Inflammation cutanée et borréliose de Lyme
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UNIVERSITÉ DE STRASBOURG ÉCOLE DOCTORALE VIE ET SANTÉ EA 4438 Physiopathologie et médecine translationnelle Groupe borréliose de Lyme THÈSE présentée par : Frédéric SCHRAMM soutenue le : 29 mars 2012 pour obtenir le grade de : Docteur de l’université de Strasbourg Discipline/ Spécialité : Vie et Santé / Aspects cellulaires et moléculaires de la biologie Inflammation cutanée et borréliose de Lyme – étude in vitro des interactions entre les cellules résidentes de la peau et Borrelia – THÈSE dirigée par : BOULANGER-CHICOIS Nathalie JAULHAC Benoît Docteur, Université de Strasbourg Professeur, Université de Strasbourg RAPPORTEURS : LOZNIEWSKI Alain GUEIRARD Pascale Professeur, Faculté de Médecine de Nancy Docteur, Institut Pasteur de Paris AUTRES MEMBRES DU JURY : LIPSKER Dan BOYE Thierry Professeur, Université de Strasbourg Docteur, Hôpital d'instruction des armées, Toulon 1 REMERCIEMENTS À Madame le Docteur Nathalie Boulanger et Monsieur le Professeur Benoît Jaulhac. Je vous remercie d’avoir dirigé ce travail de thèse. Aux membres du jury, Monsieur le Professeur Professeur Alain Lozniewski, Madame le Docteur Pascale Gueirard, Monsieur le Professeur Dan Lipsker, Monsieur le Docteur Thierry Boye. Je vous remercie d’avoir accepté d’évaluer la qualité scientifique de ce travail. Je tiens également à remercier Cathy Barthel, Élodie Colin, Chantal Deléna, Aurélie Kern, Sylvie de Martino et Claire Marchal. Merci pour votre gentillesse, votre disponibilité et toute l’aide que vous m’avez apportée durant de ce travail. À mes parents et grands-parents qui m’ont soutenu tout au long de mes études. À toute ma famille. À Gaëlle, Thomas et Valentine, avec tout mon amour. 2 LISTE DES ABRÉVIATIONS ACA : acrodermatite chronique atrophiante MCP-1 : monocyte chemoattractant protein 1 ADN : acide désoxyribonucléique MFAP : microfibril-associated glycoprotein ARN : acide ribonucléique MMP : matrix metalloprotease BCR : B cell receptor MSCRAMMs : Bgp : Borrelia gag binding protein adhesive matrix molecules Bip : B-cell inhibitory protein Msp : major surface protein Bmp : Borrelia membrane protein MyD88 : myeloid differentiation primary response gene 88 BSK : Barbou – Stoenner – Kelly NK : natural killer cell CD : cluster de différenciation NKT : natural killer T lymphocyte CFHRs : complement factor H-related proteins NLR : nucleotide-binding domain and leucine- rich repeat- CLA : cutaneous lymphocyte-associated antigen containing molecule CMH : complexe majeur d’histocompatibilité NOD : nucleotide oligomerization domain CPA : cellule présentatrice d’antigène Oms66 : outer membrane-spanning 66-kDa protein CRASP : complement regulator-acquiring surface protein Osp : outer surface protein CSF : colony stimulating factor PAI : plasminogen activator inhibitor Dbp : decorin binding protein PAMPs : pathogen associated molecular patterns DC-SIGN : dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule- PBMCs : peripheral blood mononuclear cells 3-grabbing non-integrin PBS : phosphate buffered saline ELAM-1 : endothelial leukocyte adhesion molecule 1 PCR : polymerase chain reaction Erp : OspE-F related lipoprotein PRR : pattern recognition receptor FGF : fibroblast growth factor RFLP : restriction length fragment polymorphism Fnbp : fibronectin binding protein RST : ribosomal spacer type GAG : glycosaminoglycane Salp : salivary protein GM-CSF : granulocyte/macrophage colony-stimulating factor Serpin : serin protease inhibitor hBD : human β-defensin Sfbp : streptococcal fibronectin binding protein ICAM-1 : intercellular adhesion molecule 1 STARI : southern tick-associated rash illness IFN : interféron TBE virus : tick-borne encephalitis virus IL : interleukine TGF : transforming growth factor Irac : Ixodes ricinus salivary anticomplement protein TIMP : tissue inhibitors of metalloproteases IRIS : Ixodes ricinus immunosuppressor TLR : Toll-like receptor Ir-LBP : Ixodes ricinus leukotriene B4-binding protein TNF : tumor necrosis factor IRS-2 : Ixodes ricinus serpin-2 tPA : tissue-type plasminogen activator Isac : Ixodes scapularis salivary anticomplement protein Tpr : Treponema pallidum repeat KGF : keratinocyte growth factor TROSPA : tick receptor for OspA LFA-1 : lymphocyte function-associated antigen 1 uPA : urokinase-type plasminogen activator LIPER : lipocalin from Ixodes persulcatus VEGF : vascular endothelial growth factor LIR : lipocalin from Ixodes ricinus VlseE : VMP (vesicular membrane protein)-like sequence E LPS : lipopolysaccharide microbial surface components recognising 3 TABLE DES MATIÈRES INTRODUCTION 8 I 8 LA PEAU : SA STRUCTURE ET SES PRINCIPALES COMPOSANTES A L’ÉPIDERME ET LES KÉRATINOCYTES 10 B LA JONCTION DERMO-ÉPIDERMIQUE 14 C LE DERME : FIBROBLASTES ET MATRICE EXTRACELLULAIRE 15 1 Les fibroblastes 17 2 La matrice extracellulaire 21 Composants principaux de la matrice extracellulaire 23 Les enzymes protéolytiques : métalloprotéases et sérine-protéases 25 D LES DÉFENSES IMMUNITAIRES DE LA PEAU 27 1 La réponse immunitaire innée 27 La cascade du complément 29 Les peptides antimicrobiens 30 Activation de la composante cellulaire de l’immunité innée 31 2 La réponse immunitaire adaptative 35 II BORRÉLIOSE DE LYME : ASPECTS ÉPIDÉMIOLOGIQUES ET CLINIQUES 37 A HISTORIQUE 37 B ÉPIDÉMIOLOGIE DE LA BORRÉLIOSE DE LYME 40 C MANIFESTATIONS CLINIQUES 41 1 Aspects cliniques principaux et histoire naturelle de la maladie 41 2 Manifestations cutanées de la borréliose de Lyme 49 III A L’érythème migrant 49 Le lymphocytome borrélien 51 L’acrodermatite chronique atrophiante 52 BORRÉLIOSE DE LYME : LE VECTEUR, LA BACTÉRIE ET SA TRANSMISSION 56 BIOLOGIE DES TIQUES 56 4 1 2 B Généralités 56 Taxonomie 56 Anatomie 56 Cycle de développement 58 Biotope et répartition géographique des espèces vectrices de la borréliose de Lyme 62 La salive de tique 65 Activité anti-hémostatique 65 Activité anti-inflammatoire de la salive et modulation de la réponse immunitaire innée 66 Effet sur la réponse immunitaire adaptative 70 BIOLOGIE DES BORRELIA 75 Taxonomie et répartition géographique 75 Structure et organisation génomique de la bactérie 78 C TRANSMISSION DE BORRELIA 80 1 Dynamique de la transmission 81 2 IV 1 2 3 Évolution topographique et dynamique de Borrelia chez le vecteur 81 Délai de transmission du vecteur à l’hôte 82 Bases moléculaires de la transmission 83 Situation avant la prise du repas sanguin 83 Modifications moléculaires engendrées par le gorgement 84 Initiation de l’infection chez l’hôte vertébré 85 L’histoire du vaccin 86 INTERACTION DE BORRELIA AVEC LA PEAU ET SON SYSTÈME IMMUNITAIRE 88 Interaction de Borrelia avec la matrice extracellulaire 88 Les adhésines de Borrelia 88 Borrelia et destruction de la matrice extracellulaire 91 Initiation de la réponse immunitaire par Borrelia 93 Interaction de Borrelia avec les TLRs 94 Interaction de Borrelia avec les autres PRRs 96 Activation des réponses immunitaires spécifiques 97 Mécanismes d’échappement de Borrelia à la réponse immunitaire 101 5 Mécanismes d’échappement à l’action du complément 101 Mécanismes d’échappement à la réponse immunitaire humorale 103 Mécanismes « physiques » d’échappement à la réponse immunitaire 105 Contribution de la salive de tique aux mécanismes d’échappement de Borrelia 108 PRÉSENTATION DU PROJET 112 1 Contexte général 112 2 Présentation du projet de recherche 113 ARTICLE 1 115 ARTICLE 2 129 DISCUSSION 145 I DISCUSSION TECHNIQUE 145 1 In vitro et in vivo 145 2 Choix des cellules étudiées : kératinocytes et fibroblastes 147 3 Choix des spirochètes utilisés et conditions expérimentales de culture 149 4 Préparation des extraits de glandes salivaires de tique 151 5 Analyse des microarrays 152 II DISCUSSION SCIENTIFIQUE 154 1 La salive de tique dans la transmission de Borrelia 154 Effet antialarmine de la salive de tique 155 Effet lytique de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés humains 156 2 Inflammation cutanée dans la borréliose de Lyme 158 3 Recherche d’une « signature » inflammatoire liée à l’origine de la souche 160 4 Peau, immunité et maladies à transmission vectorielle 163 CONCLUSIONS 166 BIBLIOGRAPHIE 167 6 TABLE DES ILLUSTRATIONS FIGURE 1 : PRINCIPALES STRUCTURES DE LA PEAU................................................................................. 7 FIGURE 2 : ORGANISATION DE L’ÉPIDERME ET DES KÉRATINOCYTES ............................................ 9 FIGURE 3 : PRINCIPAUX ÉLÉMENTS DE LA JONCTION DERMO-ÉPIDERMIQUE ................................ 13 FIGURE 4 : ULTRASTRUCTURE DES FIBROBLASTES ............................................................................... 16 FIGURE 5 : HÉTÉROGÉNÉITÉ ANATOMIQUE ET INTRATISSULAIRE DES FIBROBLASTES .............. 16 FIGURE 6 : PRINCIPAUX ÉLÉMENTS DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE ...................................... 22 FIGURE 7 : SYSTÈME DU COMPLÉMENT ..................................................................................................... 28 FIGURE 8 : LES RÉCEPTEURS DE TYPE TOLL ............................................................................................. 32 FIGURE 9 : BORRELIA BURGDORFERI, MALADIE DE LYME – ORIGINE DES MOTS............................ 39 FIGURE 10 : MANIFESTATIONS CUTANÉES DE LA BORRÉLIOSE DE LYME ....................................... 47 FIGURE 11 : ASPECTS HISTOLOGIQUES DES MANIFESTATIONS CUTANÉES DE LA BORRÉLIOSE DE LYME . 48 FIGURE 12 : POSITION TAXONOMIQUE DES TIQUES DU GENRE IXODES ............................................ 55 FIGURE 13 : PRINCIPAUX ÉLÉMENTS ANATOMIQUES DE LA TIQUE ET DE SES PIÈCES PIQUEUSES ..... 55 FIGURE 14 : STASES DE DÉVELOPPEMENT DE LA TIQUE I. RICINUS ................................................... 57 FIGURE 15 : ORGANE DE HALLER................................................................................................................. 57 FIGURE 16 : CYCLE DE DÉVELOPPEMENT DE LA TIQUE ........................................................................ 59 FIGURE 17 : TIQUE « À L’AFFÛT » SUR LA VÉGÉTATION, EN ATTENDANT LE PASSAGE D’UN HÔTE .... 61 FIGURE 18 : PIQÛRE DE TIQUE....................................................................................................................... 61 FIGURE 19 : DISTRIBUTION GÉOGRAPHIQUE DES PRINCIPALES TIQUES VECTRICES DE LA BORRÉLIOSE DE LYME ................................................................................................................................... 61 FIGURE 20 : POSITION TAXONOMIQUE DES BACTÉRIES DU GENRE BORRELIA................................ 74 FIGURE 21 : STRUCTURE DES BACTÉRIES DU GENRE BORRELIA ......................................................... 77 TABLEAU 1 : PROTÉINES ANTI-HÉMOSTATIQUES ET IMMUNOMODULATRICES DE LA SALIVE DE TIQUE. . 64 7 Figure 1 : Principales structures de la peau crête épidermique Épiderme papille dermique derme papillaire rete subpapillare glande sudoripare Derme derme réticulaire glande sébacée Hypoderme follicule pileux rete cutaneum D’après Grice et coll., 2011. 8 Introduction INTRODUCTION I LA PEAU : SA STRUCTURE ET SES PRINCIPALES COMPOSANTES La peau est un tissu complexe qui constitue une barrière contre les agressions physiques et chimiques du milieu extérieur [Proksch et coll., 2008]. Elle constitue également une barrière immunologique contre les microorganismes qui colonisent de façon transitoire ou permanente sa surface [Grice et coll., 2011], ou qui y pénètrent au bénéfice d’une effraction cutanée, à l’image des bactéries, virus, ou parasites des maladies à transmission vectorielle [Nestle et coll., 2009]. Outre son rôle de protection, la peau est également un organe sensoriel [Birder et coll., 1994]. Elle exerce aussi diverses fonctions métaboliques (synthèse de la vitamine D3, par exemple [Holick, 1988]), et participe à la régulation thermique de l’organisme. La peau est constituée d’un épithélium – l’épiderme – qui repose sur un tissu conjonctif – le derme (Figure 1). La peau repose elle-même sur le tissu adipeux sous-cutané – l’hypoderme –, qui assure la jonction entre celle-ci et les organes et tissus sous-jacents. 9 Introduction Figure 2 : Organisation de l’épiderme et des kératinocytes D’après Denecker et coll., 2008. 10 Introduction A L’ÉPIDERME ET LES KÉRATINOCYTES L’épiderme constitue la couche la plus superficielle de la peau. Son épaisseur est faible, de l’ordre du dixième de millimètre, mais varie considérablement selon la partie du corps considérée1 [Kanitakis, 2002]. L’épiderme est un épithélium pavimenteux stratifié kératinisé d’origine ectodermique. Les kératinocytes y sont très largement majoritaires puisqu’ils représentent à eux seuls plus de 95 % des cellules de l’épiderme [Kanitakis, 2002]. L’agencement et la différenciation des kératinocytes permettent d’individualiser quatre couches successives au sein de l’épiderme [Stevens et coll., 2006]. La couche basale est la couche la plus profonde (Figure 2). Elle est constituée d’une seule assise de kératinocytes non différenciés : les kératinocytes basaux. Ce sont des cellules hautes, cylindriques, dont le grand axe est perpendiculaire à la jonction dermo-épidermique. Elles sont reliées entre elles et aux cellules de la couche épineuse adjacente par des desmosomes ; elles sont également reliées à la lame basale sous-jacente par des hémidesmosomes [Kanitakis, 2002]. Les kératinocytes basaux sont des cellules souches dont la prolifération, puis la migration vers les couches supérieures et la différenciation cellulaire permettent le renouvellement constant de l’épiderme. Les cellules basales qui migrent dans la couche épineuse perdent leur morphologie cylindrique, elles s’aplatissent et prennent un aspect polygonal. Sur les préparations histologiques, où existe une certaine rétraction du cytoplasme, les kératinocytes de la couche épineuse semblent accrochés entre eux par des épines (d’où le nom donné à cette couche de cellules), qui correspondent à autant de desmosomes permettant l’ancrage des filaments de kératine2 [Kanitakis, 2002]. La production de kératine dans ces cellules augmente, les filaments de kératine deviennent plus épais et plus 1 En peau fine (paupières par exemple) son épaisseur ne dépasse pas 50 µm, alors qu’en peau épaisse (paume des mains et plante des pieds) son épaisseur peut atteindre 1 mm en raison de l’importance de la couche cornée. 2 Les kératines sont les composants des filaments intermédiaires des cellules épithéliales. 11 Introduction denses. Les kératinocytes de la couche épineuse de l'épiderme forment plusieurs rangées cellulaires (3 à 4 assises cellulaires en peau fine et 8 à 10 en peau épaisse). La couche granuleuse, située au-dessus de la couche épineuse, est formée par 2 à 3 rangées de cellules. Les kératinocytes de la couche granuleuse sont très aplatis et leur noyau commence à dégénérer [Stevens et coll., 2006]. Ces cellules sont caractérisées par l’accumulation de matériel cytoplasmique majoritairement composé de kératine et de lipides. L’aspect granuleux est dû à la présence de grains de kératohyaline3 et de petits grains lamellaires riches en lipides, les kératinosomes4. La couche cornée représente la couche la plus superficielle de l’épiderme. C’est elle qui confère le plus à la peau sa fonction de barrière physique [Proksch et coll., 2008]. Elle est composée de 5 à 10 assises de cellules mortes, les cornéocytes. Ces cellules sont complètement aplaties, dépourvues de noyau et d’organites intracellulaires, et leur cytoplasme est composé de kératine et de filaggrine5. Les cornéocytes les plus superficiels se détachent de l’épiderme après la lyse du ciment intercellulaire et des desmosomes6. Dans certaines régions corporelles (en peau épaisse uniquement), on distingue encore une 5e couche, la couche claire (stratum lucidum) qui correspond à une zone intermédiaire de transition entre la couche granuleuse et la couche cornée et dont le rôle principal est de limiter les forces de friction entre ces deux structures [Stevens et coll., 2006]. Outre les kératinocytes, l’épiderme comprend également les mélanocytes, les cellules de Merkel7, ainsi que des cellules immunitaires spécialisées d’origine hématopoïétique : il s’agit 3 Les grains de kératohyaline contiennent de multiples copies de profilaggrine. Dans la couche cornée, la profilaggrine se transforme en filaggrine qui participe à formation de la matrice cytoplasmique des cornéocytes. 4 Les kératinosomes déversent leur contenu par exocytose dans les espaces intercellulaires de la couche cornée ; ils y forment un ciment intercornéocytaire fait de lamelles lipidiques. 5 6 7 La filaggrine agrège les filaments de kératine et permet leur organisation en faisceaux dans les cornéocytes. C’est le phénomène de desquamation. Ces cellules ont pour fonctions celles de mécanorécepteurs, et pourraient également exercer des fonctions trophiques sur les terminaisons nerveuses périphériques et les annexes cutanées. 12 Introduction majoritairement des cellules de Langerhans, mais également de lymphocytes T, principalement CD8+ [Nestle et coll., 2009]. Les cellules de Langerhans sont les cellules dendritiques de l’épiderme, leur fonction principale est de capturer les antigènes et de les présenter aux lymphocytes T CD4+ après avoir migré vers les ganglions lymphatiques. L’épiderme ne contient ni vaisseaux sanguins ni vaisseaux lymphatiques. Il est séparé du tissu conjonctif sur lequel il repose – le derme –, par une lame basale qui constitue la jonction dermo-épidermique. Introduction 13 Figure 3 : Principaux éléments de la jonction dermo-épidermique Adhésion focale Hémidesmosome laments de kératine Kératinocyte basal Épiderme laments d’actine plectine - BPAG1 BPAG2 intégrine α3β1 intégrine α6β4 Filaments d’ancrage Lamina lucida collagène XVII laminine laminines Lame basale collagène IV nidogène Fibres d’ancrage perlécane Lamina densa collagène VII collagènes I et III NOTE. BPAG1 : bullous pemphigoid antigen-1. BPAG2 : bullous pemphigoid antigen-2. D’après http://www.netzwerk-eb.de/e14/e193/e249/index_eng.html. Derme 14 Introduction B LA JONCTION DERMO-ÉPIDERMIQUE La jonction dermo-épidermique représente une structure spécialisée de la matrice extracellulaire, qui sépare l’épithélium sus-jacent – l’épiderme – du tissu conjonctif sousjacent – le derme (Figure 3). La jonction dermo-épidermique est une lame basale, synthétisée conjointement par les fibroblastes du derme et par les kératinocytes de la couche basale de l’épiderme. La lame basale joue un rôle fondamental comme support mécanique permettant l’adhésion entre derme et épiderme. Elle intervient également comme support à l’adhésion et la migration des kératinocytes lors de la restauration de l’épiderme après blessure cutanée [Martin, 1997]. Enfin, la lame basale se comporte également comme une barrière régulant les échanges métaboliques et les migrations cellulaires (cellules de Langerhans, lymphocytes) entre derme et épiderme [Kanitakis, 2002]. 15 Introduction C LE DERME : FIBROBLASTES ET MATRICE EXTRACELLULAIRE Le derme est un tissu conjonctif d’origine mésodermique sur lequel repose l’épiderme. Il contient des vaisseaux sanguins, des vaisseaux lymphatiques, des nerfs, ainsi que les annexes cutanées (glandes sudoripares, follicules pileux et glandes sébacées). La diversité cellulaire du derme est plus importante que celle de l’épiderme. Outre les fibroblastes qui y représentent les cellules résidentes principales, le derme comprend également de nombreuses cellules immunitaires spécialisées (cellules dendritiques dermiques, mastocytes, macrophages, lymphocytes T CD4+, lymphocytes T γδ et lymphocytes NKT8), et les cellules de soutien des fibres nerveuses et des vaisseaux sanguins et lymphatiques. L’épaisseur du derme, de l’ordre du millimètre, est plus grande que celle de l’épiderme, mais varie selon la partie du corps considérée9 [Kanitakis, 2002]. La surface du derme au contact de l’épiderme présente de nombreuses projections – papilles dermiques – qui s’imbriquent avec des projections épidermiques – crêtes épidermiques (Figure 1, page 7). L’interdigitation entre derme et épiderme renforce la jonction dermo-épidermique et augmente considérablement la surface d’échange entre les deux structures. Le derme est divisé en deux couches : le derme papillaire (en superficie) et le derme réticulaire (en profondeur), séparés par le plexus vasculaire souspapillaire (rete subpapillare). Un plexus vasculaire dermique profond (rete cutaneum) sépare le derme réticulaire de l’hypoderme sous-jacent. Le derme, à l’image de l’épiderme, est un tissu en renouvellement constant qui résulte d’un équilibre entre synthèse et destruction des composants protéiques de la matrice extracellulaire. 8 9 NKT : lymphocyte natural killer T. L’épaisseur du derme peut atteindre près de 4 mm au niveau du dos, des paumes des mains ou des plantes des pieds. Introduction 16 Figure 4 : Ultrastructure des fibroblastes A B granule de sécrétion microtubule appareil de Golgi noyau réticulum endoplasmique rugueux ribosome nucléole mitochondrie cytoplasme brilles de collagène D’après : http://medinfo.ufl.edu/~dental/denhisto/em/em2_fibroblast.jpg prolongement cellulaire D’après : http://www.rejuvenal.info/images/Terminology/FibroblastImage.jpg Figure 5 : Hétérogénéité anatomique et intratissulaire des fibroblastes A B 1 2 Épiderme derme papillaire 3 retesubpapillare Derme derme réticulaire 4 Hypoderme retecutaneum NOTE. A : Les fibroblastes des régions anatomiques 1–4 présentent des différences importantes dans leur expression génique [Chang et coll., 2002]. B : Au sein d’une même zone anatomique, les fibroblastes du derme papillaire, du derme réticulaire et les fibroblastes associés aux follicules pileux présentent également des différences fonctionnelles. 17 1 Introduction LES FIBROBLASTES Les fibroblastes sont les cellules résidentes principales du derme. Ce sont des cellules allongées de morphologie fusiforme ou étoilée. En microscopie optique, leur cytoplasme est peu visible, au contraire de leur noyau. En microscopie électronique, on y observe tous les organites cellulaires habituels et en particulier les organites impliqués dans la synthèse des protéines (Figure 4). Les fibroblastes du derme représentent une population hétérogène de cellules. L’hétérogénéité des fibroblastes se décline à deux niveaux : anatomique et intratissulaire (Figure 5). L’hétérogénéité anatomique relative à la zone corporelle considérée est liée à l’origine embryologique multiple de ces cellules, mésodermique ou neurectodermique [Sorrell et coll., 2009]. L’impact fonctionnel de cette hétérogénéité anatomique est important : des études transcriptomiques réalisées sur des fibroblastes cutanés issus de sites anatomiques variés ont montré l’existence de différences significatives dans l’expression de gènes impliqués dans la synthèse de la matrice extracellulaire, dans le métabolisme lipidique, ainsi que dans les mécanismes de migration et de différenciation cellulaire [Chang et coll., 2002; Rinn et coll., 2006; Rinn et coll., 2008]. Par ailleurs, au sein d’un même site anatomique, les fibroblastes cutanés présentent une hétérogénéité intratissulaire, également objectivée par des différences fonctionnelles entre trois sous-populations cellulaires distinctes de fibroblastes : les fibroblastes superficiels du derme papillaire, les fibroblastes profonds du derme réticulaire et les fibroblastes associés aux gaines des follicules pileux [Sorrell et coll., 2004; Pflieger et coll., 2006]. Les fibroblastes synthétisent les quatre grandes classes des constituants de la matrice extracellulaire : les collagènes, l’élastine, les protéoglycanes et les glycoprotéines de liaison (fibronectine et laminines) [Alberts et coll., 2011]. Les fibroblastes synthétisent également des enzymes protéolytiques (métalloprotéases matricielles et sérine-protéases) dont le rôle 18 Introduction principal est le clivage des différents constituants protéiques matriciels [Shapiro, 1998]. Dans le derme, les fibroblastes sont donc à la fois les cellules principales de soutien et les maîtresarchitectes du remodelage de la matrice extracellulaire. Néanmoins, la restriction des fibroblastes à ce seul rôle a longtemps conduit à considérer ces cellules comme les moins spécialisées du tissu conjonctif. C’est oublier les nombreuses autres fonctions jouées par ces cellules qui sont au centre de nombreux processus de régulation cellulaire [Sorrell et coll., 2009]. Les fibroblastes du derme interagissent avec les autres cellules résidentes de la peau, comme les kératinocytes et les cellules endothéliales des vaisseaux dermiques. Des boucles paracrines permettent une interaction étroite entre kératinocytes et fibroblastes : la production d’IL-1α par les kératinocytes induit notamment la synthèse par les fibroblastes dermiques de KGF-110 et de GM-CSF11 [Maas-Szabowski et coll., 1996], deux facteurs de croissance qui agissent en retour sur la croissance et la différenciation des kératinocytes [Maas-Szabowski et coll., 2001]. Les boucles paracrines de stimulation cellulaire entre fibroblastes et cellules épithéliales (kératinocytes, cellules endothéliales des vaisseaux dermiques) jouent un rôle majeur dans la prolifération et la différenciation cellulaire épidermique [Yamaguchi et coll., 1999], dans la constitution et l’organisation de la jonction dermo-épidermique [Marinkovich et coll., 1993] ainsi que dans les processus de cicatrisation des blessures cutanées [Martin, 1997; Werner et coll., 2007]. Les fibroblastes sont des cellules clés dans la cicatrisation cutanée après une blessure, et ce à toutes les étapes successives de ce processus – phase inflammatoire, phase épithéliale, phase de remodelage tissulaire –, et l’interaction des fibroblastes avec les kératinocytes et les cellules endothéliales y contribue largement. De plus, les fibroblastes jouent un rôle important dans la synthèse de la nouvelle matrice 10 11 KGF-1 : keratinocyte growth factor-1. GM-CSF : granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Introduction 19 extracellulaire (riche en collagène, fibronectine et acide hyaluronique) et participent ainsi à la formation du tissu de granulation12 [Martin, 1997]. Enfin, la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes13, stimulée par l’expression forte de TGF-β114 et de fibronectine dans la plaie, confère à ces cellules des propriétés contractiles qui contribuent au rapprochement des parois de la plaie [Martin, 1997; Lorena et coll., 2002]. Enfin, les fibroblastes interagissent avec les cellules immunitaires spécialisées. Lors d’un processus cutané pathologique (tumoral ou infectieux, par exemple), les fibroblastes contribuent au recrutement et à l’infiltration des cellules immunitaires dans la peau par la synthèse de cytokines et de chimiokines (comme l’IL-8, l’IL-6 ou encore MCP-115) [BroutyBoye et coll., 2000; Galindo et coll., 2001; Silzle et coll., 2004]. L’expression de CD4016 par les fibroblastes permet également une interaction directe avec les cellules immunitaires exprimant CD40-ligand (lymphocytes B, lymphocytes T, cellules dendritiques, macrophages …) [Smith et coll., 1997; Brouty-Boye et coll., 2000]. L’interaction CD40/CD40-ligand contribue d’une part à l’activation des leucocytes recrutés et d’autre part à l’accentuation du recrutement de ces dernières par une stimulation de la synthèse des chimiokines et cytokines pro-inflammatoires [Banchereau et coll., 1994]. De plus, les fibroblastes dermiques sont également capables d’induire la maturation des cellules dendritiques cutanées, lors de leur migration depuis la peau vers les ganglions lymphatiques de drainage [Saalbach et coll., 2007]. Les fibroblastes peuvent ainsi être considérés comme de 12 Le tissu de granulation est un tissu conjonctif richement vascularisé qui remplace le caillot de fibrine lors de la phase proliférative du processus de cicatrisation cutanée. Il est composé d’une matrice extracellulaire riche en collagène de type III, synthétisée par les fibroblastes. 13 Les myofibroblastes présentent des caractéristiques ultra-structurales et fonctionnelles proche de celles des muscles avec une forte expression d’α-actine musculaire. 14 15 16 TGF-β1 : transforming growth factor β1. MCP-1 : monocyte chemoattractant protein 1. CD40 est un membre de la superfamille des récepteurs au TNF-α. 20 Introduction véritables cellules sentinelles du système immunitaire inné [Smith et coll., 1997; Silzle et coll., 2004; Saalbach et coll., 2007]. Introduction 21 2 LA MATRICE EXTRACELLULAIRE Dans la peau, la matrice extracellulaire est un réseau tridimensionnel complexe de macromolécules au sein duquel les cellules du derme sont dispersées. La matrice extracellulaire n’est pas seulement un échafaudage structural qui supporte les tensions mécaniques auxquelles le tissu est soumis, elle joue aussi un rôle important dans les mécanismes qui régulent l’adhérence, la migration, la prolifération ainsi que la différenciation cellulaire [Alberts et coll., 2011]. Dans la peau, la matrice extracellulaire est principalement synthétisée par les fibroblastes. Parmi les composants moléculaires de la matrice extracellulaire, les protéines fibreuses que sont les collagènes et l’élastine (organisés sous forme de fibres) représentent les éléments de structure les plus importants. Les autres éléments protéiques principaux de la matrice extracellulaire (fibronectine, laminine) contribuent à la fois à organiser les éléments structuraux de la matrice et à favoriser l'adhérence des cellules à celle-ci. Enfin, des chaînes polysaccharidiques de glycosaminoglycanes17 viennent constituer une substance de base fortement hydratée dans laquelle les protéines fibreuses et les cellules sont incluses. La matrice extracellulaire est un tissu dont le remodelage permanent repose sur l’équilibre entre synthèse et destruction de ses constituants : cette dernière fonction est assurée par des métalloprotéases matricielles et des sérines-protéases. 17 Associés de façon covalente avec un corps protéique, les glycosaminoglycanes forment des protéoglycanes. Introduction 22 Figure 6 : Principaux éléments de la matrice extracellulaire Collagène chaînes α procollagène Fibres élastiques tropocollagène Fibre élastique Réseau de bres élastiques brilles de collagène micro brilles ( brilline) 10 - 300 nm relaxation étirement liaison croisée élastine bres de collagène 0,5 - 3 m MFAP D’après Alberts et coll., 2011. D’après Alberts et coll., 2011. Fibronectine Laminines auto-assemblage S S domaines de liaison chaîne β S S N-term C-term brine collagène brine brine intégrine brine héparine syndécane brine S S ponts disulfures intégrine perlécane N-term intégrine chaîne γ modules de type I, II et III région variable C-term chaîne α nidogène --R-G-D-- auto-assemblage D’après http://en.wikipedia.org/wiki/Fibronectin D’après Alberts et al., 2011 D’après Alberts et coll., 2011. Protéoglycanes coeur protéique chondroïtine sulfate kératane sulfate acide hyaluronique protéines de liaison D’après Alberts et coll., 2011. 23 Introduction Composants principaux de la matrice extracellulaire Les fibres de collagène : une molécule de collagène est formée par l’assemblage hélicoïdal de trois chaînes α, la polymérisation des molécules de collagène permet la formation de fibrilles de collagène (10 à 300 nm de diamètre) et l’agrégation finale de ces polymères permet la constitution des fibres de collagène (plusieurs micromètres de diamètre) [Alberts et coll., 2011]. La grande majorité des fibres présentes dans le derme sont des fibres de collagène de type I et III18 : le derme réticulaire contient plus de collagène de type III que le derme papillaire et les fibres de collagène y sont plus organisées [Kanitakis, 2002]. Les fibres de collagène sont responsables de la résistance aux tensions mécaniques qui s’exercent sur le derme. Les fibres élastiques : les fibres élastiques sont constituées d’un noyau protéique fibreux central – l’élastine –, recouvert d’une gaine de microfibrilles. Les microfibrilles sont ellesmêmes principalement composées d’une glycoprotéine qui se lie à l’élastine – la fibrilline –, associée à de petites molécules, les microfibril-associated glycoproteins (MFAP) [Alberts et coll., 2011]. Le réseau de fibres élastiques dans la matrice extracellulaire du derme confère à la peau son élasticité. La fibronectine : la fibronectine est un dimère composé de deux sous-unités19 réunies par des ponts disulfures à l’une de leurs extrémités, et chaque sous-unité est repliée en une série de domaines fonctionnels distincts, connectés par des segments polypeptidiques flexibles [Alberts et coll., 2011]. Les différents domaines fonctionnels représentent des sites 18 Plus de 42 gènes humains codent des chaînes α de collagène différentes et 27 types de collagènes résultent des différentes combinaisons d’assemblage de ces chaînes α. 19 Dans le génome humain, un seul gène code la fibronectine, mais l’épissage alternatif des transcrits est à l’origine de nombreuses isoformes différentes de la fibronectine. 