocytes est illustrée dans la
figure 1.4. Les plasmocytes de la moelle osseuse sont en contact direct avec les cellules stromales
[3][100][101] qui sécrètent la chimiokine CXCL12, dont le ligand CXCR4 est exprimé par les plasmocytes
[100]. Les plasmocytes sont aussi retrouvés à proximité dès des cellules CAR (CXCL12-abundant reticular
cells), sécrétrices de CXCL12. Les souris déficientes en CXCR4 ont une déficience dans la migration de leur
plasmablastes vers la moelle osseuse [102] ce qui démontre le rôle clé de cette chimiokine dans le
microenvironnement des plasmocytes. Il a aussi été démontré que les éosinophiles et les mégacaryocytes
faisaient également partie de la niche des plasmocytes. Le rôle de ces cellules consiste principalement en la
sécrétion des facteurs de survie tels IL-6 et APRIL. Plusieurs autres cellules telles que les ostéoclastes, les
ostéoblastes, les monocytes, les neutrophiles ainsi que les cellules épithéliales joueraient un rôle dans les
11
niches des plasmocytes de la même façon à travers la sécrétion d’IL-6, d’APRIL ou encore de BAFF
[95][103][101]. En plus de la présence de ces différents facteurs solubles, les plasmocytes possèdent à leur
surface plusieurs molécules d’adhésion telles que VLA-4 (very late activation antigen-4), LFA-1 (leukocyte
function-associated antigen-1), l’antigène CD44 ou encore PSG-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1), qui leur
permettent d’interagir avec les cellules présentes dans ce microenvironnement et d’assurer leur survie
[103][104].
Figure 1.4 Niche de survie des plasmocytes à longue vie. Cellules, CAR (CXCL12-abundant reticular cells)
cellules réticulaires sécrétrices de CXCL12; MGK : mégacaryocytes. Figure traduite de [101][103].
1.2.5.2 Principaux facteurs de survie des plasmocytes
APRIL est l’une des plus importantes molécules connues pour la survie des plasmocytes. Cette molécule de la
famille des TNF est sécrétée dans la zone sous-épithéliale des muqueuses lors d’une infection et de façon
constitutive dans la moelle osseuse où elle permet la survie des plasmocytes à longue vie [105][106]. Dans la
moelle osseuse, cette molécule est sécrétée par de nombreuses cellules, dont les cellules dendritiques, les
cellules endothéliales, les mégacaryocytes, les neutrophiles et les éosinophiles [101]. APRIL possède trois
récepteurs, soit TACI (transmembrane activator, calcium modulator and cyclophilin ligand interactor), BCMA
(B cell maturation antigen) et BAFF-R (B cell activating factor receptor) ; l’affinité de APRIL est cependant plus
faible sur BAFF-R comparativement aux deux autres récepteurs [107][108]. APRIL a aussi été rapporté
comme liant les sulfates d’héparane sur des molécules telles que le CD138 [71]. Le niveau d’expression des
récepteurs de APRIL sur les lymphocytes B varie selon le degré de maturité de la cellule et son stade de
différenciation. En effet, la progression des lymphocytes B vers l’état de plasmablaste et de plasmocyte, est
caractérisée par une diminution de l’expression de TACI et de BAFF-R à leur surface contrastant avec une
augmentation pour BCMA [108].
12
Dans le microenvironnement permettant la survie des plasmocytes, on retrouve aussi la chimiokine CXCL12
ou SDF-1 (Stromal derived factor-1) principalement produite par les cellules stromales de la moelle
osseuse, mais aussi par les ostéoblastes, les cellules endothéliales ainsi que les cellules réticulaires de la
moelle osseuse [109]. Son interaction avec son récepteur principal (CXCR4) est connue pour être importante
pour le développement des lymphocytes B, la colonisation de la moelle osseuse par les cellules souches
hématopoïétiques ainsi que leur rétention à cet endroit [110]. La sécrétion et la concentration de CXCL12 dans
cet organe sont contrôlées par le système nerveux central et suivent un rythme circadien qui permet la
libération de certaines cellules souches dans la circulation sanguine [111]. Le CXCL12 possède également
une grande affinité pour le CXCR7, mais sa liaison avec ce dernier ne semble pas induire une signalisation
menant à la migration cellulaire induite telle qu’observée lors de sa liaison avec le CXCR4 [112].
Cette survie des plasmocytes au niveau de la moelle est primordiale pour le système immunitaire humoral et
offre une protection pendant plusieurs années contre des pathogènes de toutes sortes. Leur habilité à sécréter
des anticorps sans contact supplémentaire avec l’antigène en font des cellules ressources pour la protection
des personnes immuno-supprimées.
1.3 Les plasmocytes et la thérapie cellulaire
1.3.1 Greffe de cellules souches hématopoïétiques
La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est une intervention médicale consistant en
l’injection intraveineuse de cellules souches autologues ou allogéniques à un receveur. Indiqué autant chez
les enfants que les adultes, ce traitement permet le rétablissement du système hématopoïétique chez les
patients dont le système serait endommagé ou absent. Les cellules utilisées peuvent provenir de la moelle
osseuse, du sang de cordon ombilical ou de la mobilisation de CSH dans la circulation sanguine [113]. En fait,
la majorité des transplantations de cellules souches hématopoïétiques sont réalisées avec des cellules
mobilisées, car elles induisent une meilleure reconstitution immunitaire en plus de faire appel à l’aphérèse
comme processus de prélèvement, ce qui est moins invasif. [114]. Le G-CSF est injecté au donneur
allogénique ou au patient 4 à 5 jours précédents le prélèvement [109] et peut augmenter la quantité de CSH
dans la circulation sanguine de 44 fois [115]. Le G-CSF peut activer simultanément le système nerveux central
et les macrophages de la moelle osseuse qui agiront de concert pour diminuer la sécrétion de CXCL12 dans
la moelle osseuse [109]. Il peut aussi induire le clivage de CXCL12 et d'autres molécules d'adhésion par des
protéases produites par des neutrophiles de la moelle osseuse activés par le G-CSF [116]. Cette action libère
les CSH et induit aussi leur prolifération.
Avant la transplantation des CSH, le receveur peut subir plusieurs traitements permettant de réduire les
risques de développement de la maladie du greffon contre l’hôte, le rejet de la transplantation ou encore
l’éradication de la maladie pour laquelle la transplantation a lieu. Ces traitements consistent notamment en
13
l’irradiation complète du patient, en administration de médicaments chimiothérapeutiques ou les deux en
même temps [117].
1.3.2 Les applications de la transplantation
La transplantation de CSH est indiquée principalement pour le traitement de maladies hématologiques. Les
transplantations autologues sont indiquées pour des maladies telles que les myélomes multiples, les
lymphomes hodgkiniens et non-hodgkiniens, la leucémie myéloïde aigue ou encore les neuroblastomes. Les
transplantations allogéniques peuvent être aussi effectuées dans les maladies précédentes en plus des
leucémies lymphatiques chroniques, d’anémie aplasique, de thalassémie, d’anémie drépanocytaire ou de
désordres génétiques [113][118]. Le traitement est aussi indiqué pour les tumeurs solides telles que le cancer
des testicules [119]. Une étude internationale d’envergure a révélé qu’il y a eu 50 417 transplantations en
2006, dont 43 % étaient des transplantations allogéniques et 57 % autologues. La majorité (54 %) des
interventions effectuées était pour le traitement de désordres lymphoprolifératifs. Les leucémies représentaient
34 % des interventions alors que le traitement de tumeurs solides représentait 6 % des cas [113].
1.3.3 La reprise de greffe et la reconstitution du système immunitaire
Suite à la transplantation, les CSH doivent migrer vers la moelle osseuse du receveur. Ce processus implique
plusieurs molécules dont les intégrines 4 et 5, le CD44 ainsi que le CXCL12 et son ligand CXCR4 [120]. Une
fois ce processus complété, la régénération du système hématopoïétique peut débuter. Selon la source des
CSH (moelle osseuse, sang de cordon, sang périphérique), le délai de régénération des sous-populations
cellulaires peut varier [121]. Dans le cas des cellules du système immunitaire inné, les neutrophiles sont les
premières cellules à apparaitre, environ 14 jours après la transplantation de CSH du sang, 21 jours après la
transplantation de cellules de la moelle osseuse et environ 30 jours suite à la transplantation de cellules de
sang de cordon. La reconstitution totale des cellules NK (Natural Killers) a lieu 1 à 2 mois après la
transplantation [118]. Les monocytes et les macrophages font ensuite leur apparition durant la même période
[121]. Dans le cas de transplantations de cellules provenant du sang de cordon, la reconstitution des
lymphocytes T peut prendre de 9 à 12 mois tandis que celle des lymphocytes B va de 3 à 6 mois [122].
La lymphopoïèse des cellules B requiert un environnement spécialisé, qui est souvent influencé dans la
maladie du greffon contre l’hôte ou par les traitements pour contrer cet état [123]. D’ailleurs, la reconstitution
complète de ces cellules peut prendre de 1 à 2 ans suivant la transplantation [121]. La présence d’anticorps
du receveur plusieurs années après la transplantation de CSH a toutefois permis de prouver la capacité de
chimio-radiorésistante des plasmocytes, plus précisément ceux résidents dans la moelle osseuse [124][125].
Ce sont ces plasmocytes qui sont à l’origine de la proportion de cellules observée à la figure 1.5.
14
Cellules immunitaires
(% du compte normal)
- Neutrophiles, monocytes,
cellules NK
- Cellules T CD4+
- Cellules B, T CD8+
- Plasmocytes, cellules
dendritiques
Transplantation
Semaines
Mois
Années
Figure 1.5 Reconstitution des cellules immunitaires après une transplantation de CSH. La quantité
approximative des populations cellulaires est exprimée comme le pourcentage du compte cellulaire normal
avant la transplantation et avant la radiation complète du patient. Figure traduite de [121].
1.3.4 Problèmes post-transplantation et vulnérabilité aux infections
Une fois la transplantation effectuée, plusieurs problèmes peuvent survenir, dont le développement de la
maladie du greffon contre l’hôte, une rechute dans les cas de cancer ou encore des infections. La moitié des
décès suivant une transplantation provenant de sang de cordon sont dus à des infections [126]. Dans les cas
où il y a irradiation du patient avant la transplantation, cela peut endommager les surfaces des muqueuses du
patient et donc laisser place à la libération de pathogènes commensaux dans la circulation sanguine [118].
Dans les 100 premiers jours suivant la transplantation, les patients sont surtout victimes d’infections virales et
fongiques [117]. Pour ce qui est de l’immunité humorale, l’absence de lymphocytes B mémoires et
d’immunoglobulines spécifiques expose les patients à des infections par des pathogènes tels que le
Streptococcus pneumonia ou encore Haemophilus influenzae [117]. Les patients greffés sont donc
vulnérables et plusieurs moyens sont envisagés afin de leur procurer une meilleure protection immunitaire.
1.3.5 Traitement des problèmes post-transplantations
Plusieurs traitements post-transplantation de thérapies cellulaires ont été développés durant les dernières
années. Beaucoup de ces thérapies consistent en l’expansion ex vivo de cellules immunomodulatoires telles
que les cellules T régulateurs (Treg), les cellules NK/ Treg, les cellules NK provenant du donneur, les cellules
souches mésenchymateuses ou encore au transfert de cellules T spécifiques à un antigène viral ou tumoral.
Tous ces traitements visent l’amélioration de la reconstitution immunitaire ainsi que la protection face aux
infections [117]. Dans le cadre des transplantations de CSH du sang de cordon, une thérapie consistant en
15
l’injection de lymphocytes T provenant du sang de cordon a été proposée [127]. Les lymphocytes T mémoires
sont aussi des ressources intéressantes pour la prévention des infections. Ces cellules sont expansionnnées
in vitro en présence de cellules présentatrices d’antigènes ayant internalisé l’antigène spécifique pour laquelle
les cellules mémoires sont spécifiques. Ces cellules une fois injectées au patient suite à la transplantation,
aident à la protection contre les infections de cytomégalovirus, du virus Epstein-Barr ou encore d’adénovirus
[128]. Étant donné que la quantité de lymphocytes T mémoires dans le sang de cordon est assez faible, cette
thérapie n’est pas la plus appropriée. Des études sont présentement en cours pour induire l’activation in vitro
de cellules T naïves provenant de cette source, afin de réduire les risques d’infections chez les patients [129].
Dans le cas des transplantations effectuées pour le traitement des leucémies, le risque de rechute peut être
diminué par l’utilisation de lymphocytes T génétiquement modifiés pour être dirigés vers les cellules tumorales
[130].
1.3.6 Introduction des plasmocytes générés in vitro
Les lymphocytes B sont les cellules au coeur de l’immunité humorale. Tel que vu précédemment, leur
reconstitution peut nécessiter plusieurs mois, ce qui expose les patients à plusieurs dangers. Lorsqu’un
régime pré-transplantation exigeant une irradiation est nécessaire, cela entraîne la perte des lymphocytes en
périphérie ainsi que la mémoire immunologique du patient. La plupart des thérapies développées jusqu’à
présent servent principalement à la reconstitution des lymphocytes T pour le rétablissement de l‘immunité
cellulaire. L’introduction de cellules procurant une immunité humorale pourrait être un traitement
supplémentaire administré aux patients afin de les aider à combattre les infections. Par ailleurs, une étude
menée par le groupe du Dr Klein a démontré que la mobilisation de CSH de la moelle osseuse vers le sang
périphérique à l’aide du G-CSF [115] induit aussi une mobilisation des plasmocytes de cet organe. Ces
cellules étaient de phénotype CD38hi, dont seulement 38% exprimaient le marqueur CD138 et leur quantité
dans la circulation sanguine était de 6 fois supérieure à la normale suite à un traitement avec le G-CSF.
Sachant qu’un individu en santé possède environ 1x109 plasmocytes, la quantité de cellules ainsi mobilisée et
injectée au receveur représenterait seulement 3% de son nombre initial de plasmocytes. Les auteurs de cette
étude suggèrent tout de même que ces cellules pourraient se réfugier dans la moelle osseuse du patient et
contribuer à la reconstitution de sa mémoire immunologique humorale [115]. Cette observation ouvre une voie
vers une thérapie qui serait principalement basée sur l’utilisation de plasmocytes générés in vitro, qui
pourraient être injectés au patient au moment de la transplantation, comme il se fait naturellement lors des
transplantations de cellules souches mobilisées. Ces plasmocytes obtenus de la différenciation de
lymphocytes B mémoires du patient pourraient sécréter des anticorps provenant de sa propre mémoire
immunologique.
16
L’équipe de Dr Sonia Néron travaille actuellement au développement d’un microenvironnement in vitro
permettant l’expansion et la différenciation de lymphocytes B mémoires provenant de donneurs en santé en
plasmocytes sécréteurs d’immunoglobulines. À la lumière des observations de Caraux et coll, il était logique
de proposer d’utiliser ce microenvironnement pour la préparation ex vivo de plasmocytes pour les patients
greffés.
1.4 Modèles de culture développés jusqu’à présent
La culture in vitro de lymphocytes B est pratiquée depuis plusieurs années. Plusieurs équipes ont élaboré des
systèmes de culture permettant leur différenciation in vitro en cellules sécrétrices d’anticorps
[65][131][132][133][134]. Dans la majorité des cas, il s’agit d’une combinaison de cytokines ainsi que
l’implication de l’interaction CD40-CD154 (revue par Néron et coll., 2011) [135] . Les cytokines utilisées sont
principalement les interleukines 2, 4, 6, 10, 12, 15, 21 et l’IFN-. Ces modèles en une [131], deux [65] ou trois
phases [134][133] permettent la génération de plasmablastes et de plasmocytes. Toutefois, aucun de ces
systèmes de culture in vitro ne permet une grande expansion des cellules ni le maintien de la culture au-delà
d’une dizaine de jours.
Une seule étude a récemment décrit la génération de plasmocytes à longue vie à partir de lymphocytes B
mémoires [132]. Le système de culture développé par cette équipe consistait en la mise en culture de cellules
B mémoires dans un milieu additionné d’IL-21, d’anti-IgM et IgG en présence de cellules CD154+ pendant 3
jours. À la suite de cette étape, les cellules-supports étaient retirées et les lymphocytes B étaient cultivés dans
un milieu additionné d’IL-2, d’IL-21, de facteur de croissance pour hybridome (HybridoMax) pendant 3 jours.
Pour le reste de la culture des cellules B, un milieu composé d’IL-6, d’IL-21 d’IFN- en présence d’une lignée
de cellules stromales était utilisé. La première phase de ce système de culture avait pour but d’activer les
lymphocytes B, la deuxième d’induire leur différenciation tandis que la troisième permettait la survie des
plasmocytes générés.
1.5 Expansion et différenciation in vitro de lymphocytes B
humains
1.5.1 Interaction CD40-CD154
L’interaction entre les molécules CD40 et CD154 est importante pour l’activation des lymphocytes B naïfs ainsi
que celle des cellules mémoires. Son utilisation in vitro a été introduite par Banchereau et coll en 1991 et
depuis, c’est l’interaction la plus utilisée pour l’activation in vitro de lymphocytes B [136]. Plusieurs études ont
été menées en utilisant cette interaction cellulaire sous différentes formes, soit à travers des lignées cellulaires
exprimant le CD154, des anticorps anti-CD40, des membranes cellulaires CD154+ ou encore la molécule
CD154 recombinante [135].