24 Introduction spécifiques d'interaction avec d'une part les constituants moléculaires de la matrice extracellulaire (comme le collagène ou l’héparine) et d'autre part les cellules. Une séquence particulière de trois acides aminés – arginine/glycine/acide aspartique (ou RGD) – constitue un site d’interaction important pour la fixation des intégrines et représente ainsi une des composantes de l’interaction entre cellules et matrice extracellulaire [Alberts et coll., 2011]. Les laminines : les laminines sont une des composantes principales de la lame basale. Il s’agit d’une famille de protéines flexibles, composées de trois longues chaînes polypeptidiques (α, β et γ)20 reliées par des ponts disulfures, arrangées à la manière d’un bouquet à trois fleurs dont les tiges sont enroulées et les têtes restent séparées [Alberts et coll., 2011]. Les molécules de laminine jouent un rôle majeur dans l’assemblage et l’organisation de la lame basale et dans son ancrage aux cellules (par son domaine de liaison aux intégrines). Les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes : les glycosaminoglycanes (GAG) sont des chaînes polysaccharidiques composées de répétitions d’unités disaccharidiques21. Il existe quatre groupes de GAG – les acides hyaluroniques, les chondroïtines/dermatanes sulfates, les héparines sulfates et les kératanes sulfates –, et à l’exception de l’acide hyaluronique, tous les GAG établissent une liaison covalente avec une protéine pour former un protéoglycane [Alberts et coll., 2011]. Parmi les protéoglycanes d’intérêt, on peut citer le perlécane qui est un composant de la lame basale, et la décorine qui se lie aux fibres de collagène et en contrôle l’assemblage. 20 Cinq types de chaînes α, trois types de chaînes β et trois types de chaîne γ sont connues, mais seules 12 isoformes de laminines sont décrites chez l’homme. 21 Un des deux sucres qui composent le disaccharide répétitif est toujours aminé et aussi le plus souvent sulfaté. 25 Introduction Les enzymes protéolytiques : métalloprotéases et sérine-protéases La capacité des cellules du derme à détruire la matrice extracellulaire est aussi importante que leur capacité à la synthétiser et à se lier à elle. Cette capacité est mise à profit dans les processus de réparation tissulaire, mais également dans les mécanismes de prolifération et de migration cellulaire. Ainsi, même dans un tissu sain, la matrice extracellulaire n’est pas statique, il s’agit vraiment d’un tissu dynamique soumis à un lent renouvellement constant. La destruction des composantes de la matrice extracellulaire repose sur l’activité d’enzymes protéolytiques (protéases) qui appartiennent principalement à la classe des métalloprotéases22 matricielles ou à la classe des sérines-protéases23. Certaines métalloprotéases comme la collagénase MMP124 (qui clive le collagène de type I et II) ou l’élastase MMP12 (qui clive l’élastine des fibres élastiques) sont assez spécifiques, d’autres comme la stromélysine MMP3 ou la matrilysine MMP7 ont une activité catalytique sur un plus grand nombre de substrats, et le spectre protéolytique de ces différentes métalloprotéases est parfois chevauchant [Vu et coll., 2000]. L’intégrité structurale de la matrice est obtenue grâce à un contrôle étroit de l’activité des métalloprotéases matricielles. La régulation de cette activité est assurée par le contrôle de l’activation des précurseurs enzymatiques, la sécrétion d’inhibiteurs tissulaires de métalloprotéases (TIMP25), et le confinement de certaines protéases à la surface cellulaire (métalloprotéases membranaires MMP14, MMP15, MMP16 et MMP17) [Vu et coll., 2000]. Outre leur rôle majeur dans le remodelage de la matrice extracellulaire, les métalloprotéases matricielles interviennent également dans le contrôle et la modulation de la réponse inflammatoire et de l’immunité 22 23 24 25 Le site catalytique des métalloprotéases contient un ion métallique (zinc le plus souvent), d’où leur nom. La séquence peptidique du site catalytique des sérines-protéases contient toujours une sérine, d’où leur nom. MMP : matrix metalloprotease. TIMP : tissue inhibitors of metalloproteases. 26 Introduction innée, par leur action potentialisatrice ou inhibitrice sur l’activité des cytokines et des chimiokines [Parks et coll., 2004]. Par exemple, la métalloprotéase MMP9 induit le clivage et l’activation de la chimiokine IL-8 [Van den Steen et coll., 2000]. À l’inverse, d’autres métalloprotéases comme MMP1, -3, -13 et -14 induisent le clivage et l’inactivation des chimiokines CCL2, CCL8 et CCL13 [McQuibban et coll., 2002]. Des sérines-protéases participent également à la destruction des composants protéiques matriciels. L’exemple typique de ces sérines-protéases est la plasmine, enzyme clé du processus de fibrinolyse, et dont le rôle tissulaire est moins souvent évoqué. La plasmine est synthétisée sous forme d’un précurseur inactif – le plasminogène. L’activation du plasminogène en plasmine est sous la dépendance d’activateurs du plasminogène (tPA26 et uPA27), eux-mêmes contrôlés par les inhibiteurs de l’activateur du plasminogène (PAI-128 et PAI-2). Dans les tissus, la plasmine est capable de détruire directement les composants protéiques de la matrice extracellulaire (à l’exception du collagène) [Saksela et coll., 1988], ou indirectement par l’activation des métalloprotéases (comme MMP1 et MMP9) [Davis et coll., 2001]. 26 27 28 tPA : tissue-type plasminogen activator. uPA : urokinase-type plasminogen activator. PAI : plasminogen activator inhibitor. 27 Introduction D LES DÉFENSES IMMUNITAIRES DE LA PEAU La première ligne de défense de la peau contre les agents pathogènes est la barrière physique que l’épiderme (et en particulier sa couche cornée) constitue. La flore commensale cutanée contribue également à la protection de la peau contre les agents pathogènes, dans la mesure où les germes commensaux entrent en compétition avec les germes pathogènes pour la même niche écologique [Alberts et coll., 2011]. À cette première protection s’ajoutent les défenses immunitaires spécialisées, dont les composantes innée et adaptative sont étroitement liées. 1 LA RÉPONSE IMMUNITAIRE INNÉE La principale fonction du système immunitaire inné (dans la peau mais également dans tous les autres organes) est d’assurer la défense immédiate de l’organisme contre les agents pathogènes, avant que les mécanismes plus spécifiques – mais aussi plus lents à se développer – du système immunitaire adaptatif ne se mettent en place. De plus, le système immunitaire inné contribue, par l’intermédiaire des cellules présentatrices d’antigènes et des très nombreuses molécules de signalisation extracellulaires qu’il produit, à l’activation des réponses adaptatives. Le système immunitaire inné de la peau s’articule autour de médiateurs solubles variés (cascade du complément, peptides antimicrobiens, cytokines et chimiokines), de cellules immunitaires spécialisées, et de cellules épithéliales et conjonctives (kératinocytes, fibroblastes), qui participent à la synthèse des médiateurs solubles. 28 Figure 7 : Système du complément Introduction 29 Introduction La cascade du complément Le système du complément29 (Figure 7) est composé de plus d’une trentaine de protéines, présentes à la fois dans le compartiment plasmatique et dans les espaces extracellulaires tissulaires. Il est organisé sous la forme d’une cascade enzymatique comportant trois voies d’activation, un composant central (C3) et une voie effectrice commune. Le système comprend également un ensemble complexe de protéines régulatrices qui assurent son contrôle et permettent de protéger les cellules de l’hôte. La voie classique (activation initiale de C1) est initiée par la fixation d’anticorps de type IgG ou IgM à leurs antigènes cibles30 ; la voie des lectines (activation initiale de la lectine liant le mannane) et la voie alternative (activation directe de C331) sont initiées par divers résidus (comme le mannose ou la N-acétylglucosamine pour la voie des lectines, ou le lipopolysaccharide (LPS) des bactéries à Gram négatif pour la voie alternative) présents à la surface des microorganismes [Male et coll., 2007]. Les trois voies conduisent à l’immobilisation du fragment C3b à la surface du pathogène, qui déclenche à son tour l’activation des composants tardifs du complément (C5 à C9), dont l’assemblage en « complexe d’attaque membranaire » aboutit à la formation d’un pore transmembranaire qui entraîne finalement la lyse du pathogène cible. Outre l’action lytique directe exercée sur les agents pathogènes, le complément participe également au recrutement des cellules phagocytaires (effets chimiotactiques de petits composants formés comme C3a et C5a), à l’induction du processus de phagocytose (opsonisation de la cible), et à 29 Le terme « complément » a été proposé par Paul Ehrlich en 1897 pour désigner les capacités de ce système à amplifier (ou « complémenter ») les propriétés bactéricides du sérum. 30 Cette voie nécessite que l’hôte ait préalablement développé des anticorps spécifiques contre le pathogène cible. À ce titre, la voie classique du complément est liée à la réponse immunitaire adaptative. 31 L’hydrolyse naturelle de C3 permet la génération permanente à bas bruit de C3a et C3b. Introduction 30 la sélection de lymphocytes B spécifiques (reconnaissance simultanée des complexes C3d/antigènes par les récepteurs CR2 et BCR32) [Male et coll., 2007]. Les peptides antimicrobiens Les peptides antimicrobiens sont de petites molécules cationiques33 qui, comme leur nom l’indique, exercent une activité antimicrobienne directe sur un large spectre de microorganismes (bactéries à Gram positif et négatif, champignons, parasites, virus). Dans la peau, les deux principales familles de peptides antimicrobiens sont les défensines et les cathélicidines [Yamasaki et coll., 2008], mais d’autres peptides possédant une activité antimicrobienne y sont également synthétisés, comme la psoriasine [Gläser et coll., 2005], la dermcidine [Schittek et coll., 2001], la RNase7 [Harder et coll., 2002] ou encore le lysozyme [Klenha et coll., 1967]. L’unique membre des cathélicidines chez l’homme – LL-37 – est produit par de nombreuses cellules cutanées, incluant les kératinocytes, les polynucléaires neutrophiles et les mastocytes. Les défensines les plus exprimées dans la peau chez l’homme sont les β-défensines34 : les kératinocytes participent notamment à la synthèse de hBD-135, -2 et -3. Outre leur activité antimicrobienne, les peptides antimicrobiens ont une activité chimiotactique sur une large variété de cellules immunitaires spécialisées36 [Yamasaki et coll., 2008] ; ils stimulent également la migration, la prolifération et la production de cytokines par les kératinocytes (à ce titre, ils contribuent également aux mécanismes de cicatrisation cutanée) [Niyonsaba et coll., 2007]. Les peptides antimicrobiens représentent 32 33 34 BCR : B cell receptor. Les peptides antimicrobiens sont riches en acides aminés basiques (arginine et lysine). La distinction entre α-, β- et θ-défensines est liée à la répartition des ponts disulfures qui unissent les feuillets β dont ces molécules sont constituées ; l’homme ne produit pas de θ-défensines. 35 36 hBD : human β-defensin. LL-37 stimule le recrutement des polynucléaires neutrophiles, des monocytes/macrophages et des lymphocytes T ; les β-défensines stimulent le recrutement des polynucléaires monocytes/macrophages, des lymphocytes T, des cellules dendritiques, et des mastocytes. neutrophiles, des Introduction 31 donc d’importants « signaux de dangers », et le concept émergeant d’« alarmine » qui leur est attaché [Oppenheim et coll., 2007] résume la diversité de leurs effets sur les réponses immunitaires innée et adaptative. Activation de la composante cellulaire de l’immunité innée De nombreuses cellules participent à la réponse immunitaire innée cutanée. Les cellules immunitaires spécialisées qui résident dans la peau, ou qui y sont recrutées à la faveur d’un processus inflammatoire, en font bien entendu partie au premier plan : il s’agit des cellules dendritiques (cellules de Langerhans et cellules dendritiques dermiques), des monocytes/macrophages, des polynucléaires neutrophiles, des mastocytes, et des cellules NK37 [Nestle et coll., 2009]. Les fonctions principales de ces cellules sont : — la phagocytose : elle est assurée par les cellules phagocytaires professionnelles (macrophages et polynucléaires neutrophiles) ; — la lyse directe des pathogènes ou des cellules les ayant internalisés : elle repose sur la libération dans le milieu extracellulaire du contenu des granules des polynucléaires neutrophiles (lysozyme, hydrolase acide, peptides antimicrobiens) et des cellules NK (perforine et granzymes) [Male et coll., 2007] ; — l’apprêtement puis la présentation des antigènes aux cellules de l’immunité adaptative par les cellules présentatrices d’antigène (cellules dendritiques) ; De plus, les mastocytes [Kumar et coll., 2010] ainsi que les principales cellules résidentes épithéliales (kératinocytes) ou conjonctives (fibroblastes) de la peau participent également à l’initiation et la coordination de la réponse inflammatoire générée lors d’un processus infectieux. 37 NK : natural killer. Introduction 32 Figure 8 : Les récepteurs de type Toll PAMPs bactériens PAMPs viraux acide lipotéichoïque ?? lipopeptides triacylés lipopeptides diacylés agelline LPS TLR5 TLR4 ilôts CpG ARN double brin ARN simple brin peptidoglycane TLR10 TLR1 TLR2 TLR6 compartiment extracellulaire cytoplasme TLR8 endosome TLR9 TLR7 TLR3 noyau D’après Kapetanovic et coll., 2007 ; Nestle et coll., 2009. Cyt okines I nt erférons Pept ides ant imicrobiens 33 Introduction L’activation de ces différents types cellulaires nécessite au préalable la reconnaissance sélective des agents pathogènes par ces cellules. Cette reconnaissance repose sur des récepteurs capables de distinguer les immunostimulants associés aux pathogènes (non-soi) des molécules de l’hôte (soi). Ces immunostimulants sont fréquemment présents sous forme de motifs répétés à la surface des pathogènes, et sont ainsi appelés motifs moléculaires associés aux agents pathogènes – ou PAMPs38. Le peptidoglycane et les flagelles bactériens, les ilots dinucléotidiques – cytosine polyguanine (CpG) – non méthylés de l’ADN bactérien et viral, le LPS des bactéries à Gram négatif, ou encore le mannane et la chitine des champignons font partie des PAMPs les mieux caractérisés [Alberts et coll., 2011]. Ces PAMPs sont reconnus par des récepteurs de reconnaissance de motif – ou PRRs39. Les PRRs incluent la famille emblématique des récepteurs de type Toll40 – ou TLRs41,42 [Medzhitov et coll., 1997], mais d’autres familles de récepteurs comme les récepteurs intracellulaires de type NOD – ou NLRs43 – et certains récepteurs de type lectine (à l’exemple du récepteur au mannose, DC-SIGN44, ou dectine-1 et -2, exprimés notamment par les cellules phagocytaires mononucléées et les cellules dendritiques) sont également impliqués dans la reconnaissance des pathogènes [Kapetanovic et coll., 2007]. À l’heure actuelle, dix TLRs fonctionnels (Figure 8) ont été identifiés chez l’homme [Kawai et coll., 2011]. TLR1, -2, -4, -5, -6, et -10 sont exprimés à la surface des cellules, alors que TLR-3, -7, -8 et -9 sont des récepteurs 38 39 40 PAMPs : pathogen associated molecular patterns. PRR : pattern recognition receptors. Chez la drosophile, la protéine Toll, initialement décrite comme un récepteur cellulaire impliqué dans le positionnement embryonnaire de l’axe dorso-ventral, est impliquée dans la défense immunitaire anti-fongique. 41 42 TLR : Toll-like receptor. Les TLRs (homologues de la protéine Toll de drosophile) ont été décrits pour la première fois chez l’homme à la fin des années quatre-vingt-dix. 43 NLR : initialement acronyme de NOD (Nucleotide Oligomerization Domain)-like receptors, le terme NLR représente actuellement l’acronyme de nucleotide-binding domain and leucine- rich repeat-containing molecules. 44 DC-SIGN : dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin. 34 Introduction intracellulaires situés dans la voie endosomale [Blasius et coll., 2010]. Chez l’homme, les TLRs sont très largement exprimés par les cellules immunitaires, mais également par les kératinocytes [Nestle et coll., 2009] et les fibroblastes [Wang et coll., 2011]. La stimulation de ces différents récepteurs active les voies de signalisation intracellulaire (et notamment la voie NF-κB45) qui conduisent à la synthèse de cytokines proinflammatoires. Les cytokines contribuent à initier, amplifier et coordonner les réponses immunitaires innée et adaptative. Il est impossible ici d’en faire une description détaillée – tant le nombre et la diversité de ces médiateurs solubles sont grands. Les cytokines sont classées dans un certain nombre de catégories, dont les principales sont : — les interleukines : elles sont produites majoritairement par les leucocytes, mais les kératinocytes et les fibroblastes sont également capables de les synthétiser ; — les chimiokines46 : leur principale fonction (chimiotactisme) est de stimuler la migration et le recrutement cellulaire sur le site d’une réaction inflammatoire ; elles sont produites par les cellules immunitaires spécialisées, mais aussi par les cellules épithéliales et conjonctives ; — les familles du TNF47, du TGF (éléments clés du processus inflammatoire), et les CSF48 (qui contrôlent la division et différentiation des cellules d’origine hématopoïétique) ; — les interférons : les interférons de type I (IFN-α et IFN-β en particulier) sont principalement produits par les cellules infectées par un virus ; l’interféron de type II (IFN-γ) est produit par les lymphocytes T et les cellules NK. Bien connus pour leur rôle dans l’immunité antivirale [Sadler et coll., 2008], les interférons sont également impliqués dans la défense contre les bactéries intra- [Perry et coll., 2005] et extracellulaires [Mancuso et coll., 2009]. 45 46 47 48 NF-κB : nuclear factor κB. L’espacement des deux premières cystéines définit quatre catégories de chimiokines (CC, CXC, C, et CX3C). TNF : tumor necrosis factor. CSF : colony stimulating factor. 35 2 Introduction LA RÉPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE La réponse immunitaire adaptative est un système de défense contre les pathogènes, propre aux vertébrés. Contrairement à la réponse immunitaire innée, la réponse immunitaire adaptative se caractérise par sa spécificité à l’égard de l’agent pathogène qui l’induit, et sa capacité à conserver une mémoire immunologique, à même d’assurer plus efficacement et plus rapidement la destruction d’un pathogène « connu » lors d’une réinfection. Néanmoins, la distinction dichotomique (dont l’objectif didactique fait pourtant sens) entre réponse immunitaire innée et adaptative est très réductrice, car les deux systèmes sont interdépendants. L’activation efficace du système immunitaire adaptatif nécessite par exemple qu’il soit préalablement stimulé par le système immunitaire inné, et plusieurs types cellulaires – de même que de nombreux médiateurs solubles – participent aux deux systèmes. Les deux bras armés du système immunitaire adaptatif – la réponse à médiation cellulaire et la réponse de type humorale (médiée par les anticorps) – reposent respectivement sur les lymphocytes de type T et les lymphocytes de type B (ainsi que leur forme mature plasmocytaire). Alors que les lymphocytes B reconnaissent les antigènes associés aux pathogènes dans leur configuration native, les lymphocytes T reconnaissent des fragments antigéniques apprêtés par les cellules présentatrices d’antigènes, en association aux protéines CMH49. Dans la peau, on retrouve les cellules présentatrices d’antigène capables d’initier la réponse adaptative : ce sont les cellules dendritiques dermiques et les cellules de Langerhans dans l’épiderme [Nestle et coll., 2009]. Elles sont l’exemple type des cellules situées à l’interface entre immunité innée et adaptative. Après avoir capté l’antigène, les cellules dendritiques quittent la peau par les vaisseaux lymphatiques pour rejoindre les ganglions lymphatiques locorégionaux correspondants, au sein desquels ils présentent l’antigène aux lymphocytes T naïfs. La stimulation (spécifique de l’antigène présenté) et l’expansion clonale 49 CMH : complexe majeur d’histocompatibilité. 36 Introduction des lymphocytes conduisent à la génération d’un grand nombre de lymphocytes effecteurs et de lymphocytes mémoires. Dans l’épiderme, la majorité des lymphocytes T résidents sont des lymphocytes T CD8+ mémoires, alors que dans le derme la proportion entre lymphocytes T CD8+ et lymphocytes T CD4+ (mémoires pour la plupart) est approximativement équivalente [Nestle et coll., 2009]. La plupart de ces lymphocytes expriment le marqueur CLA50 dont l’affinité pour la E-sélectine (ou ELAM–151) – exprimée plus spécifiquement par les cellules endothéliales d’un site cutané inflammatoire – permet leur adressage spécifique dans la peau [Picker et coll., 1991]. Lors d’un processus inflammatoire cutané, les différentes chimiokines et autres médiateurs solubles chimiotactiques exprimés localement contribuent au recrutement approprié des leucocytes circulants et leur migration depuis le courant circulatoire vers la peau, au niveau du site inflammatoire. Les lymphocytes T auxilliaires (T helper), dont la capacité à stimuler la production d’anticorps par les lymphocytes B est essentielle pour l’élimination des pathogènes extracellulaires, sont également présents dans la peau, en particulier lorsqu’une réaction inflammatoire s’y produit. Les Th1, Th2 et Th17 en sont les principaux sous-types [Nestle et coll., 2009] ; cependant, une autre catégorie de lymphocytes T auxilliaires – les Th22 –sécrétant l’IL-22 mais (à la différence des Th17) pas l’IL-17 ni l’IFN-γ, semblent également impliqués dans la réponse immunitaire adaptative cutanée [Eyerich et coll., 2009]. 50 51 CLA : cutaneous lymphocyte-associated antigen. ELAM-1 : endothelial leukocyte adhesion molecule 1. 37 Introduction II BORRÉLIOSE DE LYME : ASPECTS ÉPIDÉMIOLOGIQUES ET CLINIQUES A HISTORIQUE Les premières descriptions de la maladie de Lyme ont été rapportées en Europe dès la fin du XIXe siècle. Buchwald en 1883 [Buchwald, 1883], puis Pick en 1894 [Pick, 1894], décrivaient les caractéristiques cliniques de ce qui fut identifié par Herxheimer et Hartmann en 1902 [Herxheimer et coll., 1902] comme l’acrodermatite chronique atrophiante52 (ACA). La manifestation clinique cardinale de la maladie de Lyme, l’érythème migrant, a été décrite dès le début du XXe siècle. Afzelius en 1910 [Afzelius, 1910] décrivait un érythème faisant suite à une piqûre de tique, évoquant déjà ainsi la possibilité d’une maladie infectieuse à transmission vectorielle, puis Lipschütz en 1913 [Lipschütz, 1913] proposa le terme d’« erythema chronicum migrans »53. Garin et Bujadoux en 1922 [Garin et coll., 1922] furent les premiers à décrire les manifestations neurologiques de la maladie54. Garin et Bujadoux décrivaient alors le cas d’une méningoradiculite survenue chez un patient ayant présenté un érythème migrant. La notion d’une piqûre de tique préalable et d’un test de BordetWassermann55 positif chez ce patient en l’absence d’arguments cliniques en faveur d’une syphilis a conduit ces auteurs dès cette époque à évoquer l’hypothèse d’une spirochétose transmise par les tiques. Quelques années plus tard, Bannwarth rapporta la première description de méningite lymphocytaire après piqûre de tique [Bannwarth, 1941]. Parmi les autres manifestations cutanées de la maladie de Lyme, le lymphocytome cutané bénin (dont le 52 53 L’acrodermatite chronique atrophiante est également connue sous le nom de maladie de Pick-Herxheimer. L’érythème migrant (terme à préférer à celui d’érythème chronique migrant) est également connu sous le nom d’érythème de Lipschütz. 54 L’atteinte méningoradiculaire de la neuroborréliose précoce est également appelée syndrome de Garin- Bujadoux-Bannwarth. 55 Le test de Bordet-Wassermann est un test sérologique basé sur la réaction de fixation du complément, utilisé à cette époque pour le diagnostic biologique de la syphilis. 38 Introduction terme fut introduit en 1943 par Bäfverstedt [Bäfverstedt, 1943], et dont l’usage consacre désormais le nom de « lymphocytome borrélien ») fut décrit pour la première fois en 1911 par Burckhardt [Burckhardt, 1911]. Bien que les aspects dermatologiques et neurologiques de la maladie aient été identifiés dès le début du XXe siècle en Europe, il aura fallu attendre le début des années soixante-dix pour que soit décrite par Scrimenti la première observation clinique de la maladie (un érythème migrant) en Amérique du Nord [Scrimenti, 1970]. Le nom de la maladie de Lyme provient de celui de la commune d’Old Lyme (Connecticut, États-Unis, Figure 9) où, en 1977, les manifestations articulaires de la maladie ont été décrites pour la première fois par Steere [Steere et coll., 1977a]. Steere et ses collaborateurs ont ensuite pu établir un lien entre les manifestations cutanées et articulaires observées avec les autres aspects neurologiques et cardiaques de la maladie [Steere et coll., 1977b]. Les diverses manifestations cliniques de la maladie n’ont été finalement regroupées dans le cadre nosologique de la borréliose de Lyme que dans les années quatre-vingt, après la découverte de l’agent étiologique par Burgdorfer [Burgdorfer et coll., 1982], un spirochète dont l’espèce type, Borrelia56 burgdorferi, porte désormais le nom. 56 La dénomination du genre bactérien est un hommage à Amédée Borrel, directeur de l'Institut d'hygiène et de bactériologie de Strasbourg, de 1919 à 1936. Introduction 39 Figure 9 : Borrelia burgdorferi, maladie de Lyme – origine des mots A http://www.pbase.com/csw62/image/51179027 B C NOTE. (A) Localisation géographique de la commune de Old Lyme, (Connecticut, États-Unis). (B) Amédée Borrel (http://www.pasteur.fr/ip/portal/action/WebdriveActionEvent/oid/01s-00000f-025) (C) Willy Burgdorfer (http://www.sciencephoto.com/image/) 40 B Introduction ÉPIDÉMIOLOGIE DE LA BORRÉLIOSE DE LYME La borréliose de Lyme est la maladie à transmission vectorielle la plus fréquente de l’hémisphère nord. Elle survient en Europe, en Amérique du Nord, en Asie ainsi que dans quelques pays du Maghreb, suivant ainsi la distribution géographique de son vecteur (Figure 19, page 61). En l’absence de systèmes de déclaration obligatoire de la maladie dans la plupart des pays concernés, les chiffres d’incidence rapportés sont à considérer avec précaution : dans une récente revue de la littérature, le nombre annuel moyen de cas était estimé à environ 65 000 en Europe, 16 000 en Amérique du Nord et 3 000 en Asie [Hubalek, 2009]. En Europe, les taux d’incidence présentent d’importantes variations géographiques avec un gradient décroissant d’est en ouest : les plus fortes incidences sont observées en Europe centrale avec plus de 100 cas pour 100 000 habitants en Autriche et en Slovénie [Hubalek, 2009]. En France, l’incidence de la borréliose de Lyme a été estimée à 9,4 cas pour 100 000 habitants57 avec également de fortes variations régionales, les incidences les plus élevées étant observées dans le Nord-Est (et en particulier en Alsace) et dans le Limousin [Letrilliart et coll., 2005]. Enfin, aux États-Unis, l’incidence est estimée à environ 6 cas pour 100 000 habitants et par an [Hubalek, 2009]. 57 Estimation obtenue sur une période d’observation de mai 1999 à avril 2000. 41 Introduction C MANIFESTATIONS CLINIQUES 1 ASPECTS CLINIQUES PRINCIPAUX ET HISTOIRE NATURELLE DE LA MALADIE La maladie de Lyme évolue en deux phases, précoce et tardive. La phase précoce localisée (anciennement phase primaire) correspond à l’apparition d’un érythème migrant qui survient après un délai de quelques jours le plus souvent, et parfois jusqu’à quelques semaines après la piqûre de tique. Sa fréquence est variable en fonction des études, mais se situe environ autour de 70 à 80 % des patients présentant une borréliose de Lyme confirmée [Strle et coll., 2009]. La lésion cutanée évolue généralement sur plusieurs semaines, voire plusieurs mois avant de régresser spontanément ; l’administration d’un traitement antibiotique adapté permet de réduire la durée globale de son évolution. De façon parfois presque concomitante, ou plus souvent décalée par rapport à la phase précoce localisée, peut suivre une phase précoce disséminée. Cette phase précoce disséminée (anciennement phase secondaire) correspond à la dissémination du pathogène, par voie sanguine, vers ses organes cibles profonds (système nerveux central et périphérique, articulations, cœur, œil notamment), mais aussi superficiels puisque la peau est l’un des sites de dissémination possible et même privilégié de la bactérie. La dissémination hématogène de la bactérie peut se traduire par des signes généraux à type de syndrome pseudogrippal. Les manifestations cliniques observées à ce stade sont très variées avec une prédominance des formes neurologiques et rhumatologiques ; les atteintes dermatologiques, cardiaques ou ophtalmologiques étant plus rares. L’atteinte neurologique58 se manifeste principalement par des méningo-radiculites sensitives, et les localisations crâniennes de la méningo-radiculite sont fréquentes [Oschmann et coll., 1998]59. Toutes les paires de nerfs crâniens peuvent être 58 59 On parle à ce stade de neuroborréliose précoce. Dans cette étude, l’atteinte des nerfs crâniens concernait 47 % des 330 cas de neuroborréliose étudiés. 42 Introduction potentiellement touchées, mais l’atteinte uni- ou bilatérale du nerf facial est prépondérante [Oschmann et coll., 1998], en particulier chez l’enfant [Christen et coll., 1993]. La borréliose de Lyme représente d’ailleurs en zone d’endémie une des étiologies les plus fréquentes des paralysies faciales de l’enfant [Jenke et coll., 2011]60. Des atteintes méningées ou motrices périphériques pures isolées sont possibles, mais plus rares ; il en est de même pour les atteintes encéphalitiques, cérébelleuses ou médullaires, qui surviennent principalement lors de la phase tardive de la maladie [Strle et coll., 2009]. Les manifestations rhumatologiques sont essentiellement des arthrites inflammatoires, mono- ou plus rarement oligoarticulaires, qui concernent principalement les grosses articulations comme le genou [Strle et coll., 2009]. Les manifestations dermatologiques de la phase disséminée précoce sont représentées par l’érythème migrant multiple et par le lymphocytome borrélien (anciennement lymphocytome cutané bénin). Les manifestations cardiaques de la borréliose de Lyme sont principalement en rapport avec des troubles de la conduction à type de bloc auriculo-ventriculaire [Strle et coll., 2009]. L’atteinte oculaire peut concerner toutes les tuniques de l’œil61 (conjonctive, cornée, corps vitré, rétine) ainsi que le nerf optique [Bodaghi, 2007]. Le spectre clinique des manifestations oculaires associées à la borréliose de Lyme étant particulièrement large et sa fréquence particulièrement faible, leur diagnostic demeure difficile. Les manifestations tardives de la maladie (anciennement phase tertiaire) peuvent survenir plusieurs mois voire plusieurs années après le début de l’infection ; elles sont de nature cutanée, neurologique ou articulaire et elles évoluent sur un mode chronique. L’atteinte cutanée tardive de la borréliose de Lyme correspond à l’ACA. Le rôle pathogénique de Borrelia dans la survenue d’autres dermatoses chroniques comme les morphées, les lichens scléreux ou encore les dermatites granulomateuses interstitielles [Moreno et coll., 2003] a été 60 61 Dans cette étude, les neuroborrélioses représentaient 23,5 % des cas de paralysie faciale (106 enfants inclus). Dans le cadre d’une neuroborréliose, la symptomatologie oculaire peut aussi être liée à l’atteinte méningoencéphalitique ou à l’atteinte des nerfs crâniens III, IV et VI (oculomoteurs) ainsi que du V et du VII. 43 Introduction évoqué. Les études dont le diagnostic étiologique est basé sur la sérologie sont non seulement contestables par leur méthodologie (la sérologie ne permettant pas à elle seule d'apporter la preuve d'une infection active à Borrelia) mais également contradictoires, les unes affirmant [Aberer et coll., 1985; Aberer et coll., 1987b; Aberer et coll., 1987c; Weber et coll., 1988; Aberer et coll., 1991b] et les autres infirmant [Hansen et coll., 1987; Hoesly et coll., 1987; Vaillant et coll., 1992; Akimoto et coll., 1996] l'existence d'un lien entre infection à Borrelia et survenue de morphées/lichens scléreux. Par ailleurs, les études basées sur la recherche de la bactérie par PCR dans ces lésions cutanées sont également contradictoires, car même si la plupart d'entre elles excluent ce lien de causalité [Meis et coll., 1993; Ranki et coll., 1994; Dillon et coll., 1995; Fan et coll., 1995; Wienecke et coll., 1995; Weide et coll., 2000; Goodlad et coll., 2002], deux études suggèrent cependant que certaines espèces particulières de Borrelia (B. afzelii et B. garinii notamment) pourraient être responsables de morphées ou de lichens scléreux dans des zones géographiques bien déterminées (Allemagne, Japon) [Schempp et coll., 1993; Fujiwara et coll., 1997]. La controverse sur ce sujet pourrait être lié, en partie au moins, à la confusion des différentes entités nosologiques, très proches sur le plan anatomo-clinique, ainsi qu'à la coexistence, chez un même individu, de ces différentes manifestations cliniques [Aberer et coll., 1987a; Coulson et coll., 1989; Carlesimo et coll., 2010]. Les complications neurologiques62 sont essentiellement des encéphalomyélites chroniques et des polyneuropathies sensitives axonales qui surviennent principalement chez des patients atteints d’une ACA, dans les dermatomes concernés par l’atteinte cutanée [Kindstrand et coll., 1997; Oschmann et coll., 1998]. Enfin, les manifestations rhumatologiques tardives sont caractérisées par des arthrites chroniques qui viennent compliquer l’évolution des arthrites de la phase précoce. 62 On parle à ce stade de neuroborréliose tardive. 