17
L’équipe du Dr Néron a démontré que l’interaction entre les molécules CD40 et CD154 agissait comme un
rhéostat sur la régulation de l’activation lymphocytes B suite à une réponse immunitaire primaire ou
secondaire [47][48] Brièvement, une forte interaction CD40-CD154 (environ 5000 à 10 000 molécules de
CD154 par lymphocyte B) favorise la prolifération plus importante des lymphocytes B naïfs (CD27-, IgM+IgD+),
tandis qu’une faible interaction (500 à 1000 molécules CD154 par lymphocyte B) favorise plutôt la prolifération
et la différenciation des cellules naïves et à mémoire (CD27+, IgG+IgA+) [48]. Ce modèle de culture est basé
sur l’interaction entre les lymphocytes B venant du sang périphérique et d’une lignée cellulaire adhérente
(L4.5) exprimant le CD154 [137]. Ce modèle a permis la mise au point de conditions permettant une grande
expansion de lymphocytes B mémoires provenant du sang de participants en santé. La forte interaction entre
les lymphocytes B et la lignée cellulaire CD154+ ainsi que la présence des interleukines 2, 4 et 10 permettent
une expansion de 1x106 après 50 jours de culture. Les cellules générées par cette expansion secrètent des Ig
polyclonaux et la distribution des sous-classes est proportionnelle à celle retrouvée dans le sérum humain
[138]. De plus, les travaux de maîtrise de Josiane Tremblay-Rochette ont permis le criblage de plusieurs
facteurs solubles permettant d’induire une différenciation des cellules B ainsi expansionnées, en contact avec
une faible interaction avec CD154. Il s’est révélé que c’était la combinaison de l’IL-6 et IL-10 qui induisait la
meilleure différenciation des lymphocytes B mémoires en plasmocytes [139]. Ces cytokines sont donc à la
base de la phase de différenciation in vitro.
1.5.2 Interaction CD27-CD70
L’interaction cellulaire entre CD27 et CD70 est aussi impliquée dans la différenciation cellulaire in vivo et est
étudiée également in vitro [29][140][141]. CD27 est habituellement présent sur les lymphocytes B mémoires et
CD70 est présent sur les lymphocytes T activés et peut aussi être présent sur les lymphocytes B activés [142].
Le groupe de Avery et coll. a également observé que cette interaction augmentait la génération de
plasmocytes in vitro [143]. De plus, la culture simultanée de cellules B naïves (CD27-) et mémoires (CD27+)
activées en présence de l’interaction CD40-CD154 a permis de montrer que ces deux sous-populations
avaient une réponse différentielle des cellules naïves et mémoires par rapport à l’interaction avec CD154 [63].
Une étude ciblant l’interaction entre CD27 et CD70 a montré que les deux populations cellulaires avaient en
fait la capacité de s’influencer via la liaison entre les cellules naïves CD70 + qui poussaient les cellules B
mémoires CD27+ à se différencier [144]. De plus, la forte expression de CD27 sur les plasmocytes indique un
rôle potentiel de cette protéine au niveau de la différenciation ou de la survie cellulaire, suite à son interaction
avec son ligand, le CD70 [50]. Un microenvironnement favorable aux plasmocytes pourrait donc inclure une
interaction entre CD27 et CD70.
18
2. Hypothèse
Il serait possible de différencier des lymphocytes B mémoires en plasmocytes en contrôlant leur
microenvironnement de culture in vitro.
19
3. Objectifs
1. Comparer l’effet des interactions CD40-CD154 et CD27-CD70 sur la différenciation des lymphocytes
B afin de déterminer si la liaison CD27-CD70 serait un meilleur choix.
2. Dans les conditions établies, optimiser la viabilité cellulaire par l’utilisation de facteurs de survie.
3. Procéder à la caractérisation des plasmocytes générés in vivo.
21
4 Méthodologie
4.1 Cellules humaines
4.1.1 Participants à l’étude
La trentaine de participants de cette étude ont signé un consentement éclairé. Le processus de recrutement,
le protocole de recherche et les formulaires de consentement étaient tous approuvés par le comité d’éthique
de recherche d’Héma-Québec.
4.1.2 Les cellules mononuclées du sang
Lors du don de plaquettes, celles-ci sont récoltées avec des instruments d’aphérèse (Trima Accel, Gambro
BCT, Lakewood, CO, É.-U.) et sont leucoréduites pendant la procédure. Les leucocytes sont en fait retenus
dans une chambre de leucoréduction qui est utilisée afin d’isoler les cellules mononuclées du sang (PBMC,
peripheral blood mononuclear cells) [145]. Après le processus, les chambres de leucoréduction ont été
gardées à température pièce jusqu’à la récupération des PBMC. Pour l’isolement, les chambres ont été vidées
de leur contenu et rincées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) composée de 10 mM de
K2PO4, 136 mM de NaCl (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), 8 g/L de glucose (Sigma Aldrich, Oakville, ON,
Canada) additionnée de 10 % d’ACD (acid–citrate-dextrose) (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, É.-U.),
soit le PBS-Glucose avec ACD. Pour chaque chambre, un volume de rinçage de 45 mL était injecté avec une
seringue de 60 mL et une aiguille de taille 22. La suspension de PBMC a ensuite été déposée sur un coussin
de Ficoll-Hypaque (GE HealthCare Biosciences, Baie-d’Urfé, QC, Canada) et a été centrifugée pendant 8 min
à 1000 g sans frein. L’interface composée des cellules mononuclées du sang a ensuite été récupérée, lavée
avec du PBS-glucose sans ACD et les cellules ont été mises en suspension à 100x106 cellules/mL dans du
milieu de congélation composé à 50 % d’IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s medium), 40 % de FBS (fœtal
bovin sérum) (tous les deux d’Invitrogen) et à 10 % de DMSO (diméthysulfoxyde) (Sigma-Aldrich) et
congelées à -80 °C dans un système de congélation CoolCell LX (Biocision, Mill Valley, CA, É.-U.) pour être
transférées ensuite dans de l’azote liquide.
4.1.3 Lymphocytes B mémoires IgG+, IgA+, ou IgE+
Pour l’isolement des lymphocytes B mémoires à partir des PBMC, deux étapes de sélections négatives sont
nécessaires. Les PBMC ont rapidement été décongelés en les déposant goutte à goutte dans une solution de
PBS contenant 50 % de FBS. Cette suspension cellulaire a ensuite été centrifugée à 1000g pendant 6 min.
Les cellules ont été remises en suspension dans du PBS-glucose contenant 2 % FBS à une concentration de
23
5x107 cellules/mL. La trousse d’isolement de lymphocytes B humains (B cell Enrichment kit) (Stem Cell
Technologies, Vancouver, CB, Canada) a ensuite été utilisée selon les directives de la compagnie. Une fois
les cellules B isolées, elles ont été congelées selon le même protocole que les PBMC.
Cette banque de cellules B CD19+ a été utilisée pour l’isolement de lymphocytes B mémoires au début de
chaque culture. La décongélation a été faite de la même manière que pour les PBMC. Les lymphocytes B
mémoires IgG, IgA et/ou IgE ont été isolés grâce à une trousse de sélection négative permettant d’enlever les
cellules B exprimant des IgD ou IgM de surface et faite sur mesure par StemCell Technologies pour les
besoins de notre laboratoire. L’ensemble de ces étapes a généré une population de lymphocytes B mémoires
d’une pureté supérieure à 90 % composée à 60 % de cellules IgG+ et 40 % de cellules IgA+ et pouvant
contenir des cellules IgE+ [138].
4.1.4 Les cellules mononuclées de la moelle osseuse
Cinq échantillons de cellules mononuclées humaines de la moelle osseuse ont été achetés chez Lonza
(Walkerville, MD, É.-U). Une fois décongelées selon le processus décrit à la section 4.1.3, elles ont été mises
en suspension dans le milieu IMDM additionné de 10 % de FBS faible en IgG (Gibco, Life Technologies)
pendant une nuit avant les essais.
4.2 Les lignées cellulaires humaines
4.2.1 Les cellules 3H7 et L4.5
Les 3H7 et L4.5 sont des cellules adhérentes utilisées comme cellules-supports dans le système de culture. Il
s’agit de la lignée cellulaire de fibroblaste murin L929 (CCL-1, American Type Culture Collection, Manassas,
VA, É.-U.). Dans le cas des 3H7, la lignée a subi une modification génétique lui permettant l’expression
constitutive du CD70 humain [144]. Pour ce qui est des L4.5, une procédure de transfection a permis
l’expression constitutive du CD154 murin, qui possède une très grande homologie avec la molécule humaine
et est capable d’interagir avec un ligand d’origine humaine [137]. Les 3H7 utilisées en culture cellulaire
exprimaient en moyenne 25 000 molécules CD70 par cellule tandis que les L4.5 possédaient 21 000
molécules CD154 par cellule [48]. Ces lignées ont été cultivées dans un milieu IMDM 5 % FBS. Lors des
cultures de lymphocytes B, elles étaient irradiées avec 7500 rad à l’aide d’un irradiateur  GammaCell 1000
Elite au 137Cs (Nordion International, Kanata, ON, Canada).
4.2.2 Ramos, RPMI-8226, U266, Jurkat
Les lignées Ramos, RPMI-8226 et U266 (toutes de l’American Type Culture Collection) ont été cultivées dans
le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Invitrogen) contenant 10 % de FBS. Les cellules Jurkat
24
(American Type Culture Collection) ont été cultivées dans ce même milieu contenant en plus 1mM de pyruvate
de sodium (NaPyr) (Invitrogen). Les comptes cellulaires et mesures de la viabilité ont été faits avec le bleu de
trypan et à l’aide d’un hématimètre.
4.3 Culture de lymphocytes B humains
4.3.1 Expansion des lymphocytes B
Les cellules CD19+IgA+, CD19+IgE+ et/ou CD19+IgG+ ont été mises en culture avec la lignée L4.5 à raison de
2-3x106 cellules/mL dans des plaques 6 puits Primaria (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada) en
présence de 4-6x105 cellules/mL de L4.5 (CD154+) irradiés, comme rapporté récemment [138]. Cette coculture
correspond à un ratio 1:5 de lymphocytes B par L4.5. Pour l’expansion des cellules, le milieu de culture utilisé
était composé d’IMDM supplémenté à 10 % de FBS faible en IgG, de 10 g/mL d’insuline, 5.5 g/mL de
transferrine, de 6.7 ng/mL de sodium de sélénite (tous provenant de chez Invitrogen). Un mélange de
cytokines développé par l’équipe du Dr Néron [138] a aussi été ajouté au milieu de culture des cellules. Il s’agit
d’IL-2 à 5 ng/mL (environ 50 U/mL), d’IL-10 à 40 ng/mL (environ 20 U/mL) (tous les deux ont été obtenus de
chez PeproTech, Rocky Hill, NJ, É.-U.) et d’IL-4 à 3,5 ng/mL (environ 100 U/mL) (R&D Systems, Minneapolis,
MN, É-U.).
Dans le cadre des cultures de lymphocytes B, le milieu était renouvelé tous les 2 à 3 jours en remplaçant la
moitié du volume dans lequel baignait les cellules par du milieu frais. Les cellules-supports quant à elles
étaient changées tous les 4 à 5 jours. À chacune de ces étapes, une partie du surnageant de culture était
conservé stérilement à 4 C. Lorsque la quantité de cellules d’un donneur était supérieure à 5x106 cellules, les
cellules étaient cultivées dans des pétris 100x20mm (BD Biosciences) à 3x105 cellules/mL.
Cette première phase de culture a permis d’obtenir de grandes quantités de lymphocytes B mémoires. Après
19 jours de culture, les cellules étaient congelées, comme décrit à la section 4.3.1. Des banques de cellules B
mémoires ont ainsi été créées pour les essais de différenciation.
4.3.2 Transition
Les travaux de maitrise de Josiane Tremblay Rochette ont démontré l’importance de la phase de transition
entre l’étape d’expansion et de différenciation des lymphocytes B [139]. La première partie de cette phase de
transition consistait à décongeler les lymphocytes B et les mettre en culture à 3x105 cellules/mL avec 1,5x104
cellules/mL de cellules L4.5 ce qui correspond à un ratio de 1 cellule support pour 20 cellules B. Lors de cette
étude nous avons également utilisé la lignée 3H7 (CD70+) à ce même ratio. La composition du milieu de mise
en culture était le même que lors de la phase d’expansion. Le jour de décongélation des cellules correspond
au jour 0 de la phase de différenciation. La deuxième partie de cette étape consistait à introduire de l’IL-6 dans
25
le milieu de renouvellement après 2-3 jours de culture. Il s’agit du milieu habituel supplémenté à 12.5 ng/mL
d’IL-6 (Peprotech). Cette phase de transition dure ainsi 4-5 jours.
4.3.3 Différenciation des lymphocytes B
Après 4-5 jours de la phase de transition, les cellules supports ont été renouvelées et les cellules ont été
remises en suspension dans un milieu contenant uniquement de l’IL-6 à 12.5 ng/mL et IL-10 à 40 ng/mL. Cette
combinaison de cytokine a pour effet d’induire une meilleure différenciation des lymphocytes B [139].
4.3.4 Survie des lymphocytes B et des plasmocytes
Les facteurs solubles APRIL (R&D Systems, Minneapolis, MN, É.-U.), CXCL12 (Peprotech) et Insulin-like
growth factor-long R3 (IGF-R3) (SAFC Biosciences, Lenaxa, KS, É.-U.) ont été testés à différentes
concentrations sur les cellules B lors de la phase de différenciation. Ces molécules ont été combinées au
mélange de cytokine de base dans cette phase de culture, soit IL-6 et IL-10. Leur introduction dans le milieu
de culture se faisait en même temps que l’IL-6, soit au premier renouvellement de milieu des cellules.
4.3.5 Système de culture des lymphocytes B mémoires
Le système de culture établi comporte plusieurs phases telles qu’illustrées à la figure 4.1. Dans le cadre de
cette étude, lors de la présentation des résultats, sauf indication contraire, le jour 0 correspond au jour de
décongélation des lymphocytes B obtenus suite à la phase d’expansion pour les mettre dans leur
environnement de différenciation.
IL-2-4-6-10
L4.5 ou 3H7
IMDM 10 % FBS
AN
SI
TI
O
N
IL-2-4-10
Ratio 1:5 L4.5
IMDM 10 % FBS
DIFFERENCIATION
TR
EXPANSION
IL-6-10
L4.5 ou 3H7
IMDM 10 % FBS
J0
J19
J0
J5
J14
Figure 4.1 Système de culture des lymphocytes B mémoires. Les cellules sont expansionnées pendant 19
jours, congelées et conservées dans de l’azote liquide jusqu’aux essais de différenciation. Tel qu’indiqué,
différentes combinaisons d’interleukines et de ratio de cellules-support sont utilisées dans chacune des
phases.
26
4.4 Mesure de la sécrétion d’immunoglobulines
4.4.1 ELISA
Les concentrations d’IgG et d’IgA dans les surnageants de sécrétion ont été déterminées par enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA). Les dosages d’IgA ont été effectués dans des plaques Immulon-2 à fond plat
(Thermo Scientific, Rockford, IL, É.-U.) tandis que les dosages d’IgG étaient réalisés dans des plaques à fond
rond (Thermo Scientific). Tous les anticorps utilisés provenaient du laboratoire Jackson Immunoresearch
Laboratories (West Grove, PA, É.-U.). Un volume de 100 µL (IgA) ou de 50 µL (IgG) par puits a été déposé
pour les trois couches ELISA alors que le blocage était effectué dans un volume de 200 µL (IgA) ou 150 µL
(IgG). À moins d’indication contraire, toutes les incubations ont été faites pendant 1 heure à 37 C. Au terme
de chaque incubation, les puits étaient lavés 6 fois avec une solution d’eau contenant 0,10 % de Tween
(Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada) à l’aide du laveur automatique ELx405 Auto Plate Washer (Bio-Tek
Instruments inc., Winoosky, VT, É.-U.).
L’anticorps de capture était constitué d’anticorps de chèvre spécifique aux IgG (2.5 µg/mL) ou aux IgA
(0.3 µg/mL). Ces anticorps étaient dilués dans du tampon carbonate 100 mM pH9.6 (3.28 g/L Na2CO3 et
7.08 g/L NaHCO3 (tous de chez Sigma Aldrich). Les plaques ont été scellées et mises à 4 C pendant toute la
nuit. Lors de la journée d’ELISA, les plaques ont été lavées et bloquées avec une solution composée de PBS,
de caséine à 0.25 % p/v et de Tween 20 à 0,05 % (tous deux de Fischer Scientific). Cette solution a aussi
servi comme diluant tout au long des ELISA. Après le blocage, les échantillons des surnageants des cellules B
cultivées ont été préparés en dilution sérielle avec la solution de PBS-Caséine-Tween. Les standards ont été
préparés en utilisant un sérum humain calibré de Binding Sites (San Diego, CA, É.-U.) dans un intervalle de 0
à 20 ng/mL pour les IgA et de 0 à 100 ng/mL pour les IgG. La solution de PBS-Caséine-Tween seule a été
utilisée comme contrôle négatif et une solution d’IgA ou d’IgG purifiés (Sigma-Aldrich) a été utilisée comme
contrôle interne. La révélation a été faite à l’aide d’un anticorps de chèvre spécifique aux chaines lourdes et
légères des IgA, IgG et IgM, couplé à la peroxydase à une dilution de 1/10 000 pour les deux classes
d’immunoglobulines. Le tétraméthylbenzidine (TMB) (Scytek Laboratories, Logan UT) a été utilisé comme
substrat. Il a été ajouté dans les puits à température pièce pendant 12 à 17 min. Cette réaction a ensuite été
arrêtée par l’ajout de H2SO4 1N et les densités optiques ont été mesurées à une longueur d’onde de 450 nm et
une référence de 650 nm avec le lecteur de plaque ELISA MRW 386-4RD (Dynatech laboratories, Billinghurst,
Royaume-Uni).
4.4.2 Essai BioPlex
Le dosage simultané des immunoglobulines IgA, IgG1, IgG2, IgG3 IgG4, IgM et IgE dans les surnageants
cumulés aux jours 5 et 14 de la phase de différenciation a été fait à l’aide de la trousse Bio-Plex Pro human
27
Isotyping Kit selon les instructions du manufacturier (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). L’essai a été effectué dans
un plateau Immulon-2HB fond plat et les lavages ont été faits à la main à l’aide d’une plaque 96 puits
magnétique. Brièvement, les puits étaient remplis de solution de lavage et déposés sur la plaque aimantée
pendant 2 min pour l’adhérence des billes magnétique au fond des puits et le surnageant était prélevé en
maintenant le plateau Immulon sur la surface aimantée. Les étapes d’incubation en agitation ont été faites sur
un agitateur Innova 4000 (New Brunswick Scientific, Enfiel, CT, É.-U.). Le milieu IMDM composé de 10 % de
FBS faible en IgG a été utilisé pour la dilution des échantillons ainsi que comme contrôle négatif. La suite de
l’essai a été effectuée en suivant les instructions du manufacturier. La lecture du plateau a été réalisée avec le
Luminex IS 100 Instrument (Luminex, Austin, TX, É.-U.)
4.4.3 ELISPOT
La proportion de cellules sécrétrices d’IgG a été déterminée par un enzyme-linked immunosorbent spot
(ELISPOT) standard [63]. Les essais ont été effectués sur des plaques à filtre multiscreen stériles MilliPore
(EMD MilliPore, Billerica, MA, É.-U.). Les anticorps utilisés sont les mêmes qu’à la section 4.4.1 et ont été
utilisés à la même concentration. Au terme de chaque incubation, les puits étaient lavés 6 fois avec une
solution de saline (0.85 %) à l’aide d’un flacon laveur. À moins d’indication contraire, toutes les incubations ont
été effectuées à 37 °C.
Les plaques ont été activées en y déposant 17 µL par puits d’éthanol 70 % et rincées 3 fois avec 150 µL de
PBS 1mM avant l’évaporation de l’éthanol. Les plaques ont ensuite été incubées avec l’anticorps de capture
durant toute la nuit. Le blocage de la plaque a été fait sur 2h avec 150 µl/puits d’IMDM contenant 10 % de
FBS faible en IgG. Ce milieu servait aussi de diluant pour les échantillons ainsi que de contrôle négatif. Les
cellules ont été lavées une fois avec du PBS-Glucose (centrifugation à 1000 g pendant 6min) et préparées
pour obtenir une densité de 10 000 à 350 000 cellules dans la première dilution. Les dilutions sérielles 1 : 2 ont
été préparées en tube et les cellules déposées dans un volume de 100 µl. Les cellules ont été incubées suite
à cette étape à 37 °C 5 % CO2 pendant 18h. La révélation a été faite telle que décrite pour l’ELISA en diluant
l’anticorps de révélation dans du PBS contenant 1 % caséine (ICN Biomedicals, Irvine, CA, É.-U.) et en
l’incubant pendant 2h. Le True Blue (KPL, Gaithersburg, MD, É.-U.) a été utilisé comme substrat de la
peroxydase et a été incubé durant 20 min à la température de la pièce (TP). La visualisation et le compte des
taches de sécrétion ont été faits à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 25X.
4.5 Cytométrie en flux
4.5.1 Marquage extracellulaire
Le marquage extracellulaire des cellules a permis de suivre le phénotype des cellules tout au long des
cultures. Tous les anticorps utilisés étaient des monoclonaux de souris couplés à des molécules fluorescentes
28
et étaient utilisés à une concentration de 1g/106 cellules. À moins d’indications contraires, toutes les
incubations ont été effectuées à la noirceur et à température pièce. Les anticorps ciblant le CD3 couplé à
l’APC et le CD38 couplé au PCP-Cy5.5 provenaient tous deux de chez BD (BD Biosciences). Les anticorps
ciblant le CD19 couplé au PE-Cy7, CD70 et CD126 couplé au PE provenaient de Pharmingen (BD
Biosciences). Les anticorps ciblant le CD27 couplé à l’APCefluor, CD31 couplé au FITC, CD38 et CD267 (antiTACI) couplés au PE, CD39 couplé au PCP-efluor 710 et CD184 (CXCR4) couplé au PE-Cy7 provenaient de
eBioscience. L’anti-CD45 couplé au Krome Orange provenait de chez Immunotech (Vaudreuil-Dorion, Qc,
Canada) alors que l’anti-CD138 couplé au Alexa efluor 647 provenait de chez AbD Serotec (Raleigh, NC, É.U.). L’anti-CD269 (anti-BCMA) couplé au PE quant à lui provenait de VWR (Mississauga, ON, Canada).
Pour chaque test, environ 1x106 cellules ont été lavées avec du PBS-glucose et centrifugées à 1000 g
pendant 6 min et mises en suspension dans 100 L d’une solution de PBS-1% (v/v) contenant FBS-0.01%
(v/v) NaN3. Les cellules ont ensuite été incubées avec 10ng/mL de Pacific Blue (Molecular Probes, Life
Technologies) pendant 30 min dans l’obscurité après quoi elles ont été lavées avec la solution de PBS-FBSNaN3 et mises en suspension dans cette même solution à raison de 100 l de cellules par test. Elles ont par la
suite été mélangées aux anticorps et incubées pendant 15 à 30 min. La fixation a été faite avec une solution
de formaldéhyde 2 % (Sigma Aldrich) et suivie d’une étape de lavage après quoi les cellules ont été mises en
suspension dans 1,2 mL de PBS-FBS-NaN3 et conservées à 4 °C jusqu’à l’acquisition des données avec le
cytomètre, soit 18 à 20h suivant le marquage.
Dans le cas des marquages des cellules de moelle osseuse, les cellules ont été mises en suspension dans
une solution de PBS-FBS-NaN3 contenant 0.001 mM de Sytox Blue (Molecular Probes, Life Technologies),
afin d’exclure les cellules mortes. Ces cellules n’ont pas été fixées et l’acquisition au cytomètre a été faite
immédiatement après le marquage.
Des billes de compensation Compbeads (BD Biosciences) ont été préparées avec des témoins isotypiques de
souris (IgG1) pour les fluorochromes non couplés en tandem (FITC, PE, APC) ou aux anticorps anti-CD19,
anti-CD39, anti-CD138, anti-CD27 ou anti-CD45, afin d’effectuer la compensation entre les différents
fluorochromes utilisés. Des contrôles de fluorescence minus one (FMO) ont été faits afin de déterminer
l’emplacement des quadrants séparant les cellules positives des négatives d’un marqueur donné. L’acquisition
des évènements a été effectuée à l’aide d’un cytomètre en flux Partec CyFlow (Partec, Swedesboro, NJ, É.U.) et le logiciel Flomax 3.0, en ciblant de 10 000 à 300 000 évènements. Les données ont été
subséquemment analysées à l’aide du logiciel FCS Express 4.0 (De Novo Software, Los Angeles, CA, É.-U.)
29
4.5.2 Comparaison des clones d’anticorps anti-CD138
Étant donné l’importance du CD138 dans la reconnaissance des plasmocytes autant in vitro qu’in vivo, une
étude comparative de différents clones anti-CD138 a été faite. Ces essais ont été menés sur des lymphocytes
B humains cultivés in vitro, des PBMC ainsi que des cellules mononuclées de la moelle osseuse. Les cellules
ont donc été marquées selon le protocole décrit à la section 4.5.1 avec les cinq anticorps monoclonaux antiCD138 couplé au PE, soit B-A38 (AbCam, Cambridge, MA, É.-U.), B-B4 PE (AbD Serotec) DL101 (Biolegend,
San Diego, CA É.-U. et eBioscience) et MI-15 (BD Biosciences) et aussi B-A38 couplé avec l’Alexa 647(AbD
Serotec). Le marqueur de viabilité utilisé était le Pacific Blue (Molecular Probes, Life Technologies) et les
cellules ont été fixées. L’acquisition des données a été faite avec le Partec CyFlow ou l’Accuri C6 (BD
Biosciences). Lorsque deux anticorps étaient mélangés lors des essais de compétition, seulement la moitié du
volume recommandé par test par le manufacturier était utilisée.
4.5.3 Prolifération cellulaire
La prolifération des cellules Jurkat en présence ou en absence de 200ng/mL d’APRIL a été mesurée à l’aide
d’une coloration au CellVue Jade (eBioscience) selon les instructions du manufacturier. À la fin du marquage,
les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS-glucose, comptées et mises en culture. La lecture de la
fluorescence de la génération 0 a été faite le jour de la mise en plaque des cellules. La prolifération a été
suivie par la détermination de la fluorescence des cellules du jour 0 au jour 3 avec le cytomètre Partec Cy
Flow. Les index de prolifération ont été calculés avec le logiciel ModFit (Verity Software House, Topsham, ME,
É.-U.). Les données ont été comparées en calculant le pourcentage d’inhibition tel que décrit par Munson et
coll. 2010 [146] :
, où I.P. est l’index de prolifération.
4.5.4 Fluorescent Cell Barcoding
4.5.4.1 Lignées cellulaires
La méthode de Fluorescent Cell Barcoding (FCB) a été utilisée afin de suivre simultanément le même
intermédiaire de signalisation dans plusieurs conditions. Il s’agit du protocole de FCB standard [147] adapté à
notre laboratoire. À moins d’indication contraire, toutes les étapes de lavage ont été effectuées avec du PBS
et les incubations ont été faites à la noirceur et à TP. Les cellules U266 et RPMI ont été mises en culture
pendant 7 jours dans du milieu RPMI contenant 15 % ou 10 % FBS respectivement et additionné d’APRIL à
raison de 200ng/mL. Elles ont été lavées et mises au repos dans leur milieu de culture respectif exempt
d’APRIL pendant 18h, avant le début des essais. Après cette période, elles ont été lavées et stimulées en les
incubant pendant 20 min dans un milieu IMDM contenant 5 % FBS et 200 ng/mL d’APRIL. Une partie des
cellules a été incubée pour la même période dans un milieu exempt d’APRIL et elles ont été utilisées comme
30
témoins non stimulés. Toutes les cellules ont ensuite été fixées avec du formaldéhyde à 2 % (v/v) (SigmaAldrich) et perméabilisées par une incubation de 30 min dans une solution de méthanol à 90 %. Le colorant
utilisé pour donner une signature unique à chacune des conditions de l’expérience était le Pacific Blue
(Molecular Probes, Life Technologies). Des dilutions de ce colorant ont été préparées avec du DMSO (SigmaAldrich); 0,09 M; 0,5 M; 3,1 M et 18,3 M, avec lesquelles les cellules ont été marquées. Les cellules
ainsi colorées ont été lavées, mises en suspension dans du méthanol 90 % et incubées pour la nuit à 4 °C.
Suite à cette incubation, elles ont été lavées et mises en suspension dans une solution de PBS contenant 1 %
de BSA (Fisher Scientific). Les différentes conditions ont par la suite été regroupées dans un même tube et
divisées en fraction pour mesurer l’état de phosphorylation de protéines cibles avec les anticorps anti-pERK12, anti-NFB, anti-pP38 et anti-AKT. Tous ces anticorps étaient couplés à Alexa 647 (BD Biosciences).
L’acquisition des données a été effectuée avec le cytomètre Partec Cy Flow avec les logiciels indiqués à la
section 4.5.1.
4.5.4.2 Plasmocytes générés in vitro
Le même protocole a été appliqué aux plasmocytes générés in vitro, mais avec une matrice 4X2. Ils ont été
stimulés avec 50g/mL d’IL-6, d’IL-21, d’IFN- ou de TNF (PeproTech) ou encore du LPS (E. Coli 026:B6,
Sigma-Aldrich) à 10g/mL. Ces cellules ont donc été colorées avec deux colorants FCB, soit le Pacific Blue
aux concentrations finales décrites à la section 4.5.4.1. Le Dylight 800 NHS (Molecular Probes, Invitrogen)
était utilisé à des concentrations finales de 0 M et 0,5 M également dilué dans du DMSO. Les cellules ainsi
colorées ont ensuite été marquées avec un anti-CD38 PE-Cy7 et anti-CD138 PE en plus des anticorps suivant
couplés à l’Alexa 647 : pSTAT1, pSTAT3, pNFB et pp38 tous provenant de BD Biosciences. L’analyse des
données a été faite par l’exclusion des débris dans un graphique SSC/FSC. Cette région a été rapportée sur
un graphique CD38/CD138 et la suite des analyses a été faite sur les plasmocytes CD38hiCD138+. Les
compensations ont été faites avec des billes prévues à cet effet et appliquées aux fichiers qui ont été exportés
sur la plateforme d’analyse Cytobank [148]. Des matrices Heat Map ont été générées en utilisant la formule du
log2 (MFI
stimulées/(MFI non-stimulées
moyenne). Le contrôle négatif était constitué de la médiane de fluorescence
d’anti-phosphoprotéines de cellules non-stimulées.
4.6 Immunofluorescence
4.6.1 Microscopie à fluorescence
Les plasmocytes CD138+ générés in vitro ont été visualisés par microscopie à fluorescence à l’aide d’un
anticorps anti-CD138 (AbCam, Cambridge, MA, É.-U.). Un anticorps de chèvre spécifique aux IgG de souris
(AbD Serotec) a été utilisé comme anticorps secondaire. Les noyaux ont été colorés avec le DAPI (Sigma
Aldrich) et l’actine a été visualisée grâce à la phalloïdine 594 (Molecular Probes, Life Technologies).
31
Brièvement, les cellules ont été concentrées sur des lames de microscopie avec un Cytospin 4 Cytocentrifuge
(Thermo Scientific,) à une vitesse de 500g pendant 5 min. Elles ont ensuite été fixées, pendant 30 min, avec
du formaldéhyde 2 % (Sigma-Aldrich) fraichement préparé, après quoi les cellules ont été incubées pendant
20 min avec une solution de PBS contenant 2 % (p/v) d’albumine bovine sérique (BSA) et 0,01 % (p/v) de
saponine (Sigma-Aldrich). Par la suite, les cellules ont été incubées pendant 1 heure avec l’anticorps primaire
(anti-CD138) à 1g/mL, lavées deux fois avec une solution de PBS contenant 0.1 % de Nonidet-P40 (Sigma
Aldrich) et incubées pendant 2h avec l’anticorps secondaire, à la noirceur et elles ont été lavées deux fois
avec cette dernière solution et une fois avec du PBS. Le marquage de l’actine a été fait en incubant les
cellules pendant une heure avec de la phalloïdine. Les cellules ont par la suite été lavées comme à l’étape
précédente et incubées avec 100 ng/mL d’une dilution de DAPI pendant 15 min. Finalement, les cellules
marquées ont été recouvertes d’une solution de conservation Prolong Gold antifade reagent (Invitrogen, Life
Technologies) et scellées avec une lamelle. Les lames ont été visualisées grâce à un microscope à
fluorescence Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon, Mississauga, ON, Canada) avec un objectif 100X avec huile à
immersion et le logiciel TsView7. La superposition des images a été faite à l’aide d’ImageJ (National Institutes
of Health, Bethesda, MD, É.-U.)
32
5. Résultats
5.1 Étude comparative des anticorps monoclonaux anti-CD138
Le système de culture établi par notre équipe est basé sur l’interaction entre CD40 sur les lymphocytes B et
CD154 sur les cellules supports. Cette interaction est utilisée à des intensités variables et permet la génération
de plasmocytes exprimant le CD138 [48]. CD138 est le marqueur par excellence pour la détermination de la
génération des plasmocytes en différenciation terminale, cependant plusieurs clones d’anticorps monoclonaux
peuvent servir pour sa détection. Afin de tester la capacité des différents anticorps monoclonaux commerciaux
à détecter les plasmocytes générés par notre système de culture, des tests en cytométrie en flux ont été
effectués. Les lymphocytes B mémoires ont été expansionnés pendant 19 jours et ont été mis dans un
environnement de différenciation pendant 5 jours. Les cellules ont ensuite été marquées avec les anticorps
couplés au PE soit BA38, BB4, DL101 et MI-15 utilisés séparément et en une combinaison B-A38 et DL101
(MIX) (Fig. 5.1).