44 Introduction Une présentation complète de la maladie – un érythème migrant après piqûre de tique, suivi de manifestations disséminées neurologiques ou articulaires, et le développement tardif d’une acrodermatite ou de lésions neurologiques ou articulaires chroniques – est relativement rare. Si la description schématique de l’histoire naturelle de la maladie sous forme de phases (primaire localisée, primaire disséminée et tardive) présente un avantage didactique indéniable, elle présente aussi malheureusement l’inconvénient d’une vue trop théorique et parfois décalée par rapport à la réalité des observations rapportées par les praticiens de terrain. Les différentes phases de la maladie peuvent être chevauchantes et la progression de la maladie d’une phase à une autre n’est pas systématique. Même en l’absence de traitement, les manifestations de la phase précoce (localisée ou disséminée) peuvent régresser spontanément sans jamais conduire au développement des manifestations de la phase tardive. Inversement, la phase précoce peut être totalement asymptomatique ou ses manifestations cliniques peuvent passer inaperçues, les manifestations tardives de la maladie survenant alors de façon inaugurale sans qu’aucun élément de la phase précoce de la maladie ait pu être décelé. Le seul signe clinique permettant d’établir de façon formelle le diagnostic de borréliose de Lyme est la présence d’un érythème migrant typique, qu’on peut à ce titre considérer comme une manifestation pathognomonique de la maladie. Cependant, aux États-Unis, l’existence d’une autre pathologie transmise par les tiques, le STARI63, responsable de lésions cutanées de présentation très similaire à celle de l’érythème migrant, ne permet pas d’être aussi catégorique et doit faire évoquer la possibilité d’un diagnostic différentiel [Strle et coll., 2009]. D’autres manifestations cliniques, comme le lymphocytome cutané bénin et l’ACA, de diagnostic parfois difficile, sont également extrêmement évocatrices d’une borréliose de Lyme. Les autres manifestations cliniques de la maladie ne sont pas spécifiques de la borréliose de Lyme : c’est l’exposition possible à des piqûres de tique en zone d’endémie 63 STARI : southern tick-associated rash illness. Le STARI est dû à Borrelia lonestari (espèce génétiquement proche du groupe des Borrelia des fièvres récurrentes), transmise par la tique dure Amblyomma americanum. Introduction 45 associée à des arguments cliniques et des données biologiques compatibles qui permettent d’évoquer le diagnostic. À l’exception de l’érythème migrant typique, la positivité d’un test biologique est requise pour confirmer le diagnostic de borréliose de Lyme [Schramm et coll., 2009]. L’infection par Borrelia est plus souvent symptomatique aux États-Unis (90 % des cas avec séroconversion) qu’en Europe (<50 % des cas) [Strle et coll., 2009] et la présentation clinique de la borréliose de Lyme aux États-Unis et en Europe est différente. Ces différences sont en partie liées à la distribution géographique transatlantique très différente des espèces pathogènes de Borrelia et à l’existence d’un organotropisme relatif lié à l’espèce de Borrelia en cause [Baranton et coll., 2009]. En Amérique du Nord, la borréliose de Lyme se complique plus souvent d’atteintes articulaires que d’atteintes neurologiques et les manifestations cutanées représentées par le lymphocytome borrélien et l’ACA ne sont que très rarement rapportées [DiCaudo et coll., 1994; Lipsker, 2007; Strle et coll., 2009; Smetanick et coll., 2010]. Si l’on excepte les exceptionnelles identifications de B. bissettii chez l’homme, B. burgdorferi ss est la seule espèce pathogène présente aux États-Unis [Girard et coll., 2011], et toutes les manifestations cliniques de la borréliose de Lyme qui y sont observées lui sont entièrement attribuées. À l’inverse, toutes les espèces pathogènes actuellement connues sont présentes en Europe, y compris B. lusitaniae [Collares-Pereira et coll., 2004], B. valaisiana [Diza et coll., 2004; Saito et coll., 2007] et B. bissettii [Rudenko et coll., 2009b], même si les descriptions cliniques sont rares et parfois sujettes à discussion [Baranton et coll., 2009], et quatre d’entre elles sont plus fréquemment observées chez l’homme : B. garinii, B. bavariensis, B. afzelii et B. burgdorferi ss. De façon schématique, en Europe B. burgdorferi ss est plus souvent associé aux manifestations articulaires de la borréliose de Lyme [Jaulhac et coll., 2000], B. garinii et B. bavariensis aux manifestations neurologiques [Ruzic-Sabljic et coll., 2001; Fingerle et coll., 2008] et B. afzelii aux manifestations cutanées 46 Introduction (lymphocytome et ACA) [Lenormand et coll., 2009; Smetanick et coll., 2010]. Cependant, l’organotropisme attribué aux différentes espèces de Borrelia n’est pas exclusif. À titre d’exemple, bien que B. afzelii soit l’espèce la plus souvent associée à l’ACA [Ruzic-Sabljic et coll., 2002], trois autres espèces – B. burgdorferi ss, B. garinii et B. valaisiana – ont également été occasionnellement détectées dans des lésions d’ACA [Rijpkema et coll., 1997; Picken et coll., 1998]. Introduction 47 Figure 10 : Manifestations cutanées de la borréliose de Lyme B A C D E G H F I J NOTE. (A, B, C) Érythème migrant. (D, E, F) Lymphocytome borrélien. (G, H, I, J) Acrodermatite chronique atrophiante. Illustrations : Müllegger et coll., 2008 ; Strle et coll., 2008 (dans Current problems in dermatology – Lipsker D, Jaulhac B, eds ; Karger) ; Stanek et coll., 2003 ; http://www.zeckenrollen.de/Zeckenschutz/Zecken-und-Krankheiten#. 48 Introduction Figure 11 : Aspects histologiques des manifestations cutanées de la borréliose de Lyme NOTE. (A, B) Érythème migrant. (C, D) Lymphocytome borrélien. (E, F) Acrodermatite chronique atrophiante. Illustrations : Strle et coll., 2008 (dans Current problems in dermatology – Lipsker D, Jaulhac B, eds ; Karger) 49 2 Introduction MANIFESTATIONS CUTANÉES DE LA BORRÉLIOSE DE LYME L’érythème migrant L’érythème migrant est à la fois la plus fréquente des manifestations cliniques de la borréliose de Lyme64 et la première à apparaître après le début de l’infection [Berglund et coll., 1995] : c’est la manifestation cardinale de la maladie. L’érythème migrant débute quelques jours à quelques semaines après le début de l’infection par une lésion maculopapuleuse érythémateuse, centrée par le site de la piqûre de tique, qui s’étend progressivement de manière annulaire et centrifuge sur une période de quelques jours à quelques semaines pour former une lésion cutanée qui peut atteindre jusqu’à plusieurs dizaines de centimètres de diamètres [Müllegger et coll., 2008]. Bien qu’inconstant, un éclaircissement central progressif partiel ou total de la lésion peut survenir et lui donner son aspect annulaire typique à centre clair et à bordure inflammatoire. La bordure active de la lésion représente le front de migration des Borrelia dans la peau et la réaction inflammatoire cutanée, mais l’isolement de la bactérie par culture à partir du centre de la lésion [Jurca et coll., 1998] ou en peau « saine » périlésionnelle [Berger et coll., 1992] est possible. La topographie de la lésion est variable puisqu’elle dépend de la localisation de la piqûre de tique : les localisations préférentielles sont les membres inférieurs, les zones de striction des vêtements et les plis chez l’adulte ; la partie supérieure du corps, la face, le cou et les oreilles sont plus fréquemment concernés chez l’enfant [Berglund et coll., 1995]. Même en l’absence de traitement, la lésion est spontanément résolutive, mais la disparition complète de celle-ci peut prendre plusieurs mois alors qu’elle est obtenue en quelques jours après instauration d’une antibiothérapie efficace. 64 Dans cette étude suédoise, la survenue de l’érythème migrant concernait 77 % des cas (1 471 patients inclus). 50 Introduction Les lésions multiples d’érythème migrant ont une signification bien différente de l’érythème migrant « unique », puisqu’elles sont la conséquence d’une diffusion hématogène de la bactérie puis de sa localisation et de sa multiplication dans la peau à distance du site d’inoculation. L’érythème migrant multiple est défini par la présence d’au moins 2 lésions cutanées évocatrices. Ces lésions secondaires sont généralement de taille équivalente, mais sont cependant de plus petite taille que la lésion initiale et sont dépourvues de l’induration centrale correspondant au point de piqûre de la tique [Müllegger et coll., 2008]. L’érythème migrant multiple est plus fréquent chez l’enfant que chez l’adulte et son incidence est plus élevée aux États-Unis qu’en Europe [Berglund et coll., 1995; Gerber et coll., 1996]. L’analyse histologique de biopsies réalisées dans la partie centrale de lésions d’érythème migrant montre un infiltrat interstitiel et périvasculaire du derme à prédominance lymphohistiocytaire, et la présence dans une moindre mesure de plasmocytes, de polynucléaires neutrophiles et de cellules de Langerhans [de Koning, 1993; Hulinska et coll., 1994]. L’aspect histologique de la bordure inflammatoire des lésions et de la peau « saine » périlésionnelle montre également un infiltrat lymphohistiocytaire du derme, essentiellement périvasculaire. L’épiderme est épargné, mais l’infiltration lymphohistiocytaire en regard de la jonction dermo-épidermique en zone centrale de la lésion peut s’accompagner d’une rupture de la membrane basale [de Koning, 1993; Hulinska et coll., 1994]. Les caractéristiques histologiques de l’érythème migrant sont donc peu spécifiques, mais la présence de plasmocytes au sein de l’infiltrat ainsi que son caractère neurotrope et syringotrope permettent d’évoquer une étiologie infectieuse – en particulier borrélienne [Lipsker, 2007]. La production accrue dans les lésions d’érythème migrant de cytokines pro-inflammatoires, comme l’IFN-γ [Müllegger et coll., 2000] (stimulant le recrutement et l’activation des macrophages), et des chimiokines CXCL9 et CXCL10 (stimulant le recrutement des lymphocytes T) [Müllegger et coll., 2007] est bien corrélée avec les observations Introduction 51 histologiques montrant la prédominance des lymphocytes et des macrophages activés dans l’infiltrat lésionnel. L’infiltrat lymphocytaire, d’immunophénotype T, associé à l’augmentation du nombre de cellules de Langerhans suggère une participation forte de la réponse immunitaire à médiation cellulaire dans la réponse initiale de l’hôte à l’infection par Borrelia. Le lymphocytome borrélien Le lymphocytome est l’une des manifestations cutanées disséminées de la borréliose de Lyme. Cette manifestation de la maladie ne concerne presque que les borrélioses de Lyme européennes ; elle est exceptionnelle en Amérique (de rares cas ont été rapportés aux ÉtatsUnis [Finkel et coll., 1990; Strle et coll., 2009] ainsi qu’au Mexique [Gordillo-Perez et coll., 2007]). En Europe, le lymphocytome demeure une manifestation relativement rare de la maladie : dans une cohorte suédoise, sa fréquence était respectivement de 2 % et 7 % chez les adultes et les enfants présentant une borréliose de Lyme confirmée65 [Berglund et coll., 1995]. L’aspect clinique est celui d’un nodule solitaire, ou plus rarement d’une plaque ferme, de quelques centimètres de diamètre et dont la couleur est variable – rose, rouge, voire bleu violacé. Ses localisations préférentielles sont le lobe de l’oreille (chez l’enfant) et la région aréolo-mamelonnaire (chez l’adulte) [Stanek et coll., 2003], mais le visage, le tronc et le scrotum peuvent également être concernés par cette lésion [Müllegger et coll., 2008]. L’aspect histologique de ces lésions montre un infiltrat dermique dense à prédominance lymphocytaire, structuré en follicules lymphocytaires avec centre germinatif : l’infiltrat est mixte, à prédominance de lymphocytes B66, mais comprend également des plasmocytes, des macrophages et des polynucléaires éosinophiles [de Koning, 1993]. La lésion respecte l’épiderme et en est séparée par une bande dermique d’aspect normal. À la différence de 65 66 Confirmation clinique et biologique (sérologique) des cas dans cette étude. Le diagnostic différentiel avec un lymphome cutané de type B peut se poser. 52 Introduction l’érythème migrant et de l’ACA où la production des chimiokines CXCL9 et CXCL10 stimulant le recrutement des lymphocytes T est majoritaire, les lésions cutanées du lymphocytome montrent au contraire une faible expression de CXCL9 et CXCL10 et une forte expression de CXCL13 dont l’activité principale est le recrutement des lymphocytes B et leur organisation au sein des follicules lymphocytaires [Müllegger et coll., 2007]. L’acrodermatite chronique atrophiante L’acrodermatite chronique atrophiante est la manifestation cutanée de la phase tardive de la borréliose de Lyme. Cette atteinte cutanée n’est que très rarement rencontrée aux ÉtatsUnis [DiCaudo et coll., 1994; Smetanick et coll., 2010], elle reste donc l’apanage des borrélioses européennes. Dans une étude suédoise, sa fréquence globale était estimée à 3 % des cas confirmés de borréliose de Lyme [Berglund et coll., 1995]. Par ailleurs, l’ACA concerne un peu plus souvent la femme que l’homme67 [Aberer et coll., 1991a; de Koning et coll., 1995; Brehmer-Andersson et coll., 1998] et cette manifestation clinique est très exceptionnellement rencontrée chez l’enfant [Brzonova et coll., 2002; Zalaudek et coll., 2005; Andres et coll., 2010]. Du fait de la très longue durée d’incubation et d’évolution des lésions [Asbrink et coll., 1986; Brehmer-Andersson et coll., 1998], il est très difficile d’établir un lien précis entre la notion d’une piqûre de tique, sa topographie et la survenue d’une ACA. Néanmoins, si la majorité des patients relatent une exposition fréquente à des piqûres de tique, seuls 10 % à 20 % d’entre eux se souviennent avoir présenté un érythème migrant localisé dans le même territoire que l’ACA dans les quelques mois ou années précédents [Asbrink, 1985; Müllegger et coll., 2008]. L’évolution de l’ACA se fait en deux phases. Elle débute par une phase initiale inflammatoire caractérisée par l’apparition de plaques érythémateuses infiltrées, plus ou moins œdémateuses, parfois cyanotiques, et dont la localisation prédomine 67 Ratios femme/homme : 1,7 – 19 patients – dans l’étude de Aberer et coll., 1991 ; 2,3 – 23 patients – dans l’étude de de Koenig et coll., 1995 ; 2 – 111 patients – dans l’étude de Brehmer-Andersson et coll., 1998. 53 Introduction sur les faces d’extension des membres, dans leur région acrale et en regard des surfaces articulaires [Müllegger et coll., 2008]. Un traitement antibiotique efficace administré à ce stade peut permettre une régression complète des lésions inflammatoires, mais en l’absence de traitement l’ACA progresse en quelques mois vers une phase atrophique irréversible qui lui confère son nom et son aspect caractéristique [Lipsker, 2007]. En zone lésée, la peau devient plus fine, elle prend un aspect en « papier cigarette » et laisse apparaître par transparence le réseau veineux sous-jacent. Au toucher, la peau est lisse et a perdu son élasticité. Des lésions fibrotiques peuvent se surajouter aux lésions atrophiques, elles prennent alors l’aspect de nodules fibrotiques ou de bandes fibreuses [Marsch et coll., 1993; BrehmerAndersson et coll., 1998]. Par ailleurs, une allodynie68 et l’association d’une ACA avec une polyneuropathie sensitive axonale plus symptomatique dans le territoire de l’ACA sont très fréquentes (environ deux patients sur trois) [Kindstrand et coll., 1997]. Enfin, des troubles ostéo-articulaires à type de luxation ou subluxations des petites articulations et des arthralgies voire des arthrites des grosses articulations situées dans le territoire des lésions cutanées peuvent aussi s’observer [Müllegger et coll., 2008]. À la phase inflammatoire, l’étude histopathologique des lésions montre un infiltrat lymphoplasmocytaire dermique périvasculaire et périannexiel – pouvant s’étendre à l’hypoderme, mais respectant l’épiderme –, des modifications vasculaires à type de télangiectasies69, ainsi qu’un certain degré d’œdème [Brehmer-Andersson, 1993]. À ce stade, l’épiderme peut encore être intact ou présenter un léger amincissement. Au stade atrophique, le derme est très aminci et la fibrose dermique est nette. Le nombre des fibres de collagène et des fibres élastiques est très réduit, l’infiltrat cellulaire est beaucoup moins dense, mais constitué d’une plus grande proportion de plasmocytes, et les annexes sont raréfiées [de 68 69 L’allodynie est une douleur ressentie à la suite d’une stimulation non nociceptive. La télangiectasie est une dilatation vasculaire anormale par sa taille et par sa permanence. 54 Introduction Koning et coll., 1995; Brehmer-Andersson et coll., 1998]. L’épiderme est lui aussi très atrophique et l’interdigitation dermo-épidermique disparaît au profit d’une ligne basale aplatie. La réponse immunitaire cellulaire de type T observée dans les lésions d’ACA – objectivée par l’infiltrat lymphocytaire, d’immunophénotype majoritaire T, et l’expression par ces lymphocytes de molécules d’activation70 – [Buechner et coll., 1993], suggère que les lésions d’ACA résultent d’une réaction immunitaire dirigée contre Borrelia [Lipsker, 2007]. Au plan moléculaire, les lésions d’ACA montrent une expression élevée des cytokines proinflammatoires IL-1β, TNF-α et IFN-γ, ainsi qu’une expression forte et plus élevée que celle observée dans les lésions d’érythème migrant pour les chimiokines CXCL9 et CXCL10 [Müllegger et coll., 2007]. 70 LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen 1) et ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1). Introduction 55 Figure 12 : Position taxonomique des tiques du genre Ixodes D’après http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/ Figure 13 : Principaux éléments anatomiques de la tique et de ses pièces piqueuses Ixodes ricinus : adult e femelle Capitulum * A B Hypostome Chélicères Pédipalpes Base * © A ut orit és de la Confédé rat ion Suisse ©Christ ian Gaut ier C Idiosome * * * 4 paires de pattes © Science Phot o Lib rary NOTE. Capitulum d’I. ricinus observé en microscopie électronique (A et C) et contraste de phase (B). Illustrations : (A) http://web.expasy.org/prolune/dossiers/025/ ; (B) http://www.vernamicrographie.fr/rostre_ricinus_view.htm ; (C) http://www.sciencephoto.com/ 56 Introduction III BORRÉLIOSE DE LYME : LE VECTEUR, LA BACTÉRIE ET SA TRANSMISSION A BIOLOGIE DES TIQUES 1 GÉNÉRALITÉS Taxonomie Les tiques, ou Ixodoidea, sont des acariens : ils appartiennent donc sur le plan taxonomique à l’embranchement des arthropodes71, et à la classe des arachnides (Figure 12). On distingue deux principales familles de tiques, les tiques dures (famille des Ixodidae) et les tiques molles (famille des Argasidae)72. La borréliose de Lyme est une maladie transmise à l’homme par des tiques dures du genre Ixodes. Anatomie À la différence des insectes dont le corps est segmenté en trois parties (tête, thorax et abdomen), les tiques présentent un corps globuleux non segmenté – l’idiosome –, dont la partie postérieure (équivalent de l’abdomen) est fusionnée avec la partie antérieure (équivalent du thorax), laquelle se détache nettement, chez les tiques du genre Ixodes, du capitulum73 (équivalent de la tête) (Figure 13). La base du capitulum porte elle-même trois pièces piqueuses – un hypostome en position ventrale et deux chélicères en position dorsale – ainsi que deux pièces sensorielles – les pédipalpes en position latérale [Pérez-Eid, 2007]. 71 72 73 Les arthropodes constituent un embranchement des animaux invertébrés. Une troisième famille, les Nuttalliellidae est représentée par une seule espèce présente en Afrique du Sud. Le capitulum est en position antérieure chez les Ixodidae et en position ventrale chez les Argasidae. Introduction 57 Figure 14 : Stases de développement de la tique I. ricinus A B © Infect ious Diseases Societ y o f Am erica N . Boulanger (collect ion pe rsonnelle) NOTE. A : Les quatre stases de développement de la tique I. ricinus non gorgée (de la gauche vers la droite) : adulte femelle, adulte mâle, nymphe et larve [Parola et coll., 2001]. La cuticule rigide (flèche) recouvre la totalité de la surface dorsale chez le mâle, mais reste limitée à la partie antérieure du corps chez la femelle. B : Nymphe gorgée (en bas) et non gorgée (en haut) d’I. ricinus. Figure 15 : Organe de Haller http://www.flickr.com/photos/28088928@N07/sets/72157605874720396/ http://www.flickr.com/photos/28088928@N07/sets/72157605874720396/ 58 Introduction Les tiques du genre Ixodes présentent trois stases74 de développement : la larve (qui sort de l’œuf75), la nymphe et l’adulte (Figure 14-A). La stase larvaire est la seule à ne posséder que trois paires de pattes, les stases nymphales et adultes en possèdent quatre. La cuticule des lxodidae porte sur sa face dorsale un écusson sclérifié rigide, le reste du tégument est plus lâche et permet la dilatation du corps de la tique lors de la prise du repas sanguin (Figure 14-B). Les organes internes sont composés d’un tube digestif ramifié, de deux glandes salivaires s’abouchant dans le rostre et d’organes sexuels. L’ensemble des organes internes baigne dans un liquide circulatoire, l’hémolymphe. Les structures sensorielles de la tique comprennent les pédipalpes, des soies distribuées sur le tégument, ainsi qu’un complexe sensoriel – l’organe de Haller (Figure 15) – localisé à la partie dorsale du tarse de la première paire de pattes [Parola et coll., 2001] : ces différentes « organes » sensoriels permettent à la tique de repérer ses hôtes cibles. Cycle de développement À toutes les stases de développement, la tique est un ectoparasite hématophage strict76. Le caractère parasitaire n’est que temporaire et correspond pour chaque stase à la prise d’un unique repas sanguin sur un hôte vertébré. Le repas sanguin dure plusieurs jours, mais les Ixodes pouvant survivre plusieurs années dans leur biotope, la tique passe donc la plus grande partie de son existence à l’état libre. Les trois phases parasitaires sont séparées entre elles par deux phases à terre où se passent les métamorphoses : le cycle parasitaire est donc triphasique. 74 Alors que le « stade » est la forme prise par un acarien après une simple mue de croissance, la « stase » est la forme prise après une métamorphose qui entraîne en plus des modifications de croissance un changement d’aspect. À la différence de certains autres groupes d’acariens, les tiques n’ont qu’un seul stade par stase. 75 76 La femelle pond entre 500 et 2 000 œufs. À l’exception de l’adulte mâle qui ne prend que rarement un repas sanguin de faible volume. 59 Introduction Figure 16 : Cycle de développement de la tique D’après Parola et coll., 2001. 60 Introduction La durée totale du cycle est variable (de 2 à 3 ans en moyenne, et jusqu’à 6 ans), et cette variation dépend principalement des conditions environnementales [Parola et coll., 2001]. La larve et la nymphe n’ont pas de tropisme particulier et peuvent se nourrir sur 300 espèces de vertébrés (oiseaux, mammifères de petite et grande taille, reptiles) [Anderson, 1991] alors que les adultes en revanche ont un tropisme plus marqué pour les animaux de grande taille : le cycle des Ixodes est de type télotrope77 (Figure 16). Dans le cycle parasitaire de la tique, l’homme n’est qu’un hôte accidentel. La transmission de Borrelia à l’homme (voir aussi chapitre « Transmission de Borrelia », page 80) peut survenir quelle que soit la stase de développement de la tique – larve, nymphe ou adulte. Néanmoins, la transmission par les larves est d’autant moins probable que le passage vertical transovarien des Borrelia chez I. persulcatus [Nefedova et coll., 2004], I. pacificus [Schoeler et coll., 1993], I. scapularis [Magnarelli et coll., 1987] et I. ricinus [Bellet-Edimo et coll., 2005] est rare ; la transmission par un adulte mâle est elle aussi très peu probable, car celui-ci ne prend que très exceptionnellement un repas sanguin. Ce sont les nymphes qui sont le plus souvent78 responsables de la transmission de la borréliose de Lyme à l’homme [Matuschka et coll., 1992; Nahimana et coll., 2004], car leur dispersion au niveau du biotope colonisé est large, leur densité en zone endémique est élevée – jusqu’à 10 voire 30 fois celle observée pour les adultes [Mermod et coll., 1975] –, et leur petite taille rend leur détection sur la peau beaucoup plus difficile et tardive que pour les adultes femelles. 77 78 Les individus immatures (larves et nymphes) sont ubiquistes et les adultes plutôt spécialistes. Dans l’étude de Nahimana et coll., 2004, concernant les régions ouest de la Suisse, le risque relatif de transmission de la borréliose de Lyme après piqûre de nymphe était trois fois plus élevé qu’après piqûre de tique adulte. Introduction 61 Figure 17 : Tique « à l’affût » sur la végétation, en attendant le passage d’un hôte © Biopix.dk © Olivier M at t el art http://www.biopix.dk/photo.asp?photoid=35842&photo=ixodes-ricinus http://photographienature.blogspot.com/2009_06_01_archive.html Figure 18 : Piqûre de tique http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ixodes_ricinus_PL.jpg Figure 19 : Distribution géographique des principales tiques vectrices de la borréliose de Lyme D’après Gern, 2009 ; Dennis et coll., 1998. 62 Introduction En dehors des périodes de diapause hivernale, les tiques à l’état libre sont en quête d’un hôte vertébré pour la prise du repas sanguin. Les espèces du genre Ixodes sont exophiles79 : leur « quête » s’effectue au-dessus de la strate herbacée, elles grimpent sur la végétation basse où elles attendent à l'affût le passage d’un l'hôte (Figure 17) qu’elles repèrent avec différents « organes » sensoriels (pédipalpes, organe de Haller, soies …), sensibles à des stimuli mécaniques, thermiques et chimiques. Une fois la tique sur l’hôte, celle-ci se déplace sur lui et peut mettre jusqu’à plusieurs heures avant de piquer la peau pour la prise du repas sanguin (Figure 18). Le repas sanguin s’effectue en une phase initiale de gorgement lent, suivie d’une deuxième phase de gorgement rapide durant laquelle l’alternance d’ingestion de sang et de salivation–régurgitation permet de concentrer le repas sanguin ingéré. La durée du repas varie entre 3 et 10 jours en fonction de la stase de développement de la tique. Une fois repue, la tique se laisse tomber sur le sol puis digère son repas sanguin qui va permettre sa métamorphose [Pérez-Eid, 2007]. Lors du repas sanguin, la femelle peut ingérer jusqu’à 150 fois son poids de sang [Capinera, 2008]. Biotope et répartition géographique des espèces vectrices de la borréliose de Lyme Les tiques sont très sensibles à la dessiccation, on les retrouve essentiellement dans les zones forestières humides. Elles sont exclues des biotopes trop secs comme le pourtour méditerranéen et les zones d’altitude80. La nécessité de coloniser des biotopes humides conditionne leur activité saisonnière et leur distribution géographique. I. ricinus, vecteur principal de la borréliose de Lyme en Europe, présente une distribution géographique (Figure 19) qui s’étend du nord vers le sud entre les latitudes 65 °N (Islande) et 39 °N (sud de l’Italie), ainsi qu’en Afrique du Nord (Tunisie, Algérie, Maroc) et de l’ouest vers l’est depuis le Portugal jusqu’en Russie [Gern, 2009]. Une autre espèce de tique très répandue en Europe, 79 80 Le cycle de développement, depuis la ponte jusqu’au stade adulte, s’effectue en milieu extérieur ouvert. La limite verticale de distribution d’I. ricinus est variable en Europe, autour de 1 000 à 1 500 mètres. 63 Introduction I. hexagonus, pourrait aussi transmettre la borréliose de Lyme : la compétence81 de ce vecteur pour la transmission du pathogène a été démontrée expérimentalement [Gern et coll., 1991], et le hérisson (hôte habituel de I. hexagonus), dont le contact avec l’homme est possible en dehors des zones forestières, représente également un réservoir potentiel pour Borrelia [Gern et coll., 1997]. I. persulcatus, vecteur principal de la borréliose de Lyme en Asie, est présent depuis la partie la plus orientale de l’Europe jusqu’en Chine et au Japon [Parola et coll., 2001]. En Amérique du Nord les deux vecteurs principaux de la borréliose de Lyme sont I. scapularis82, présent dans le centre et la moitié est des États-Unis ainsi qu’au sud et sud-est du Canada, et I. pacificus, principalement présent sur la côte ouest des États-Unis jusqu’en Colombie-Britannique au sud-ouest du Canada [Dennis et coll., 1998; Ogden et coll., 2008]. 81 La compétence représente ici la capacité à être infecté, puis se comporter comme un réservoir pour la bactérie, et à transmettre celle-ci à une tique lors de son repas sanguin. 82 I. scapularis est la dénomination actuelle de l’espèce anciennement connue sous le nom de I. dammini. 64 Introduction Tableau 1 : Protéines anti-hémostatiques et immunomodulatrices de la salive de tique. 65 2 Introduction LA SALIVE DE TIQUE La salive de tique présente de très nombreuses fonctions. La salive joue tout d’abord un rôle important dans la dynamique du repas sanguin, puisque sa sécrétion est nécessaire pour éliminer l’eau contenue dans le sang ingurgité et concentrer ce dernier ; la salive participe également à la constitution d’un cément autour des pièces piqueuses, favorisant l’ancrage de la tique à la peau ; enfin, la salive véhicule un ensemble complexe de molécules dont les effets anti-hémostatiques, antalgiques/anti-inflammatoires et immunomodulateurs – déjà décrits depuis plus de 25 ans [Ribeiro et coll., 1985] – permettent d’inhiber la réaction de rejet – générée lors d’une effraction cutanée par un corps étranger (ici les pièces piqueuses de la tique, et les sécrétions salivaires injectées) –, autorisant ainsi la poursuite du repas sanguin, dont la durée s’étale sur plusieurs jours. Les fonctions des molécules contenues dans la salive de tique sont redondantes (une même cible pour plusieurs molécules), et de nombreuses molécules de la salive de tique sont multifonctionnelles (une même molécule pour plusieurs cibles). Dans ce chapitre ne seront évoquées que les activités pharmacologiques principales de la salive de tique, et seuls quelques exemples choisis (concernant plus particulièrement les espèces vectrices de la borréliose de Lyme) seront présentés (Tableau 1). Pour une revue détaillée, se référer articles de Francischetti et coll., 2009 et de Hovius et coll., 2008b. Activité anti-hémostatique La salive de tique agit sur les trois volets de l’hémostase, que représentent la vasoconstriction, l’agrégation plaquettaire et la coagulation. La salive de tique contient en particulier des protéines de la famille des serpines83, qui jouent un rôle important dans le contrôle des sérines protéases impliquées dans la cascade de la coagulation. Parmi ces 83 Serpin : serin protease inhibitor. 66 Introduction protéines, IRIS84 contribue à l’activité anti-hémostatique de la salive d’I. ricinus, en inhibant à la fois l’agrégation plaquettaire et la coagulation : la capacité d’IRIS à inhiber la cascade de la coagulation repose notamment sur l’inhibition de sérines protéases clés, comme la thrombine ou le facteur Xa [Prevot et coll., 2006]. Une autre serpine présente dans la salive d’I. ricinus, IRS-285 (plus récemment décrite), inhibe l’agrégation plaquettaire induite par deux sérines protéases, la cathepsine G et – à forte dose – la thrombine [Chmelar et coll., 2011]. D’autres molécules de la salive à activité anticoagulante sont maintenant bien caractérisées, en particulier chez I. scapularis, comme les protéines Ixolaris et Penthalaris, inhibant la voie extrinsèque de la coagulation (Ixolaris et Penthalaris inhibent l’activation du facteur X par le complexe facteur tissulaire/facteur VII activé) [Francischetti et coll., 2002; Francischetti et coll., 2004; Nazareth et coll., 2006], ou encore la protéine Salp1486 inhibant l’activité du facteur Xa (à la convergence des deux voies d’activation de la cascade de la coagulation) [Narasimhan et coll., 2002]. La prostaglandine E2 (composé lipidique présent dans la salive d’I. scapularis) contribue également aux effets anti-hémostatiques de la salive par son action vasodilatatrice [Sa-Nunes et coll., 2007]. Activité anti-inflammatoire de la salive et modulation de la réponse immunitaire innée L’inflammation cutanée, provoquée par la piqûre de tique, libère un grand nombre de médiateurs. Parmi ces médiateurs, l’histamine (produite par les mastocytes et les polynucléaires basophiles) – entrainant un prurit –, la sérotonine (produite par les plaquettes, les mastocytes ou encore les macrophages) et la bradykinine (dont la production est secondaire à l’activation du facteur XII de la cascade de la coagulation) – entrainant une 84 85 86 IRIS : Ixodes ricinus immunosuppressor. IRS-2 : Ixodes ricinus serpin-2. Salp14 : salivary protein 14. 