Pour tous les anticorps utilisés, les profils d’expression sont semblables à l’exception de celui observé pour le
clone DL-101 et le MIX (Fig 5.1-A et B). L’intensité médiane de fluorescence (MFI) du marquage de CD138
obtenue pour chacun de ces clones ou du MIX était semblable telle que montrée à la figure 5.1 C. Toutefois,
tel que mentionné au niveau des profils d’expression, des variations ont été observées au niveau de la
fréquence des cellules CD138+ détectées par ces clones. En effet, l’utilisation des clones B-A38, B-B4 et MI15 détectait des fréquences similaires de cellules CD138+ variant entre 16 % ± 8 % et 23 % ± 9 % (Fig. 5.1
D). Cependant, lorsque le clone DL101 était utilisé seul ou en combinaison avec le B-A38 (MIX), la fréquence
de cellules détectées était deux fois supérieure à celle obtenue avec les autres clones (p < 0,001). De plus,
cette augmentation du nombre de cellules CD138+ a aussi été observée sur les lymphocytes B dès le jour 19
(résultats non montrés). Afin de vérifier que la plus grande fréquence de cellules CD138 + obtenue lorsque les
cellules étaient marquées avec le clone DL101 ou le MIX n’était pas due à une reconnaissance non spécifique
de ce clone à une autre molécule à la surface des cellules, les lignées de lymphocytes B, soit les cellules
Ramos CD138neg, les cellules SKW 6.4 CD138lo et les cellules RPMI CD138+ ont été testées.
Tel que montré à la figure 5.2, les cellules Ramos étaient négatives pour CD138 peu importe la combinaison
d’anticorps utilisée. Tel qu’attendu, les cellules SKW6.4 exprimaient moyennement le CD138, lorsque
marquées avec le clone B-A38 en présence ou en absence du clone DL-101. Toutefois, on remarquait une
diminution de la fluorescence moyenne (MFI) de ces cellules lors du marquage avec l’anticorps DL101.
Finalement, l’intensité de fluorescence des cellules RPMI marquées avec l’anticorps DL-101 utilisé seul est
diminuée par rapport au marquage en présence de B-A38 seul ou combiné à DL-101.
33
Tout en indiquant que DL-101 était spécifique, ces observations soulevaient aussi un questionnement vis-à-vis
de la cible reconnue par cet anticorps.
Neg
32
Compte
EVENTS
B-A38
B-B4
B
MI-15
40
Neg
M1
32
24
M2
16
10
1
2
10
CD138-PE
10
3
10
MIX
M1
24
M2
16
0 0
10
4
10
1
2
10
CD138-PE
D
Cellules CD138+ (%)
MFI CD138
C
DL-101
8
8
0 0
10
B-A38
40
Compte
EVENTS
A
*
**
**
*
**
10
3
10
4
*
Figure 5.1 Marquage des cellules CD138+ générées in vitro. Les cellules différenciées in vitro ont été
marquées avec les clones B-A38, B-B4, DL101, MI-15 ou le mélange de DL101 et B-A38 (MIX). Les profils du
niveau d’expression de CD138 détecté par les clones B-A38, B-B4 et MI-15 (A) et de B-A38, DL101 et le Mix
de ceux-ci (B) sont représentatifs de 6 expériences indépendantes. (C) La médiane d’intensité de
fluorescence pour CD138 de chaque clone est présentée comme la moyenne  l’erreur standard moyenne. Il
s’agit des moyennes de 6 expériences pour les clones B-B4 et MI-15 et de 10 expériences pour B-38, DL101
et le MIX. (D) La fréquence des cellules CD138+ vivantes détectée par chaque clone ou combinaison de
clones B-A38 et DL101 (n=6 ou n=10 comme en (B)). La comparaison des différentes conditions a été
effectuée avec le test de Boneferroni. Les différences observées étaient entre le clone DL101 et les autres
clones (identifiée par **; p value <0,001) et entre le MIX et les clones B-A38, B-B4 et MI-15 (*; p value <
0,001). Aucune différence significative n’a été observée pour les MFI en C.
34
Figure 5.2 Marquage de lignées cellulaires avec des clones anti-CD138. Les lignées cellulaires Ramos,
RPMI-8226 et SKW 6.4 ont été marquées avec les clones B-A38, DL101 ou le mélange des deux (MIX). Les
cellules négatives (Neg) sont les cellules témoins non marquées.
A
B
Figure 5.3 Marquage de plasmocytes in vivo. Les plasmocytes obtenus du sang (A) et de la moelle
osseuse (B) ont été marqués avec B-A38, DL101 ou le mélange des deux. En (A), les plasmocytes ont été
ciblés d’abord sur les cellules vivantes CD45+ avant d’être rapportées sur le graphique CD19/CD138. Les
graphiques présentés sont représentatifs de quatorze expériences indépendantes. (B) Les cellules
mononuclées de la moelle osseuse de quatre donneurs (A, B, C, D) ont été sélectionnées en fonction de leur
expression positive de CD19 et CD45 et de l’exclusion du marqueur de viabilité (Pacific blue). Les résultats
présentés sont les fréquences obtenues pour quatre échantillons différents.
35
Étant donné la diversité observée dans les résultats obtenus avec les différents clones anti-CD138, des
expériences ont été menées avec les plasmocytes provenant du sang et de la moelle osseuse. Un marquage
de plasmocytes provenant du sang a permis de voir que le clone DL101 ne marquait pas de façon non
spécifique d’autres leucocytes, tel que montré par la fréquence des cellules CD138 observées, allant de
0.02 % à 0.1 % (Fig 5.3 A). De plus, un marquage des plasmocytes de la moelle osseuse comparant les
clones DL-101 et BA38 a montré que ces deux clones donnaient lieu à la même proportion de cellules CD138
sur les quatre donneurs testés (Fig. 5.3 B). Les clones BA38 et DL-101 semblent détecter les mêmes cellules.
Les épitopes ciblés par les clones testés surtout B-B4, MI-15 et DL-101 ont été partiellement identifiés [66]
[149][150][151][152]. Cependant, nous ne savons pas si les épitopes de DL-101 et BA38 sont semblables ou
différents. Un essai de marquage simultané de lymphocytes B différenciés avec une combinaison de B-A38 et
B-B4 et une autre de B-A38 et DL101 a été effectué (Fig.5.4). Pour ce faire, BA38 était couplé a de l’Alexa674 et les deux autres clones au PE. Il a été possible de déterminer que les clones B-B4 et B-A38 étaient
capables de lier simultanément les plasmocytes générés in vitro (BA+BB+). Toutefois, l’utilisation de DL101 et
de B-A38 a mis en lumière deux populations de plasmocytes reconnues par l’un ou l’autre de ces anticorps,
soit BA+DL- et BA-DL+. Une comparaison de ces trois sous-populations (Fig. 5.4 B) a révélé qu’il n’y avait
aucune différence significative dans la proportion de cellules CD138+ dans ces populations (comparaison
multiple avec le test Turkey-Kramer, p value= 0,2220).
3
10
2
10
R3 = 19%
1
10
0
10 0 1 2 3 4 5 6 7
10 10 10 10 10 10 10 10
DL-101 PE
20
15
10
5
0
BA-DL+
5
10
4
10
25
BA+DL-
R2 = 26%
BA+BB+
B
7
10
6
10
Cellules CD138+ (%)
7
10
6
10
R1 = 24%
5
10
4
10
3
10
2
10
1
10
0
10
0
1
2
3
4
5
6
7
10 10 10 10 10 10 10 10
B-B4 PE
B-A38 Alexa 647
B-A38 Alexa 647
A
Figure 5.4 Essai de compétition des clones anti-CD138. Les lymphocytes B expansionnés et différenciés in
vitro ont été marqués simultanément avec BA38 couplé à l’Alexa-647 et B-B4 et DL-101couplés au PE. (A) La
région R1 contient les cellules ressorties positives pour le marquage avec B-A38 (BA) et B-B4 (BB). Les
régions R2 et R3 contiennent les cellules positives pour B-A38 et/ou DL101 (DL). (B) Les fréquences de
cellules CD138 sont présentées comme la moyenne  erreur standard moyenne obtenue pour cinq
expériences indépendantes. Il s’agit des proportions de cellules obtenues en (A), soit BA+BB+, BA+DL — ou BADL+.
La comparaison des anticorps anti-CD138 a permis de révéler des différences importantes dans la quantité de
plasmocytes détectés entre le clone DL101 et les autres clones (B-A38, B-B4 et MI-15). Lorsqu’utilisé pour le
marquage de cellules différenciées in vitro, ce clone peut détecter deux fois plus de cellules CD138+ que les
36
autres clones. Il a aussi été déterminé que DL-101 semblait spécifique à la molécule CD138. Un essai de
compétition a permis de constater que les clones B-B4 et B-A38 pouvaient marquer simultanément les mêmes
cellules tandis que ce dernier et le DL101 détectent des populations de cellules CD138+ distinctes.
Dans l’ensemble, ces observations indiquaient que l‘utilisation de BA38 pouvait demeurer un choix judicieux
pour le suivi des plasmocytes in vitro puisqu’il est capable de bien détecter les cellules RPMI-8226, tout
comme les cellules normales dans le sang et la moelle osseuse. Bien que DL-101 semblait offrir la possibilité
de détecter plus de CD138+, la suite de ces expérimentations a été poursuivie uniquement avec l’utilisation de
BA38 étant donné que les résultats obtenus avec ce clone sont constants peu important l’origine des cellules
marquées.
5.2 Différenciation des lymphocytes B avec l’interaction CD70
L’interaction entre les molécules CD40 et CD154 est utilisée depuis fort longtemps dans la culture in vitro des
lymphocytes B [136]. Cependant, d’autres interactions se déroulant in vivo ont aussi attiré l’attention
notamment celle entre les molécules CD27 et CD70 pouvant jouer un rôle important au niveau de la
différenciation [29][30]. Nous avons voulu comparer la capacité de ces deux interactions (CD70 et CD154) à
induire la différenciation de lymphocytes B mémoires du sang expansionnés en plasmocytes. Les lymphocytes
B ont été expansionnés tel que décrit à la section 4.3.1 pendant 19 jours et congelés. Des banques de cellules
ont ainsi été créées et utilisées pour les essais en phase de différenciation. Les cellules étaient décongelées
et mises en phase de transition avant d’être complètement transférées en phase de différenciation tel
qu’illustrée à la figure 4.1.
5.2.1 Détermination du ratio de CD70
L’utilisation de l’interaction CD154 à différentes intensités a une influence sur le devenir des lymphocytes B
[48]. Ainsi, avant l’étude comparative des interactions CD70 et CD154, il a été important de déterminer la
meilleure intensité ou ratio de cellules CD70+ à utiliser dans notre système de culture et qui mènera à une
meilleure différenciation des lymphocytes B.
37
2 plas moI.FCS
Vivantes 1:20
CD70
1 plas moI.FCS
Vivantes
CD70 1:5
10
10
1
12
±8
10
0
10
10
10
10
10
0
1
2
10
10
10
1 plasmo
I.FCS
CD138
VivantesAlexa647
3
10
4
4
3
33
±16
50
±20
2
1
0
10
17
±4
0
1
2
10
10
10
CD138 Alexa647
CD138
3
10
10
10
10
4
4
29
±16
2
1
10
±6
0
10
10
10
60
±22
3
Jour 5
2
10
CD38
CD38 PCP-Cy5.5
28
±13
10
10
10
10
0
1
2
10
10I
10
2 plasmo
CD138
VivantesAlexa647
3
10
4
4
3
58
±3
28
±4
Jour 14
10
3
59
±18
CD38 PCP-Cy5.5
10
4
CD38 PCP-Cy5.5
CD38 PCP-Cy5.5
10
2
1
0
10
13
±1
0
1
2
10
10
10
CD138 Alexa647
3
10
4
Figure 5.5 Différenciation des lymphocytes avec l’interaction CD70. Les lymphocytes B ont été cultivés
avec un ratio 1:5 ou 1:20 de cellules 3H7 pendant 14 jours. Les figures présentées sont représentatives de 3
expériences indépendantes. Les chiffres indiqués sont des moyennes  écart type de la proportion (%) des
cellules dans chaque quadrant.
Les cellules ont donc été cultivées après leur décongélation en présence d’une forte ou faible interaction avec
les cellules correspondant à un ratio 1:5 ou 1:20 d’une lignée cellulaire CD70+ (3H7). Cela correspond à 1
cellule 3H7 pour 5 ou 20 lymphocytes B. Cette étude a été faite en examinant principalement l’émergence de
plasmocytes (CD38hiCD138+/-) ainsi que la capacité sécrétrice des cellules générées dans les deux conditions.
Comme montré à la figure 5.5, la différenciation des cellules induite par les différents ratios de CD70 était
semblable après 5 jours de culture. En effet, la forte interaction (ratio 1:5) CD70 a donné lieu à l’émergence de
28±13 % de plasmocytes CD138+ tandis que cette proportion était de 29±16 % avec la faible interaction
(1:20). Une différence notable a toutefois été observée après 14 jours de culture. La proportion de cellules
CD138+ à ce jour était environ deux fois supérieure en ratio 1:20, soit 58 ±3 % par rapport à 33±16 %. La
capacité de sécrétion de ces cellules a aussi été comparée et les cellules cultivées avec une faible interaction
CD70 avaient une meilleure sécrétion d’IgG, soit 18644 g/106 cellules par rapport à 11537 g/106 cellules.
La viabilité cellulaire était semblable tout au long de la culture dans ces deux conditions (résultats non
montrés). Les résultats ainsi obtenus ont permis de conclure que l’utilisation d’une faible interaction avec
CD70 induisait une meilleure différenciation des lymphocytes B.
38
5.2.2 Comparaison des interactions CD70 et CD154
5.2.2.1 Phénotype CD38 et CD138
Suite à ces observations, les expérimentations ont été effectuées afin de déterminer si une faible interaction
avec CD70 induisait une meilleure différenciation des lymphocytes B par rapport à l’interaction CD154 en se
fiant aux mêmes critères décrits précédemment, soit l’apparition de cellules CD38hiCD138+/- et la sécrétion
d’immunoglobulines. La figure 5.6 montre l’évolution de la présence de CD38 et CD138 sur les cellules
vivantes, soit négatives pour le marquage Pacific Blue. Au jour 0, soit le jour de la mise en culture des cellules
dans l’environnement de différenciation, environ la moitié des lymphocytes B expansionnés exprimaient le
CD38 et 17 ±4 % des cellules l’exprimaient fortement (CD38hi). Cette proportion a augmenté tout au long de la
culture telle que montrée à la figure 5.6 C. Au jour 5, une plus grande proportion de plasmocytes a été
générée avec l’interaction CD70. En effet à ce jour, 53 ±7 % des cellules dans cette condition affichaient le
phénotype CD38hi tandis que cette proportion était de 35 ±6 % avec l’interaction CD154 (p value= 0,0260; test
Mann-Whitney). Ces profils d’expression ont évolué durant la culture et les deux conditions donnaient lieu à
des proportions de cellules CD38hi et CD138+ similaires après 14 jours de culture (Fig. 5.6B et C). En effet, la
quantité de plasmocytes CD138+ au début de la culture était de 5 ±2 %. Cette fréquence a rapidement monté
après seulement 5 jours de culture et était de 29 ±2 % chez les cellules cultivées en interaction CD70 et de
19 ±3 % en CD154. La fréquence de ces plasmocytes dans cette condition était plus faible que dans la
condition CD70 après 14 jours de culture. Cette dernière a permis la génération de 37±5 % CD138+ alors que
l’interaction CD154 en a généré que 29 ±4 %.
39
Jour
D5 5
Jour
D0 0
4
10
3
10
2
3
10
1
10
2
10
0
10
1
10
10
10
10
Jour
D1414
10
10
10
10
0
10
1
10
2
10
3
10
10
4
4
10
3
10
2
10
1
10
10
0
10
0
10
1
10
2
10
3
10
CD38
10
0
10
Cellules CD38hi (%)
**
*
***
60
0
10
1
10
2
10
3
10
2
1
0
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
4
3
10
4
2
1
0
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
C
**
Cellules CD138+ (%)
CD138
10
80
3
4
10
B
4
CD70
10
10
4
CD154
A
40
20
0
60
*
***
45
**
30
15
0
CD70
D0
CD154
D5
CD70
CD154
D14
CD70
D0
CD154
D5
CD70
CD154
D14
Figure 5.6 Émergence de cellules CD38hiCD138+. Les résultats sont présentés comme des moyennes 
erreurs moyennes standards de six expériences indépendantes. (A) Profil d’expression de CD38 et CD138
aux jours 0, 5 et 14 des cultures cellulaires en interactions CD70 ou CD154. Les cellules analysées ont été
ciblées sur la région des cellules vivantes (Pacific blue négatives). (B) Fréquence de cellules CD38hi dans les
conditions à l’étude. La comparaison de la quantité de cellules CD38hi au jour 5 entre les deux conditions a été
faite avec le test de Mann-Whitney, avec un p value de 0,0260. Pour le suivi de l’apparition de cellules
CD138+. (C), le test de Kruskal-Wallis a été utilisé (*p < 0,05; **p <0,01; ***p <0,001).