67 Introduction sensation douloureuse87 [Julius et coll., 2001] –, ont des effets délétères pour la tique, car la réaction de grattage induite pourrait perturber la prise du repas sanguin, obérant dès lors les chances de son succès. Une famille de protéines contenues dans la salive de tique – les lipocalines – (dont plusieurs membres, dénommés LIRs88 et LIPERs89, ont été respectivement décrits chez I. ricinus [Beaufays et coll., 2008a] et chez I. persulcatus [Konnai et coll., 2011]), ont la capacité de séquestrer et d’inhiber l’action de l’histamine et de la sérotonine [Sangamnatdej et coll., 2002]. Par ailleurs, les lipocalines constituent une famille protéique aux multiples fonctions90 [Flower, 1996], dont certaines (anti-inflammatoire, antiagrégant plaquettaire, inhibition du complément) ont été caractérisées dans la salive d’espèces variées de tiques dures et de tiques molles [Francischetti et coll., 2009]. La salive d’I. scapularis contient également une métallo-enzyme dont l’activité kininasique induit l’hydrolyse de la bradykinine [Ribeiro et coll., 1986; Ribeiro et coll., 1998]. La voie alternative du complément est un des piliers, le plus efficace et le plus précoce, de la réponse immunitaire innée. L’inactivation du complément représente pour la tique un impératif absolu, devant lui permettre d’échapper à la réaction cutanée de rejet, à laquelle s’expose tout corps étranger qui pénètre la peau en profondeur. La corrélation entre la spécificité d’hôte de certaines espèces du genre Ixodes91, et l’aptitude de la salive de ces mêmes espèces à inhiber plus spécifiquement la cascade du complément de leurs hôtes préférentiels, mise en évidence par l’équipe de Nuttall et coll. [Lawrie et coll., 1999], témoigne de l’importance particulière que revêt l’inhibition du complément pour la réussite du repas sanguin, et des capacités développées par les tiques pour s’adapter à leurs hôtes et se 87 88 89 90 La sérotonine et la bradykinine activent les terminaisons des fibres nerveuses nociceptives afférentes. LIR : lipocalin from Ixodes ricinus. LIPER : lipocalin from Ixodes persulcatus. Exemples de fonctions des lipocalines : modulation de la réponse immunitaire, transport de molécules (rétinol, phéromones …), régulation de l’hémostase. 91 Les espèces de tique étudiées dans cet article étaient I. ricinus, I. hexagonus, et I. uriae. 68 Introduction prémunir de leurs défenses. Plusieurs protéines de la salive de tique inhibant l’activité du complément sont maintenant bien caractérisées. La protéine Isac92, isolée de la salive d’I. scapularis, empêche (à la manière du facteur H) la formation de la C3 convertase en inhibant le recrutement du facteur B (fB) par le composant C3b, et accélère également la dissociation des complexes C3bB préformés [Valenzuela et coll., 2000]. Salp20, une autre protéine salivaire identifiée chez I. scapularis, inhibe de façon similaire la C3 convertase, en dissociant la liaison covalente entre fB et C3b [Tyson et coll., 2007]. Par ailleurs, deux analogues structuraux d’Isac ont été identifiés dans la salive d’I. ricinus, et respectivement dénommés Irac-1 et Irac-293 [Daix et coll., 2007] : la coexpression de ces deux protéines confère à la salive d’I. ricinus une activité inhibitrice sur la cascade du complément d’une large variété d’hôtes vertébrés, dont l’homme [Schroeder et coll., 2007]. Plus récemment, ont encore été décrites cinq autres protéines de la salive d’I. ricinus – IxAC-B194, IxAC-B2, IxAC-B3, IxAC-B4 et IxAC-B5 – et dont le mécanisme d’action est similaire à celui des protéines Isac et Irac [Couvreur et coll., 2008]. Enfin, une analyse transcriptomique a également permis d’identifier dans la salive d’I. pacificus une séquence nucléotidique analogue à celle du gène codant pour la protéine Isac [Francischetti et coll., 2005b]. Devant la blessure cutanée induite par les pièces piqueuses de la tique, la réussite de la mise en place des réponses immunitaires à médiation cellulaire repose sur la capacité de l’hôte à produire, de façon efficace et coordonnée, les chimiokines et cytokines permettant le recrutement et l’activation des leucocytes sur le site de la piqûre de tique. Les mécanismes de défense élaborés par les tiques incluent la sécrétion salivaire de molécules possédant une activité anticytokinique et antichimiokinique large. Dans une étude de Nutall et coll., l’activité de sept cytokines/chimiokines – IL-8 (CXCL8), MCP-1 (CCL2), MIP-1α (CCL3), 92 93 94 Isac : Ixodes scapularis salivary anticomplement protein. Irac : Ixodes ricinus salivary anticomplement protein. IxAC : Ixodes anti-complement. 69 Introduction RANTES (CCL5), Eotaxin (CCL11) – était inhibée (à des degrés divers) par la salive des tiques dures (Dermacentor reticulatus, Amblyomma variegatum et I. ricinus) [Hajnicka et coll., 2005]. Des travaux plus récents ont identifié, dans la salive de tique, une nouvelle famille de molécules capables d’inhiber l’activité des chimiokines pro-inflammatoires, dénommées « évasines ». Evasin-1 (premier membre de cette famille, décrit chez Rhipicephalus sanguineus) inhibe de façon sélective les chimiokines CCL3, CCL4 et CCL18 [Frauenschuh et coll., 2007] ; Evasin-395 inhibe l’activité de CXCL1 et CXCL8, et Evasin-4 inhibe l’activité de CCL5 et CCL11 [Deruaz et coll., 2008]. Les polynucléaires neutrophiles représentent une composante cellulaire importante de la réponse immunitaire innée, à laquelle les tiques sont confrontées : ils infiltrent précocement et massivement le derme lésé par les pièces piqueuses de la tique [Castelli et coll., 2008]. Les tiques ont développé des mécanismes de protection contre l’activité de ces cellules. La salive d’I. scapularis altère certaines fonctions clés des polynucléaires neutrophiles, comme la phagocytose [Ribeiro et coll., 1990] ; la production d’ions superoxydes par les polynucléaires neutrophiles est également altérée par deux protéines salivaires, dénommées ISL-929 et ISL-1373 [Guo et coll., 2009]. Une lipocaline de la salive d’I. ricinus est également capable d’altérer le recrutement in vitro et in vivo des polynucléaires neutrophiles, en inhibant le leucotriène B4 (agent chimiotactique de premier plan pour ces cellules) : il s’agit de LIR6, maintenant renommée Ir-LBP96 [Beaufays et coll., 2008b]. Les cellules NK semblent peu impliquées dans l’immunité développée par l’hôte vertébré contre la piqûre de tique [Wikel, 1999]. Si la salive de certaines espèces de tique (comme D. reticulatus) présente la capacité d’inhiber l’activité des cellules NK humaines in vitro, la salive d’I. ricinus semble au contraire dépourvue d’une telle action [Kubes et coll., 2002]. 95 96 La fonction et le ligand de Evasin-2 ne sont pas connus à ce jour. Ir-LBP : Ixodes ricinus leukotriene B4-binding protein. 70 Introduction Enfin, les molécules IRIS, IRS-2, et la prostaglandine E2, dont l’activité antihémostatique a été évoquée plus haut, présentent également une activité immunosuppressive. IRIS agit sur la réponse immunitaire innée et adaptative de l’hôte, en inhibant à la fois la synthèse de cytokines pro-inflammatoires, et en modulant l’activité des macrophages et des lymphocytes T [Leboulle et coll., 2002]. L’activité d’IRIS sur les monocytes/macrophages repose en particulier sur sa capacité à inhiber la sécrétion du TNF-α [Prevot et coll., 2009]. IRS-2 présente quant à elle des propriétés anti-inflammatoires, qui reposent sur sa capacité à inhiber spécifiquement deux sérines protéases leucocytaires – la cathepsine G97 et la chymase98 [Pejler et coll., 2007; Korkmaz et coll., 2008; Chmelar et coll., 2011]. La prostaglandine E2 participe quant à elle aux effets immunomodulateurs de la salive en inhibant la maturation des cellules dendritiques [Sa-Nunes et coll., 2007], dont le rôle, à l’interface entre immunité innée et immunité adaptative, est essentiel. Outre ses effets inhibiteurs sur la maturation des cellules dendritiques, la salive de tique inhibe également leur migration vers les ganglions lymphatiques de drainage cutanés, ainsi que leur capacité à y présenter les antigènes transformés aux lymphocytes T [Skallova et coll., 2008]. Effet sur la réponse immunitaire adaptative Alors qu’une tique ne doit faire face « qu’aux seuls » mécanismes de la réponse immunitaire innée de l’hôte lors du premier repas sanguin, c’est aux deux types de réponse immunitaire – innée et adaptative – auxquels une tique doit répondre pour éviter la réaction cutanée de rejet lors d’un deuxième repas sanguin. L’acquisition d’une « résistance » aux 97 La cathepsine G est une protéase contenue dans les grains azurophiles des polynucléaires neutrophiles, impliquée dans le remodelage de la matrice extracellulaire et possédant une activité antimicrobienne et une activité chimiotactique directe sur les leucocytes. 98 La chymase est une protéase mastocytaire, impliquée dans l’activation de l’IL-1β et de l’IL-18, ainsi que dans la dégradation de nombreux substrats comme l’angiotensine I et différents composants de la matrice extracellulaire. 71 Introduction piqûres de tique est un phénomène qui dépend à la fois de l’espèce de tique et de l’hôte concerné par la piqûre : par exemple, s’il est établi que la résistance acquise des cobayes aux piqûres de Dermacentor andersoni est liée au développement d’une réponse immunitaire spécifique à médiation cellulaire [Wikel et coll., 1978], le développement d’une immunité adaptative chez la souris ne semble en revanche pas suffisante pour altérer significativement la prise du repas sanguin d’I. scapularis ou d’I. pacificus [Schoeler et coll., 2000]. Néanmoins, une étude histologique comparée de biopsies cutanées (murines et humaines) a montré que la réponse inflammatoire locale après piqûre unique d’I. scapularis (dilatation vasculaire importante, mais infiltration cellulaire très modérée au niveau des pièces piqueuses) est très différente de celle observée après piqûres répétées (faible dilatation vasculaire mais infiltration cellulaire massive par des lymphocytes, des histiocytes, ainsi que des polynucléaires neutrophiles et éosinophiles) [Krause et coll., 2009] : ces données soulignent l’importance des mécanismes immunitaires adaptatifs dans la réaction cutanée aux piqûres de tique. Le rôle des anticorps et des lymphocytes B, dans les mécanismes de résistance aux piqûres de tique développés par les hôtes vertébrés n’est pas formellement établi [Francischetti et coll., 2009]. Cependant, la salive de tique d’I. ricinus est capable d’inhiber la fonction et les capacités de prolifération de lymphocytes B murins [Hannier et coll., 2003]. La protéine salivaire responsable de cette activité inhibitrice sur les lymphocytes B a été caractérisée, et dénommée Bip99 ; son mécanisme d’action n’a pas été clairement déterminé, mais il semble intervenir sur la voie de signalisation des TLRs [Hannier et coll., 2004]. L’inhibition des lymphocytes T par des constituants salivaires représente un autre volet des mécanismes de défense des tiques face à la réponse immunitaire adaptative de l’hôte. 99 Bip : B-cell inhibitory protein. 72 Introduction L’équipe de Ribeiro et coll. a montré qu’une cystatine100 sécrétée dans la salive d’I. scapularis – la sialostatine L101 – inhibe la prolifération de lymphocytes T cytotoxiques murins in vitro, et présente également une activité anti-inflammatoire in vivo [Kotsyfakis et coll., 2006]. Les effets inhibiteurs de la salive de tique sur la capacité des cellules dendritiques à présenter les antigènes aux lymphocytes T est connue [Sa-Nunes et coll., 2007; Skallova et coll., 2008], et la sialostatine L participe au défaut d’activation lymphocytaire T, secondaire à l’altération de la présentation antigénique par les cellules dendritiques : celui-ci est lié à un défaut de clivage des antigènes à présenter, induit in vivo par l’inhibition directe de la sialostatine L sur la cathepsine S [Sa-Nunes et coll., 2009]. Par ailleurs la salive d’I. scapularis contient une autre cystatine, la sialostatine L2, dont le rôle essentiel pour la réussite du repas sanguin a été démontré par ARN interférence [Kotsyfakis et coll., 2007]. Une protéine de liaison à l’IL-2, capable d’inhiber la prolifération des lymphocytes T humains in vitro, a également été mise en évidence dans la salive d’I. scapularis [Gillespie et coll., 2001]. Enfin, l’action de la protéine IRIS sur les lymphocytes T, déjà évoquée plus haut, repose en particulier sur l’inhibition de la prolifération et de la capacité des lymphocytes T murins à produire de l’IFN-γ [Leboulle et coll., 2002]. Parmi les nombreuses protéines de la salive de tique, Salp15 (initialement décrite chez I. scapularis [Das et coll., 2001]) est de loin la protéine la plus étudiée, car c’est probablement la protéine salivaire qui contribue le plus aux mécanismes d’échappement de Borrelia à la réponse immunitaire cutanée de l’hôte, lors de la phase initiale de l’infection (voir chapitre « Contribution de la salive de tique aux mécanismes d’échappement de Borrelia », page 108). La protéine Salp15 agit en particulier sur la réponse immunitaire adaptative de l’hôte. L’interaction de Salp15 avec le co-récepteur CD4 inhibe l’activation des lymphocytes T CD4+ 100 Les cystatines sont une famille protéique dont la fonction métabolique principale est l’inhibition des cystéine-protéases (comme les cathepsines ou les caspases). 101 Cet inhibiteur présente, in vitro, une forte affinité pour la cathepsine L, d’où son nom. 73 Introduction [Anguita et coll., 2002; Garg et coll., 2006; Juncadella et coll., 2007], et l’interaction de Salp15 avec le récepteur DC-SIGN inhibe à la fois la production de cytokines proinflammatoires et l’activation des lymphocytes T par les cellules dendritiques [Hovius et coll., 2008a]. 74 Introduction Figure 20 : Position taxonomique des bactéries du genre Borrelia NOTE. Les espèces en caractère rouge sont celles pour lesquelles des cas d’infection humaine ont été rapportés. D’après http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/. Introduction 75 B BIOLOGIE DES BORRELIA Taxonomie et répartition géographique La borréliose de Lyme est due à des spirochètes (bactéries spiralées) appartenant à l’ordre des Spirochaetales, à la famille des Spirochaetaceae et au genre Borrelia (Figure 20) [Paster et coll., 2000]. Outre le genre Borrelia, les spirochètes comptent trois autres genres bactériens d’intérêt médical : Treponema, Leptospira et Brachyspira. Le genre Treponema comprend l’espèce Treponema pallidum – agent de la syphilis –, ainsi que les espèces responsables des tréponématoses non vénériennes ; le genre Leptospira comprend plusieurs espèces de leptospires responsables de la leptospirose ; le genre Brachyspira comprend différentes espèces responsables de spirochétoses intestinales, mais leur caractère pathogène est controversé [Tsinganou et coll., 2010]. Le genre Borrelia comprend quant à lui les espèces bactériennes responsables des fièvres récurrentes ainsi que l’ensemble des espèces responsables ou apparentées phylogénétiquement aux agents de la borréliose de Lyme. Ces dernières sont regroupées dans le complexe B. burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi sl). À ce jour, le complexe B. burgdorferi sl compte 19 espèces102 et un genomospecies103 décrits. Huit d’entre elles sont impliquées en pathologie humaine : B. burgdorferi sensu stricto [Burgdorfer et coll., 1982; Johnson et coll., 1984], B. garinii [Baranton et coll., 1992], B. afzelii [Canica et coll., 1993], B. spielmanii [Richter et coll., 2004], B. valaisiana [Wang et coll., 1997], B. lusitaniae [Le Fleche et coll., 1997], B. bavariensis [Margos et coll., 2009] et B. bissettii [Postic et coll., 102 Toutes ces espèces ne sont pas encore formellement validées, cinq espèces sont proposées mais pas encore confirmées : B. americana, B. bavariensis, B. kurtenbachii, B. yangtze et B. finlandensis. 103 Borrelia genomospecies 1 (depuis renommée Borrelia americana) et Borrelia genomospecies 2 n’avaient pas été proposées initialement comme des espèces à part entière en raison de données insuffisantes et d’un nombre d’isolats trop restreint. 76 Introduction 1998]. En Europe, toutes les espèces pathogènes sont présentes, mais trois d’entre elles sont plus fréquentes : B. garinii, B. afzelii et B. burgdorferi ss, avec une plus grande prévalence de B. garinii et B. afzelii. À l’inverse, en Amérique du Nord, B. burgdorferi ss est la seule espèce pathogène pour l’homme présente (en exceptant les exceptionnelles descriptions de cas humains liés à B. bissettii [Girard et coll., 2011]). Les autres espèces du groupe B. burgdorferi sl, majoritairement décrites aux États-Unis (B. californiensis [Postic et coll., 2007], B. carolinensis [Rudenko et coll., 2011], B. americana [Rudenko et coll., 2009a], B. andersonii [Marconi et coll., 1995], B. kurtenbachii [Margos et coll., 2010], et Borrelia genomospecies 2 [Postic et coll., 2007]), en Asie (B. japonica [Kawabata et coll., 1993], B. turdi [Fukunaga et coll., 1996], B. tanukii [Fukunaga et coll., 1996], B. sinica [Masuzawa et coll., 2001], et B. yangtze [Chu et coll., 2008]) ou en Europe (B. finlandensis [Casjens et coll., 2011]) n’ont pas été identifiées à ce jour chez l’homme et sont donc considérées comme des espèces non pathogènes [Baranton et coll., 2009]. 77 Introduction Figure 21 : Structure des bactéries du genre Borrelia D’après Guerau-de-Arellano et coll., 2005 ; Rosa et coll. 2005. 78 Introduction Structure et organisation génomique de la bactérie Comme les autres spirochètes d’intérêt médical, les bactéries du genre Borrelia sont facilement reconnaissables en microscopie optique à fond noir par leur morphologie hélicoïdale et leur mobilité caractéristique. D’une longueur de 4 à 30 µm et d’un diamètre de 0,2 à 0,5 µm, les bactéries du genre Borrelia se caractérisent par une ultrastructure particulière (Figure 21) qui se compose, de l’intérieur vers l’extérieur, par [Barbour et coll., 1986] : — le cylindre protoplasmique, correspondant au corps cellulaire délimité par la membrane cytoplasmique et un peptidoglycane104 très mince [Rosa et coll., 2005] ; — l’espace périplasmique, contenu entre la membrane externe et le cylindre protoplasmique, renfermant 7 à 30 endoflagelles (associés à une protéine, la flagelline) insérés aux extrémités du cylindre protoplasmique et dont l’enroulement autour de ce dernier confère à la bactérie à la fois sa mobilité caractéristique (associant des mouvements de rotation, de torsion et de compression) et sa forme spiralée [Motaleb et coll., 2000] ; — la membrane externe, de structure trilamellaire, où sont enchâssés plus d’une centaine de polypeptides et de lipoprotéines [Fraser et coll., 1997]. La structure de la paroi des Borrelia présente des similitudes avec la paroi des bactéries à Gram négatif, mais celle-ci ne prend pas la coloration de Gram. Une différence importante avec de nombreuses autres bactéries à Gram négatif est l’absence de LPS [Takayama et coll., 1987] impliqué dans la physiopathologie du sepsis. En revanche, elle comprend de très nombreuses protéines de surface (comme les protéines Osp105 dont il existe 6 membres connus – OspA à OspF [Norris et coll., 1992; Lam et coll., 1994] – ou encore les protéines 104 La synthèse de ce peptidoglycanne est la cible des β-lactamines, classe antibiotique majeure du traitement de la borréliose de Lyme. 105 Osp : Outer surface protein. 79 Introduction VlsE106), dont la diversité et la variabilité d’expression témoignent des importantes capacités d’adaptation de la bactérie à des hôtes et environnements différents. Ces protéines de surface jouent également un rôle essentiel dans la transmission, la dissémination et l’échappement de Borrelia au système immunitaire de l’hôte. Le génome de B. burgdorferi est de petite taille (environ 1,5 Mb). Il est segmenté, composé d’un chromosome linéaire de petite taille (environ 900 kb) et de très nombreux plasmides linéaires et circulaires (d’une taille de 5 à 56 kb), dont la somme représente près de 40 % du génome. Le chromosome présente un faible taux de guanine et de cytosine, avec un contenu en G+C moyen de 28,6 % [Fraser et coll., 1997] distinguant Borrelia des genres Leptospira (G+C ≈ 35 %) et Treponema (G+C ≈ 53 %) [Hyde et coll., 1984]. Le matériel génétique de B. burgdorferi est inhabituel : cette bactérie présente en effet la double singularité de posséder à la fois un chromosome et des plasmides linéaires – alors que la plupart des bactéries ont un chromosome circulaire et ne possèdent pas de plasmides linéaires – et d’être au sein du règne bactérien l’espèce qui compte le plus grand nombre de plasmides connue [Fraser et coll., 1997; Casjens et coll., 2000]. À titre d’exemple, la souche B31 de B. burgdorferi ss compte au total 21 plasmides107, dont 9 circulaires et 12 linéaires [Stewart et coll., 2005]. 106 107 VlseE : VMP (vesicular membrane protein)-like sequence E. On peut même imaginer que la souche native comptait plus que les 21 plasmides décrits, certains plasmides ayant pu être perdus lors de la culture in vitro de la souche étudiée. 80 Introduction C TRANSMISSION DE BORRELIA Chez la tique à jeun, c’est à dire avant le début du repas sanguin, Borrelia est localisée dans l’intestin de la tique. Cependant, il est maintenant bien établi que la transmission de Borrelia à l’hôte vertébré ne se fait pas par régurgitation passive du contenu intestinal, mais fait suite au contraire à une migration active des spirochètes qui franchissent successivement la barrière constituée par l’épithélium intestinal pour disséminer dans l’hémolymphe, puis la paroi des glandes salivaires avant d’être injectés avec la salive de tique dans la peau [Dunham-Ems et coll., 2009]. Lorsque la tique infectée par Borrelia débute son repas sanguin, l’environnement physiologique initial dans lequel se trouvent les spirochètes est considérablement transformé : sa composition, mais aussi ses constantes physiques de température et de pH sont modifiées108 [Yang et coll., 2000], d’abord par la transsudation de liquide interstitiel dans l’intestin de la tique, puis par l’irruption soudaine des facteurs solubles plasmatiques et des éléments figurés du sang ingéré. Aux changements environnementaux majeurs auxquels Borrelia doit faire face lors du gorgement de la tique, la bactérie répond par une modification tout aussi majeure de sa dynamique de croissance et de l’expression de ses protéines de surface majoritaires. 108 L’afflux de sang dans l’intestin de la tique induit une augmentation de température et une diminution du pH. 81 1 Introduction DYNAMIQUE DE LA TRANSMISSION Évolution topographique et dynamique de Borrelia chez le vecteur Le gorgement de la tique induit une multiplication rapide des Borrelia : plusieurs études réalisées in vivo chez la tique montrent une augmentation très importante du nombre de Borrelia dans l’intestin de celle-ci, passant de la centaine de bactéries avant la prise du repas sanguin à la dizaine, voire la centaine de milliers d’organismes 72 heures après [de Silva et coll., 1995; Piesman et coll., 2001]. La multiplication bactérienne exponentielle et la très forte population de Borrelia au niveau intestinal [de Silva et coll., 1995] contrastent avec le très faible nombre de Borrelia qui disséminent dans l’hémolymphe après avoir franchi la barrière intestinale, puis pénètrent dans les glandes salivaires [Piesman et coll., 2001; Dunham-Ems et coll., 2009]. Ainsi, l’infection de l’hôte vertébré repose sur la transmission d’un inoculum bactérien très faible, mais composé de bactéries virulentes [Ohnishi et coll., 2001; Lima et coll., 2005]. La migration de Borrelia dans la tique est biphasique : à la phase initiale d’adhérence aux parois latérales des cellules épithéliales intestinales, pendant laquelle les spirochètes – alors immobiles – migrent vers la profondeur de l’épithélium digestif, succède une phase de migration « active » permettant aux spirochètes devenus mobiles de franchir la membrane basale, puis de pénétrer dans les glandes salivaires via l’hémolymphe [DunhamEms et coll., 2009]. Le délai au bout duquel les premiers spirochètes sont observables dans les glandes salivaires de la tique, une fois le repas sanguin débuté, reflète le temps nécessaire à la migration des Borrelia depuis l’intestin jusqu’à l’invasion des glandes salivaires : ce délai moyen (36 à 72 heures) [Ohnishi et coll., 2001; Dunham-Ems et coll., 2009], est concordant avec les délais moyens de transmission – observés ou estimés – chez l’homme et l’animal. 82 Introduction Délai de transmission du vecteur à l’hôte La transmission de Borrelia à l’homme ne survient effectivement pas au tout début du repas sanguin. Le risque théorique de transmission existe dès les premières heures qui suivent l’attachement de la tique, mais l’expérience clinique montre que le risque est faible durant les 24 premières heures et il est également clairement établi que ce risque augmente avec la durée d’attachement de la tique109. Les données expérimentales obtenues chez l’animal montrent une transmission possible de Borrelia par la tique I. scapularis dès 24 heures après le début du repas sanguin avec une efficacité maximale de transmission à 72 heures [Piesman et coll., 1987; Hojgaard et coll., 2008]. Une transmission encore plus précoce de Borrelia à l’animal par la tique I. ricinus a été décrite dès 17 heures après l’attachement de la tique avec une efficacité maximale de transmission à 47 heures [Kahl et coll., 1998]. Sur le modèle européen, la dynamique de transmission semble également être influencée par la nature du couple Borrelia/Ixodes : I. ricinus est en effet capable de transmettre B. afzelii plus précocement et plus efficacement que B. burgdorferi ss [Crippa et coll., 2002]. 109 Les recommandations en matière de prévention de la borréliose de Lyme insistent sur la nécessité de retirer une tique fixée à la peau le plus rapidement possible afin de limiter le risque d’infection. 83 2 Introduction BASES MOLÉCULAIRES DE LA TRANSMISSION Situation avant la prise du repas sanguin Dans le vecteur – la tique du genre Ixodes –, et avant que celle-ci ne puisse prendre un repas sanguin chez un nouvel hôte vertébré, les spirochètes se développent dans l’intestin de la tique au contact de la muqueuse intestinale. Dans cet environnement, Borrelia y exprime de façon prédominante les protéines de surface OspA et OspB, alors que l’expression de la protéine de surface OspC reste indétectable [Schwan et coll., 1995; Schwan et coll., 2000]. Les gènes ospA et ospB sont localisés sur le plasmide linéaire de 54 kb (lp54) et organisés dans un seul et unique opéron sous le contrôle du même promoteur [Bergstrom et coll., 1989]. Les protéines OspA et OspB jouent un rôle essentiel pour la colonisation et la survie de Borrelia dans l’intestin de la tique [Yang et coll., 2004]. OspA interagit notamment de façon spécifique avec une protéine de la tique, TROSPA110, située à la surface des cellules épithéliales intestinales et plus particulièrement exprimée au niveau des jonctions serrées qui unissent ces dernières [Pal et coll., 2004a]. L’interaction d’OspA avec son récepteur TROSPA permet non seulement l’adhésion de Borrelia à la surface de l’épithélium intestinal de la tique, mais aussi la persistance de la bactérie dans l’environnement physiologique hostile que constituent la lumière intestinale et son contenu [Fikrig et coll., 2006]. L’importance de cette protéine de surface pour le cycle de Borrelia chez la tique est soulignée par les expériences qui montrent que des mutants ospA- sont incapables de coloniser efficacement la tique, mais gardent leur capacité à infecter la souris [Yang et coll., 2004]. OspB semble également constituer un facteur de virulence, essentiel à l’adhésion de Borrelia à l’intestin de la tique, mais son récepteur n’a pas encore été identifié [Fikrig et coll., 2004; Neelakanta et coll., 2007]. 110 TROSPA : tick receptor for OspA. 84 Introduction Modifications moléculaires engendrées par le gorgement Le gorgement de la tique induit la synthèse rapide et l’expression majoritaire par Borrelia de la protéine de surface OspC, initialement non exprimée chez la tique à jeun [Schwan et coll., 1995]. OspC ne semble pas strictement indispensable à la dissémination systémique de Borrelia dans la tique et son passage dans les glandes salivaires [Grimm et coll., 2004; Tilly et coll., 2006], mais son expression pourrait cependant faciliter ce processus [Pal et coll., 2004b]. L’induction de OspC n’est observée que de façon transitoire lors du gorgement (la proportion de Borrelia dans l’intestin de la tique exprimant OspC diminue à nouveau à la fin du repas sanguin), et seulement chez la tique déjà infectée par Borrelia avant le repas sanguin, alors que OspC n’est pas exprimée par Borrelia lorsque la tique acquiert la bactérie lors de la prise d’un repas sanguin sur un hôte infecté [Schwan et coll., 2000]. Ces données indiquent un rôle important d’OspC dans la transmission du pathogène de la tique vers l’hôte mammifère, mais pas dans la transmission de l’hôte mammifère vers la tique. Par ailleurs, l’induction de la protéine OspC lors du repas sanguin s’accompagne d’une réduction réciproque de l’expression de la protéine OspA [Schwan et coll., 2000; Pal et coll., 2004a]. Ce changement dans l’expression des protéines de surface OspA et OspC observé in vivo est bien corrélé avec les données obtenues in vitro, lesquelles soulignent notamment l’importance de la température dans ce mécanisme avec une expression faible d’OspA mais forte d’OspC à 37 °C, et une inversion de tendance rendant la protéine OspC indétectable à 24 °C [Schwan et coll., 1995]. La protéine de surface OspA intervient néanmoins dans la dissémination systémique de Borrelia dans la tique au tout début de la phase de gorgement rapide, car elle présente un domaine de liaison pour le plasminogène et pour un activateur du plasminogène – uPA [Fuchs et coll., 1994; Klempner et coll., 1995]. Le plasminogène de l’hôte vertébré, contenu dans le sang ingéré par la tique, est ainsi lié puis transformé en son principe actif – la plasmine –, dont l’activité protéolytique est mise à profit par la bactérie 85 Introduction pour franchir la barrière intestinale de la tique. À ce titre, OspA est un élément important dans la transmission de Borrelia à l’hôte vertébré, car cette protéine permet d’amorcer la migration systémique de la bactérie depuis l’intestin vers l’hémolymphe puis les glandes salivaires de la tique [Coleman et coll., 1997]. Enfin, la répression d’OspA lors du gorgement de la tique s’accompagne également d’une répression de son récepteur TROSPA ; ces modifications parallèles et concomitantes contribuent au « décrochement » des spirochètes, facilitant ainsi le franchissement de la barrière épithéliale intestinale par les spirochètes et leur passage dans l’hémolymphe [Pal et coll., 2004a]. Initiation de l’infection chez l’hôte vertébré Parmi les liporotéines de surface de Borrelia, OspC est certainement celle qui joue le rôle le plus important dans la transmission de Borrelia à l’hôte vertébré puis sa dissémination. Des souches déficientes pour la synthèse d’OspC sont en effet incapables d’induire une infection chez la souris [Grimm et coll., 2004; Tilly et coll., 2006]. De tels mutants ospC-/- sont éliminés de la peau moins de 48 heures après leur injection : étant donné l’importance d’OspC aux étapes les plus précoces de l’infection, l’équipe de Rosa et coll. évoque un rôle possible de cette protéine dans les mécanismes d’échappement à la réponse immunitaire innée de l’hôte [Tilly et coll., 2007]. Cependant, l’équipe de Liang et coll. a démontré que l’absence d’OspC peut être compensée par la surexpression d’autres lipoprotéines de surface (OspA, OspE, VlsE ou DbpA), prévenant ainsi la destruction rapide des souches déficientes pour OspC, et restaurant la capacité de Borrelia à établir l’infection initiale puis à disséminer vers ses organes cibles [Xu et coll., 2008]. Ces nouvelles données indiquent que le rôle d’OspC évoqué par Rosa et coll. repose principalement sur la capacité d’OspC et des autres lipoprotéines de surface à maintenir l’intégrité de la membrane externe de Borrelia, protégeant ainsi la bactérie des défenses immunitaires innées de l’hôte. Néanmoins, OspC étant la lipoprotéine de surface majoritairement exprimée lors de la transmission, c’est bien 86 Introduction d’elle dont dépend la réussite de l’infection initiale, et il apparaît également que cette protéine de surface est spécifiquement requise pour la dissémination efficace de Borrelia vers ses organes cibles [Xu et coll., 2008; Seemanapalli et coll., 2010]. L’histoire du vaccin Enfin, il est difficile de terminer ce chapitre portant sur les bases moléculaires de la transmission de Borrelia à l’homme sans évoquer l’« aventure » du seul vaccin humain de la borréliose de Lyme ayant été commercialisé jusqu’à ce jour [Steere et coll., 1998] et dont le mode d’action reposait précisément sur l’inhibition de la transmission de Borrelia de la tique vectrice vers l’hôte accidentel que représente l’homme. Il s’agissait d’un vaccin recombinant de la protéine de surface OspA, choisie pour son rôle essentiel dans le cycle des Borrelia au niveau du vecteur et les bonnes performances observées avec son utilisation lors des phases précliniques de développement du vaccin [Fikrig et coll., 1990]. La stratégie vaccinale était basée sur la neutralisation du pathogène dans l’intestin de la tique au tout début de la phase de gorgement rapide (c’est à dire avant la modification de l’expression des lipoprotéines de surface OspA/B et OspC) par les anticorps anti-OspA ingérés avec le repas sanguin [de Silva et coll., 1996]. La neutralisation du pathogène était attendue (et confirmée lors des différentes expérimentations in vivo) par un effet bactéricide direct ou par blocage de la multiplication, de l’attachement à la muqueuse intestinale et de la dissémination systémique des Borrelia dans la tique [Pal et coll., 2001]. Le vaccin111, dont la Food and Drug Administration (FDA) a autorisé la mise sur le marché le 21 décembre 1998 aux États-Unis, a vu sa production volontairement abandonnée par son fabricant tout juste trois ans après sa commercialisation en raison d’un trop faible succès commercial lié non seulement au coût et à la lourdeur du 111 Vaccin commercialisé sous le nom de LYMErixTM par la société GlaxoSmithKline. 87 Introduction protocole vaccinal,112 mais aussi, et surtout à une controverse autour d’un risque potentiel d’arthrite auto-immune dont la survenue chez l’homme n’a pourtant jamais été démontrée [Abbott, 2006; Nigrovic et coll., 2007]. 112 Le vaccin présentait également une efficacité insuffisante (protection estimée à 80 % des individus ayant reçu trois doses vaccinales) limitée dans le temps (obligeant le recours à des doses booster additionnelles) et une protection croisée avec des souches non nord-américaines probablement limitée. 88 Introduction IV INTERACTION DE BORRELIA AVEC LA PEAU ET SON SYSTÈME IMMUNITAIRE 1 INTERACTION DE BORRELIA AVEC LA MATRICE EXTRACELLULAIRE Dans la peau, mais également dans tous les autres tissus et organes que Borrelia est susceptible de coloniser et au sein desquels Borrelia se multiplie, la bactérie entretient des liens étroits avec les éléments de la matrice extracellulaire, grâce à plusieurs protéines de surface dont certaines jouent le rôle de véritables adhésines. Borrelia étant par ailleurs dépourvue d’activité protéolytique intrinsèque, la bactérie détourne à son profit les propres systèmes de destruction de la matrice extracellulaire (métalloprotéases et sérines-protéases) de l’hôte pour se mouvoir dans les espaces intercellulaires. Les adhésines de Borrelia Borrelia exprime à sa surface plusieurs lipoprotéines capables de lier la fibronectine, dont la plus étudiée est BBK32 [Probert et coll., 1998]. La synthèse de BBK32 (codée par le gène bbk32 situé sur le plasmide lp36) débute lors du gorgement de la tique et son expression est fortement induite après transmission à l’hôte vertébré [Fikrig et coll., 2000]. In vitro, les données expérimentales indiquent que les modifications de température et de pH sont deux facteurs environnementaux importants qui participent à la modification de l’expression de BBK32 [He et coll., 2007]. Au même titre que d’autres protéines de liaison à la fibronectine exprimées par des pathogènes extracellulaires, comme les protéines FnbpA113 de Staphylococcus aureus ou SfbI114 de Streptococcus pyogenes, avec lesquelles BBK32 possède des analogies structurales et fonctionnelles [Raibaud et coll., 2005], BBK32 appartient à la 113 114 Fnbp : fibronectin binding protein. Sfbp : streptococcal fibronectin binding protein. 89 Introduction famille des MSCRAMMs115 [Kim et coll., 2004] – molécules de surface spécialisées dans l’adhésion aux éléments de la matrice extracellulaire [Patti et coll., 1994]. Outre sa capacité d’adhésion à la fibronectine, BBK32 est également capable de lier différents glycosaminoglycanes de l’hôte (comme le dermatane ou l’héparine sulfate) [Fischer et coll., 2006]. Grâce à ces différents types d’interactions, BBK32 semble impliquée dans la capacité des Borrelia circulantes à adhérer aux vaisseaux et à pénétrer dans les tissus à partir du système circulatoire [Norman et coll., 2008]. Les données expérimentales concernant les conséquences d’une perte de fonction de BBK32 indiquent que l’absence de BBK32 réduit l’infectiosité de Borrelia [Seshu et coll., 2006], mais que sa présence n’est cependant pas essentielle à la transmission et à la dissémination du pathogène [Li et coll., 2006]. D’autres lipoprotéines de surface, comme RevA116 et RevB, sont également capables d’assurer une liaison de Borrelia avec la fibronectine [Brissette et coll., 2009a], et permettent probablement de compenser la perte de fonction de BBK32 dans ces modèles expérimentaux. La redondance des fonctions d’adhérence (une même cible tissulaire pouvant être reconnue par différentes protéines de surface de Borrelia), et la multiplicité des cibles tissulaires avec lesquelles Borrelia interagit, contribuent certainement à limiter pour la bactérie les conséquences fonctionnelles inhérentes à la perte de matériel génétique (BBK32 est codée par un gène plasmidique), et traduit un fort potentiel d’adaptation de Borrelia aux différents environnements rencontrés. Deux autres lipoprotéines, DbpA117 et DbpB, permettent l’adhésion de Borrelia à la décorine [Guo et coll., 1995], et assurent ainsi une liaison indirecte entre la bactérie et les fibres de collagène du derme et des autres tissus conjonctifs cibles de l’infection. Elles sont, comme BBK32, à considérer comme de véritables membres de la famille des MSCRAMMs 115 116 117 MSCRAMMs : microbial surface components recognising adhesive matrix molecules. L’appellation rev indique l’orientation réverse des gènes rev par rapport aux gènes adjacents dénommés rep. Dbp : decorin binding protein. 90 Introduction [Guo et coll., 1998]. DbpA et DbpB sont respectivement codées par les gènes dbpA et dbpB situés sur le plasmide lp54, et la transcription de ces derniers est induite après transmission à l’hôte vertébré [Hagman et coll., 1998]. DbpA et DbpB représentent des facteurs de virulence importants pour Borrelia [Shi et coll., 2008b] : les résultats expérimentaux sur modèle murin indiquent notamment que l’infectivité des souches déficientes en protéines de liaison à la décorine est diminuée [Shi et coll., 2008a], et que la dissémination de Borrelia chez des souris déficientes en décorine est également altérée [Brown et coll., 2001]. Enfin, bien que l’étude initiale de Guo et coll. n’ait pas permis de démontrer que Borrelia peut interagir de façon directe avec les fibres de collagène [Guo et coll., 1995], des données plus récentes indiquent au contraire que la bactérie est capable non seulement d’adhérer aux fibres de collagène de type I, mais également d’y former des microcolonies, et ce en l’absence de décorine ou d’autres protéoglycanes [Zambrano et coll., 2004]. Outre les protéines de liaison à la décorine, d’autres protéines de surface de Borrelia, comme BBK32 mais aussi Bgp118 permettent l’adhésion de la bactérie aux protéoglycanes et glycosaminoglycanes de l’hôte [Parveen et coll., 2000]. Si Bgp représente l’une des nombreuses protéines d’adhésion de Borrelia, Bgp est en revanche l’une des rares protéines sécrétées dans le milieu extérieur par la bactérie [Cluss et coll., 2004]. Par ailleurs, des travaux récents ont permis de mettre en évidence une interaction directe entre Borrelia et la laminine (composant majeur des lames basales) et d’identifier plusieurs protéines de surface impliquées dans cette interaction. Il s’agit d’un membre de la famille des lipoprotéines Erps119 – ErpX – [Brissette et coll., 2008; Brissette et coll., 2009c], ainsi que de la lipoprotéine BmpA120 et de ses trois paralogues BmpB, BmpC, et BmpD [Verma et coll., 118 119 120 Bgp : Borrelia gag binding protein. Le gène codant Bgp est situé sur le chromosome linéaire de Borrelia. Erp : OspE-F related lipoprotein. Bmp : Borrelia membrane protein. La fonction de BmpA, initialement décrite comme la protéine P39, et de ses paralogues n’a pas encore été identifiée. 91 Introduction 2009] : ces protéines constituent ainsi encore d’autres facteurs d’adhésion de Borrelia à la matrice extracellulaire, probablement impliqués dans la dissémination, puis l’invasion et la persistance des tissus cibles de l’infection. Enfin, une autre protéine de surface – P66 –, bien que n’interagissant pas directement avec la matrice extracellulaire, représente une autre adhésine majeure de Borrelia [Antonara et coll., 2007]. La protéine P66 (également connue sous le nom de Oms66121), codée par un gène chromosomique [Probert et coll., 1995], est une protéine exposée à la surface membranaire de Borrelia [Bunikis et coll., 1995; Probert et coll., 1995; Skare et coll., 1997]. Alors que la synthèse de P66 est indétectable chez la tique non gorgée, son expression est induite par le gorgement [Cugini et coll., 2003]. P66 reconnaît spécifiquement la sous-unité β3 des intégrines, et permet notamment l’adhésion de Borrelia aux plaquettes via l’interaction avec l’intégrine αIIbβ3122 et à l’endothélium via l’interaction avec l’intégrine αVβ3 [Coburn et coll., 1993; Coburn et coll., 1999; Coburn et coll., 2003] : l’adhésion de Borrelia aux plaquettes activées, agrégées sur la paroi des vaisseaux lésés, pourrait constituer l’un des mécanismes par lesquels la bactérie accède à la circulation sanguine systémique et dissémine vers ses organes cibles. Borrelia et destruction de la matrice extracellulaire Au contraire d’autres bactéries invasives qui produisent et excrètent dans le milieu extérieur des protéases (on pourra citer par exemple la synthèse par Staphylococcus aureus des protéases SspA, ScpB et de l’auréolysine [Skare et coll., 1997]), Borrelia est dépourvue d’activité protéolytique intrinsèque [Coleman et coll., 1995; Klempner et coll., 1995]. Néanmoins, Borrelia compense l’absence de cette activité en induisant la synthèse de diverses métalloprotéases (MMP-1, MMP-3, MMP-9, par exemple) à la fois in vitro [Gebbia et coll., 121 122 Oms66 : outer membrane-spanning 66-kDa protein. L’intégrine αIIbβ3 est également connue sous le nom de glycoprotéine GpIIb-IIIa. 92 Introduction 2001; Hu et coll., 2001; Behera et coll., 2004] et in vivo [Lin et coll., 2001; Zhao et coll., 2003]. Par ailleurs, Borrelia peut lier le plasminogène ainsi que les activateurs tissulaires du plasminogène [Klempner et coll., 1995] (dont la production locale est – au moment de la transmission à l’hôte vertébré – avantageusement augmentée par l’inflammation générée à la fois par la blessure liée à la piqûre de tique et par la réponse immunitaire dirigée contre la bactérie). L’activation du plasminogène en plasmine, liée à la surface de Borrelia, permet à la bactérie de détruire les composants adjacents de la matrice extracellulaire et des membranes basales [Coleman et coll., 1999] (à la faveur du large spectre protéolytique intrinsèque de la plasmine et à l’activation indirecte des métalloprotéases, voir chapitre « Les enzymes protéolytiques : métalloprotéases et sérine-protéases », page 25), favorisant ainsi la migration tissulaire et probablement aussi la pénétration vasculaire du spirochète [Coleman et coll., 1995; Klempner et coll., 1995]. Plusieurs protéines de surface de Borrelia sont capables de lier le plasminogène. OspA est la première d’entre elles [Fuchs et coll., 1994], mais comme nous l’avons vu plus haut, si la liaison OspA/plasminogène présente en effet une importance fonctionnelle pour la migration de Borrelia dans la tique [Coleman et coll., 1997], la synthèse de la protéine OspA est ensuite réprimée chez l’hôte vertébré au profit d’OspC. La protéine OspC présente aussi une affinité pour le plasminogène, mais si le rôle de la liaison OspC/plasminogène comme facteur de virulence potentiel pour Borrelia a également été suggéré [Lagal et coll., 2006], la diminution de la production d’OspC jusqu’à son absence complète de synthèse dans les quelques jours qui suivent de début de l’infection chez l’hôte vertébré [Liang et coll., 2002a; Crother et coll., 2004] ne permet pas de considérer cette liaison comme un facteur de virulence déterminant pour les manifestations disséminées de la phase tardive de la maladie. Trois lipoprotéines de la famille Erp – ErpP, ErpA et ErpC – sont capables de lier le plasminogène [Brissette et coll., 2009b], mais à la différence d’OspA et OspC, les lipoprotéines de la famille Erp sont fortement exprimées tout au long de 93 Introduction l’infection chez l’hôte vertébré [Miller et coll., 2005; Miller et coll., 2006]. Ces protéines Erp contribuent probablement à la dissémination du pathogène, en particulier dans les phases tardives de la maladie [Brissette et coll., 2009b]. Enfin, une autre protéine de surface, CRASP-1123, mieux connue pour son rôle dans le mécanisme d’échappement de Borrelia à la lyse médiée par le complément (voir chapitre « Mécanismes d’échappement à l’action du complément », page 101), est également capable de lier le plasminogène (ainsi que plusieurs autres composants de la matrice extracellulaire comme la fibronectine, la laminine, et le collagène), et de le convertir en plasmine [Hallstrom et coll., 2010]. 2 INITIATION DE LA RÉPONSE IMMUNITAIRE PAR BORRELIA Borrelia interagit avec une grande variété de cellules immunitaires spécialisées – comme les cellules dendritiques [Filgueira et coll., 1996; Suhonen et coll., 2003], les lymphocytes [Knigge et coll., 1996; Kalish et coll., 2003; Kinjo et coll., 2006; Collins et coll., 2008], les monocytes/macrophages [Cruz et coll., 2008; Salazar et coll., 2009], ou encore les mastocytes [Talkington et coll., 1999] – dont la présence dans la peau constitue un réseau de surveillance, indispensable à la défense de l’organisme contre les infections [Nestle et coll., 2009]. Mais Borrelia est également capable d’induire l’activation de cellules résidentes « structurales » comme les kératinocytes et les fibroblastes [Ebnet et coll., 1997; Marchal et coll., 2009], ou encore les cellules endothéliales [Sellati et coll., 1995; Sellati et coll., 1996; Ebnet et coll., 1997], qui participent elles aussi (directement ou indirectement) à ce réseau de surveillance. L’activation de ces différentes catégories cellulaires par Borrelia repose d’une part sur l’interaction de la bactérie avec les récepteurs cellulaires de reconnaissance de motif (comme les récepteurs TLRs ou NODs) impliqués principalement dans la réponse immunitaire innée 123 CRASP : complement regulator-acquiring surface protein. 94 Introduction non spécifique, et d’autre part sur l’interaction plus spécifique entre les cellules de l’immunité adaptative et les antigènes bactériens apprêtés par les cellules présentatrices d’antigènes. Interaction de Borrelia avec les TLRs Les TLRs jouent un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire dirigée contre Borrelia [Guerau-de-Arellano et coll., 2005]. Borrelia ne produit pas de LPS [Takayama et coll., 1987] mais possède au contraire de nombreuses lipoprotéines de surface fortement immunogènes [Brandt et coll., 1990], dont un motif triacylé124 de la partie lipidique constitue un véritable PAMP [Singh et coll., 2006]. In vivo, l’injection intra-articulaire [Gondolf et coll., 1994] ou intradermique [Norgard et coll., 1995] de lipoprotéines (ou de leurs équivalents lipopeptidiques) de Borrelia induit une atteinte inflammatoire localisée. Les lipoprotéines de Borrelia sont en effet capables d’induire une réponse pro-inflammatoire caractérisée par la production de cytokines et chimiokines résultant de l’activation de la voie NF-κB, elle-même activée par la stimulation des récepteurs TLRs [Singh et coll., 2006]. Cette réponse pro-inflammatoire est liée in vitro à l’interaction des lipoprotéines de Borrelia avec TLR2 [Hirschfeld et coll., 1999]. Les modèles expérimentaux dans lesquels TLR2 ou MyD88125 (son effecteur intracellulaire) sont inactivés montrent que la voie de signalisation TLR2 joue un rôle majeur dans le contrôle initial de l’infection tissulaire : les charges bactériennes tissulaires observées à la phase initiale de l’infection dans les systèmes TLR2-/- ou MyD88-/- sont en effet jusqu’à 250 fois plus élevées que dans leurs témoins « sauvages » [Wooten et coll., 2002; Bolz et coll., 2004; Liu et coll., 2004; Wang et coll., 2004; Behera et coll., 2006]. Néanmoins, Borrelia est capable d’induire des lésions inflammatoires (parfois même plus sévères ou touchant des tissus habituellement non concernés par l’infection à Borrelia [Wooten et coll., 2002; Behera et coll., 2006]) en 124 125 N-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-(R)-cysteinyl, encore appelé Pam3Cys. MyD88 : myeloid differentiation primary response gene 88. 95 Introduction l’absence d’une voie de signalisation TLR2 opérationnelle : ces données indiquent que d’autres TLRs (et d’autres PRRs) sont impliqués dans la reconnaissance de la bactérie. Une étude a démontré que les individus « faiblement répondeurs » à la vaccination par le LYMErix (protéine OspA recombinante) ont une faible expression cellulaire de TLR1 et que des souris déficientes en TLR1 et TLR2 ne produisent qu’une très faible réponse anticorps à la vaccination par OspA [Alexopoulou et coll., 2002]. Ces résultats suggèrent que TLR1 joue aussi (avec TLR2) un rôle important dans la reconnaissance des lipoprotéines triacylées de Borrelia ; ces résultats sont par ailleurs en accord avec les données de la littérature indiquant que l’association hétérodimérique TLR2/TLR1 est responsable de la détection de motifs lipopeptidiques spécifiques triacylés (l’association TLR2/TLR6 est quant à elle responsable de la détection des motifs diacylés) [Kawai et coll., 2011]. De plus, une coopération TLR2/TLR6 dans l’activation de cellules endothéliales par la lipoprotéine OspA ayant été démontrée in vitro [Bulut et coll., 2001], il n’est pas exclu que TLR6 participe également in vivo à la reconnaissance de Borrelia et à l’induction de la réponse immunitaire dirigée contre elle. En revanche, TLR4 ne participe pas à la reconnaissance de la bactérie, car le ligand principal de TLR4 est le LPS des bactéries à Gram négatif [Kawai et coll., 2011], et Borrelia en est dépourvue [Takayama et coll., 1987]. Par ailleurs, d’autres composants bactériens que les lipoprotéines de surface sont susceptibles d’interagir avec les TLRs de l’hôte. Les macrophages de souris déficients en TLR2, bien qu’insensibles aux lipoprotéines de Borrelia, restent par exemple sensibles à l’activation par d’autres composants de la bactérie [Wooten et coll., 2002]. La flagelline (protéine principale des flagelles bactériens) pourrait être l’un de ces composants. La flagelline est en effet reconnue par TLR5 [Kawai et coll., 2011], mais la flagelline de Borrelia n’est pas exposée à la surface de la bactérie (car contenue intégralement dans l’espace périplasmique). Lorsque TLR2 est fonctionnel, TLR5 ne semble pas jouer de rôle significatif 96 Introduction dans la production de cytokines en réponse à la stimulation par des Borrelia vivantes [Salazar et coll., 2009]. Deux études ont pourtant mis en évidence un rôle possible de TLR5 dans la réponse inflammatoire induite par Borrelia [Bernardino et coll., 2008; Shin et coll., 2008], mais l’induction de la voie TLR5 observée est probablement liée à la stimulation du récepteur par des constituants flagellaires de bactéries lysées. Par ailleurs, TLR9 reconnaît les ilots CpG de l’ADN des pathogènes126 [Kawai et coll., 2011]. Ces motifs CpG pourraient également être à l’origine de l’induction d’une réponse inflammatoire par Borrelia : si deux équipes ayant évalué la question n’ont pas permis de confirmer cette hypothèse [Bernardino et coll., 2008; Shin et coll., 2008], seule l’équipe de Schwartz a jusqu’à présent pu montrer que Borrelia est capable d’induire (après phagocytose dans un système de culture ex vivo de PBMCs127 humains) la synthèse d’interférons de type I et de cytokines pro-inflammatoires en stimulant non seulement TLR9, mais aussi TLR7 [Petzke et coll., 2009] – impliqué quant à lui dans la reconnaissance d’ARN simple brin viraux, bactériens ou fongiques [Kawai et coll., 2011]. Encore plus récemment, Cervantes et coll. ont découvert que TLR8 (situé comme TLR7 et TLR9 dans la voie phagolysosomiale en position intracellulaire, et impliqué comme TLR7 dans la reconnaissance d’ARN simple brin [Kawai et coll., 2011]) intervient également dans la modulation de la réponse immunitaire induite par Borrelia (après phagocytose dans des monocytes humains), de façon coopérative avec TLR2, et même exclusive pour la synthèse d’IFN-β [Cervantes et coll., 2011]. Interaction de Borrelia avec les autres PRRs La reconnaissance de Borrelia par d’autres PRRs que les TLRs a jusqu’à présent été peu étudiée. Néanmoins, des études récentes indiquent que Borrelia interagit avec les récepteurs intracellulaires de type NOD (sensibles au peptidoglycane des bactéries). L’interaction de 126 127 Les ilots CpG sont fréquemment présents dans l’ADN bactérien et viral, mais rares chez les mammifères. PBMCs : peripheral blood mononuclear cells. 97 Introduction Borrelia avec NOD2 induit notamment la synthèse de cytokines pro-inflammatoires, et cette réponse se surajoute à celle déjà produite par l’interaction de la bactérie avec TLR2 [Oosting et coll., 2010]. Borrelia induit également in vitro l’expression de NOD2 par des cellules gliales [Sterka et coll., 2006b] et microgliales [Sterka et coll., 2006a] murines. La stimulation du récepteur NOD2 joue un rôle important dans la réponse inflammatoire (observée à la fois in vitro et in vivo128) provoquée par Borrelia dans le système nerveux central [Chauhan et coll., 2009]. Par ailleurs, un autre PRR, le récepteur au mannose (MR) – élément majeur de la fonction phagocytaire des cellules présentatrices d’antigènes et des macrophages, impliqué dans la reconnaissance de motifs polysaccharidiques mannosylés présents à la surface de nombreux pathogènes (bactéries à Gram positif et négatif, mycobactéries, levures, parasites …) [Apostolopoulos et coll., 2001] – pourrait également participer à la reconnaissance de Borrelia, dans la mesure où le rôle de l’interaction Borrelia/MR dans l’adhésion de la bactérie aux macrophages a été démontré in vitro [Cinco et coll., 2001]. Activation des réponses immunitaires spécifiques Les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) jouent un rôle central dans la réponse immunitaire contre Borrelia, à l’interface entre les réponses innées et adaptatives. Dans la peau, les CPA (cellules dendritiques dermiques et cellules de Langerhans) représentent une des premières lignes de défense contre l’infection à Borrelia : elles sont capables de phagocyter la bactérie (dérivés notamment des lipoprotéines de surface) et d’apprêter ses antigènes [Filgueira et coll., 1996; Suhonen et coll., 2003] pour les présenter aux lymphocytes T CD8+ [Beermann et coll., 2000]. In vivo, la participation des lymphocytes T dans la réponse immunitaire dirigée contre Borrelia a été démontrée dans plusieurs modèles expérimentaux 128 Dans cette étude, le volet in vivo du protocole expérimental reposait sur l’injection intracérébrale de Borrelia chez des souris NOD2-/- ou chez des souris témoins sauvages. 98 Introduction murins129 [Pachner et coll., 1991; Keane-Myers et coll., 1995]. Chez l’homme également, la réactivité spécifique des populations lymphocytaires T à divers antigènes de Borrelia a été mise en évidence, en particulier chez des patients atteints de manifestations tardives chroniques de la maladie [Dattwyler et coll., 1988; Yoshinari et coll., 1991; Kalish et coll., 2003]. Outre les lymphocytes T CD8+, Borrelia est également capable d’activer les lymphocytes T CD4+ [Knigge et coll., 1996]. Concernant la polarisation des lymphocytes T CD4+ (balance Th1/Th2) induite par l’infection à Borrelia, la question de son impact sur l’évolution de la maladie reste controversée. Certains travaux indiquent que la synthèse d’IL-12130 et la persistance d’une production cytokinique de type Th1 favoriseraient la progression de la maladie chez l’homme [Gross et coll., 1998; Widhe et coll., 2004] et les souris sensibles à l’infection par Borrelia [Matyniak et coll., 1995; Anguita et coll., 1996], alors qu’une réponse de type Th2 serait corrélée avec une évolution favorable de la maladie [Matyniak et coll., 1995; Gross et coll., 1998; Widhe et coll., 2004]. Cependant, d’autres études indiquent au contraire qu’une forte réponse Th1 pourrait avoir des effets bénéfiques et favoriser la résolution de l’infection à la fois chez l’animal (réduction de la cardite induite par Borrelia dans un modèle murin) [Bockenstedt et coll., 2001] et chez l’homme [Sjowall et coll., 2005], en particulier à la phase initiale cutanée de l’infection [Sjowall et coll., 2011]. Par ailleurs, la mise en évidence d’une synthèse locale d’IL-17 dans le liquide céphalorachidien [Henningsson et coll., 2011]131 ainsi que dans les surnageants de culture de 129 Dans l’étude de Kaene-Myers et coll., 1995, la déplétion des LT CD4+ induisait une aggravation des manifestations articulaires, alors que la déplétion en LT CD8+ induisait au contraire une amélioration de la symptomatologie articulaire, suggérant un rôle protecteur des LT CD4+ et un effet facilitateur des LT CD8 dans l’infection à Borrelia. 130 131 L’IL-12 représente un stimulus puissant qui oriente les cellules T vers une différenciation de type Th1. Dans cette étude, une réponse locale de type Th1 prédominait, mais la synthèse concomitante d’IL-17 a été détectée dans le liquide céphalo-rachidien de 49 % des patients (65 sur 133) atteints de neuroborréliose. 99 Introduction lymphocytes T synoviaux [Codolo et coll., 2008]132 de patients respectivement atteints de neuroborréliose et d’arthrite de Lyme indique un rôle possible des lymphocytes de type Th17 dans les manifestations disséminées de la borréliose de Lyme. Borrelia induit l’activation des cellules NKT, qui représentent une sous-population très particulière de lymphocytes T133 : les cellules NKT reconnaissent en effet de façon spécifique un antigène glycolipidique134 de Borrelia, que les CPA leur présentent par l’intermédiaire de CD1d [Godfrey et coll., 2006; Kinjo et coll., 2006]. L’importance des cellules NKT dans la défense de l’hôte contre l’infection à Borrelia a été évaluée in vivo sur modèle murin. Dans le tissu hépatique, les cellules NKT participent, en collaboration avec les cellules de Kupffer (capables de phagocyter Borrelia [Sambri et coll., 1996]), à la clairance vasculaire des spirochètes : les cellules NKT limitent ainsi la dissémination systémique de Borrelia et son passage dans ses organes cibles [Lee et coll., 2010]. Les cellules NKT contribuent également à limiter la sévérité des manifestations articulaires [Tupin et coll., 2008] et cardiaques [Olson et coll., 2009] de la maladie. Borrelia induit aussi l’activation d’une autre sous-population spécifique de lymphocytes, les lymphocytes T γδ. L’équipe de Budd et coll. a montré que la stimulation de lymphocytes T γδ synoviaux par Borrelia induit leur prolifération à la fois in vitro [Vincent et coll., 1996] et in vivo, via un mécanisme partiellement dépendant de TLR2 [Collins et coll., 2008; Shi et coll., 2011]. Les lymphocytes T γδ ainsi stimulés induisent également la maturation des cellules dendritiques in vitro [Collins et coll., 2005], et participent in vivo à l’induction d’une réponse immunitaire adaptative protectrice contre 132 Dans cette étude, les lymphocytes T utilisés dans les tests in vitro ont été collectés chez 5 patients atteints d’arthrite de Lyme. 133 Les cellules NKT se distinguent des cellules T classiques par le fait que le TCR (T cell receptor) ne reconnaît pas des antigènes peptidiques apprêtés par le CMH, mais des antigènes lipidiques ou glycolipidiques présentés par la molécule CD1d (molécule présentatrice d’antigène). 134 La structure glycolipidique reconnue est un diglycéride (diacylglycérol). 100 Introduction l’infection à Borrelia [Shi et coll., 2011]135. Les cellules NKT et les lymphocytes T γδ sont donc deux catégories spécifiques de lymphocytes T, capables de stimuler, en réponse à l’infection par Borrelia, les deux types de réponse immunitaire – innée et adaptative –, à l’embranchement desquelles elles se situent. Enfin, la stimulation des lymphocytes B et la production subséquente d’anticorps spécifiques sont des données largement reprises dans la littérature (expérimentale, diagnostique et clinique) au sujet de la borréliose de Lyme. Mais si la réponse anticorps est capable d’induire la rémission des animaux infectés dans les modèles expérimentaux murins (sans toutefois parvenir à une élimination complète de la bactérie) [Barthold et coll., 2006], il n’en demeure pas moins que les manifestations cliniques chez l’homme (et en particulier celles de la phase tardive chronique de la maladie) surviennent en dépit d’une forte réponse humorale dirigée contre la bactérie [Kraiczy et coll., 2002] (voir chapitre « Mécanismes d’échappement à la réponse immunitaire humorale », page 103). 135 Dans cette étude, des souris déficientes en LT γδ présentaient une expansion lymphocytaire (B, T CD4+ et T CD8+) réduite, corroborée par une production faible d’anticorps anti-Borrelia et de cytokines pro-inflammatoires ; parallèlement, la charge bactérienne tissulaire et l’inflammation cardiaque observée étaient plus élevées que chez les souris témoin. 101 3 Introduction MÉCANISMES D’ÉCHAPPEMENT DE BORRELIA À LA RÉPONSE IMMUNITAIRE Mécanismes d’échappement à l’action du complément La voie alternative du complément est une des grandes composantes de la réponse immunitaire innée à laquelle Borrelia, et de façon plus large les micro-organismes infectieux, doivent faire face dans l’environnement représenté par l’hôte vertébré, et ce dès les premières heures après leur inoculation. Afin de se protéger de la lyse cellulaire médiée par la voie alternative du complément, Borrelia détourne à son profit le propre mécanisme de protection des cellules du soi contre le complément. Borrelia exprime en effet à sa surface plusieurs protéines qui peuvent lier le facteur H (fH), le facteur 1 de type H (fHL-1, factor H-like 1), ou encore d’autres protéines apparentées au facteur H (CFHRs, complement factor H-related proteins) : ces différentes protéines sont des inhibiteurs spécifiques de la convertase de la voie alternative du complément [Brissette et coll., 2008]. Les protéines de surface de Borrelia qui possèdent la plus grande affinité pour fH sont les protéines CRASP-1 et CRASP-2 [Kraiczy et coll., 2001], ainsi que trois membres de la famille des protéines Erp – ErpP (CRASP-3), ErpC (CRASP-4) et ErpA (CRASP-5) [Brissette et coll., 2008] ; CRASP-1 et CRASP-2 possèdent aussi une affinité pour fHL-1, alors que les protéines Erp en sont dépourvues [Kraiczy et coll., 2001; Brissette et coll., 2008] ; ErpP, ErpC et ErpA peuvent également lier plusieurs autres protéines apparentées au facteur H (CFHR-1, CFHR-2 et CFHR-5) [Haupt et coll., 2007; Siegel et coll., 2010]. D’autres protéines membranaires de Borrelia sont capables de lier le facteur H, comme OspE [Hellwage et coll., 2001] ou ErpX [Stevenson et coll., 2002], mais leur affinité pour cette protéine est plus faible [Brissette et coll., 2008]. L’adhésion de Borrelia à des protéines de l’hôte, spécialisées dans l’inhibition de la voie alternative du complément, constitue ainsi le mécanisme d’échappement principal de Borrelia à la lyse 102 Introduction médiée par le complément. De plus, fH étant lié aux cellules eucaryotes par différents récepteurs (comme les sélectines leucocytaires [Malhotra et coll., 1999] ou encore l’intégrine αIIbβ3 des plaquettes [Vaziri-Sani et coll., 2005]), la liaison fH/Borrelia pourrait également favoriser l’adhésion de la bactérie aux cellules et tissus de l’hôte : un mécanisme similaire d’adhésion cellulaire a été décrit chez Streptococcus pneumoniae [Hammerschmidt et coll., 2007]. L’acquisition de protéines régulatrices de l’hôte, pour se prémunir de l’activité du complément, est un mécanisme utilisé par de nombreux pathogènes (y compris les bactéries du genre Leptospira – proches du genre Borrelia –, dont les protéines LenA136 et LenB lient fH [Fraga et coll., 2011]). Par ailleurs, Borrelia exprime également à sa surface une protéine apparentée à CD59 (ou protectine) [Pausa et coll., 2003]. CD59 est une protéine membranaire, exprimée par la plupart des cellules eucaryotes, qui participe à la protection des cellules du soi contre le complément : elle vient se loger dans le complexe membranaire d’attaque en cours d’assemblage et bloque sa formation [Male et coll., 2007]. Le mimétisme moléculaire avec un facteur de régulation clé de la voie d’attaque membranaire du complément représente ainsi un autre mécanisme d’échappement de Borrelia à la lyse médiée par le complément. Enfin, Borrelia bénéficie indirectement et localement (au niveau du site de la piqûre de tique) des effets immunomodulateurs de certaines protéines de la salive de tique (voir chapitre « Contribution de la salive de tique aux mécanismes d’échappement de Borrelia », page 108), comme les protéines Isac137 d’I. scapularis [Valenzuela et coll., 2000], leurs homologues Irac138 chez I. ricinus [Schroeder et coll., 2007], et la protéine Salp20 [Tyson et coll., 2007], inhibant spécifiquement l’activité du complément (voir chapitre « Activité anti-inflammatoire de la salive et modulation de la réponse immunitaire innée », page 66) [Valenzuela et coll., 136 137 138 Len : leptospiral endostatin-like protein. Isac : Ixodes scapularis salivary anticomplement protein. Irac : Ixodes ricinus salivary anticomplement protein. 103 Introduction 2000; Tyson et coll., 2007]. Borrelia bénéficie également de façon plus directe de l’effet de la protéine Salp15 qui inhibe le dépôt des constituants du complexe d’attaque membranaire à sa surface [Schuijt et coll., 2008]. Mécanismes d’échappement à la réponse immunitaire humorale Lorsque la bactérie est injectée dans la peau d’un hôte vertébré, OspC est la lipoprotéine de surface la plus exprimée. OspC représente un facteur de virulence majeur pour Borrelia, mais il représente également un antigène puissant, à l’origine d’une réponse humorale spécifique [Fung et coll., 1994]. Celle-ci vient exercer une forte pression immunitaire sur la bactérie : OspC induit notamment la synthèse d’anticorps neutralisants [Rousselle et coll., 1998] dont l’action lytique est médiée par le complément et par l’opsonisation de la bactérie [Steere et coll., 2004]. Les spirochètes inoculés dans la peau sont (au moins localement et temporairement) protégés des effets bactéricides de ces anticorps, car la protéine OspC est initialement « masquée » par la protéine Salp15. L’association OspC/Salp15 a lieu dans les glandes salivaires de la tique avant l’injection des Borrelia dans la peau [Ramamoorthi et coll., 2005] (voir chapitre « Contribution de la salive de tique aux mécanismes d’échappement de Borrelia », page 108). Dans un second temps, la synthèse de cet antigène fortement immunogène est inhibée : cette inhibition, secondaire à la mise en place de la réponse anticorps chez l’hôte vertébré, représente un mécanisme important d’échappement de Borrelia à la réponse immunitaire humorale [Liang et coll., 2002a; Xu et coll., 2006]. Sur un modèle murin d’immunodépression (souris SCID), Borrelia exprime OspC tout au long de l’infection [Liang et coll., 2002a; Liang et coll., 2002b], alors que l’expression d’OspC est inhibée chez la souris immunocompétente. De plus, l’expression constitutive « forcée » de la protéine OspC empêche la bactérie d’établir une infection chronique chez des souris immunocompétentes [Xu et coll., 2006]. 