5.2.2.2 Sécrétion d’immunoglobulines
La confirmation de la différenciation des cellules s’appuie par leur fonction de sécrétion d’immunoglobulines,
cette caractéristique a été comparée chez les cellules cultivées dans chacune des conditions d’intérêt sur des
surnageants de culture prélevés aux jours 5 et 14. Après cinq jours de culture, les deux interactions cellulaires
ont donné lieu à des niveaux de sécrétion d’immunoglobulines équivalents (Fig. 5.7 A).
40
Figure 5.7 Sécrétion d’immunoglobulines. À chaque changement des cellules adhérentes, la moitié du
milieu de culture était prélevé et gardé stérile pour des essais de mesure de la sécrétion des cellules. (A) Jour
5 (B) Jour 14. Les concentrations d’immunoglobulines relatives ont été déterminées pour ces deux jours(C)
Jour 5 (D) Jour 14. Cette concentration a été déterminée en normalisant la concentration d’Ig sécrétée par la
quantité totale de cellules vivantes au jour 5.
Comme attendu, les IgA et les sous-classes d’IgG étaient les immunoglobulines sécrétées en plus grande
quantité, avec 244 ± 137g/mL et 211 ± 112g/mL d’IgA avec l’interaction CD70 et CD154 respectivement.
41
Les IgG1 étaient les plus abondants parmi les sous-classes d’IgG, avec une concentration s’élevant à 51 ±
10g/mL suivant l’interaction CD70 et 59 ± 17g/mL suite à la culture de cellules avec l’interaction CD154 au
jour 5 (Fig. 5.7 A).
Au jour 14, la concentration en IgG1 était plus élevée dans les surnageants de cultures faites avec l’interaction
CD154 (51 ± 10g/mL par rapport à 29 ± 4g/mL). De plus, la sécrétion d’IgG3 avec l’interaction CD154 (17
± 4g/mL) était deux fois plus élevée qu’avec l’interaction CD70 (7 ± 2g/mL) (Fig 5.7 B). Étant donné que la
concentration cellulaire était différente lors des cultures dans les deux conditions, la sécrétion relative a été
calculée (Fig. 5.7 C et D), en normalisant la concentration d’Ig sécrétée avec la quantité totale de cellules au
jour 5 dans chacune des conditions. La sécrétion d’Ig au jour 14 est donc semblable dans les deux conditions
lorsque l’on tient compte de la quantité de cellules, tel que montré par la sécrétion relative d’IgG1 qui était de 5
± 1g/106 cellules avec interaction CD70 par rapport à 6 ± 1g/106 cellules pour l’interaction CD154.
5.2.2.3 Évolution de l’expression des molécules CD27 et CD70
Étant donné l’importance du marqueur CD27 pour répondre à l’interaction de CD70, un suivi de l’évolution de
ce marqueur durant la différenciation des cellules a été effectué (Fig. 5.8). De plus, une des caractéristiques
des plasmocytes est aussi la forte expression du CD27 [50] ce qui rend l’étude de ce marqueur important.
La proportion de cellules CD27+ dans la culture augmentait de jour en jour, et ce, avec les deux interactions
d’intérêt. Au jour 14, cette fréquence atteignait 60 ±5 % et 75 ±7 % avec l’interaction CD70 et CD154
respectivement. En moyenne, la proportion de ces cellules était de 17±3 % au moment de la mise en culture
des cellules. L’intensité de fluorescence de ce marqueur augmentait de façon constante sur les cellules
cultivées avec l’interaction CD154. Quant aux cellules cultivées en interaction CD70, l’intensité de
fluorescence du CD27 augmentait légèrement entre le jour 0 et 5 mais diminuait après ce jour, passant de
7859 à 5916. Cette expression est deux fois plus faible que celle observée sur les cellules cultivées avec
l’interaction CD154, dont l’intensité de fluorescence était de 13227. Cette différence n’était toutefois pas
significative (p value =0,0952, test Mann-Whitney).
42
Figure 5.8 Expression de CD27. L’intensité de fluorescence (médiane d’intensité de fluorescence) du CD27
(A) ainsi que la fréquence de cellules CD27+ (B) ont été mesurées tout au long des cultures. Les valeurs
présentées sont les moyennes  erreurs moyennes standards obtenues d’expériences indépendantes (n=3
pour les jours 0 et 5, n=6 pour le jour 14).
43
Figure 5.9 Évolution de l’expression de CD27 et CD70. Ces graphiques présentés sont représentatifs de
trois expériences indépendantes. (A) Profil d’expression au jour 0. Les proportions de chacune des régions
sont la moyenne obtenue pour les 3 expériences effectuées. R1 : cellules CD70+CD27-; R2 : CD70lowCD27-;
R3 : CD70-CD27+ (B) Profil d’expression au jour 14.
Le ligand du CD27 est le CD70. Celui-ci est connu pour être exprimé sur les lymphocytes B [142]. Il était donc
important de suivre l’évolution de l’expression de ce marqueur de surface. Le marquage fait sur les cellules au
jour 0 (Fig. 5.9 A) a montré que trois populations cellulaires étaient présentes lors de l’analyse simultanée de
ce marqueur et du CD27. En effet, le tiers des cellules (33  2 %) étaient de phénotype CD70+CD27-. Une
plus faible proportion (21±2 %) exprimait plus faiblement le CD70 sans exprimer le CD27 (CD70loCD27-). Un
autre tiers des cellules (28±2 %) exprimait uniquement le CD27 (CD70-CD27+). L’étude ces marqueurs de
surface au jour 14 (Fig. 5.9 B) a montré qu’il y a eu un mouvement des cellules vers une plus grande
expression du CD27 tandis qu’elles perdaient l’expression de son ligand, le CD70. Tel que montré à la
figure 5.8, 60  5 % et 75 ±7 % des cellules cultivées avec les interactions CD70 et CD154 respectivement
exprimaient le CD27.
44
5.2.2.4 Prolifération et viabilité
La différenciation cellulaire induite par la culture des lymphocytes B a des effets non seulement au niveau de
l’expression de marqueurs de surface et de la sécrétion d’immunoglobulines, tel qu’observé précédemment,
mais la croissance cellulaire peut aussi s’en trouver affectée. Les comptes cellulaires effectués lors des
changements des cellules-supports CD70+ ou CD154+ ont permis de suivre la prolifération, l’expansion ainsi
que la viabilité des cellules en culture. Dans les deux conditions à l’étude, le pic de la prolifération cellulaire se
trouve au jour 5, où il est d’un facteur d’expansion de 1,3 0,4 et de 1,8  0,4 avec l’interaction CD70 et
CD154 respectivement. Le taux de prolifération des cellules diminue à partir de ce jour et le plus faible taux est
calculé au jour 14 pour les deux conditions. Au jour 9, le taux de prolifération des cellules cultivées avec
l’interaction CD154 est toutefois deux fois supérieur qu’avec l’interaction CD70, soit 1,5  0,3 par rapport à 0,6
 0,1 et cette différence est significative (test Mann-Whitney, p value= 0,0087).
L’expansion cellulaire avait un profil légèrement différent. En effet, elle augmentait pour les cellules dans les
deux conditions, mais le pic n’était pas au même moment. Dans le cas de l’interaction CD70, l’expansion
maximale des cellules (1,3  0,3) a été observée 5 jours après le début de la culture tandis que celle des
cellules en interaction CD154 était au jour 9 (2,7  0,8). Non seulement le moment du pic d’expansion était
différent dans les deux conditions, mais l’expansion cellulaire était toujours plus élevée chez les cellules
cultivées en CD154. Après 5 jours de culture, elle était trois fois supérieure que celle des cellules en
interaction CD70 (différence non significative selon le test Mann-Whitney, p value= 0,0931). Cette différence
était d’autant plus grande à la fin de la culture (jour 14), où l’expansion des cellules en interaction CD154 était
6 fois supérieure. Cette différence était significative, avec un p value de 0,0260 avec le test Mann-Whitney.
Une caractéristique importante des cellules en culture est leur viabilité. Tel que montré à la figure 5.10 C,
celle-ci baisse drastiquement dans les deux conditions à l’étude à partir du jour 5. En moyenne, les cultures
étaient démarrées avec des cellules ayant 74 ±2 % de viabilité. Après 14 jours de culture, cette valeur était en
moyenne de 33  5 % et de 37  7 % avec les interactions cellulaires CD70 et CD154 respectivement.
45
Figure 5.10 Croissance des cellules. Les données sont présentées comme des moyennes  erreurs
standard moyennes de 6 expériences indépendantes. Pour les comparaisons entre les conditions, le test
Mann-Whitney a été utilisé. (A) Taux de prolifération. Différence significative entre les conditions au jour 9, p
value= 0,0087 (B) Expansion. Différence significative au jour 14, p value= 0,026 (C) Viabilité cellulaire.
46
5.2.2.5 Comparaison globale de l’effet de CD70 et CD154 lors de la phase de
différenciation
Cette série d’expérimentations ciblant l’effet des interactions CD70 et CD154 sur la différenciation des
lymphocytes B mémoires expansionnés a été menée en suivant l’émergence de cellules CD38hiCD138+/-, la
sécrétion d’immunoglobulines, l’expression de CD27 ainsi que l’évolution des cellules en culture. Il en est
ressorti que l’interaction avec CD70 induit une émergence rapide de plus de cellules CD38hi après 5 jours de
culture. La quantité de cellules différenciées en fonction de l’expression de CD38 et de CD138 est toutefois
similaire dans les deux conditions de culture après 14 jours. De plus, aucune différence n’a été observée sur
la capacité sécrétrice des cellules dans chacune des conditions, que ce soit d’IgA, d’IgE, IgM, ou des sousclasses d’IgG.
D’un autre côté, lors de ces essais le niveau d’expression de CD27 augmentait au fur et à mesure dans les
cultures tout en demeurant plus élevé avec l’interaction CD154. L’évaluation de l’expression de CD70 a de
plus mis en lumière un profil d’expression inverse entre celui-ci et le CD27. En effet, la plupart des cellules
exprimaient uniquement le CD70 au jour 0, alors que 60 à 75 % d’entre elles exprimaient le marqueur CD27
en fin de culture.
Au point de vue de l’activité globale, les comptes cellulaires effectués durant les cultures ont permis de suivre
la prolifération, l’expansion et la viabilité cellulaire. Une différence significative a été notée dans le taux de
prolifération des cellules au jour 9 en faveur de l’interaction CD154 et ces cellules avaient une meilleure
expansion en fin de culture. La viabilité cellulaire dans les deux conditions était similaire, mais diminuait au fur
et à mesure des cultures. Une faible viabilité en fin de culture ne donnant pas la possibilité de faire beaucoup
d’analyses avec les cellules générées. Il était donc nécessaire de tester des facteurs pouvant améliorer la
viabilité des cellules, ce qui pourrait aider à une meilleure comparaison des interactions cellulaires d’intérêt.
5.3 Amélioration de la viabilité des lymphocytes B
Afin d’approfondir la comparaison des interactions cellulaires CD154 et CD70 sur la différenciation in vitro des
lymphocytes B expansionnés, les prochaines étapes visaient à améliorer la viabilité des cellules en culture.
Cet objectif a été adressé par l’utilisation de facteurs solubles ayant été rapportés comme favorisant la survie
in vivo des lymphocytes B et/ou des plasmocytes. Sauf indication contraire, APRIL, CXCL12 et IGF-R3, ont
été ajoutés dans le milieu de culture des cellules au même moment que l’IL-6, soit au premier changement de
milieu de culture suivant la décongélation des cellules. Les molécules utilisées étaient ajoutées aux
interleukines déjà présentes.
47
5.3.1 APRIL
5.3.1.1 APRIL n’a pas d’effet sur la viabilité des cellules in vitro
APRIL est l’une des plus importantes molécules connues pour la survie des plasmocytes [101]. L’étude de son
effet de survie in vitro sur des cultures de lymphocytes B a débuté par une dose-réponse, afin de déterminer la
concentration optimale de cette molécule qui permettrait d’améliorer la viabilité des cellules. Dans le cadre de
cet essai, des doses allant de 0 à 200 ng/mL d’APRIL recombinante ont été testées sur des cellules cultivées
avec l’interaction CD70 utilisée à un ratio 1:20 pendant 14 jours. APRIL a été introduite dans les cultures au
jour 7. Tel que montré à la figure 5.11, aucune des concentrations utilisées dans la dose réponse n’a semblé
augmenter la viabilité des cellules par rapport à la condition contrôle, soit en absence d’APRIL. La viabilité
dans toutes les conditions était inférieure à 75 %. Les meilleures viabilités obtenues au jour 14 étaient de 68 %
avec 100 ng/mL et 65 % avec 25 ng/mL. Il n’y avait donc pas de lien entre la viabilité cellulaire et la
concentration d’APRIL utilisée dans le milieu de culture des cellules. Pour s’assurer que cette indifférence
n’avait pas un lien avec l’interaction cellulaire utilisée lors de cet essai, une expérience comparant la viabilité
des cellules cultivées avec l’interaction CD154 en présence ou non d’APRIL a été faite. La concentration de
200 ng/mL a été utilisée pour s’assurer donner un signal maximal de survie aux cellules en culture.
Figure 5.11 Dose-réponse d’APRIL. Les cellules ont été cultivées en interaction CD27-CD70 ratio 1:20
pendant 14 jours. Les différentes concentrations d’APRIL ont été introduites lors du changement de milieu au
jour 7 ce qui a permis une évaluation de la viabilité au jour 9. n=1
48
100
Viabilité (%)
75
50
25
0
Contrôle
APRIL
Contrôle
CD70
APRIL
CD154
Figure 5.12 : Effet d’APRIL sur la viabilité cellulaire en interaction CD70 et CD154. Viabilité mesurée à
J=9. La ligne pointillée indique la viabilité au jour 0 (86 %) de la phase de différenciation. La culture a été faite
avec 200 ng/mL d’APRIL introduite dans les conditions données entre le jour 4 et le jour 9. Cet essai a été
réalisé une seule fois. La condition contrôle ne contenait pas d’APRIL.
Tel que montré à la figure 5.12, l’interaction cellulaire utilisée ne semble pas impliquée au niveau de la viabilité
des cellules cultivées en présence d’APRIL. En effet, dans le cadre de cette expérience, on observe une
baisse de la viabilité dans toutes les conditions à l’étude par rapport à la viabilité cellulaire au jour 0 (86 %).
Cette molécule ne semble pas non plus avoir d’effet sur de la différenciation des cellules au niveau de la
sécrétion d’IgG et d’IgA. Bien que la sécrétion d’IgG varie entre 101 et 133 g/mL et que celui d’IgA varie
entre 26 et 31 g/mL, il n’y a pas de différence notable sur le niveau de sécrétion de ces immunoglobulines
(Fig. 5.13 A) parmi les conditions à l’étude. La même observation est faite au niveau de la quantité de cellules
sécrétrices d’IgG (Fig. 5.13 B). Il n’y avait pas de différence au niveau de la quantité de cellules sécrétrices
d’anticorps entre les milieux contenant ou non de l’APRIL. De plus, une analyse en cytométrie en flux de la
quantité de plasmocytes CD138+ générée a montré que la proportion de cette population n’était pas influencée
par la présence d’APRIL dans le milieu de culture (résultats non montrés).
Ces observations n’étant pas en accord avec les études publiées, deux possibilités ont été testées d’une part,
se pourrait-il qu’une des composantes du milieu de culture inhibe l’effet d’APRIL? D’autre part, les cellules en
culture ont-elles les récepteurs nécessaires pour répondre à cette molécule? Dans le système de culture à
l’étude, la phase de différenciation se déroule en présence des interleukines 6 et 10. La première est
principalement connue comme étant un facteur important dans la différenciation des lymphocytes B [153]
tandis que le dernier est un facteur de survie cellulaire [154].
49
A
Sécrétion (µg/mL)
160
IgG
120
IgA
80
40
0
APRIL
Contrôle
CD70
B
APRIL
Contrôle
CD154
Cellules sécrétrices
d'IgG (%)
40
30
20
10
0
APRIL
Contrôle
CD70
APRIL
Contrôle
CD154
Figure 5.13 Effet d’APRIL sur la fonction sécrétrice des lymphocytes B. Ces essais ont été effectués au
jour 9 de la culture. (A) La sécrétion d’IgG et d’IgA a été évaluée par ELISA sur les surnageants de culture. (B)
La quantité de cellules sécrétrices d’IgG a été évaluée dans chaque condition par ELISPOT en ratio par
rapport au nombre de cellules viables en culture.
Étant donné que l’IL-10 a un rôle redondant avec APRIL dans le système de culture, la présence simultanée
de ces deux facteurs pourrait contrecarrer l’effet d’APRIL. Afin d’étudier cette possibilité, les cellules ont été
cultivées avec l’un ou l’autre des interactions cellulaires d’intérêt, en présence d’APRIL, avec ou sans IL-10,
sur une période de 14 jours (Fig. 5.14). Dans toutes les conditions, la viabilité des cellules a diminué au fur et
à mesure de la culture et était autour de 50 % au jour 14. Il s’est avéré que la présence d’APRIL ne permettait
pas de maintenir une bonne viabilité des cellules après leur mise en culture et la présence ou l’absence d’IL10 n’était pas la cause de ce résultat. Dans le cadre de cette expérience, APRIL a été introduite dans le milieu
de culture en début de la phase de différenciation, à une concentration de 25 ng/mL, au lieu de 200ng/mL telle
que montrée à la figure 5.12. Malgré cela, les conclusions demeurent les mêmes, soit de la diminution de la
viabilité des cellules.
50
Figure 5.14 Effet de la présence simultanée d’APRIL et d’IL-10 sur la viabilité cellulaire. Les cellules ont
été cultivées avec 25 ng/mL d’APRIL dès le début la culture cellulaire, pendant 14 jours avec l’interaction
CD70 ou CD154. Ce résultat est représentatif d’une expérience.
In vivo, APRIL induit ses effets à travers son interaction avec ses récepteurs qui sont au nombre de quatre. Il
s’agit du BCMA (B Cell Maturation Antigen), TACI (Transmembrane Activator and Calcium Modulator and
Cyclophilin Ligand Interactor) et des protéoglycanes à héparanes sulfates [106] [155]. Une variante d’APRIL
peut aussi lier BAFF-R avec une faible affinité [107]. Un marquage de cytométrie en flux a été effectué sur des
cellules cultivées en présence d’APRIL, afin d’étudier la présence des récepteurs BCMA et TACI.
Tel que montré à la figure 5.15, la proportion de cellules BCMA+ est deux fois supérieure parmi les cellules
cultivées en interaction CD70 par rapport aux cellules cultivées en interaction CD154. Toutefois, la présence
simultanée d’APRIL et d’IL-10 n’influence pas l’expression de ce récepteur parmi les cellules cultivées avec
l’une ou l’autre des interactions. Dans toutes les conditions à l’étude, la proportion de cellules TACI + est
toujours inférieure à celles exprimant BCMA. Il est à noter que la proportion de cellules BCMA+ après 14 jours
de culture est de près de 21 %, parmi les cellules cultivées avec l’interaction CD70 et en absence d’IL-10.
C’est cependant dans cette même condition qu’on retrouve la plus grande proportion de cellules TACI +, soit
15 %. En somme, même après une culture de 14 jours de cellules en présence d’APRIL, moins de 20 % des
cellules expriment ces récepteurs. Cette observation pourrait expliquer le peu d’influence d’APRIL dans ces
conditions, puisque la majorité des cellules ne pouvaient pas y répondre. Ce phénotype peut être aussi illustré
au niveau de l’intensité de fluorescence de ces deux marqueurs (Fig. 5.15 B). L’intensité de fluorescence
corrèle avec la proportion de cellules exprimant l’un ou l’autre des récepteurs. Étant donné que les deux
anticorps étaient couplés au même fluorochrome, il est possible de comparer directement les intensités de
fluorescence obtenues.
51
A
B
Cellules non-marquées
CD70 +IL-10
CD70
CD154 +IL-10
CD154
C
o
m
pt
e
TACI
BCMA
Figure 5.15 Expression des récepteurs d’APRIL. Marquage extracellulaire en cytométrie en flux sur des
cellules cultivées 14 jours en présence d’APRIL et/oud’IL-10. Cet essai a été réalisé une seule fois. Les deux
anticorps étaient couplés au PE. (A) Fréquence des cellules exprimant les récepteurs BCMA et TACI (B)
Intensité de fluorescence de BCMA et de TACI.
En résumé, nous n’avons pas pu observer un effet induit par APRIL sur les cellules en culture, que ce soit au
niveau de la viabilité cellulaire, de leurs fonctions sécrétrices, de leur différenciation phénotypique ou encore
au niveau de la modulation de l’expression des récepteurs de ce facteur soluble.
5.3.1.2 Mesure de l’activité biologique d’APRIL
Suite à ces observations, il était important de s’assurer que la molécule recombinante d’APRIL utilisée dans
les cultures était bien fonctionnelle et avait une activité biologique. Une mesure de l’activité biologique d’APRIL
a été menée à travers l’étude de la signalisation intracellulaire induite par cette molécule ainsi que son effet
sur la prolifération d’une lignée cellulaire. La liaison d’APRIL à BCMA ou TACI, induit la phosphorylation de
plusieurs protéines de signalisation. Dans les essais in vitro, nous avons testé ce phénomène sur deux lignées
52
cellulaires, soit les cellules U266 et RPMI qui expriment les récepteurs TACI et BCMA [155]. Ces cellules ont
été cultivées pendant 7 jours en présence ou en absence de 200 ng/mL d’APRIL.
A
Cellules non-marquées
Contrôle
APRIL
Co
mp
te
B
TACI
BCMA
TACI
BCMA
Co
mp
te
Figure 5.16 Expression de TACI et BCMA sur lignées cellulaires. Un marquage extracellulaire effectué
après la culture des cellules dans un milieu contenant 200 ng/mL d’APRIL, après 14 jours. Les deux anticorps
étaient couplés au PE. (A) U266 (B) RPMI-8226
L’expression de TACI et de BCMA a été mesurée par cytométrie en flux sur les cellules U266 (Fig. 5.16 A) et
les cellules RPMI-8226 (Fig. 5.16 B). Pour les deux lignées cellulaires, TACI était exprimé par 24 % des
cellules U266 et 12 % des cellules RPMI-8226. La culture de ces lignées avec APRIL ne semblait pas en
influencer son expression, étant donné les proportions semblables de 21 % et 15 % de cellules TACI+ chez les
cellules U266 et RPMI-8226 respectivement. De plus, la présence d’APRIL ne semblait pas modifier
l’expression de BCMA sur ces deux lignées. La proportion de cellules BCMA+ était de 57 % et 60 % pour les
cellules U266 et RPMI-8226 respectivement.
Après les 7 jours de culture, les cellules U266 et RPMI-8226 ont été mises au repos dans du milieu ne
contenant pas d’APRIL pendant 18h après quoi, elles ont été restimulées pendant 20 min avec 200 ng/mL
d’APRIL et le niveau de phosphorylation des protéines cibles dans la voie de signalisation induite par APRIL
(ERK ½, AKT, NFkB et p38) a été mesuré. Aucune conclusion n’a pu être tirée suite à ces essais étant donné
que la présence d’APRIL (pendant 7 jours ou 20 min) n’a pas induit la phosphorylation d’aucune protéine cible
chez les U266 ou les RPMI (résultats non montrés).
53
Étant donné que les observations précédentes ne permettaient pas de conclure que la source de APRIL était
biologiquement active, une autre activité d’APRIL a été testée, soit son effet positif sur la prolifération d’une
lignée de lymphocytes T, les Jurkat. L’activité biologique de ce facteur soluble a donc été testée en cultivant
ces cellules en présence ou en absence de 200 ng/mL d’APRIL sur une période de 72h. L’essai a été mené
en duplicata et la prolifération cellulaire a été mesurée après 24h, 48h et 72h, en cytométrie en flux par un
marquage avec le CellVue. Les taux de prolifération obtenus ont permis le calcul du pourcentage d’inhibition
[146]. Il a été observé que la prolifération des cellules cultivées avec APRIL avait une meilleure prolifération
après 24h, comparativement aux cellules contrôles avec une inhibition de 13 5 %. Ce résultat suggère que la
molécule d’APRIL utilisée dans nos essais avait bien une activité biologique.
5.3.2 CXCL12
L’étude de l’effet de CXCL12, une chimiokine qui joue un rôle dans le microenvironnement des plasmocytes
[109], sur la viabilité des cellules in vitro a été initiée par une dose-réponse ayant pour but de déterminer la
meilleure concentration permettant l’amélioration de la viabilité des cellules par rapport au milieu de culture de
base. Dans le cadre de cet essai, les cellules ont été cultivées avec 40, 120 ou 300 ng/mL de CXCL12 et en
interaction CD154 (Fig. 5.17).
Figure 5.17 Dose réponse de CXCL12. Les cellules ont été cultivées pendant 14 jours avec différentes
concentrations de CXCL12, en interaction CD154. Le CXCL12 a été introduit dans les milieux de culture au
premier changement de milieu, soit au jour 2.
Dans toutes les conditions testées, la viabilité cellulaire a diminué au fur et à mesure de la culture. Lors de cet
essai, la culture contrôle (0 ng/mL) a dû être arrêtée au jour 9, car la viabilité y était très faible (67 %). Alors
que les cellules cultivées avec 40 et 100 ng/mL de CXCL12 avaient atteint respectivement 66 et 68 % de
viabilité au jour 14. Étant donné ces résultats encourageants, des concentrations de 50 et 100 ng/mL ont été
testées sur trois échantillons indépendants en interaction CD154 et comparées à la condition de culture sans
54
CXCL12 (Fig. 5.18 A). Le patron de viabilité des cellules était semblable dans toutes les conditions au fur et à
mesure de la culture et était de 56 % (n=1) 5713 % et 5716 % pour la condition contrôle et les deux tests
avec 50 et 100ng/mL de CXCL12, respectivement, au jour 14 de la culture. En somme, la présence de
CXCL12 dans le milieu de culture des cellules cultivées avec l’interaction CD154 n’améliorait pas leur survie
par rapport au milieu de culture de base. La même conclusion a pu être tirée lors des essais effectués avec
l’interaction CD70, où les cellules ont été cultivées avec 100 ng/mL de CXCL12 pendant 11 jours (Fig. 5.18 B).
Dans ces essais, la viabilité cellulaire dans la condition contrôle et CXCL12 était de 4510% et 44 ±13 %,
respectivement.
A
B
Figure 5.18 Influence de CXCL12 sur la viabilité cellulaire in vitro. Les données sont présentées sous
forme de moyennes  écarts-types (A) Cellules cultivées sur 14 jours avec l’interaction CD154 (n=3 sauf au
jour 14, où n=1 pour la condition contrôle). (B) Cellules cultivées sur 11 jours avec l’interaction CD70 (n=3)
Afin d’induire son effet de chimiotactisme, le CXCL12 doit interagir avec le CXCR4 qui est une molécule
présente sur les plasmocytes in vivo [109]. La présence de ce récepteur a été étudiée sur les cellules cultivées
55
in vitro (Fig. 5.21). Les analyses ont été faites sur les cellules vivantes CD19+ au jour 9 qui ont été cultivées
avec les concentrations indiquées de CXCL12 ou avec le milieu de culture de base sans CXCL12 (contrôle).
Étonnamment, la proportion de cellules B exprimant CXCR4 était inversement proportionnelle à la
concentration de cette chimiokine dans le milieu de culture des cellules (Fig. 5.19 A), passant de 13 % dans le
contrôle à 4 % parmi les cellules cultivées avec 300 ng/mL de chimiokine. Un deuxième essai effectué avec
des concentrations de 50 et 100 ng/mL a permis d’observer la même diminution d’expression du CXCR4 au
jour 9 (Fig. 5.19 B) et le même profil avait été observé sur des cellules du jour 14 (résultats non montrés).
A
B
Figure 5.19 Expression de CXCR4. Détermination sur les cellules après 9 jours de culture en interaction
CD154. (A) Phénotype en fonction de la dose-réponse de CXCL12. (B) Phénotype des cellules cultivées avec
50 et 100 ng/mL de CXCL12 en interaction CD154.
En bref, le milieu de culture supplémenté de 50 ou 100 ng/mL de CXCL12 n’a pas induit une amélioration de
la viabilité cellulaire par rapport au milieu de base, et ce, avec les cellules cultivées avec l’interaction CD70 et
CD154. Malgré cela, il a été possible de démontrer que les cellules répondaient à la présence de cette
chimiokine dans leur milieu de culture à travers la relation de proportion inverse entre la concentration de
CXCL12 et la quantité de cellules exprimant le récepteur CXCR4, qui a d’ailleurs déjà été documentée dans
des études publiées [156][157].
5.3.3 IGF-R3
Les facteurs de croissance tels que l’insuline-like growth factor 1 (IGF-1) ont été identifiés comme important
pour la survie des myélomes, qui sont des cellules cancéreuses apparentées aux plasmocytes [68]. Afin de
tester cet effet in vitro, une molécule recombinante substitut IGF-R3 a été ajoutée à raison de 60 ng/mL dans
le milieu de culture de base des lymphocytes B mémoires expansionnés et cultivés en phase de différenciation
avec l’interaction CD154. Son effet sur la survie cellulaire a été mesuré en comparant la viabilité des cellules
par rapport à des cellules cultivées en son absence. Nos essais suggèrent que ce facteur de croissance
56
n’avait aucun effet sur la survie des lymphocytes B in vitro (Fig. 5.20). En effet, la viabilité cellulaire était de
57 % dans le contrôle par rapport à 49±6 % en présence d’IGF-R3.
Figure 5.20 Effet d’IGF-R3 sur la viabilité cellulaire. Cellules cultivées pendant 9 jours avec l’interaction
CD154. La figure représente la moyenne  écart-type de trois échantillons indépendants du jour 0 à 9 et d’un
échantillon au jour 14 dans la condition IGF-R3.
5.3.4 Instabilité de la viabilité
Les trois molécules, APRIL, CXCL12 et IGF-R3, étudiées dans le but d’améliorer la survie des plasmocytes
générés afin de mieux comparer les types d’interactions permettant la différenciation des lymphocytes B
mémoires en plasmocytes, n’ont pas donné les résultats attendus. Ces molécules ont été ajoutées au milieu
de culture de base de la phase de différenciation du système de culture développé dans lequel on retrouve
aussi les interleukines 6 et 10 et les essais effectués en interaction CD154 et CD70 ont donné lieu au même
résultat. L’activité biologique de APRIL et de CXCL12 avait pourtant été confirmée alors que le facteur de
croissance IGF-R3 avait été utilisé dans un milieu sans sérum et s’était montré efficace [158]. Ces résultats
indiquent que les plasmocytes générés lors de la phase de différenciation ont des besoins beaucoup plus
complexes que ce qui a déjà été rapporté et notre étude s’est poursuivie afin de pouvoir en faire une
caractérisation plus avancée.
5.4 Caractérisation des plasmocytes générés in vitro
Tel que montré à la section 5.2, le système de culture mis au point permet la différenciation de lymphocytes B
expansionnés à l’aide d’un ou l’autre des interactions CD27 ou CD154, permet la génération de plasmocytes
CD38hiCD138+/-. Étant donné que le but à long terme des travaux est l’utilisation des cellules générées dans le
cadre de thérapie cellulaire, leur caractérisation est donc primordiale, car elle pourrait nous aider à mieux
cerner les éléments essentiels à leur survie. In vivo, on retrouve deux populations de plasmocytes se
distinguant uniquement par leur capacité à persister dans des niches de survie retrouvées dans la moelle
57
osseuse ou les MALT [15][92] et leur capacité de sécrétion d’immunoglobulines. Afin de déterminer quel type
de plasmocyte était généré dans notre modèle de culture, les cellules obtenues à la fin de la phase de
différenciation ont été étudiées afin de déterminer leur patron de sécrétion, leur morphologie, leur réponse à
différents stimuli ainsi que leur phénotype en analysant l’expression de molécules de surface.
5.4.1 Patron de sécrétion des cellules différenciées
Un essai ELISPOT a permis de déterminer le patron de sécrétion d’IgG des plasmocytes générés en culture.
On observe une hétérogénéité au niveau du patron des taches de sécrétion d’IgG des cellules, et ce, avec les
cellules issues des deux interactions cellulaires à l’étude. Tel que présenté sur la figure 5.21, la grosseur des
taches informe sur la quantité d’immunoglobuline sécrétée par une cellule. Cette caractérisation permet de
distinguer des cellules sécrétant beaucoup plus d’IgG que d’autres, ce qui laisse entrevoir une hétérogénéité
dans la population de cellules sécrétrices d’anticorps générées dans notre système de culture.
CD70
CD154
Figure 5.21 Patron de sécrétion d‘IgG. Les cellules cultivées pendant 9 jours avec l’interaction CD70 ou
CD154 ont été analysées par ELISPOT. Ce résultat est représentatif de deux expériences indépendantes.
Pour l’essai présenté, la fréquence de cellules sécrétrices était de 16% avec l’interaction CD70 et de 31 %
avec l’interaction CD154.
En sachant que les plasmocytes à longue-vie ont plus faible taux de sécrétion, les deux populations de
cellules sécrétrices observées dans la figure 5.21 pourraient représenter des populations de plasmocytes à
courte et à longue-vie. Afin de vérifier quel patron de taches pouvait être observé pour les plasmocytes à
longue-vie in vivo nous avons utilisé des échantillons congelés de moelle osseuse. Ces cellules ont été
décongelées et mises au repos durant 18h avant le début des essais d’ELISPOT (Fig. 5.22)
58
A
B
Moelle osseuse
In vitro
Figure 5.22 Patron de sécrétion d’IgG de plasmocytes de la moelle osseuse. (A) ELISPOT sur des
cellules mononuclées de la moelle osseuse d’un individu en santé. Dans ce puits, 250 000 cellules totales
avaient été déposées et la fréquence de cellules sécrétrices observée était 0,13 %. (B) Comparaison du
patron de sécrétion d’IgG de cellules provenant de la moelle osseuse par rapport à des cellules générées in
vitro après 14 jours de culture suite à une interaction avec CD154. Les deux puits comptent 62 taches de
sécrétion et proviennent respectivement de 62 500 et de 625 cellules vivantes déposées provenant de la
moelle osseuse ou générées in vitro. Les ELISPOT de moelle osseuse sont représentatifs de 5 expériences
indépendantes tandis que celui des cellules générées in vitro représente 3 expériences indépendantes.