104 Introduction Les modifications antigéniques de surface, induites par la pression immunitaire exercée sur la bactérie, sont considérables [Liang et coll., 2002b]. À l’inhibition de la synthèse d’OspC, s’ajoute en particulier la surexpression d’une autre lipoprotéine de surface – la protéine VlsE [Liang et coll., 2004b]. Outre la modification de son niveau d’expression, la protéine VlsE présente également de façon très précoce des variations antigéniques majeures. Le gène vls qui code la protéine VlsE est situé sur un plasmide linéaire (le plasmide lp28) ; vls est constitué d’un site d’expression (vlsE) et de 15 cassettes silencieuses (non transcrites) situées en amont de celui-ci [Zhang et coll., 1997]. Des phénomènes aléatoires de recombinaison génétique entre le site d’expression et les différentes cassettes surviennent dès les premiers jours qui suivent l’infection de l’hôte vertébré et conduisent à l’expression d’un grand nombre de variants VlsE [Zhang et coll., 1997]. Cette mosaïque antigénique permet à la bactérie d’échapper à la destruction par les anticorps anti-VlsE. Il s’agit d’un mécanisme majeur d’échappement à la réponse immunitaire humorale de l’hôte, diamétralement opposé à celui observé pour OspC. La perte du plasmide lp28 (qui porte le gène vls et ses cassettes de recombinaison) n’abolit pas la capacité de Borrelia à infecter un hôte vertébré, mais elle empêche la bactérie de persister chez des souris immunocompétentes, alors qu’elle n’a aucune conséquence sur sa persistance chez des souris immunodéprimées [Labandeira-Rey et coll., 2003; Lawrenz et coll., 2004]. Ces études indiquent que la protéine VlsE n’intervient pas dans la dissémination du pathogène vers ses organes cibles, mais que ses variations antigéniques constituent un élément essentiel pour la persistance de la bactérie dans les tissus au sein desquels la bactérie aura pu disséminer. Ce mécanisme d’échappement à la réponse immunitaire humorale par variation antigénique d’une protéine de surface fortement exprimée et immunogène est retrouvé de façon analogue chez d’autres bactéries : 105 Introduction c’est le cas notamment pour la protéine TprK139 de Treponema pallidum ou encore de la protéine majeure de surface Msp2140 d’Anaplasma marginale (bactérie pathogène transmise également par les tiques) [Palmer et coll., 2009]. Mécanismes « physiques » d’échappement à la réponse immunitaire Parmi les tissus et organes que Borrelia peut coloniser lors de sa dissémination hématogène, le système nerveux central et l’œil sont deux exemples particuliers de sites dont la faible activité immunologique locale et la faible accessibilité aux réponses immunitaires systémiques en font des organes « privilégiés » sur le plan immunologique [Male et coll., 2007]. La « séquestration » de Borrelia dans de tels sites représente pour la bactérie un mécanisme purement « physique » d’échappement à la réponse immunitaire [Embers et coll., 2004]. De façon tout à fait similaire, la matrice extracellulaire et les cellules de la peau (mais aussi des autres organes) dans lesquelles Borrelia est susceptible de pénétrer pourraient constituer un véritable refuge, à l’abri des défenses immunitaires de l’hôte. Les adhésines de Borrelia, dont le rôle dans les interactions entre la bactérie et la matrice extracellulaire a été discuté plus haut, pourraient participer à ce type de mécanismes d’échappement, avec par exemple : — la liaison à la décorine (résultant en un recouvrement de Borrelia par des antigènes du soi) et la capacité de la décorine à inhiber l’action du complément [Krumdieck et coll., 1992] et du TGF-β [Yamaguchi et coll., 1990], offrant une protection locale à Borrelia [Liang et coll., 2004a] ; — la sécrétion de Bgp dans les espaces extracellulaires pouvant constituer un véritable « leurre antigénique » [Cluss et coll., 2004]. 139 Tpr : Treponema pallidum repeat. La protéine TprK est une protéine de la membrane externe de T. pallidum, elle induit une réponse humorale et cellulaire et représente une cible des anticorps opsonisants. 140 Msp : major surface protein. La protéine Msp2 est une protéine membranaire de Anaplasma marginale. 106 Introduction Borrelia pourrait ainsi trouver dans la matrice extracellulaire et ses interactions avec les molécules qui la compose, un microenvironnement protégé de la réponse immunitaire de l’hôte, propice à la persistance de la bactérie dans les tissus cibles infectés et favorisant le développement des manifestations tardives chroniques de la borréliose de Lyme [Liang et coll., 2004a; Cabello et coll., 2007]. La phagocytose de Borrelia par les cellules de la lignée mono/macrophagique [Montgomery et coll., 1993, 1994; Sambri et coll., 1996], ou par d’autres cellules immunitaires spécialisées comme les polynucléaires neutrophiles [Szczepanski et coll., 1988; Suhonen et coll., 1998], représente un axe important des défenses immunitaires mises en place pour lutter contre l’infection. La conséquence de cette phagocytose est bien entendu la destruction de la bactérie et la réduction de l’inoculum bactérien ; mais la phagocytose de Borrelia, par la production de cytokines pro-inflammatoires qu’elle induit, contribue également de façon plus globale à l’activation de la réponse immunitaire générée contre la bactérie [Moore et coll., 2007; Cruz et coll., 2008]. Cependant, même dans ces cellules phagocytaires professionnelles, la survie intracellulaire d’une faible proportion des Borrelia phagocytées a été observée [Montgomery et coll., 1993]141. De plus, l’internalisation et la survie intracellulaire de Borrelia dans plusieurs types cellulaires non phagocytaires d’origine humaine ont été démontrées in vitro : ces données concernent les cellules endothéliales [Ma et coll., 1991; Wu et coll., 2011], les lymphocytes T et B [Dorward et coll., 1997], les cellules neuronales et gliales [Livengood et coll., 2006], et les fibroblastes cutanés [Klempner et coll., 1993; Wu et coll., 2011] ainsi que les synoviocytes [Girschick et coll., 1996]142. Dans ces deux derniers types cellulaires, une survie intracellulaire d’une durée respective de quatre [Wu et coll., 2011] et huit semaines [Girschick et coll., 1996] a été observée. Par ailleurs, une 141 Mais dans cette étude, la durée de cette survie n’a été évaluée que jusqu’à 24 heures après l’infection cellulaire. 142 Les synoviocytes sont des cellules fibroblastiques spécialisées des membranes synoviales. 107 Introduction localisation intracellulaire de Borrelia dans des synoviocytes isolés d’un patient atteint d’une arthrite de Lyme a également été démontrée in vivo [Chary-Valckenaere et coll., 1998]. De façon similaire à la protection relative offerte par les cellules endothéliales [Brouqui et coll., 1996] et les fibroblastes cutanés [Georgilis et coll., 1992] [Wu et coll., 2011] contre l’effet borrélicide d’antibiotiques à faible pénétration intracellulaire, ces cellules (par la localisation et la possibilité d’une survie intracellulaire prolongée qu’elles procurent à Borrelia) pourraient également constituer pour la bactérie un sanctuaire à l’abri des défenses immunitaires de l’hôte. La possibilité de transformation kystique des Borrelia (et de réversion des formes kystiques en formes mobiles) constitue potentiellement encore un autre mécanisme d’échappement à la réponse immunitaire de l’hôte. La crédibilité de cette possibilité repose essentiellement sur des observations in vitro ou chez l’animal [Brorson et coll., 1997, 1998; Alban et coll., 2000; Gruntar et coll., 2001; Miklossy et coll., 2008]. Enfin, si les différents mécanismes « physiques » potentiels d’échappement de Borrelia à la réponse immunitaire (et à l’action des traitements antibiotiques) évoqués ci-dessus pourraient représenter une hypothèse alternative séduisante pour expliquer la survenue de certaines manifestations tardives chroniques de la maladie, leur persistance, voire les échecs cliniques de traitements antibiotiques chez certains patients143, cette hypothèse contribue malheureusement aussi à alimenter l’argumentaire de certains groupes de patients (et de praticiens) défendant de façon inconditionnelle l’existence d’un « syndrome post-Lyme » et les liens entre la symptomatologie fonctionnelle qui y est rattachée et une infection persistante « occulte » potentielle à Borrelia (pour une revue critique du syndrome post-Lyme et de l’attitude clinique raisonnable à adopter, voire respectivement [Feder et coll., 2007] et [Puechal et coll., 2009]). Notons par ailleurs qu’aucune étude scientifique crédible n’a jusqu’à 143 Les « vrais » échecs cliniques d’une antibiothérapie bien conduite dans la borréliose de Lyme sont rares. 108 Introduction présent pu démontrer formellement que l’existence des formes kystiques et/ou intracellulaires de Borrelia observées in vitro puisse avoir une conséquence clinique réelle sur l’évolution naturelle de la maladie chez l’homme ou son évolution après traitement antibiotique. Contribution de la salive de tique aux mécanismes d’échappement de Borrelia La salive de tique et ses composants exercent, à des degrés divers, des effets immunomodulateurs portant à la fois sur la réponse immunitaire innée et adaptative de l’hôte : ces effets ont une importance capitale pour les pathogènes transmis par les tiques, car ils favorisent l’établissement de l’infection chez l’hôte vertébré [Wikel, 1999]. Si la modulation des réponses immunitaires induite par la salive de tique, rapportée dans un grand nombre d’études (voir chapitre « Activité anti-inflammatoire de la salive et modulation de la réponse immunitaire innée », page 66), semble intuitivement profitable aux Borrelia transmises, l’impact réel de la salive de tique sur la transmission, l’initiation de l’infection par Borrelia, ou encore sa dissémination, n’a été analysé que par un nombre plus restreint d’études. Les effets de la salive de tique sur l’immunité de l’hôte semblent le plus souvent se cumuler avec les mécanismes d’échappement développés par Borrelia pour se prémunir de celle-ci. Plusieurs études réalisées sur modèle murin ont démontré que la salive de tique accentue la virulence de Borrelia : elle augmente la bactériémie et induit une apparition précoce de B. afzelii dans le tissu vésical [Pechova et coll., 2002] ; elle favorise également la multiplication cutanée locale (au site d’injection) et la dissémination par voie hématogène de B. burgdorferi ss [Zeidner et coll., 2002; Machackova et coll., 2006] et de B. lusitaniae [Zeidner et coll., 2002] ; elle est enfin capable de restaurer la virulence d’une souche de B. burgdorferi ss faiblement pathogène [Adusumilli et coll., 2010]. Les résultats de notre propre équipe montrent que la présence de la salive de tique (inoculée dans la peau de souris de façon préalable à l’injection des spirochètes) inhibe fortement la réponse inflammatoire locale induite par Borrelia [Kern et coll., 2011]. Si les résultats de ces quelques études 109 Introduction indiquent de façon concordante que la salive de tique augmente l’infectivité de Borrelia, il est cependant important de noter que cette capacité de la salive de tique est dépendante de la nature du couple Borrelia/tique : certaines espèces de tique ont un effet bénéfique plus marqué pour certaines espèces de Borrelia [Zeidner et coll., 2002] (ces données témoignent par ailleurs des capacités importantes d’adaptation du pathogène à son vecteur). Il est également très important de noter que les modifications de la réponse immunitaire (mise en place de la réponse immunitaire adaptative « anti-tique ») induite par des piqûres de tiques successives peut conduire à une résistance acquise aux piqûres de tique et aux pathogènes qu’elles transmettent. L’équipe de Piesman et coll. a montré que des souris préalablement infestées par des larves naïves d’I. scapularis présentent une résistance acquise à la transmission de Borrelia par une nouvelle piqûre de tique [Wikel et coll., 1997], Nazario et coll. ont obtenu des résultats similaires chez le cobaye [Nazario et coll., 1998], et une étude clinique rétrospective a également montré que des personnes préalablement exposées à des piqûres de tique répétées et présentant une réponse inflammatoire locale marquée aux piqûres de tique ont un risque réduit de contracter la borréliose de Lyme [Burke et coll., 2005]. Les effets de plusieurs protéines sur l’activité du complément (comme les protéines Isac, Irac, IxAC ou encore Salp20) sont maintenant bien connus, et les données concernant leur impact sur l’infection par Borrelia sont disponibles pour quelques-unes d’entre elles. Par exemple, l’inhibition de la synthèse de la protéine Isac (par ARN interférence) entraine une diminution de la charge bactérienne dans la salive de tique, mais cette diminution est insuffisante pour bloquer la transmission de Borrelia, ce qui semble indiquer une faible contribution de la protéine Isac dans l’établissement de l’infection cutanée initiale [Soares et coll., 2005]. La protéine Salp20 semble protéger par ailleurs de façon efficace B. garinii des effets bactéricides du complément in vitro [Tyson et coll., 2007]. 110 Introduction De plus, la salive de tique module les fonctions de plusieurs composantes cellulaires de l’immunité. Il est par exemple établi que la salive d’I. scapularis inhibe la capacité des polynucléaires neutrophiles à adhérer in vitro aux Borrelia [Montgomery et coll., 2004] et à phagocyter la bactérie [Ribeiro et coll., 1990]. Il a été également montré que l’immunisation de souris par les protéines ISL-929/1373 réduit la charge bactérienne observée dans la peau et les articulations144, ce qui indique un rôle facilitateur de ces deux protéines (capables d’inhiber la fonction des polynucléaires neutrophiles) dans l’infection initiale et la dissémination de Borrelia [Guo et coll., 2009]. En outre, la protéine Bip, dont l’activité immunosuppressive sur les lymphocytes B a été mise en évidence, inhibe très fortement la prolifération lymphocytaire B induite in vitro par les protéines OspA et OspC : ces données indiquent un rôle potentiel de la protéine Bip dans la protection initiale de Borrelia contre la réponse immunitaire de l’hôte au niveau du site de la piqûre de tique [Hannier et coll., 2004]. Enfin, des travaux récents (réalisés in vivo sur modèle murin) ont montré que la sialostatine L2 (dont la sécrétion salivaire est fortement induite par le repas sanguin et dont la contribution à la réussite du repas sanguin est essentielle) favorise la multiplication locale de Borrelia au site d’injection cutanée145, indiquant un rôle facilitateur de la sialostatine L2 dans l’initiation de l’infection [Kotsyfakis et coll., 2010]. Concernant maintenant le cas particulier de la protéine Salp15, celle-ci est tellement liée à la « stratégie » utilisée par Borrelia pour se prémunir du système immunitaire de l’hôte, qu’on pourrait considérer que ses effets sont plus synergiques qu’additifs avec les mécanismes d’échappement développés par la bactérie. La synthèse de Salp15 est induite par le gorgement, et cette synthèse est encore un peu plus induite chez la tique infectée par Borrelia que chez la tique non infectée [Ramamoorthi et coll., 2005]. Nous avons déjà évoqué 144 Dans cette étude, la réduction de la charge bactérienne chez les souris immunisées a été observée dans la peau 7, 14 et 21 jours après l’infection, et à 21 jours dans l’articulation. 145 Dans cette étude, la charge bactérienne a été observée dans la peau 4 jours après l’injection de Borrelia. 111 Introduction plus haut les travaux de Ramamoorthi et coll., qui ont montré l’existence d’une interaction forte et spécifique entre Salp15 et OspC : l’interaction étroite entre Borrelia et Salp15 dans les glandes salivaires d’I. scapularis permet de protéger directement la bactérie contre l’effet bactéricide des anticorps neutralisants de l’hôte et d’augmenter l’infectivité des Borrelia injectées dans la peau [Ramamoorthi et coll., 2005]. Des résultats similaires ont été obtenus avec un analogue de Salp15 chez la tique I. ricinus (Salp15 Iric-1) [Hovius et coll., 2007; Hovius et coll., 2008b]. L’interaction entre Borrelia et Salp15 permet aussi d’inhiber le dépôt des composés de la voie terminale du complément – C5b, C6, C7, C8 et C9 – (qui constituent le complexe d’attaque membranaire) à la surface de la bactérie, la protégeant ainsi de la lyse médiée par le complément [Schuijt et coll., 2008]. Borrelia profite enfin de façon indirecte des effets immunosuppresseurs pléiotropes de Salp15 induits localement au niveau du site de la piqûre de tique, et notamment de l’inhibition des lymphocytes CD4+ (interaction de Salp15 avec le co-récepteur CD4) [Anguita et coll., 2002; Garg et coll., 2006; Juncadella et coll., 2007], et des cellules dendritiques (interaction de Salp15 avec le récepteur DC-SIGN) [Hovius et coll., 2008a]. Enfin, si les effets immunomodulateurs locaux induits par la salive de tique facilitent bien la transmission de Borrelia, il en va de même pour d’autres pathogènes transmis par les tiques [Nuttall et coll., 2004], comme le virus TBE146 responsable de l’encéphalite à tique [Fialova et coll., 2010] ou Francisella tularensis responsable de la tularémie [Krocova et coll., 2003]. Les effets immunomodulateurs de la salive d’autres arthropodes (moustiques, mouches) favorisent également la transmission de pathogènes [Titus et coll., 2006], comme les arbovirus (virus de la dengue, virus West-Nile, virus du Chikungunya) [Schneider et coll., 2008; Thangamani et coll., 2010], ou les leishmanies [Andrade et coll., 2007]. 146 TBE virus : tick-borne encephalitis virus. 112 Présentation du projet PRÉSENTATION DU PROJET 1 CONTEXTE GÉNÉRAL La peau représente une interface majeure pour les pathogènes transmis par les tiques ainsi que par d’autres arthropodes [Frischknecht, 2007]. Elle est une cible privilégiée de l’infection par B. burgdorferi sl – agent de la borréliose de Lyme –, et ce à toutes les phases possibles de l’évolution de la maladie. Le pathogène est inoculé dans la peau avec la salive de tique, puis s’y multiplie avant de disséminer (ou non) par voie hématogène. La peau est donc à la fois le premier site de l’infection, le point de départ des manifestations disséminées, mais également le siège de manifestations tardives chroniques de la maladie. De plus, l'interface cutanée ne constitue pas qu’une cible de l’infection à Borrelia : les interactions que ses éléments structuraux, ses cellules résidentes et ses défenses immunitaires entretiennent avec la bactérie font potentiellement aussi du tissu cutané un acteur à part entière du développement de l’infection et de l’issue qu’elle prend chez un individu donné. Dans la triade – hôte, pathogène, vecteur – de la borréliose de Lyme, la salive de tique a probablement un rôle essentiel dans la transmission vectorielle car elle augmente la pathogénicité de Borrelia et possède un effet immunosuppresseur sur l’immunité adaptative et sur l’immunité innée de l’hôte. À ce titre, la borréliose de Lyme constitue un excellent modèle pour l’étude de l’immunité cutanée. 113 2 Présentation du projet PRÉSENTATION DU PROJET DE RECHERCHE Une des thématiques principales de notre équipe de recherche est l’étude de l’immunité innée cutanée – et plus généralement de l’interface cutanée – dans la transmission des Borrelia responsables de la maladie de Lyme. Dans cette thématique, une attention particulière est portée à l’impact de la salive de tique sur l’inflammation cutanée et le développement précoce de la maladie, puisque c’est bien par l’intermédiaire de celle-ci que Borrelia est inoculée de façon naturelle dans la peau de l’hôte (humain ou animal). Au laboratoire, deux approches parallèles ont été développées : l’une sur un modèle in vitro de cultures cellulaires humaines primaires, et l’autre sur un modèle in vivo murin. Le travail réalisé sur le modèle in vitro fait l’objet des résultats présentés dans ce manuscrit de thèse ; ils viennent compléter et approfondir les résultats précédemment obtenus sur ce modèle, ainsi que les résultats récents obtenus sur le modèle in vivo murin (voir les travaux de thèse correspondants [Marchal, 2009; Kern, 2011]). Le travail de thèse présenté ici porte plus précisément sur l’étude in vitro de la réponse qu’induit Borrelia sur les deux principales cellules résidentes de la peau, que sont respectivement les kératinocytes dans l’épiderme et les fibroblastes dans le derme. Dans une première étude, nous avons travaillé sur des cultures de kératinocytes humains primaires. Nous avons analysé la réponse inflammatoire induite par Borrelia, en portant plus particulièrement notre attention sur les peptides antimicrobiens sécrétés par les kératinocytes en réponse à l’infection par la bactérie. Nous avons cherché à déterminer quelle lipoprotéine de surface était impliquée dans la stimulation des kératinocytes, et à préciser l’impact de la salive de tique (et en particulier de la protéine « phare » de la salive de tique Salp15) dans ce système expérimental. Dans la seconde étude, nous avons travaillé sur des cultures de fibroblastes dermiques humains primaires. Nous avons analysé et comparé les réponses transcriptionnelles des 114 Présentation du projet fibroblastes induites par des souches bactériennes représentatives de différentes étapes du cycle infectieux de Borrelia. Nous avons aussi cherché à déterminer si les réponses transcriptionnelles observées étaient liées à la même protéine de surface que celle induisant la stimulation des kératinocytes, et si la salive de tique y produisait les mêmes effets. Les kératinocytes, puis les fibroblastes sont parmi les premières cellules que Borrelia rencontre chez l’homme ; de plus l’environnement cutané local au moment de la transmission est lui-même considérablement modifié par la présence initiale de la salive de tique à l’endroit du point de piqûre et par l’action mécanique des pièces piqueuses (hypostome et chélicères) qui dilacèrent localement la peau. Par conséquent, les résultats obtenus grâce à l’approche expérimentale utilisée dans notre modèle in vitro (en présence ou en absence de salive de tique ou de sa protéine Salp15) apportent des connaissances nouvelles sur le rôle des kératinocytes et des fibroblastes dans la physiopathologie de la borréliose de Lyme. 115 Résultats — Borrelia et kératinocytes ARTICLE 1 Antialarmin effect of tick saliva during the transmission of Lyme disease Claire Marchal, Frédéric Schramm, Aurélie Kern, Benjamin Luft, Xiaohua Yang, Tim Schuijt, Joppe Hovius, Benoît Jaulhac, Nathalie Boulanger INFECTION and IMMUNITY, Février 2011 Le rôle de l'immunité innée de la peau lors de la transmission de Borrelia avait déjà fait l’objet d’un premier travail de recherche dans notre laboratoire. Ce travail montrait d’une part que la stimulation in vitro de kératinocytes humains primaires par Borrelia induit la synthèse de médiateurs pro-inflammatoires (IL-8 et hBD-2), et d’autre part que cette synthèse est inhibée par la présence d’extraits salivaires de tique [Marchal et coll., 2009]. Dans le travail présenté ci-après, nous avons cherché à déterminer si deux des principales lipoprotéines de surface de Borrelia – OspA et OspC – sont impliquées dans la stimulation des kératinocytes, et si la protéine de salive de tique Salp15 est responsable des effets inhibiteurs qu’induit de façon globale la salive de tique sur la réponse pro-inflammatoire des kératinocytes. Les principales techniques que nous avons utilisées dans cette étude pour mesurer la réponse des kératinocytes sont la détermination semi-quantitative par PCR des transcrits générés, et la détermination quantitative par ELISA des protéines synthétisées. Dans cette étude, nous montrons que l’induction de la réponse pro-inflammatoire des kératinocytes par Borrelia est – comme nous le supposions – bien liée aux lipoprotéines de surface OspA mais aussi et surtout OspC (majoritaire au moment de la transmission). Par ailleurs, le panel des gènes pro-inflammatoires étudiés a été étendu et nous montrons que l’expression de plusieurs chimiokines (IL-8 et MCP-1) et peptides antimicrobiens (hBD-2, 116 Résultats — Borrelia et kératinocytes hBD-3, LL-37, psoriasine et RNase7), induite par Borrelia ou sa lipoprotéine de surface OspC, est inhibée par la protéine Salp15. Nous émettons l’hypothèse que l’inhibition qu’exerce la salive de tique sur l’expression des chimiokines et des peptides antimicrobiens (dont la fonction « alarmine » a été évoquée plus haut) générée par les kératinocytes en réponse à l’infection par Borrelia, constitue un véritable effet « antialarmine » de la salive de tique, propice à la multiplication cutanée initiale de Borrelia, puis à sa dissémination ultérieure par voie hématogène. 117 Résultats — Borrelia et kératinocytes 118 Résultats — Borrelia et kératinocytes 119 Résultats — Borrelia et kératinocytes 120 Résultats — Borrelia et kératinocytes 121 Résultats — Borrelia et kératinocytes 122 Résultats — Borrelia et kératinocytes 123 Résultats — Borrelia et kératinocytes 124 Résultats — Borrelia et kératinocytes 125 Résultats — Borrelia et kératinocytes 126 Résultats — Borrelia et kératinocytes 127 Résultats — Borrelia et kératinocytes 128 Résultats — Borrelia et kératinocytes 129 Résultats – Borrelia et fibroblastes ARTICLE 2 Microarray analyses of inflammation response of human dermal fibroblasts to different strains of B. burgdorferi ss Frédéric Schramm, Aurélie Kern, Cathy Barthel, Sophie Nadaud, Nicolas Meyer, Benoît Jaulhac, Nathalie Boulanger PloS ONE, Juin 2012 L’étude de l’interaction entre Borrelia et les fibroblastes de la peau avait déjà fait l’objet d’un premier travail de recherche dans notre laboratoire. Ce travail montrait que la stimulation in vitro de fibroblastes cutanés humains primaires par Borrelia induit la synthèse de médiateurs pro-inflammatoires (IL-8, LL-37 et hBD-2) [Marchal et coll., 2009]. De manière à étendre notre champ d’investigation, nous avons choisi dans le travail présenté ci-dessous d’effectuer un screening initial large des réponses transcriptionnelles qu’induit Borrelia dans les fibroblastes au moyen de puces à ADN. En comparant les profils transcriptionnels induits par différentes souches bactériennes d’une même espèce, mais représentatives d’étapes bien distinctes du cycle infectieux de Borrelia, nous avons cherché à mettre en évidence un potentiel « effet souche » qui pourrait influencer le déterminisme évolutif du processus infectieux, dont la variabilité individuelle dans la borréliose de Lyme est observée couramment en pratique clinique. Nous avons aussi cherché à déterminer si la réponse pro-inflammatoire générée par les fibroblastes après stimulation par Borrelia était liée à la même protéine de surface (OspC) que celle induisant la stimulation des kératinocytes. Nous avons enfin analysé l’effet de la salive de tique sur notre modèle. Dans cette étude, nous montrons que la stimulation des fibroblastes par Borrelia induit l’activation d’un large panel de gènes impliqués dans la réponse inflammatoire ainsi que dans 130 Résultats – Borrelia et fibroblastes la synthèse et le remodelage de la matrice extracellulaire. Les trois souches de B. burgdorferi ss que nous avons testées dans notre modèle – respectivement isolées d’une tique et de lésions cutanées d’érythème migrant et d’ACA – induisent au sein des fibroblastes cutanés humains une réponse transcriptionnelle très similaire : aucune voie d’activation spécifique à l’une de ces souches n’a pu être mis en évidence. Par ailleurs, nous montrons que l’induction de la réponse pro-inflammatoire des fibroblastes par Borrelia n’est pas liée à la lipoprotéine de surface OspC. Nous montrons également que la salive de tique exerce in vitro un effet toxique direct sur les cultures de fibroblastes, que cet effet est dose-dépendant et de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Nous émettons l’hypothèse que l’effet cytotoxique de la salive de tique sur les fibroblastes de la peau (cellules clés du processus de cicatrisation) participe au maintien de la blessure cutanée, favorisant ainsi la poursuite du repas sanguin et l’inoculation des Borrelia dans la peau. Néanmoins, la présence de la salive de tique et son effet dans la peau sont limités à la fois dans l’espace (au point de piqûre de tique) et dans le temps (durée du repas sanguin). Ainsi, la réponse transcriptionnelle pro-inflammatoire des fibroblastes que nous avons observée in vitro en présence de Borrelia (mais en l’absence de salive de tique) est probablement un bon reflet de la réponse in vivo des fibroblastes à l’infection par Borrelia dans la peau, sur le site même des lésions cutanées inflammatoires de la phase précoce (érythème migrant) ou tardive (ACA) de la maladie. Résultats – Borrelia et fibroblastes 131 Microarray Analyses of Inflammation Response of Human Dermal Fibroblasts to Different Strains of Borrelia burgdorferi Sensu Stricto Frédéric Schramm 1 , Aurélie Kern 1 , Cat hy Bart hel 1 , Sophie Nadaud 2 , Nicolas Meyer 3 , Benoı̂t Jaulhac1. , Nat halie Boulanger 1 *. 1 EA 4438, Physiopathologie et Médecine Translationnelle, Facultés de Médecine et de Pharmacie, Université de Strasbourg, Strasbourg, France, 2 INSERM UMR-S 956, UPMC Université Paris 06, Paris, France, 3 Laboratoire de Biostatistique et Informatique Médicale, Faculté de Médecine, Université de Strasbourg, Strasbourg, France Abst ract In Lymeborreliosis, theskin isthekey site of bacterial inoculation bytheinfected tick,and of cutaneousmanifestations, erythema migrans and acrodermatitis chronica atrophicans. We explored the role of fibroblasts, the resident cells of the dermis, in the development of the disease. Using microarray experiments, we compared the inflammation of fibroblasts induced by three strains of Borrelia burgdorferi sensu stricto isolated from different environments and stages of Lyme disease: N40 (tick), Pbre (erythema migrans) and 1408 (acrodermatitis chronica atrophicans). The three strainsexhibited asimilar profile of inflammation with strong induction of chemokines (CXCL1 and IL-8) and IL-6 cytokine mainly involved in the chemoattraction of immune cells. Molecules such asTNF-alpha and NF-kBfactors, metalloproteinases (MMP-1, -3 and -12) and superoxide dismutase (SOD2), also described in inflammatory and cellular events,were up-regulated. In addition, weshowed that tick salivary gland extractsinduce acytotoxic effect on fibroblastsand that OspC,essential in thetransmission of Borrelia to thevertebrate host,wasnot responsible for the secretion of inflammatory molecules by fibroblasts. Tick saliva components could facilitate the early transmission of the disease to the site of injury creating a feeding pit. Later in the development of the disease, Borrelia would intensively multiply in the skin and further disseminate to distant organs. Cit at ion: Schramm F, Kern A, Barthel C, Nadaud S, Meyer N, et al. (2012) Microarray Analyses of Inflammation Response of Human Dermal Fibroblasts to Different Strains of Borrelia burgdorferi Sensu Stricto. PLoS ONE 7(6): e40046. doi:10.1371/journal.pone.0040046 Edit or: Roman Ganta, Kansas State University, United States of America Received November 29, 2011; Accept ed May 31, 2012; Published June 29, 2012 Copyright : ß 2012 Schramm et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: Aurélie Kern was supported by grant 2009.60.053 from the Conseil Regional d’Alsace and Direction Générale de l’Armement. Part of the research project was supported by the Pasteur Institute, PTR 309 (Programme Transversal de Recherche, Paris, France). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Com p et ing Int erest s: The authors have declared that no competing interests exist. * E-mail: [email protected] . These authors contributed equally to this work. also communicate with other cell types such as dermal dendritic cells, mast cells, macrophages and K Cs. They also participate in tissue homeostasis, leukocyte recruitment and inflammation regulation [8]. Due to their broad and highly specialized roles in conditioning the cellular and cytokine/ chemokine environment, resident sentinel fibroblasts function as part of the immune system [9]. To date, most studies of the cutaneous phase of LB have focused on the interaction of Borrelia with dendritic cells [10,11], mast cells [12], and K Cs [13,14]. A few studies have investigated fibroblast responses to this disease. A recent study indicated that the interaction of B. burgdorferi ss with dermal fibroblasts induced the proinflammatory chemokine IL-8, along with the antimicrobial peptides defensin and cathelicidin [15]. Borrelia has also been shown to internalize and survive within fibroblasts [16]. Although K Cs are the first cells to be injured by the tick mouthparts, biting pieces penetrate deeply into the skin [17]. Spirochetes are inoculated into the dermis, interacting with additional immune cells (dermal dendritic cells, mast cells…) and the fibroblasts. We found it therefore particularly relevant to assess how Borrelia infection impacts dermal fibroblasts. Int roduction Lyme borreliosis (LB) caused by spirochetes of the B. burgdorferi sl group is the most common vector-borne disease in the Northern Hemisphere. These bacteria are transmitted by the tick Ixodes spp. [1]. LB is a multisystemic infection that starts generally with an erythema migrans (EM) lesion at the site of the tick bite. Untreated, the infection can progress and disseminate, with inflammatory complications commonly affecting distant skin sites, joints, heart, and nervous system [2]. LB differs in clinical features based upon its geographic distribution and in relation to its pathogenic potential and/ or tissue tropism [3]. The skin represents a key interface in LB since it is the target of the spirochetes at the early stage of the disease, the EM and at later stages of the disease, the borrelial lymphocytoma and a typical manifestation of late european LB, the acrodermatitis chronica atrophicans (ACA) [4,5]. The skin constitutes a complex physical barrier [6]. The external multilayered part, the epidermis, mainly composed of keratinocytes (K Cs) and Langerhans cells, is tightly connected to the dermis, in which fibroblasts are the main resident cells [7]. Dermal fibroblasts not only play an active role in synthesizing and remodeling the extracellular matrix (ECM), but PLoS ONE | www.plosone.org 1 June 2012 | Volume 7 | Issue 6 | e40046 132 Résultats – Borrelia et fibroblastes Interaction Borrelia - Skin Fibroblasts In this study we investigated the role of dermal fibroblasts in skin inflammation in response to Borrelia. Since the inflammation could be related to the specific environments from which the strains were isolated, we tested one strain isolated from a tick and two strains isolated from different stages of the disease, potentially providing a link between spirochetal-related factors and LB outcome. Toward this end, we used specific skin cDNA microarrays to compare the global transcriptional response elicited in human dermal fibroblasts by three different strains of B. burgdorferi ss, isolated from an infected tick (N40) and from patients affected by EM (Pbre) or ACA (1408). Then, we investigated more precisely whether one of the major lipoproteins of Borrelia, OspC, which is necessary for the transmission of Borrelia to the vertebrate host [18,19], could be responsible for the induction of inflammatory molecules secreted by fibroblasts. Finally, we tested the effect of tick salivary gland extracts (SGE) on Borrelia-induced fibroblast response. Global Fibroblast Transcriptional Responses to B. burgdorferi ss N40, Pbre and 1408 Two independent microarray experiments were performed for each of the three Borrelia strains (N40, Pbre, 1408). Statistical analysis was then performed using the 6 experiments together by comparing treated vs untreated samples. Out of 1,302 genes present on the DNA chip, 241 genes (18.5%) were differentially regulated with a fold change above 1.7 and a false discovery rate below 5% (Figure 2A). Of these 241 genes, 103 were up-regulated, 138 were down-regulated and 75 were found to be regulated by more than 1.7-fold by each of the three Borrelia strains (47 up- and 28 down-regulated). The majority were regulated after Borrelia stimulation between 1.7 and 5-fold compared to unstimulated cells for all the three strains tested (Figure 2B). This underlines that Borrelia has a major effect on fibroblast gene expression. The transcriptional responses induced by strain N40, Pbre and 1408 have been compared: at this point, we did not to identify relevant specific strain-related transcriptional pathway. In contrast, a notable observation was that the three B. burgdorferi ss strains isolated from various environments of the Borrelia life cycle elicited very similar transcriptional profiles in primary human dermal fibroblasts, with a core of 47 genes up-regulated in response to stimulation by all three strains. Result s Fibroblasts Stimulated by B. burgdorferi ss N40, Pbre and 1408 Strains Secrete Inflammatory Genes B. burgdorferi ss N40 has been shown to induce a proinflammatory response when coincubated with human primary fibroblasts. In this response, IL-8 was induced in a dose-dependent manner [15]. To check whether B. burgdorferi ssN40, Pbre and 1408 behave similarly when co-incubated in vitro with fibroblasts, we measured IL-8 synthesis. The chemokine was secreted in a dose- and timedependent manner, with peak secretion at 24 hours after cell stimulation (Figure 1). We then chose a 24 hours time-course for fibroblast stimulation and a multiplicity of infection (MOI) of 100:1 for all the experiments to get the best signal. Up-regulated Transcriptional Responses are Largely Representative of Proinflammatory Pathways, Extracellular Matrix Synthesis and Remodeling Signals The core of 47 up-regulated genes in response to stimulation by all three strains (Table 1), included proinflammatory genes and genes involved in ECM remodeling and synthesis. High levels of chemokines (CXCL1 and IL-8) and cytokines (IL-3, IL-6, IL-9, Figure 1. Measure of IL-8 secretion by fibroblasts co-incubated with different strains of B. burgdorferi ss. (A-C) IL-8 secretion of fibroblasts stimulated by different concentrations of Borrelia N40, Pbre, 1408 at MOI of 100:1 (100B), 10:1 (10B), and 1:1 (1B) at 24 hours. (D-F) Kinetic studies of IL-8 secretions in the three strains. NEG: unstimulated fibroblasts. (A-F) Each bar shows the mean 6 SDs of triplicate values and is representative of three independent experiments. ***P, 0.001; **P, 0.01; and *P, 0.05 compared between stimulated and unstimulated cells. doi:10.1371/journal.pone.0040046.g001 PLoS ONE | www.plosone.org 2 June 2012 | Volume 7 | Issue 6 | e40046 133 Résultats – Borrelia et fibroblastes Interaction Borrelia - Skin Fibroblasts matrix metalloproteinases (MMP-1, -3 and -12). Several other genes associated with cell–matrix interaction (ITGA1, the alpha subunit of the a1b1 integrin) or structural components of the ECM including microfibrils (MFAP3), collagen fibrils (COL8A1), and laminins (LAMA1) were also up-regulated by all three Borrelia strains. Cell activation cycle genes encoding growth factors (the K Cs growth factor FGF7) and cell apoptosis-related genes encoding TNF ligand superfamily members (TNFSF10 and the B-cell activating factor TNFSF13B) and two of their receptors (TNFRSF6, TNFRSF10B), were up-regulated as well. Several other genes related to metabolism such as SOD2 were upregulated by all three Borrelia strains. Among the three strains, the strain isolated from EM induced weaker inflammation than the two other strains. A large number of genes associated with intracellular metabolic functions, DNA damage repair and cell cycle control were down-regulated by one or more Borrelia strains (Table S1). Validation of Selected Genes Among those Found to be Differentially Regulated by Microarray Analysis The mRNA expression of selected genes (IL-8, IL-6, CX CL1, SOD2, MMP-12) was analysed in kinetic experiments, at 3, 6, 12 and 24 hours after Borrelia stimulation. A similar trend in transcriptional induction was observed by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (QRT-PCR) and microarray. We confirmed strong up-regulation of the genes encoding IL-8, IL-6, CX CL1, and SOD2 for all the three Borrelia strains (Figure 3). We were not able to confirm the upregulation of MMP-12 mRNA observed in the microarray by QRT-PCR for the strain 1408. The effects of Borrelia stimulation on these gene expressions were time-dependent, with maximal responses observed 24 hours after fibroblast stimulation. All QRT-PCR data normalized to the b-actin were further confimed by normalizing them to the expression of the RNA polymerase II, another housekeeping gene known to be stable under various stimulatory conditions [21]. Results obtained after b-actin and RNApol2 normalization were very similar to each other (data not shown). Effect of OspC and SGE on Fibroblast Inflammation Figure 2. Gene expression profiles obtained from dermal fibroblasts stimulat ed with different strains of B. burgdorferi ss. (A) Venn diagram of genes significantly up-regulated (q ) or downregulated (Q ) after fibroblast stimulation with Borrelia, and compared with unstimulated fibroblasts. (B) Number of genes differentially expressed during fibroblast stimulation with Borrelia. The bars reflect the number of up-regulated genes (+) and down-regulated genes (-) for each strain. The light dotted areas correspond to gene expression changes of 1.7–5.0-fold, the grey hatched areas correspond to changes of 5.0–20.0-fold and black areas to changes $ 20.0-fold. doi:10.1371/journal.pone.0040046.g002 OspC is a surface lipoprotein, essential for Borrelia transmission to the vertebrate host. In addition to its role on K Cs inflammation [14], we tested whether OspC could also be responsible for fibroblast inflammation induced by Borrelia. Using an OspCdeficient Borrelia mutant, comparable levels of IL-8 synthesis were noted 24 hours after stimulation with wild-type spirochetes, OspCdeficient B. burgdorferi, or OspC-deficient B. burgdorferi complemented with OspC (Figure 4A). These data indicate that OspC is not responsible for Borrelia-induced proinflammatory responses in skin fibroblasts; other surface-exposed proteins of Borrelia could induce that activity. To further test the contribution of Borrelia lipoproteins to fibroblast inflammatory response, lipoprotein signaling was blocked by anti-TLR2 antibody before Borrelia stimulation. The blocking effect of anti-TLR2 antibody, already tested in the interaction OspC–keratinocytes [14], only slightly (136 2%) and not significantly inhibited IL-8 secretion (Figure 4B), indicating that Borrelia-induced fibroblast stimulation is TLR2independent. Tick saliva affects different cells in the skin [22] but its effect on fibroblast inflammation was never investigated in detail. Co-incubation of fibroblasts with Borrelia and I. ricinus SGE (20 mg/ ml) showed a dramatic decrease of IL-8 synthesis (Figure 4C). Microscopic observation of the fibroblast cultures revealed a cytotoxic effect of SGE confirmed by cell staining with Trypan blue (data not shown). A significant morphologic change IL-12B, IL-13, IL-15) were induced, along with gene encoding pentraxin 3 (PTX3), a fluid-phase pattern-recognition molecule involved in the acute-phase response and innate immunity [20]. Up-regulated genes were also largely representative of intracellular signaling/ regulating pathways that sustain inflammatory responses such as NF-kB transcription factors (NF-kB1, NF-kB2, Rel, RelB, IkB-a), interferon-related genes (the IFN-responsive factor IRF1, transducers of the JAK / STAT signaling cascade STAT1, STAT2 and the interferon-inducible genes OAS2 and IFIH1), and other transcription factors that could play a role in the inflammatory process (the NF-kB-induced HIF1A and JUN, component of the AP-1 transcription factor). Among genes involved in ECM remodeling, all Borrelia strains induced up-regulation of three PLoS ONE | www.plosone.org 3 June 2012 | Volume 7 | Issue 6 | e40046 Résultats – Borrelia et fibroblastes 134 Interaction Borrelia - Skin Fibroblasts Table 1. Up-regulated genes in fibroblasts stimulated with B. burgdorferi in comparison to unstimulated fibroblasts. Gene num ber Annot ation N40 (t ick)1 Pbre (EM)1 1408 (ACA)1 Descrip t ion/Funct ion Inflam mat i on Chemokines NM_001511 CXCL1 176.12 101.03 200.92 GROa, chemoattractant for neutrophils NM_000584 IL-8 66.40 12.89 50.32 Chemoattractant for neutrophils NM_000588 IL-3 1.96 1.89 1.90 Cytokine, regulate granulocytes and monocytes-macrophages activation and proliferation NM_000600 IL-6 39.90 6.07 13.38 Cytokine of the acute phase response NM_000590 IL-9 1.73 2.00 1.89 Cytokine, regulates T-lymphocytes activation and proliferation NM_002187 IL-12B 3.41 1.83 2.13 Cytokine, regulates T-lymphocytes and NK cells activation and proliferation NM_002188 IL-13 2.47 2.68 2.44 Cytokine, regulates inflammatory and immune responses NM_000585 IL-15 4.31 5.50 5.13 Cytokines Cytokine, regulates T-lymphocytes and NK cells activation and proliferation Innate immunity effector NM_002852 PTX3 9.01 3.68 13.45 Pentraxin-3 : component of the humoral arm of innate immunity NF-kB pathway NM_003998 NFKB1 3.89 1.98 2.62 NM_002502 NFKB2 6.62 2.19 2.83 NF-kB p105 subunit NF-kB p100 subunit NM_002908 REL 4.51 2.34 3.42 C-Rel proto-oncogene protein, member of the NF-kB transcription factors NM_006509 RELB 3.43 1.78 2.49 Member of the NF-kB transcription factors NM_020529 IKBA 8.26 3.47 5.76 Inhibit the NF-kB transcription factor NM_016817 OAS2 9.43 6.53 15.54 Oligoadenylate synthetase-2 : IFN-induced, innate immune response to viral infection NM_022168 IFIH1 11.66 6.53 15.54 IFN-induced, alteration of RNA secondary structure NM_002198 IRF1 6.01 2.65 6.73 Interferon regulatory factor-1 : transcription factor NM_007315 STAT1 7.93 6.74 11.24 Signal transducer of activation-1, up-regulate genes in response to IFN type I, II or III NM_005419 STAT2 4.83 2.29 3.68 Signal transducer of activation-2 : up-regulate genes in response to IFN type I NM_003745 SOCS1 2.18 1.75 2.60 Suppressor of cytokine signaling-1 : negative feedback loop of the JAK/STAT pathway NM_014011 SOCS5 2.05 1.79 1.91 Suppressor of cytokine signaling-5 : negative feedback loop of the JAK/STAT pathway NM_002228 JUN 2.45 2.00 3.02 Transcription factor AP-1 NM_001530 HIF1A 4.96 2.11 2.58 Hypoxia-inducible factor 1-a : NF-kB induced, role in myeloid cell-mediated inflammation IFN-related pathway Other transcripti on factors Ext racellular mat rix Metalloproteinases NM_002421 MMP-1 19.86 4.65 6.68 Matrix metalloproteinase-1 : interstitial collagenase NM_002422 MMP-3 9.46 2.49 4.37 Matrix metalloproteinase-3 : stromelysin NM_002426 MMP-12 14.15 2.74 5.90 Matrix metalloproteinase-12 : macrophage metalloelastase Component s of extracellular matrix NM_001850 COL8A1 3.10 2.06 4.58 Collagen alpha-1(VIII) chain NM_005559 LAMA1 2.61 1.75 2.24 Laminin subunit a-1 NM_005927 MFAP3 2.29 1.91 1.72 Microfibril-associated glycoprotein-3, component of the elastin-associated microfibrils Cell–matrix interactions NM_181501 ITGA1 4.51 2.15 2.39 Integrin a1 Cellular cycle TNF pathways and apoptosis NM_000043 TNFRSF6 2.37 2.04 2.41 Fas receptor, death receptor involved in apoptosis NM_003810 TNFSF10 11.66 4.58 11.25 TRAIL, TNF-related apoptosis-inducing ligand PLoS ONE | www.plosone.org 4 June 2012 | Volume 7 | Issue 6 | e40046 Résultats – Borrelia et fibroblastes 135 Interaction Borrelia - Skin Fibroblasts Table 1. Cont. Gene num ber Annot ation N40 (t ick)1 Pbre (EM)1 1408 (ACA)1 NM_003842 TNFRSF10B 1.86 1.82 2.38 TRAIL receptor 2, death receptor involved in apoptosis NM_006573 TNFSF13B 19.81 8.79 25.16 BAFF, B-cell activating factor NM_003183 ADAM17 1.91 1.75 1.83 Cleaves the membrane-bound precursor of TNF-alpha to its mature soluble form NM_003879 CFLAR 4.95 3.44 3.30 Descrip t ion/Funct ion Caspase-8 and FADD-like apoptosis regulator Apoptosis inhibition NM_001165 BIRC3 4.51 4.30 6.03 Inhibitor of apoptosis protein-1 Growth factor NM_002009 FGF7 7.36 2.71 2.26 Fibroblast growth factor-7 : stimulates keratinocyte growth NM_000636 SOD2 33.07 11.84 28.67 Superoxide dismutase NM_006169 NNMT 6.85 3.39 5.15 Nicotinamide N-methyltransferase NM_002485 NBN 3.83 3.41 2.15 Nibrin, repair of double strand breaks NM_001539 DNAJA1 3.15 2.22 3.25 Heat-shock 40 kDa protein 4 NM_000165 GJA1 1.99 1.91 1.88 Connexin-43, component of gap junctions NM_000345 SNCA 2.46 2.47 2.07 Alpha-synuclein, involved in membrane composition and turnover NM_000104 CYP1B1 3.41 2.60 2.42 Belongs to the cytochrome P450 superfamily of enzymes NM_006317 BASP1 1.91 1.71 1.82 Membrane bound protein, unknown function - LOC387763 22.02 6.07 14.31 Unknown function Cellular m et abolisms and miscellaneous 1 For each strain, values shown correspond to the mean ratio of the duplicate measurement determined between normalized gene intensity values obtained after 24 hours of fibroblast stimulation with B. burgdorferi (MOI 100:1) compared with gene intensity values from unstimulated cells. doi:10.1371/journal.pone.0040046.t001 dendritic cells [9]. Considering the tight relationships between fibroblasts, other skin cells and Borrelia, it was of particular interest to study the interaction fibroblasts–Borrelia. We previously showed that the co-incubation fibroblasts–Borrelia induces antimicrobial peptides and IL-8 synthesis. Different Borrelia-host cell ratios were studied 100, 10 and 1 Borrelia for one cell. Because the MOI 100:1 gave the strongest inflammatory response, we selected this range to study the global inflammatory response [15]. By using microarray analysis, we extended the panel of inflammatory molecules studied using different isolates of B. burgdorferi ss strains. Genes shown to be strongly up-regulated by microarray with all three strains were mostly related to proinflammatory signals – IL-6, IL-8 and CX CL1– that were further validated by QRT-PCR analysis and also at the protein level for IL-8 by ELISA. These molecules allow immune cell recruitment and differentiation in damaged tissues [25]. Other studies reported Borrelia-induced cytokine and chemokine expression (incuding IL6, IL-8, CXCL1, CXCL9, CXCL10, CCL2, and CCL5) in primary human dermal fibroblasts [13,26]. Müllegger et al., by using QRT-PCR on skin biopsies, also found similar chemokine and cytokine induction in EM and ACA, with low but significant mRNA levels of CX CL1 and the dendritic cell chemoattractant CCL20, intermediate levels of the macrophage chemoattractant CCL2, and high levels of the T-cell-active chemokines CXCL9 and CXCL10 [27]. Skin manifestations of LB – EM and ACA – exhibit dermal infiltrate, composed predominantly of lymphocytes and histiocytes [28,29,30]. With regard to the potent proinflammatory response elicited by Borrelia in fibroblasts, dermal fibroblasts could therefore be considered as central mediators in immune cell recruitment to the skin site of Borrelia invasion. Their relevance in the immune response has been lately emphasized by their role on the maturation of dendritic cells [9]. MMPs are molecules important in tissue modeling. Induction of MMPsynthesisbyresident skin cellsfacilitatesBorreliamigration from of fibroblasts was already observed at 6 hours(Figure 4D, panels II and V) leading to a mortality rate . 90% 24 hours after stimulation (Figure 4D, panels III and VI). Using serial dilutions of SGE, the ability of fibroblasts to synthesize IL-8 was almost completely restored when SGE dilution reached a dilution of 1:20 (Figure 4C), and the cytotoxic effect was reversed at the same dilution (data not shown). The decrease of Borrelia-induced IL-8 synthesis in presence of SGE should obviously be considered as inability of IL-8 synthesis related to SGE-induced cell death (Figures 4C and 4D). As Salp15 is a tick protein affecting various immunological processes [23], we tested whether the observed cytotoxic effect was due to this protein. Salp15 alone had no toxic effect on fibroblast cultures and did not inhibit IL-8 synthesis when coincubated with Borrelia. Heat-denaturation of SGE largely restored the ability of fibroblasts to synthesize IL-8 (Figure 4C) and completely abolished SGE cytotoxic effect (data not shown), indicating that SGE cytotoxic activity is linked to a proteinaceous compound present in tick saliva. Discussion The skin is a major organ in the development of LB since it constitutes the inoculation site for Borrelia and tick saliva, and for the early and late manifestations, EM and ACA respectively [4,5]. During and after the long-lasting blood meal of the ixodid tick, spirochetes multiply locally and interact with skin cells – dendritic cells, mast cells, fibroblasts and K Cs – before migrating and reaching other tissues responsible for systemic clinical symptoms. Ticks first dilacerate the epidermis containing the K Cs, then the dermis where saliva affects immune cells and the resident cells of the dermis [17]. Therefore, the immune response of the skin is essential to control the development of the disease [24]. Fibroblasts play a key role in this cutaneous immunity by cooperating with other immune cells. Fibroblasts also affect the maturation of PLoS ONE | www.plosone.org 5 June 2012 | Volume 7 | Issue 6 | e40046 136 Résultats – Borrelia et fibroblastes Interaction Borrelia - Skin Fibroblasts Figure 3. QRT-PCR analysis of mRNA expression induced by Borrelia in kinetic experim ents with fibroblasts. The mRNA levels of IL-8, IL6, CXCL1, SOD2 and MMP-12 were normalized to the b-actin housekeeping gene level and expressed as relative changes in gene expression PLoS ONE | www.plosone.org 6 June 2012 | Volume 7 | Issue 6 | e40046 137 Résultats – Borrelia et fibroblastes Interaction Borrelia - Skin Fibroblasts compared with untreated cells (NEG). Each bar shows the mean 6 SDs of triplicate values and are representative of three independent experiments. **P, 0.01; and *P, 0.05 compared between stimulated and unstimulated cells. doi:10.1371/journal.pone.0040046.g003 Figure 4. Role of OspC, I. ricinus salivary gland extracts (SGE) and Salp15 in Borrelia-induced fibroblast inflammation. (A) IL-8 synthesis induced by wild-type strain 297 (wt), OspC-deficient (OspC 2 /2 ), and OspC-deficient strain 297 complemented with a plasmid carrying the ospC gene (OspC cp) in fibroblasts. (B) IL-8 synthesis in fibroblasts induced by B. burgdorferi ss N40 (Bb) in absence or in presence of human anti-TLR2 antibody (Ab aTLR2) or isotype control antibody (Ab isotype control). (C) IL-8 synthesis in fibroblasts coincubated with 20 mg/ml SGE alone, 30 mg/ml Salp15 alone, B. burgdorferi ss N40 (Bb) alone, with the combination of Borrelia and SGE at 20 mg/ml (Bb + SGE), 5 mg/ml (Bb + SGE 1:4), 1 mg/ml (Bb + SGE 1:20), and 0.2 mg/ml (Bb + SGE 1:100), with the combination of Borrelia and Salp15 (Bb + Salp15), or with the combination of Borrelia and 20 mg/ml SGE heat-denaturated at 56uC for 1 hour (Bb + SGE 56uC), or at 98uC for 3 minutes (Bb + SGE 98uC). For (A), (B) and (C) fibroblasts were incubated with Borrelia at MOI of 100:1 for 24 hours. The negative control was unstimulated cells (NEG). Each bar shows the mean 6 SDs of triplicate values (expressed as % stimulation of IL-8 synthesis induced by Borrelia alone) and is representative of three independent experiments. ***P, 0.001; and *P, 0.05 compared with the corresponding stimulation induced by Borrelia alone. (D) Images of fibroblast cell cultures stimulated with SGE, showing SGE-induced cytotoxic effect at 6 and 24 hours (h). Images were taken at 100x (I, II and III) or at 200x magnification (IV, V and VI). doi:10.1371/journal.pone.0040046.g004 PLoS ONE | www.plosone.org 7 June 2012 | Volume 7 | Issue 6 | e40046 138 Résultats – Borrelia et fibroblastes Interaction Borrelia - Skin Fibroblasts tionnal responses[50], it could be interesting to further explore this type of interaction. In addition to theantialarmin effect of SGE on K Cs[14], we also demonstrate a lytic effect of SGE on dermal fibroblastsand that this cytotoxiceffect wasofproteinaceousnatureand not related toSalp15. This tissue lysis induced by tick SGE could explain the feeding pit described in literatureduringthetick bite[51] and observed invivoby intravital microscopy (Bockenstedt –personal communication). In a recent study, Hajnická et al. demonstrated that SGE of hard ticks displayed an inhibitory effect on cell proliferation in amousecell line, reduced cell adherenceand induced morphologic changesin human cell lines[52]. Thelyticaction of IxodesSGEinvitroon human primary fibroblasts could be linked to this effect in the days immediately followingthetick bite. Ticksalivacounteractsskin wound repair byits inhibitory effects on hemostasis (coagulation, platelet aggregation, and vasoconstriction), inflammation and innate immunity, thus avoiding tick rejection and allowing maintenance of tick attachment to thehost during blood feeding [53]. The effect of tick saliva on the skin occurs rapidly and is strictly limited to the tick bite. We hypothesized that after the tick detaches, the saliva effect decreases and Borrelia can multiply intensively locally as shown in different mouse models, especially at day 7 after syringe inoculation [45,54,55]. This intense Borrelia multiplication in the skin likely corresponds to a high ratio pathogens–host cell, at a certain point during theearly transmission, not too far from theoneweused invitro in our assay. Oncetheclinical manifestations appear, a few weeksto few months after the tick bite, Borrelia interacts with fibroblasts at different time points, first in EM, then later in ACA, inducing an inflammatory response similar to those observed in the microarray assays. theskin toother organs. In our microarray analyses, MMP-1, -3and 12 were found to be up-regulated by Borrelia. MMP-1 and MMP-3 havepreviously beenreported inpatientswith Lymearthritis[31] and in in vitro models of Lyme arthritis using cartilage explants and chondrocytes[32,33]. MMP-12, involved in matrix elastin and other basement membrane component degradation [34], wasup-regulated by Borreliain skin fibroblasts. Interestingly, ACA representsa skin manifestation where elastic fibers are destroyed [29]. Moreover, Borrelia was previously found to induce MMP-12 in dendritic cells [35]. We observed a discrepancy between microarrays and QRTPCR results for MMP-12. This lack of correlation was already described for the two techniques in similar studies, analyzing the interaction immune cells–Borrelia[36,37]. Borreliaalsoinduced genesrelated tometabolism, includingSOD2, an enzyme specifically involved in oxidative burst protection. B. burgdorferi isknown toelicit oxidativeburst inimmunecells[38,39] and the role of Borrelia-induced reactive oxygen species in patients with EM hasbeen postulated [40]. SOD activity hasbeen shown to beone ofthemechanism bywhich fibroblastsprotect against oxygen reactive intermediates generated by cytokinesand bacterial cell components [41]. All three Borrelia strains tested led to a strong up-regulated expression of SOD2that could function asaprotectivemechanism by which fibroblasts counteract potential oxidative bursts elicited by Borrelia.Wealsoobserved up-regulation of factorsinvolved in theIFN pathway, confirming theroleof thisinflammatory responsetoBorrelia [36,37]. In our study, the three strains isolated from various environments induced a very similar inflammatory profile in fibroblasts. So, no specific strain-related pathway has been identified that could link transcriptionnal responses elicited by clinical strains 1408 (isolated from ACA), Pbre (isolated from EM) or strain N40 (isolated from a tick). Host-related factors are important, asACA is predominantly observed in elderly patients, particularly women, and affects primarily sun-exposed acral parts of the body [42]. Spirochetal factors are also likely to play a key role in dermatoborreliosis outcome, since B. afzelii is the most common genospecies associated with ACA whereas B. burgdorferi ss and other genospecies are rarely isolated from this late clinical feature of LB [43]. However, we compared the fibroblast response of three strains of B. afzelii in our in vitro culture system (one strain isolated from an EM lesion and two strains isolated from ACA lesions) to the B. burgdorferi ss strain 1408 (isolated from ACA). IL-8 release from fibroblasts co-incubated with these different strains of B. burgdorferi sensu lato did not differ significantly (data not shown). A switch from OspA to OspC occurs during the migration of Borreliafrom themidgut to thesalivary glandsof thetick [44]. OspC is important in thetransmission to thevertebrate host [18,19], and this lipoprotein isalso described asasensing moleculeallowing Borreliato migrate through the skin tissue. By inducing VEGF (Vascular endothelial growth factor), OspC may affect thevascular permeability facilitating bacterial dissemination [45]. We then tried to determine whether OspC might be responsible for part of the fibroblast inflammation. When wetested an OspC-deficient mutant [46], the inflammatory response was not modified. Moreover, the blockadeof lipoprotein signalingbyanti-TLR2 antibody onlyslightly inhibited fibroblast stimulation by Borrelia.Theseresultsindicatethat OspC is not a major surface protein involved in Borrelia-elicited proinflammatory responses of fibroblasts and that other surfaceexposed Borreliaproteins, liketheintegrin-binding protein P66, could elicit that role by direct interaction with fibroblasts or by interaction with theECM componentstheyproduce[47,48,49]. AsBorreliaisable to invade fibroblastsby interacting with integrins[16], and that P66 was shown to affect both endothelial and epithelial cells transcrip- PLoS ONE | www.plosone.org Mat erials and Met hods Spirochete Strains Three european strains of B. burgdorferi ss were selected: N40 isolated from a tick, and two strains (Pbre and 1408) isolated from skin biopsies of EM and ACA respectively. B. burgdorferi ss 297 and its OspC-deficient relative mutant have already been described [46]. All strains were used at passage 5 to 8, cultured in BSK -H medium (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) at 33uC and washed before the assays. Tick Salivary Glands and Salp15 SGE of I. ricinus was prepared as described previously [14]. Absence of endotoxin was checked by the Limulus assay before use, and an equivalent of salivary glands of one tick (around 20 mg/ ml) was used. For the assays with heat-denaturated SGE, extracts were incubated at 56uC for 1 hour, or at 98uC for 3 minutes before use. Purified Salp15 from I. ricinus was used at a concentration of 30 mg/ ml, as described previously [14]. Fibroblast Culture and Stimulation Primary human dermal fibroblasts (NHDF, Promocell, Heidelberg, Germany) were maintained in FGM2 medium. To stimulate the cells, fibroblasts were used at passage 3 to 5 and seeded at 7.56 104 per well in a 12-well plate. At confluence and one day before Borrelia activation, FGM2 medium was replaced by FGM medium without fetal calf serum. If not otherwise stated, fibroblasts were stimulated with B. burgdorferi spirochetes at MOI of 100:1 for 24 hours. For the assays with tick SGE or with Salp15, spirochetes were preincubated for 30 minutes with the tick compounds at room temperature, and the preparation was then transferred onto fibroblast cellsand further incubated for 24 hours. For the assays with TLR2-blocking antibody, the anti-human 8 June 2012 | Volume 7 | Issue 6 | e40046 Résultats – Borrelia et fibroblastes 139 Interaction Borrelia - Skin Fibroblasts TLR2 antibody and itsisotype control antibody (eBioscience, Ltd., United K ingdom) were used at 5 mg/ ml and incubated for 30 min at room temperature on fibroblasts. Borrelia (at MOI of 100:1) was then added, and the samples were further incubated for 24 hours. Before collecting stimulated or unstimulated fibroblasts in Trizol (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France), the viability of cells was checked by Trypan blue staining. deposited in the GEO repository (http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/ ) with the record number GSE31740. Microarray experiments were performed according to the MIAME guidelines [59]. Statistics For ELISA and QRT-PCR, each experiment of cell stimulation with bacteria was carried out at least three times in independent experiments. Results are presented as means 6 standard deviations (SDs) and were analyzed by Student’s t test. Differences in values are considered significant at p, 0.05. For ELISAs, the data are the means 6 SDs of triplicate values and are representative of three independent experiments. For QRTPCR, the values are normalized to the negative control (medium alone) and shown as the fold number of the control’s value. The means 6 SDs of triplicate values were compared between stimulated and unstimulated cells and are representative of three independent experiments. ELISA IL-8 secretion was measured in supernatants of unstimulated and Borrelia-stimulated cells by ELISA. The protocol was based on sandwich techniques, as described by the manufacturer (R&D systems, Lille, France). RNA Extraction and Quantitative Real Time RT-PCR After removal of the supernatant, fibroblasts were directly suspended in Trizol for RNA extraction according to the manufacturer’s protocol. After treatment with DNase (Ambion, Courtaboeuf, France), 2 mg of total RNA was reverse-transcribed with the Superscript II first-strand synthesis system (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Semiquantitative reverse transcription PCR (QRT-PCR) was done on a LightCycler system 2.0 (Roche, Meylan, France) with specific primers (Table S2). Expression levels of all transcripts studied were normalized to housekeeping gene level and the relative changes in gene expression were compared with those of untreated cells using the 22 DDCt method. Two housekeeping genes were tested: b-actin and the RNA polymerase II genes [21]. Suppo rt ing Informat ion Down-r egulated genes i n fi br oblasts sti m ulated wi th B. bur gdor fer i i n com par i son to unsti m ulated fi br oblasts. 