Les analyses ont permis d’observer une hétérogénéité au niveau du patron de sécrétion des plasmocytes
provenant de la moelle osseuse comme illustrée à la figure 5.22 A. D’une manière générale, les taches de
sécrétion des cellules issues d’une culture in vitro contenaient des taches de grandeur similaire à la moelle
osseuse et aussi des taches plus grosses que ceux des cellules de moelle osseuse. (Fig. 5.22 B) suggérant la
possibilité d’une certaine similitude entre les deux sources de plasmocytes.
5.4.2 Morphologie cellulaire
Une autre manière d’analyser les cellules générées dans notre système de culture avec les interactions
cellulaires d’intérêt a été l’étude de la morphologie des cellules générées. Cela a été possible grâce à un
marquage avec des anticorps ciblant CD138, et des molécules fluorescentes ciblant l’actine et le noyau et à
leur analyse en microscopie à fluorescence (Fig. 5.23). Les cellules CD138+ ont été observées et tel
qu’attendu, elles avaient une forme elliptique avec un cytoplasme plus grand que celui des cellules CD138neg
et avaient un noyau décentré caractéristique des plasmocytes [159]. Les mêmes observations ont été faites
sur les plasmocytes générés dans les deux conditions de culture. Des contrôles négatifs sans anticorps
59
primaires ou secondaires ont été menés et il n’y avait pas de liaison non spécifique de l’anticorps secondaire
ni d’autofluorescence des cellules (résultats non montrés). De plus, la morphologie obtenue indiquait que les
cellules CD138+ générées in vitro étaient bien des plasmocytes, tel que mesuré en cytométrie en flux.
CD70
CD154
Figure 5.23 Morphologie des cellules CD138+. Les cellules ont été cultivées avec l’interaction CD70 ou
CD154 pendant 14 jours. Grossissement 100X avec de l’huile à immersion avec un microscope Nikon Eclipse
TE2000-S. Rouge : phalloïdine (actine); Bleu : Dapi (noyau); Vert : anti-CD138 (CD138).
5.4.3 Réponse intracellulaire des plasmocytes à des stimuli dans leur
environnement
Les cellules répondent à la présence de divers facteurs solubles dans leur environnement par l’activation de
voies de signalisation propres à ces facteurs. Cette faculté des plasmocytes a été étudiée par l’étude de la
signalisation intracellulaire par la méthode du FCB. Les cellules utilisées dans le cadre de cet essai sont
issues d’une culture en continu, c’est-à-dire qu’il n’y a pas eu de congélation entre la phase d’expansion et de
différenciation. La première a duré 19 jours pour tous les échantillons, mais les échantillons 1 et 2 ont été dans
un environnement de différenciation pendant 9 jours tandis que 3, 4 et 5 y ont été cultivés pendant 14 jours.
Les cellules ont été stimulées avec du LPS, de l’IL-6, de l’IL-21, de l’IFN- ou du TNF- pendant 20 min.
Dans tous les échantillons analysés, on peut voir que les plasmocytes CD38hiCD138+ répondent
principalement à la présence d’IFN- à travers l’activation de STAT1. On observe également une activation
induite par l’IL-21 à travers la phosphorylation de STAT1 et de STAT3. Ces mêmes molécules sont également
phosphorylées par la stimulation avec l’IL-6.
60
A
10
4
21
IL
-
IL
-6
2
LP
S
10
3
NS
SSC
10
1
3
10
10
2
10
0
10
0
10
1
10
10
3
10
4
3
10
0
10
1
SSC
10
2
10
3
TN
Fα
NS
10
Nα
2
0
IF
NS
1
10
10
2
Pac Blue
10
SSC
DyLight 800
10
1
10
0
0
10
1
10
2
Pac Blue
10
3
10
4
pS
TA
T1
pS
TA
T3
pN
Fκ
B
pp
38
10
pS
TA
T1
pS
TA
T3
pN
Fκ
B
pp
38
pS
TA
T1
pS
TA
T3
pN
Fκ
B
pp
38
pS
TA
T1
pS
TA
T3
pN
Fκ
B
pp
38
B
pS
TA
T1
pS
TA
T3
pN
Fκ
B
pp
38
10
NS
LPS
IL-6
IL-21
IFN-α
TNF-α
D1
D2
D3
0.25
1.62
D4
D5
3.00
Figure 5.24 Patron d’activation des plasmocytes générés in vitro. Les cellules proviennent de la culture
en continu (expansion et différenciation sans congélation des cellules entre ces deux phases) de lymphocytes
B avec l’interaction CD40-CD154. (A) Stratégie d’analyse des cellules avant leur exportation sur Cytobank.
Les cellules ont été stimulées ou non (NS: cellules non-stimulées) avec différents facteurs solubles pendant 20
min avant d’être étiquetées avec une fluorescence unique à l’aide des colorants Pacific Blue et Dylight 800.
(B) Matrices Heat Map des cinq donneurs étudiés. Les cellules de D1 et D2 ont été en environnement de
différenciation pendant 9 jours tandis que D3, 4 et 5 l’ont été pendant 14 jours. Les matrices représentent le
log2 du ratio (MFI stimulées/(MFI non-stimulées moyenne).
61
5.4.4 Expression de CD31 et CD39
L’expression des messagers ARN des molécules CD31 et CD39 a récemment été étudiée et ces molécules
pourraient permettre de faire la distinction entre les plasmocytes, les plasmablastes et les cellules B mémoires
[64]. L’expression de CD31 et CD39 sur les cellules cultivées a donc été utilisée comme outil d’analyse de
cytométrie en flux afin de compléter la caractérisation des cellules générées dans le système de culture.
L’expression de ces deux molécules de surface a été suivie sur les cellules dès leur mise en culture dans la
phase d’expansion et sur les cellules générées dans la phase de différenciation.
Dans un premier temps, l’expression de CD31 et de CD39 a été analysée après la première sélection négative
permettant l’obtention des lymphocytes B CD19+ (Fig. 5.25 A). Il s’est révélé que ces cellules du sang
périphérique exprimaient le marqueur CD39 à 88  1 %. De plus, une sous-population exprimait également la
molécule CD31 (17  7). Par la suite, le marquage des cellules obtenues lors de la deuxième étape de
sélection négative, soit les cellules B mémoires IgG+/IgA+ et/ou IgE+, a révélé la disparition de la population
CD31+ tel qu’illustré à la figure 5.25 B (0). Toutefois, la proportion de cellules CD39+ est restée la même et
était en moyenne de 85 3 %, avec une MFI de 238 ± 15. Ces cellules ont été mises en conditions
d’expansion en présence de cellules CD154+ et analysées aux jours 4 et 9.
Figure 5.25 Expression de CD31 et CD39 sur les lymphocytes B dans la phase d’expansion. (A) Le profil
d’expression de CD39 et CD31 sur les lymphocytes B, suite à la première étape de sélection négative. (B) Le
jour 0 (0) correspond aux lymphocytes B IgG+/IgA+ et/ou IgE+ obtenus après la deuxième étape de sélection
négative. Ces cellules ont été mises en culture avec des cellules CD154+ dans les conditions de la phase
d’expansion soit à un ratio 1:5 et en présence d’un mélange d’IL-2, IL-4 et IL-10 afin de favoriser leur
prolifération. L’expression de CD31 et CD39 a été analysée au jour 4 (4) et au jour 9 (9). Les graphiques
présentés sont représentatifs de 3 expériences indépendantes.
62
Dans un deuxième temps, les cellules B de la banque de 19 jours ont été analysées suite à leur décongélation
(Fig. 5.26). À ce point de leur évolution en culture, environ la moitié des cellules exprimaient le CD38, tel que
montré à la figure 5.6. Ces cellules étaient aussi à 95 ± 4 % CD39+ et une petite proportion (9 ± 3 %)
exprimait le marqueur CD31. Parmi ces cellules, une partie exprimait déjà fortement le CD38 et une analyse
des cellules CD38hiCD138+/- a permis de voir que ceux-ci exprimaient les deux marqueurs d’intérêt et se
divisaient en deux populations, soit des cellules CD31+CD39+ et CD31-CD39+ (Fig. 5.26B).
Finalement, nous avons ensuite étudié l’évolution des marqueurs CD31 et CD39 sur les plasmocytes
CD38hiCD138+/- générés pendant les 14 jours de la phase de différenciation (résultats non montrés). Sur la
base de travaux récents, dans cette série d’essais toutes les cellules exprimant fortement CD38 étaient
considérées comme étant des plasmocytes [50]. Comme observé sur les lymphocytes B lors de la phase
d’expansion (Fig. 5.26 B), tous les plasmocytes CD38hi générés étaient CD39+, peu importe l’interaction
cellulaire utilisée soit, CD70 ou CD154. De plus, ces conditions de culture n’ont pas semblé influencer la
fréquence des plasmocytes CD31+ (Fig. 5.28).
Figure 5.26 Expression de CD31 et CD39 au début de la phase de différenciation. (A) Expression de
CD38/CD138 et de CD31/CD39 au jour 0 de la phase de différenciation, avant leur mise en contact avec les
cellules support CD70+ ou CD154+. Il s’agit de l’expression sur les cellules vivantes totales. (B) L’expression
de CD31 et CD39 sur les cellules vivantes CD38hiCD138+/-. Les graphiques sont représentatifs de 6
expériences indépendantes.
L’interaction CD70 a mené à l’apparition de plasmocytes CD138+ dont 77 ± 3 % exprimaient le CD31 alors
que cette proportion avec l’interaction CD154 était de 75 ± 4 % (Fig. 5.25). Les plasmocytes CD38hi
n’exprimant pas le CD138 avaient toutefois une plus faible fréquence de CD31 +, soit 58 ± 4 % pour
63
l’interaction CD70 et 48 ± 8 % avec l’interaction CD154. Cette différence était aussi visible au niveau de la MFI
de ce marqueur qui était supérieure sur les cellules CD138+, soit 220 ± 23 par opposition à 358 ± 33 avec
l’interaction CD70. Des valeurs semblables ont été obtenues pour les cellules cultivées en interaction CD154.
CD138CD138+
10%
10
29%
3
10
10
CD39
10
10
2%
38%
3
2
2
10
1
-10
2
-10
10
4
Sang
10
4
12%
0
10
10
1
-10
2
-10
49%
1
10
2
10
3
10
4
4
4%
10
22%
3
10
2
10
1
-10
2
-10
10
10
10%
0
10
50%
1
10
2
10
3
10
4
4
2%
30%
20%
48%
Moelle osseuse
10
3
2
1
41%
35%
0
10
-10
2
-10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
CD31
Figure 5.27 Expression de CD31 et CD39 sur les plasmocytes in vivo. Les graphiques présentés sont
représentatifs de 14 expériences indépendantes pour les plasmocytes provenant du sang et de 5 expériences
pour les plasmocytes de la moelle osseuse.
Le phénotype des plasmocytes in vivo a aussi été évalué dans 14 échantillons de sang ainsi que dans 5
échantillons de moelle osseuse (figure 5.27). Les plasmocytes CD38hiCD138- en circulation exprimaient le
marqueur CD31 à 81 ± 5 % tandis que cette proportion augmentait à 93 ± 2 % chez les plasmocytes
CD38hiCD138+. De plus, la MFI de ce marqueur était cinq fois supérieure sur cette population de plasmocytes,
soit 1547 ± 223 par rapport à 310 ± 44 pour les cellules CD138- (Fig. 5.28). Pour ce qui est de la présence de
cellules positives pour CD39, la fréquence des cellules l’exprimant était trois fois plus faible dans le sang que
dans les cellules obtenues par la culture in vitro. En effet, seulement 34 ± 5 % des plasmocytes
CD38hiCD138+/- étaient positifs pour CD39. Les plasmocytes provenant de la moelle osseuse avaient une
fréquence de cellules CD39+ assez similaire à celle retrouvée dans le sang, soit 30 ± 2 % pour les cellules
CD138- et 37% ± 3 % pour les cellules CD138+.
De plus, la proportion de cellules exprimant CD31 était de 68% ± 3 % et de 85 ± 4 % pour les cellules
CD38hiCD138+ et les cellules CD38hiCD138-, respectivement. Finalement, bien que la proportion des cellules
CD39+ et CD31+ était semblable parmi les plasmocytes CD38hiCD138+ du sang et ceux de la moelle osseuse,
le niveau d’expression de CD31 sur les plasmocytes du sang était huit fois supérieur à celle de la même
population dans la moelle osseuse, soit une MFI de 1547 ± 223 dans le sang en comparaison à une MFI de
182
64
±
16
dans
la
moelle
osseuse.
CD31
Cel
lule
s
CD
hi
38
viv
ant
es
(%)
M
FI
de
s
m
ar
qu
eu
rs
125
***
**
100
*
*
CD39
*
**
***
125
***
**
100
*
75
75
50
50
25
25
0
0
1600
1500
1200
1200
400
**
*
*
**
**
**
***
**
***
***
**
**
900
***
800
**
600
*
300
0
0
-
+
CD70
-
+
CD154
-
+
Sang
-
+
MO
-
+
CD70
-
+
CD154
-
+
Sang
-
+
MO
Figure 5.28 Expression de CD31 et CD39 sur les plasmocytes. Le niveau d’expression ainsi que la
fréquence de cellules exprimant le CD31 et CD39 ont été mesurés sur les plasmocytes CD138- (-) et CD138+
(+) générés in vitro ou provenant du sang (PB) ou de la moelle osseuse (MO). Les comparaisons entre les
sous-populations de plasmocytes ont été faites avec un test non-pairé t ou Mann-Whitney (*). Les profils
d’expression des cellules CD138- (**) et CD138+ (***) de différentes origines ont été comparés avec le test de
Kruskal-Wallis.
En général, la proportion de plasmocytes CD31+ trouvée in vivo était similaire à celle générée par les
différentes interactions cellulaires in vitro. Il y avait par contre une différence marquante au niveau de
l’expression du marqueur CD39. En effet, le niveau d’expression de ce marqueur de surface était de 15 fois
supérieur sur les plasmocytes CD38hiCD138+ générés in vitro par rapport à ceux du sang et de 10 fois
supérieur à ceux provenant de la moelle osseuse (Fig 5.28).
Cette série d’expérimentations présentée plus haut a permis une caractérisation plus complète des
plasmocytes générés in vitro en fonction du profil de sécrétion d’IgG, de leur morphologie, de leur capacité à
répondre à divers stimuli ainsi que de leur expression du CD31 et du CD39. De plus, les analyses avec les
plasmocytes issus du sang ou de la moelle osseuse ont fourni des éléments de référence très intéressants
pour la comparaison des phénotypes in vivo versus in vitro.
65
6. Discussion
L’équipe du Dr Néron a mis au point un système de culture permettant l’expansion massive de lymphocytes B
mémoires grâce à l’utilisation de différentes cytokines et d’une forte interaction CD40-CD154 [158]. Les
travaux de Josiane Tremblay Rochette ont permis l’élaboration d’une combinaison de cytokine (IL-6 et 10),
permettant la différenciation de ces lymphocytes, en présence d’une faible interaction CD40-CD154 [139] . À
la vue de ces résultats, nous avons avancé qu’il serait possible d’induire une différenciation des lymphocytes
B expansionnés en plasmocytes en contrôlant des éléments de leur microenvironnement, tels que l’interaction
cellulaire utilisée lors de leur différenciation ou encore par l’ajout de divers facteurs solubles jouant aussi sur la
survie cellulaire in vivo.
Étant donné que les plasmocytes sont au cœur de l’étude, une analyse a été menée sur le meilleur clone à
utiliser en cytométrie en flux pour la détection des cellules CD138+. Cela a mis en lumière des différences
entre les clones anti-CD138 existant sur le marché, ce qui nous amené à poursuivre le reste des analyses
avec le clone B-A38. Pour ce qui est du système de culture, nous avons pu constater que l’interaction CD27CD70 induisait une différenciation plus rapide des lymphocytes B mémoires expansionnés auparavant avec
une interaction CD40-CD154, bien que la fréquence de plasmocytes générés dans les deux conditions était
semblable à la fin de la culture. L’ajout de facteurs de survie dans le milieu de culture de ces cellules n’a pas
semblé influencer la viabilité des cellules cultivées avec l’une ou l’autre des interactions cellulaires étudiées.
Par ailleurs, la caractérisation de ces plasmocytes générés à travers leur expression du CD31 et du CD39 a
démontré la ressemblance dans ces populations cellulaires tout en mettant en lumière une différence entre les
cellules générées in vitro et celles retrouvées dans le sang ou dans la moelle osseuse.
6.1 Le clone DL101 anti-CD138 détecte une nouvelle souspopulation de plasmocytes in vitro
Bien que la forte expression de la molécule CD38 (CD38hi) permette de distinguer les plasmocytes parmi les
sous-populations de lymphocyte B, la molécule CD138 demeure jusqu’à présent le marqueur unique de ces
cellules issues de la différenciation terminale des lymphocytes B [66]. Étant donné le rôle central de ce
marqueur dans l’étude des plasmocytes, il était important de s’assurer de la bonne détection de ces cellules
dans notre système de culture, en choisissant le meilleur clone lors des analyses en cytométrie en flux. Cette
analyse est très importante, car une divergence a déjà été rapportée concernant les anticorps anti-CD38. En
effet, le clone HB7 (anti-CD38) n’a pas le même patron de marquage que le clone HIT2 sur les cellules
provenant du sang [160], même s’ils sont couplés au même fluorochrome. Pour les plasmocytes, jusqu’à
présent, le clone B-A38 était préférentiellement utilisé dans notre laboratoire pour la détection des cellules
67
CD138+. La comparaison des clones 1D4, BA-38, B-B4, DL101 et MI-15 nous a permis de constater que le
clone DL101 se distinguait des autres dans sa capacité de détection d’une plus grande proportion de cellules
CD138+ (Fig. 5.1D). De plus, la quantité de cellules détectée par DL101 était équivalente en présence ou
absence du clone B-A38, ce qui suggère que DL-101 peut se lier sur les cellules qui portent l’épitope de B-A38
et sur d’autres cellules qui ne le portent pas (Fig. 5.1D). Cette divergence de réactivité anti-CD138 pourrait
provenir de son origine. En effet, parmi tous les clones testés, DL-101 est le seul qui a été obtenu par une
immunisation de souris faite à partir de la protéine CD138 recombinante [150], alors que tous les autres ont
été obtenus par l’utilisation de lignées cellulaires CD138+ en tant que source d’antigène [66][149]. La molécule
CD138 exprimée par les plasmocytes générés in vitro pourrait avoir un épitope spécifiquement détecté par le
clone DL101. Aucune différence dans la capacité de détection de cellules CD138+ entre les clones B-A38 et
DL101 n’a été observée dans des échantillons de sang ou de la moelle osseuse (Fig. 5.3), indiquant que
l’épitope DL-101 semble spécifiquement présent sur les cellules générées in vitro. Une population dite « BA38-DL101+ » a d’ailleurs été détectée parmi les plasmocytes générés in vitro (Fig. 5.4), montrant bien que le
clone DL101 et le clone B-A38 ciblent des épitopes différents. De plus, l’épitope reconnu par DL-101 semble
être présent de façon distincte sur environ 213% des cellules générées in vitro (Fig. 5.4B).
En plus des plasmocytes sains, le CD138 est aussi le marqueur des plasmocytes malins et est ciblé dans les
thérapies contre les cancers touchant ces cellules tels que les myélomes multiples [161]. Sur la base de nos
observations, une investigation plus poussée de la présence de cellules DL101+ serait intéressante, afin de
voir si une telle sous-population de plasmocytes pourrait exister dans ce cancer. De plus, CD138 a récemment
été détecté à la surface de cellules dendritiques générées in vitro à partir de monocytes provenant d’individus
en santé ayant été stimulés avec le sérum d’individus atteints de lupus érythémateux disséminé [162]. Nous
avons pu déduire que le clone anti-CD138 utilisé dans cette étude était le DL-101 selon les informations
fournies par les auteurs. Étant donné que cette étude est la seule à rapporter la présence de CD138 sur des
cellules autres que les plasmocytes, il faut s’interroger sur la nature de l’épitope détecté par le clone DL-101, à
savoir si celui-ci est spécifique à l’environnement des cellules. D’après nos résultats et ceux de Joo et coll., il
serait possible de postuler que cette population de cellules émerge spécifiquement grâce à la culture in vitro
[162]. Il serait donc intéressant de déterminer si les conditions de culture des cellules peuvent avoir un effet
sur l’émergence de cette population DL101+. Une caractérisation plus exhaustive de cette population de
plasmocytes pourrait être faite. À la lumière de ces considérations, la suite de l’étude sur la différenciation in
vitro des plasmocytes a été réalisée avec le clone B-A38, car celui-ci avait la même capacité d’identification
des cellules CD138+ peu importe l’origine des cellules analysées.
Ces résultats font l’objet d’un manuscrit intitulé : Flow cytometry assessment of in vitro generated CD138+
plasma cells, qui a été récemment soumis au journal BioMed Research International.
68
6.2 L’interaction cellulaire induit une différenciation plus rapide
Dans le cadre de l’amélioration du système de culture permettant la génération entre autres de plasmocytes
CD138+, une comparaison a été faite entre la culture des cellules avec les interactions CD40-CD154 et CD27CD70 dans la phase de différenciation. Il est ressorti que l’interaction CD70 induit une différenciation plus
rapide des lymphocytes B mémoires en plasmocytes CD38hi dans les 5 premiers jours de la culture par
rapport à l’interaction CD154 (Fig. 5.6). Toutefois, la quantité de plasmocytes générés après 14 jours est
semblable dans les deux conditions ainsi que le niveau de sécrétion d’immunoglobuline des cellules (Fig. 5.6
et 5.7). Cette différenciation rapide induite par l’interaction CD70 entre les jours 0 et 5 de la mise en culture
des cellules illustre le processus rapide qui se produit in vivo dans les centres germinatifs lors de la réaction
immunitaire secondaire [29][27]. En effet, les lymphocytes B mémoires CD27+ interagissent avec les
lymphocytes T activés exprimant le CD70, ce qui induit leur différenciation rapide en plasmocytes [163][164].
D’ailleurs, ce modèle a été prouvé in vitro, par l’induction de la différenciation de cellules B CD27 + cultivées en
présence de lymphocytes T CD70+ [165].
Lors de la mise en culture des cellules suite à leur décongélation, moins de 33% des cellules exprimaient le
CD27. Cette proportion était de 60 et 75 % en interaction CD70 et CD154 respectivement, après 14 jours de
culture (Fig. 5.8B). Cela laisse entrevoir une interaction possible entre les lymphocytes B à travers le CD27 et
CD70, qui mène à leur différenciation. Bien que les lymphocytes B puissent interagir entre eux, ils ont besoin
d’une source extérieure de CD70 pour se différencier. En effet, des travaux précédents de l’équipe ont
démontré que le retrait total du signal CD154 ou CD70 de l’environnement de culture des cellules induit
l’apoptose de celles-ci (résultats non publiés), ce qui suggère que l’environnement accompagnant le CD70
jouerait un rôle dans l’interaction avec les lymphocytes B CD27+. Ainsi, ces deux interactions, CD154 et CD70,
sont importantes pour la survie et la différenciation in vitro des lymphocytes B mémoires. Nos résultats
montrent qu’il semble tout de même y avoir une modulation dans le nombre de cellules CD70 par lymphocytes
B permettant leur différenciation (Fig. 5.5). Ainsi, l’utilisation d’une forte interaction CD27-CD70 induit une plus
faible différenciation des lymphocytes B. De plus, la présence d’IL-10 dans le milieu de culture pourrait
également favoriser cette interaction cellulaire, puisque l’IL-10 et CD70 peuvent agir de façon synergique pour
induire la différenciation de cellules B en cellules sécrétrices d’immunoglobulines [140]
Peu importe l’interaction cellulaire utilisée, l’augmentation de l’expression de CD27 sur les cellules en culture
est une preuve supplémentaire de la différenciation des cellules en plasmocytes, qui sont connus pour
fortement exprimer ce marqueur de surface [50]. Ce haut niveau d’expression de CD27 suggère également
une importance de cette molécule dans la différenciation ou la survie des plasmocytes.
69
6.3 Complexité du microenvironnement de survie des
plasmocytes
Nous avons constaté qu’aucune des molécules de survie notamment APRIL et CXCL12 ajoutées au système
de culture établi n’induisait une amélioration de la viabilité cellulaire (Fig. 5.11). Ces résultats n’étaient pas
attendus puisque APRIL et le CXCL12 sont tous deux sécrétés dans la moelle osseuse et considérés comme
des facteurs de survie indispensables pour les plasmocytes [105][109][106][166]. L’absence d’effet sur la
viabilité cellulaire suite à la culture des cellules en présence de ces molécules suggère que l’environnement in
vitro des plasmocytes n’est pas assez représentatif de leur vrai microenvironnement. Il manque certainement
des éléments ou il y a des interactions non nécessaires dans le modèle de culture des cellules, qui pourraient
contrecarrer l’effet de ces molécules de survie. De plus, la faible fréquence de cellules exprimant les
récepteurs d’APRIL, soit moins de 20% des cellules positives pour TACI ou BCMA, (Fig. 5.15A) pourrait
expliquer l’absence d’effet par cette molécule. APRIL peut aussi se lier à BAFF-R [107], mais étant donné la
faiblesse de son affinité avec ce récepteur, son expression n’a pas été étudiée sur les cellules générées in
vitro. Par ailleurs, l’induction de la prolifération d’une lignée cellulaire de lymphocytes T, qui ne présentent pas
de récepteurs connus d’APRIL à leur surface, suggère que cette molécule peut agir à travers un autre
récepteur que BCMA et TACI tel que suggéré dans la littérature [167][168].
Nos résultats suggèrent que malgré son rôle crucial rapporté par plusieurs études [101, 105][166], APRIL ne
semble pas avoir d’effet sur la culture de plasmocytes dans notre modèle in vitro. Cette observation est
corroborée par les travaux de l’équipe de Cocco et coll. [132]. Cette équipe a observé le même insuccès avec
le CXCL12, ce qui est aussi en accord avec nos observations (Fig. 5.18). Dans notre système de culture, nous
avons observé que les cellules répondaient à la présence de CXCL12 par la diminution attendue de
l’expression de CXCR4 (Fig.5.19). En effet, suite à l’interaction entre le CXCL12 et son récepteur CXCR4, ce
dernier est internalisé [157][156]. Nous savons donc que la molécule utilisée avait une activité biologique.
L’environnement in vitro de notre modèle ne semble pas permettre aux cellules de bénéficier de la présence
de CXCL12, pas plus que de APRIL. Toutefois, la faible proportion soit 13 % (Fig.5.19) de cellules exprimant
le récepteur CXCR4 à la fin de la culture montre que très peu de cellules peuvent réagir avec cette chimiokine.
Ces résultats suggèrent que les plasmocytes générés par notre système de culture, qu’ils soient obtenus suite
à l’interaction CD70 ou CD154, sont probablement différents des cellules retrouvées dans le sang et la moelle
osseuse. De plus, le type de plasmocyte généré soit à longue-vie ou à courte-vie, pourrait aussi expliquer ces
différences et l’absence de la réponse aux molécules de survie dans l’environnement de culture.
6.4 Vers une meilleure caractérisation des plasmocytes générés
Le but ultime de la différenciation in vitro des lymphocytes B mémoires en plasmocyte est leur utilisation en
thérapie cellulaire. Les essais effectués sur la caractérisation des cellules générées in vitro démontrent que
70
celles-ci n’ont pas les mêmes caractéristiques que les plasmocytes à longue-vie retrouvés dans la moelle
osseuse (Fig. 5.27). La différence principale entre ceux-ci et les cellules obtenues dans le système de culture
est l’expression de la molécule CD39. In vitro, ce marqueur est présent sur les lymphocytes B mémoires
depuis leur isolation du sang jusqu’à leur différenciation (Fig. 5.25 et 5.26). Bien que son expression ait déjà
été observée sur les cellules B en circulation [83], la faible quantité de son ARNm dans les plasmocytes [64]
suggérait qu’il pourrait s’agir d’un marqueur intéressant pour la détection des lymphocytes B en différenciation.
Le marqueur CD31 quant à lui est une molécule retrouvée sur les plasmocytes de la moelle osseuse, qui sont
connus comme étant des cellules totalement différenciées [169]. Étant donné que 45 à 77 % des plasmocytes
(CD138+/-) générés in vitro expriment cette molécule (Fig. 5.29), on pourrait penser que ces cellules sont en
fait des précurseurs de plasmocytes, qui perdront l’expression de CD39, une fois arrivées dans une niche de
survie. Toutefois, la baisse de la viabilité des cellules en culture (Fig. 5.10C) ne permettait pas de vérifier cette
hypothèse de diminution de CD39 à plus long terme.
L’augmentation de l’expression du marqueur CD31 sur les plasmocytes CD138+ indique un phénotype plus
mature de ces cellules [50]. Dans notre modèle de culture, la molécule CD31 serait exprimée par une
population de lymphocytes B naïfs (Fig. 5.25A) et disparaitrait au stade de lymphocyte mémoire pour
réapparaître au fur et à mesure de la différenciation des B, avec une plus forte expression sur les plasmocytes
CD138+. La présence de CD31 sur des cellules B naïves a déjà été rapportée sur cette population de cellules
provenant des amygdales [75] et les travaux de Vos et coll confirment son haut niveau d’expression sur les
plasmocytes.
La molécule CD31 est aussi connue comme un ligand du CD38, dont l’expression est augmentée sur les
plasmocytes [50]. L’interaction de ces deux molécules pourrait donc avoir un rôle dans la survie de ces
cellules. D’ailleurs, l’expression de CD31 sur les cellules stromales créée une interaction supplémentaire entre
ces cellules et les plasmocytes dans les niches [170].
Nos résultats complètent les travaux de De Vos et coll. quant à l’expression de CD39 et CD31 sur les
différentes sous-populations de lymphocytes B différenciés [64]. Toutefois, les différences observées au
niveau de l’expression de CD39 invitent à être vigilant quant à l’interprétation des résultats basés sur
l’utilisation de l’ARNm comme indicateur de la présence d’un marqueur de surface sur une population
cellulaire donnée. L’analyse protéique demeure indispensable pour confirmer les résultats. Par ailleurs, l’étude
simultanée de l’expression de ces deux molécules à la surface sur des populations de lymphocytes B
différenciés in vitro permet de distinguer de nouvelles sous-populations de cellules différenciées qui pourraient
peut-être être reliés aux plasmocytes à courte-vie ou longue-vie.
De plus nos observations mettent en lumière une différence entre les plasmocytes générés in vitro et ceux
retrouvés in vivo, soit dans la circulation sanguine ou la moelle osseuse. Une étude phénotypique détaillée
des plasmocytes permettrait de mieux caractériser ces cellules tout en standardisant leur physiologie pour les
71
chercheurs s’intéressant à ces cellules. Ce type d’étude pourrait s’insérer dans un projet d’envergure tel que le
consortium d’immunophénotypage chez l’humain (Human Immunophenotyping Consortium) dont le but est la
standardisation
72
de
l’identification
des
différentes
cellules
du
système
immunitaire
[160].
7. Conclusion
Cette étude a permis l’amélioration de la différenciation in vitro des lymphocytes B mémoires humains suite à
leur expansion. Elle a également permis la caractérisation des plasmocytes générés et mis en lumière des
éléments de la biologie de ces cellules centrales du système immunitaire humorale. Ces éléments tels que la
réponse intracellulaire des plasmocytes générés peuvent permettre une comparaison de ces derniers avec les
myélomes multiples et mener à une meilleure compréhension de cette maladie.
Nous avons pu constater que les interactions cellulaires entre CD27 et CD70 et entre CD40 et CD154 sont
toutes deux importantes pour la différenciation de lymphocytes B mémoires in vitro. L’ensemble des résultats
met en lumière un nouveau modèle intéressant pour la génération de plasmocytes en culture, soit l’activation
et l’expansion cellulaire en présence de l’interaction CD154, leur différenciation rapide en précurseurs de
plasmocytes avec l’interaction CD70. Nos observations indiquent toutefois que le microenvironnement actuel
n’est pas adéquat pour la survie à long-terme. Les plasmocytes CD38hi générés pourraient donc être isolés et
mis dans un milieu de survie constitué de cellules stromales tel qu’illustré à la figure 7.1. Dans un tel contexte,
les cellules pourraient devenir aptes à répondre aux molécules de survie telles qu’APRIL ou le CXCL12.
D’ailleurs, l’utilisation de telles cellules-support a déjà fait ses preuves dans des systèmes de culture de
lymphocytes B [92][132]. Ce modèle permettrait l’obtention de plasmocytes qui pourront par la suite être
utilisés pour des patients immunosupprimés, en attendant la reconstitution de leur système immunitaire suite à
une transplantation de cellules souches.
Figure 7.1 Modèle proposé pour l’évolution de la différenciation des lymphocytes B mémoires en
plasmocytes in vitro. La première phase de la culture consiste en l’activation et l’expansion des lymphocytes
B en utilisant l’interaction CD40-CD154. La deuxième phase en interaction CD27-CD70 induit la différenciation
cellulaire tandis que la troisième permet la survie des plasmocytes générés à travers l’interaction de ces
cellules avec une lignée stromale. L’expression du marqueur CD31 débute avec la différenciation des
lymphocytes B mémoires tandis que le CD39 est présent sur les cellules depuis leur mise en culture. Son
expression diminue dans l’environnement de survie des plasmocytes sans toutefois disparaître complètement.
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