1 For each strain, values shown correspond to the mean ratio of the duplicate measurement determined between normalized gene intensity values obtained after 24 hours of fibroblast stimulation with B. burgdorferi (MOI 100:1) compared with gene intensity values from unstimulated cells. Missing values are indicated with a hyphen (-). As values are expressed as ratios, a , 0.58-fold downregulation correspond to a fold change , –1.7. (PDF) T able S1 Microarray Analysis The topic-defined PIQORT M Skin cDNA Microarray (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) comprising 1,302 genes was used to generate gene expression profiles of Cy5-labeled unstimulated versus Cy3-labeled Borrelia-stimulated fibroblasts. All steps of the microarray process (including hybridization, scanning, and data analysis) were performed as described elsewhere in detail [56]. Data were based on independent duplicate measurements for each Borrelia strain (N40, Pbre, 1408) and inter-array normalization was performed by median normalization using BRBArrayTools developed by Dr. Richard Simon and the BRBArrayTools Development Team (http:/ / linus.nci.nih.gov/ BRBArrayTools.html). The normalized log-ratio values of the 6 experiments (2 experiments/ strain) were analyzed with significance analysis of microarrays (SAM) [57], using the MultiExperiment Viewer (MeV, v4.0.01) software tool [58]. Regulated genes (all strains together) were selected after one-class analysis (20,000 sample permutations) with a false discovery rate (FDR) threshold of 5% and a mean change in their expression level of at least 1.7-fold. For each particular strain, each gene found regulated in the global analysis was then considered regulated if the mean fold change of the duplicate experiments for this particular strain was above 1.7. The microarray data have been T able S2 Pr i m er s used for the quanti tati ve RT -PCR. (PDF) Ack nowledgment s We thank Prof B. Betschart and Dr L. Gern, University of Neuchâtel, for their help in maintaining the tick colony, Prof B. Wilske, University of Munich and Prof E. Ruzic-Sabljic, University of Ljubljana for providing some of the Borrelia strains, Dr. J. Hovius for providing purified recombinant Salp15, C. Delena from the French National Reference Centre of Borrelia for culture of Borrelia strains, Dr. J. Godet, Université de Strasbourg, for his help in statistical analysis of ELISA and QRT-PCR results, Dr C. Ménard for technical assistance in the Limulustests, the REID ‘‘Tiques et maladies à tiques’’ and the GEBLY (Groupe d’Etude sur la Borréliose de Lyme) for their stimulating discussions. A. K ern was supported for her PhD by the Direction Générale de l’Armement and the Conseil Régional d’Alsace. Aut hor Cont ribut ions Conceived and designed the experiments: BJ NB. Performed the experiments: FS AK CB. Analyzed the data: FS AK SN NM. Contributed reagents/ materials/ analysis tools: FS SN NM. Wrote the paper: FS BJ NB. Refer ences 1. Piesman J, Gern L (2004) Lyme borreliosis in Europe and North America. Parasitology 129 Suppl: S191–220. 2. Steere AC, Coburn J, Glickstein L (2004) The emergence of Lyme disease. JClin Invest 113: 1093–1101. 3. van Dam AP, K uiper H, Vos K , Widjojokusumo A, de Jongh BM, et al. (1993) Different genospecies of Borrelia burgdorferi are associated with distinct clinical manifestations of Lyme borreliosis. Clin Infect Dis 17: 708–717. 4. 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Missing values are indicated with a hyphen (-). 144 Résultats – Borrelia et fibroblastes Table S2. Primers used for the quantitative RT-PCR Primer type Actin Forward Reverse Sequence 5’- CCA ACC GCG AGA AGA TGA CC -3’ 5’- GAT CTT CAT GAG GTA GTC AGT -3’ Source or reference RNApol2 Forward Reverse 5’- GCA CCA CGT CCA ATG ACA T -3’ 5’- GTG CGG CTG CTT CCA TAA -3’ Radonic, 2004 IL-8 Forward Reverse 5’- TCT GCA GCT CTG TGT GAA GGT GCA GTT -3’ 5’- AAC CCT CTG CAC CCA GTT TTC CTT -3’ Marchal, 2011 IL-6 Forward Reverse 5’- CCA GAA CAG ATT TGA GAG -3’ 5’- CTA CAT TTG CCG AAG AGC -3’ Designed in this study CXCL1 Forward Reverse F : 5’- GTC ACT GTT CAG CAT CTT TTC G -3’ R : 5’- CTG CAT CCC CCA TAG TTA AGA A -3’ Designed in this study MMP12 Forward Reverse F : 5’- TGG CAT TCA GTC CCT GTA TGG AGA -3’ R : 5’- TCC CAC GGT AGT GAC AGC ATC AA -3’ Designed in this study SOD2 Forward Reverse F : 5’- TCG TGG CTG TGG TGG CTT CG -3’ R : 5’- CCT GCT GGT GCC GCA CAC T -3’ Designed in this study Designed in this study 145 Discussion DISCUSSION I DISCUSSION TECHNIQUE 1 IN VITRO ET IN VIVO L’étude des aspects physiopathologiques de la borréliose de Lyme repose sur des modèles expérimentaux in vitro et in vivo. Les approches in vivo permettent une étude globale des interactions entre la bactérie et son hôte. Plusieurs modèles animaux sont utilisés pour l’étude de la maladie : la souris, le rat147 [Barthold et coll., 1988], le lapin (dont l’intérêt principal est de présenter, comme l’être humain, un érythème migrant) [Foley et coll., 1995], le chien [Straubinger et coll., 1997] ou encore le macaque rhésus, qui constitue également un bon modèle d’étude, en raison de l’évolution de la maladie en phase précoce localisée et précoce disséminée [Philipp et coll., 1993] et des manifestations neurologiques présentées par l’animal [Pachner et coll., 1995], mais dont les contraintes logistiques et éthiques associées en limitent considérablement l’utilisation à des fins de recherche. Le modèle in vivo de la borréliose de Lyme le plus couramment utilisé reste le modèle murin. Les souris de type C3H/He sont les plus sensibles à l’infection par Borrelia : les souris infectées présentent en particulier d’importantes atteintes articulaires et cardiaques [Barthold et coll., 1990]. Ce modèle permet notamment l’étude de la transmission et de la dissémination des bactéries, ainsi que l’étude ciblée des manifestations rhumatologiques et cardiaques de la maladie. Néanmoins, quel que soit le fond génétique utilisé, les souris ne développent ni érythème migrant, ni ACA, qui représentent pourtant chez l’homme deux des trois principales manifestations cutanées de la maladie. 147 Le rat développe des arthrites. 146 Discussion Les approches in vitro permettent l’utilisation de matériel d’origine humaine, et l’étude spécifique des interactions entre Borrelia et un type cellulaire donné (ou l’association de plusieurs types cellulaires dans les modèles organotypiques). Les informations obtenues sont donc plus ciblées. Cependant, l’avantage conféré par la possibilité d’étudier les réponses cellulaires individuelles à la stimulation par le pathogène est à mettre en balance avec les biais liés à l’absence des autres acteurs cellulaires et des coopérations cellulaires établies dans le microenvironnement réel chez l’homme (mais les modèles organotypiques visant à mimer plus précisément le contexte tissulaire approchent cependant un peu plus la réalité que les modèles in vitro monocellulaires). Dans notre laboratoire, les deux approches expérimentales – in vivo sur modèle murin [Kern, 2011], et in vitro sur cultures de cellules humaines primaires – ont été développées en parallèle, et ce manuscrit présente les résultats du travail effectué in vitro. 147 2 Discussion CHOIX DES CELLULES ÉTUDIÉES : KÉRATINOCYTES ET FIBROBLASTES Les kératinocytes sont les cellules résidentes principales de l’épiderme. Nous avons choisi d’étudier la réponse des kératinocytes à l’infection par Borrelia, car ce sont les premières cellules que rencontrent les pièces piqueuses de la tique et la salive qui véhicule Borrelia dans la peau. Par ailleurs, les kératinocytes sont de véritables cellules sentinelles de l’interface cutanée : les récepteurs TLRs qu’ils expriment permettent la reconnaissance de motifs spécifiquement exprimés à la surface des pathogènes (PAMPs), induisant la synthèse de cytokines, de chimiokines et de peptides antimicrobiens, qui constituent autant de « signaux de dangers » capables d’activer les réponses immunitaires spécialisées [Nestle et coll., 2009]. Enfin, notre équipe avait montré sur un modèle de culture in vitro de kératinocytes humains primaires que Borrelia induit la synthèse de médiateurs proinflammatoires (IL-8 et hBD-2), et que cette synthèse est inhibée par la présence d’extraits salivaires de tique [Marchal et coll., 2009]. Ce système expérimental constitue donc un bon choix pour étudier de façon plus précise l’impact de la salive de tique sur la réponse immunitaire innée cutanée à l’infection par Borrelia. Après le travail réalisé sur les cellules résidentes principales de l’épiderme, nous avons voulu étudier la participation des fibroblastes cutanés à la réponse inflammatoire observée lors des manifestations cutanées de la borréliose de Lyme. La pertinence du choix des fibroblastes comme modèle d’étude repose sur les éléments suivants : — lors d’une piqûre de tique, les pièces piqueuses pénètrent profondément dans la peau : la salive de tique et les Borrelia qui y transitent sont injectées jusqu’au contact direct du derme [Castelli et coll., 2008] ; — outre leur rôle dans les mécanismes de synthèse et de remodelage de la matrice extracellulaire (voir chapitre « La matrice extracellulaire », page 21), les fibroblastes sont, à 148 Discussion l’image des kératinocytes, des cellules sentinelles qui participent aux défenses immunitaires de la peau [Smith et coll., 1997; Saalbach et coll., 2007] ; — un premier travail réalisé par notre équipe avait montré sur un modèle de culture in vitro de fibroblastes humains primaires que Borrelia induit la synthèse de médiateurs proinflammatoires (IL-8, LL-37 et hBD-2) [Marchal et coll., 2009] ; — des travaux récents montrent que Borrelia est capable de pénétrer et de survivre à l’intérieur des fibroblastes [Wu et coll., 2011] : les fibroblastes pourraient ainsi constituer pour Borrelia un « sanctuaire » à l’abri des défenses immunitaires. 149 3 Discussion CHOIX DES SPIROCHÈTES UTILISÉS ET CONDITIONS EXPÉRIMENTALES DE CULTURE Toutes les souches testées dans les deux études présentées plus haut (N40, B31, 297 pour l’étude sur les kératinocytes ; N40, Pbre, 1 408 et 297 pour l’étude sur les fibroblastes) appartiennent à l’espèce B. burgdorferi ss. Les souches N40 [Anderson et coll., 1990] et B31 [Burgdorfer et coll., 1982] isolées de tiques I. scapularis, très largement utilisées dans les travaux de recherche sur la borréliose de Lyme, ont été choisies comme souches de référence. La souche native 297 (isolée du liquide céphalorachidien d’un patient atteint de neuroborréliose [Steere et coll., 1983]) et les constructions mutées/complémentées pour la lipoprotéine OspC [Pal et coll., 2004b] (fournies par X. Yang148) dont nous disposions au laboratoire ont été choisies pour l’étude du rôle d’OspC dans notre modèle expérimental. Les souches Pbre et 1 408, respectivement isolées de biopsies cutanées de lésions d’érythème migrant et d’acrodermatite chronique, ont été choisies pour leur caractère pathogène et leur origine clinique humaine ; leur virulence a été également reproduite sur modèle murin [De Martino, 2007]. Toutes les souches ont été cultivées dans les mêmes conditions ; seul le temps de culture (fonction du délai de croissance de chacune des souches) nécessaire à l’obtention d’un nombre suffisant de spirochètes variait d’une souche à l’autre. Nous avons essayé de limiter au maximum les biais relatifs à la perte de plasmides lors des repiquages successifs en cultures in vitro, et dont l’association avec une perte potentielle de virulence est bien connue [Stewart et coll., 2005]. Pour atteindre cet objectif, toutes les souches testées ont été utilisées à faible passage (n ≤ 8), et l’intégralité des expériences concernant une souche donnée a été effectuée à partir de fractions d’un seul et unique lot de bactéries d’un même passage. 148 Stony Brook University, Division of Infectious Diseases, Stony Brook, New York 11794-8153. 150 Discussion Bien que l’effet du milieu de culture des Borrelia (milieu BSK149) sur les cellules utilisées semble négligeable par rapport à la stimulation cellulaire obtenue après inoculation des bactéries [Marchal, 2009], la réalisation d’une étape de lavage des spirochètes avant inoculation des cultures cellulaires permet d’éliminer tout risque potentiellement lié à une activation non spécifique des cellules testées par le milieu BSK. 149 BSK : Barbour – Stoenner – Kelly. 151 4 Discussion PRÉPARATION DES EXTRAITS DE GLANDES SALIVAIRES DE TIQUE Les extraits salivaires utilisés ont été préparés après dissection de glandes salivaires de tiques femelles adultes I. ricinus après gorgement sur animal (souris ou lapin), de manière à ce que la composition de la salive recueillie soit la plus proche possible de celle réellement sécrétée lors d’une piqûre de tique. La contamination bactérienne des extraits protéiques a été limitée au maximum par les précautions prises lors de la dissection des tiques (stérilisation des pinces à disséquer et des lames porte-objet ; bain d’éthanol puis de PBS150 avant la dissection des glandes salivaires ; attention particulière portée pour éviter toute lésion du tube digestif de la tique). L’absence d’endotoxine dans les extraits protéiques (vérifiée par le test du lysat d’amœbocytes de limule) a constitué une condition préalable indispensable à leur utilisation dans tous nos tests in vitro, afin d’éviter toute stimulation cellulaire par du LPS de bactéries ayant potentiellement contaminé les préparations salivaires. Enfin, la concentration finale (20 µg/mL) d’extraits protéiques de glandes salivaires utilisée pour nos tests in vitro représente l’équivalent moyen (pour un puits contenant 1 mL de milieu) de la quantité de protéine obtenue à partir d’une tique. 150 PBS : phosphate buffered saline. 152 5 Discussion ANALYSE DES MICROARRAYS L’analyse du profil transcriptionnel des fibroblastes stimulés par Borrelia reposait dans notre étude sur la technique des microarrays. Nous avons choisi de travailler sur les puces PIQORTM Skin cDNA Microarray, commercialisées par la société Miltenyi, car elles nous semblaient constituer un bon compromis entre le coût unitaire des puces, et le nombre et la nature des gènes étudiés151, par rapport aux puces permettant l’analyse du génome complet. Quelle que soit la technologie utilisée, l’analyse de données microarrays (identification des gènes significativement régulés) est rendue difficile par les biais inhérents à la variabilité biologique des échantillons testés, et la variabilité technique du processus analytique [Hatfield et coll., 2003]. Les différents paramètres dont l’impact sur la variabilité biologique pouvait être maîtrisé ont fait l’objet d’une attention particulière : ils concernent à la fois les spirochètes et les extraits salivaires testés (voir ci-dessus), ainsi que les cellules mises en culture (utilisation d’un seul et unique lot de cellules avec un nombre de passages limités avant mise en plaque, conditions expérimentales entre les essais similaires – milieux de culture, température et durée d’incubation, manipulations postincubation des surnageants et des cellules). La variabilité technique, dont les effets s’ajoutent à chaque étape du processus analytique (conservation des cellules avant extraction des acides nucléiques, extraction, amplification, marquage, hybridation et lecture) [Hatfield et coll., 2003], a été limitée par : — l’utilisation d’un protocole analytique standardisé [Diegmann et coll., 2005]; — la présence en quatre exemplaires de chaque sonde sur les puces, limitant les biais liés à l’étape d’hybridation (normalisation intraplaque). 151 Les puces PIQORTM Skin cDNA comprennent une sélection de 1 302 gènes, représentative des gènes habituellement exprimés dans la peau saine. 153 Discussion Enfin, pour que nos résultats soient analysables sur le plan statistique, deux réplicats biologiques ont été réalisés de façon indépendante pour les trois conditions expérimentales testées (comparaison du profil transcriptionnel des fibroblastes stimulés par trois souches différentes de Borrelia avec les fibroblastes témoins non stimulés). L’utilisation d’un nombre plus important de réplicats biologiques aurait pu permettre la mise en évidence d’un plus grand nombre de différences intersouches que celles que nous avons observées [Lee et coll., 2000] ; néanmoins, la normalisation interplaque152 [Simon et coll., 2007], puis l’analyse statistique globale des données microarrays [Tusher et coll., 2001] – mise en évidence des gènes différentiellement régulés, et comparaison intersouche des profils transcriptionnels induits – ont été réalisées en intégrant pour chaque gène les six valeurs disponibles (deux réplicats biologiques pour trois conditions expérimentales), augmentant ainsi la puissance globale de l’analyse statistique. 152 Normalisation par centrage de la médiane des log ratios (réalisée par le logiciel BRB-ArrayTools). 154 Discussion II DISCUSSION SCIENTIFIQUE 1 LA SALIVE DE TIQUE DANS LA TRANSMISSION DE BORRELIA La transmission de Borrelia par la tique revêt une problématique bien différente de celle d’autres agents pathogènes, comme certains arbovirus – virus West-Nile, virus de la dengue, virus du chikungunya – [Schneider et coll., 2008], les plasmodiums responsables du paludisme [Cohuet et coll., 2010], ou encore les leishmanies [Andrade et coll., 2007], transmis par l’intermédiaire d’insectes hématophages dont le repas sanguin est de courte durée. Alors que dans le paludisme par exemple, les sporozoïtes sont déjà présents dans les glandes salivaires du moustique vecteur (une femelle du genre Anopheles), et sont transmis au moment même de la piqûre par le moustique [Ghosh et coll., 2009], la transmission de Borrelia ne survient – au plus tôt – que plusieurs heures après la piqûre de tique – dont le repas sanguin s’étale quant à lui sur plusieurs jours [Piesman et coll., 1987; Kahl et coll., 1998; Crippa et coll., 2002; Hojgaard et coll., 2008]. Pendant tout ce laps de temps, les défenses de la peau ont le temps de s’organiser et de produire leurs effets, et c’est probablement pourquoi les mécanismes antihémostatiques, antalgiques/anti-inflammatoires et immunomodulateurs élaborés par la tique pour faire obstacle à ces défenses sont aussi variés et complexes [Francischetti et coll., 2009]. Bien qu’il semble contre-intuitif qu’une bactérie aussi fragile que Borrelia puisse survivre et proliférer dans un environnement aussi hostile que celui représenté par la poche sanguine dans laquelle les pièces piqueuses de la tique sont insérées et où les défenses de l’hôte tentent de se mettre en place, les propriétés immunomodulatrices complexes de la salive de tique [Hovius, 2009; Marchal et coll., 2009] confèrent au contraire aux spirochètes transmis un réel avantage pour leur implantation cutanée locale initiale, leur multiplication, et leur future dissémination (voir « Contribution de 155 Discussion la salive de tique aux mécanismes d’échappement de Borrelia », page 108). Les études que nous avons réalisées sur les deux principales populations de cellules résidentes de la peau, que représentent respectivement les kératinocytes dans l’épiderme et les fibroblastes dans le derme, nous ont permis de mettre en évidence deux nouvelles fonctions de la salive de tique. Effet antialarmine de la salive de tique Alors que les premiers travaux de notre équipe montraient que la salive de tique inhibe la réponse inflammatoire des kératinocytes induite par Borrelia [Marchal et coll., 2009], nos nouveaux travaux, qui viennent compléter ces observations initiales, montrent aussi que la salive de tique et sa protéine Salp15 inhibent la synthèse par les kératinocytes de plusieurs chimiokines et de plusieurs peptides antimicrobiens [Marchal et coll., 2011]. Par ailleurs, nos résultats indiquent que les deux principaux d’entre eux – la défensine hBD-2 et la cathélicidine LL-37 – n’ont pas d’effet bactéricide sur Borrelia, mais inhibent simplement – et de façon transitoire uniquement – la mobilité des spirochètes. L’abolition de cet effet sur les spirochètes ne représente vraisemblablement pas pour Borrelia un avantage direct capital pour sa multiplication et son développement dans la peau. En revanche, l’inhibition par la salive de tique de la synthèse de chimiokines et de peptides antimicrobiens, conduisant de facto à l’abolition de leurs propriétés chimioattractantes (qui en font de véritables signaux de dangers capables d’activer le système immunitaire) et donc à l’inhibition d’un pan entier du système d’alerte de la réponse immunitaire innée cutanée [Oppenheim et coll., 2007], constitue probablement un avantage indirect majeur pour Borrelia. Nous émettons donc l’hypothèse que la salive de tique et la protéine Salp15 possèdent une activité « antialarmine » (non décrite jusqu’à présent), qui participe aux mécanismes d’échappement de Borrelia à la réponse immunitaire innée cutanée. 156 Discussion Effet lytique de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés humains Alors que, dans notre système expérimental, les effets de la salive de tique sur les kératinocytes inhibent la synthèse de médiateurs pro-inflammatoires sans qu’aucune altération morphologique des cellules survienne, l’utilisation de concentrations identiques d’extraits salivaires sur les cultures de fibroblastes cutanés humains primaires conduit au contraire à une altération morphologique franche et rapide, aboutissant finalement à la lyse de ces cellules. Nous avons par ailleurs montré que cet effet lytique de la salive de tique sur les cultures de fibroblastes est dose-dépendant et de nature protéique, mais non lié à la protéine Salp15. Une toxicité cellulaire de la salive de tique a précédemment été observée par Hajnickà et coll., avec une méthode de préparation des extraits salivaires et des concentrations finales équivalentes à celles que nous avons utilisées : cette équipe montrait d’une part que la salive d’I. ricinus (ainsi que celle d’une autre tique dure A. variegatum) inhibe la prolifération d’une lignée de fibroblastes murins153, et d’autre part que la salive d’A. variegatum testée sur la même lignée murine ainsi que sur une lignée de fibroblastes humains154 induit l’altération morphologique puis la lyse de ces cellules [Hajnicka et coll., 2011], de façon similaire à ce que nous avons observé dans notre étude sur des fibroblastes cutanés humains primaires. L’altération des fonctions – voire l’atteinte de l’intégrité cellulaire – par la salive de tique I. scapularis a aussi été décrite sur d’autres types cellulaires, comme les polynucléaires neutrophiles [Montgomery et coll., 2004], ou les cellules endothéliales [Francischetti et coll., 2005a]. Les fibroblastes jouent un rôle déterminant dans les mécanismes de cicatrisation cutanée [Martin, 1997; Singer et coll., 1999] : par le KGF qu’ils synthétisent, les fibroblastes stimulent les kératinocytes et favorisent la réépithélialisation de la plaie [Werner, 1998] ; par 153 154 Cellules NIH-3T3. Cellules MRC-5. 157 Discussion la synthèse de facteurs proangiogéniques – VEGFs155, FGFs156, TGF-β1, angiopoïétine-1 – [Jain, 2003], les fibroblastes favorisent la revascularisation du tissu lésé ; par leur rôle central dans les mécanismes de destruction/remodelage de la matrice extracellulaire [Sorrell et coll., 2009], ainsi que par les propriétés contractiles acquises lors de leur transformation myofibroblastique [Desmouliere et coll., 2005], les fibroblastes participent à la formation, puis à la contraction du tissu de granulation. Ainsi, l’effet lytique de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés humains que nous avons mis en évidence in vitro nous laisse envisager l’hypothèse que cet effet pourrait contribuer in vivo à l’inhibition du processus de cicatrisation cutanée. Cette activité cytotoxique directe de la salive de tique sur les fibroblastes (non décrite jusqu’à présent) complète ainsi l’éventail déjà très largement décrit des activités pharmacologiques et immunomodulatrices de la salive de tique [Francischetti et coll., 2009], qui – par leurs effets inhibiteurs sur l’hémostase (coagulation, agrégation plaquettaire, vasoconstriction), la réponse inflammatoire et la réponse immunitaire innée cutanée – permettent le maintien de la blessure cutanée, la poursuite du repas sanguin durant les quelques jours que dure celui-ci, et favorisent ainsi indirectement la transmission de Borrelia dans la peau. 155 156 VEGF : vascular endothelial growth factor. FGF : fibroblast growth factor. 158 2 Discussion INFLAMMATION CUTANÉE DANS LA BORRÉLIOSE DE LYME Il est important de garder à l’esprit que la plupart des effets (pharmacologiques et immunologiques) de la salive de tique, aussi variés et puissants qu’ils soient [Francischetti et coll., 2009], sont limités à la fois dans le temps et dans l’espace, à la seule durée du repas sanguin et à la seule région cutanée concernée par la piqûre de tique. C’est pourquoi les nouvelles fonctions de la salive de tique que notre travail de recherche a permis de mettre en évidence (inhibition de la réponse inflammatoire liée à l’effet « antialarmine » sur les kératinocytes, inhibition possible de la cicatrisation cutanée liée à l’effet cytotoxique direct sur les fibroblastes) ne sont à considérer que dans le contexte initial de la piqûre de tique et de la transmission cutanée de Borrelia. Ainsi, même si la destruction probable des fibroblastes par la salive de tique au site de la piqûre de tique exclut a priori une participation importante de ces cellules dans le devenir initial des spirochètes injectés, la réponse transcriptionnelle observée sur nos cultures de fibroblastes (ou de kératinocytes) après stimulation par Borrelia (mais en absence d’extraits protéiques de glandes salivaires de tique) est probablement un bon reflet de la réponse in vivo des fibroblastes (ou des kératinocytes) à l’infection par Borrelia, lorsque les effets de la salive de tique se sont dissipés après le détachement de la tique et/ou lorsque les spirochètes ayant migré dans la peau ne sont plus soumis à ces mêmes effets. Parmi l’ensemble des modifications transcriptionnelles que nous avons observées dans les fibroblastes, la régulation positive de signaux pro-inflammatoires (comme la cytokine IL-6 et les chimiokines IL-8 et CXCL1) est probablement un déterminant majeur dans la physiopathologie des lésions cutanées observées. La synthèse de nombreuses cytokines et chimiokines par les fibroblastes cutanés humains avait déjà été décrite dans des modèles in vitro [Jones et coll., 1994; Ebnet et coll., 1997], et des études réalisées à partir de biopsies cutanées de lésions d’érythème migrant, de lymphocytome borrélien et d’acrodermatite chronique, examinées ex vivo 159 Discussion [Müllegger et coll., 2000; Müllegger et coll., 2007], confirment également nos observations. À ce titre, les fibroblastes cutanés humains peuvent être considérés comme de véritables cellules sentinelles, capables d’initier le recrutement des cellules immunitaires spécialisées au niveau des sites cutanés concernés par la présence et la multiplication locale de Borrelia. Une question fondamentale, mais encore non résolue, dans l’interaction de Borrelia avec les cellules immunitaires spécialisées ou les cellules résidentes comme les fibroblastes, est de savoir si cette interaction se résume « simplement » à la mise en place des mécanismes de défense contre la bactérie, ou au contraire si la réponse inflammatoire générée (ou plutôt son exacerbation) pourrait être la cause des manifestations cliniques initiales et chroniques de la maladie. Cette question rejoint aussi celle de la persistance extraordinaire de la bactérie dans le tissu cutané et la survenue possible de manifestations cutanées chroniques de la maladie (l’ACA) après un intervalle libre potentiel de plusieurs années sans symptômes apparents [Asbrink et coll., 1986; Brehmer-Andersson et coll., 1998]. En effet, la forte réponse inflammatoire locale, induite notamment par l’interaction de la bactérie avec les TLRs (ou d’autres PRRs), observée à la fois en phase initiale ou tardive chronique de la maladie, pourrait être liée à la persistance de Borrelia dans les tissus lésés et constituer la cause même des lésions tissulaires. Les données expérimentales indiquant la possibilité d’une internalisation [Klempner et coll., 1993] et d’une survie intracellulaire [Wu et coll., 2011] de Borrelia dans les fibroblastes cutanés font de ces cellules un possible « sanctuaire » favorisant la persistance à long terme de la bactérie dans la peau. 160 3 Discussion RECHERCHE D’UNE « SIGNATURE » INFLAMMATOIRE LIÉE À L’ORIGINE DE LA SOUCHE Dans notre étude effectuée sur les fibroblastes, que la souche ait été isolée d’une tique (N40), d’une lésion cutanée d’érythème migrant (Pbre), ou encore d’une lésion cutanée ACA (1 408), les profils transcriptionnels induits sur nos cultures de fibroblastes étaient très similaires. Ainsi, nous n’avons pas réussi à mettre en évidence de « signature » transcriptionnelle spécifique à l’origine des souches testées. Néanmoins, l’impact du choix de ces souches sur l’analyse globale des résultats mérite d’être discuté plus avant. En effet, si l’espèce B. burgdorferi ss est communément isolée de lésions d’érythème migrant, il n’en va pas de même pour les lésions d’ACA, où l’espèce la plus fréquemment isolée est – et de loin – B. afzelii, alors que B. burgdorferi ss n’est qu’exceptionnellement isolée de telles lésions [Picken et coll., 1998]. Ces différences clinicobiologiques sont à mettre en rapport avec l’existence d’un organotropisme relatif lié à l’espèce de Borrelia en cause [Baranton et coll., 2009]. Il n’est pas exclu qu’une souche de B. afzelli isolée d’une ACA induise, dans notre modèle expérimental, une stimulation des fibroblastes différente de celle que nous avons observée. Pour analyser plus en détail ce point, l’étude des interactions entre Borrelia et fibroblastes mériterait d’être poursuivie avec des souches d’autres espèces (B. afzelii, B. garinii …) et une méthodologie similaire, même si les résultats préliminaires obtenus pour tester cette hypothèse semblent indiquer que des souches de différentes espèces induisent un profil inflammatoire similaire dans notre modèle expérimental157, et si les études in vivo réalisées par notre équipe n’ont pas permis d’établir un lien entre le déterminisme évolutif de la maladie et l’espèce de Borrelia responsable de l’infection [Kern, 2011]. Mais, si d’aucuns peuvent estimer que l’utilisation de trois souches d’une même espèce (B. burgdorferi ss) est une faiblesse de notre étude, car interdisant de 157 Des souches cliniques de B. afzelii et de B. garinii induisent la synthèse d’IL-8 à des niveaux comparables à ceux obtenus avec nos trois souches de B. burgdorferi ss de référence (N40, Pbre, 1 408). 161 Discussion facto la mise en évidence de spécificités liées à l’espèce, ce choix en constitue également une force, puisque dans notre analyse comparative intersouche, les biais relatifs aux variations potentiellement induites par la diversité des espèces utilisées sont limités. Par ailleurs, la catégorisation formelle des souches bactériennes selon leur pouvoir pathogène réel chez l’homme est problématique. Une des techniques « classiquement » utilisées pour évaluer la virulence des souches de Borrelia, basée sur l’analyse de l’espace intergénique de l’ADN ribosomique 16s–23s par PCR-RFLP158 [Liveris et coll., 1999], a été réalisée sur les trois souches testées par microarray : la souche N40 isolée de tique montre un profil de type RST159 3 (profil associé aux souches non ou peu disséminantes [Jones et coll., 2006]), alors que les deux souches cliniques montrent un profil de type RST 1 (profil associé aux souches disséminantes [Jones et coll., 2006]). L’étude de ce marqueur génétique semble donc cohérente avec l’origine des souches ; cependant, il est impossible de savoir quel pourrait être le devenir de la souche N40 si celle-ci était inoculée à l’homme, ou encore si la souche Pbre (isolée d’un érythème migrant) eut pu être la cause (comme la souche 1 408) d’une ACA en l’absence de traitement antibiotique instauré précocement après la survenue de l’érythème migrant. Ainsi, quand bien même une signature transcriptionnelle eût été identifiée pour l’une ou l’autre des trois souches testées, des conclusions strictes concernant l’impact d’un potentiel « effet souche » sur le déterminisme de la maladie auraient été difficiles à poser. Enfin, toutes les analyses microarrays permettant l’analyse du profil transcriptionnel des fibroblastes ont été réalisées à l’aide de cellules fibroblastiques dérivées d’un seul et unique lot cellulaire160 ; or, l’hétérogénéité anatomique [Sorrell et coll., 2009] et tissulaire [Sorrell et coll., 2004] des fibroblastes dermiques est connue pour être à l’origine de variations 158 159 160 RFLP : restriction length fragment polymorphism. RST : ribosomal spacer type. Ce lot de fibroblastes provient précisément de la peau jugale d’un homme âgé de 55 ans. 162 Discussion concernant les profils d’expression génique de cette population cellulaire [Chang et coll., 2002; Rinn et coll., 2006; Rinn et coll., 2008]. Par conséquent, les résultats des analyses microarrays auraient pu être différents, et des variations entre les profils transcriptionnels induits par les trois souches testées – plus importantes que celles observées dans notre étude – auraient pu être mises en évidence, si un autre lot de cellules (issues du même patient mais d’un site anatomique différent, ou tout simplement d’un autre patient) avait été utilisé. Cependant, le modèle d’étude que nous avons choisi (fibroblastes dermiques isolés d’une seule région anatomique, mais de toute l’épaisseur du derme) reste intéressant dans la mesure où Borrelia est susceptible d’interagir aussi bien avec les fibroblastes du derme papillaire que du derme réticulaire, et ce quel que soit le stade du cycle infectieux des spirochètes (effraction cutanée lors de la transmission, érythème migrant, ACA). De plus, l’interprétation des résultats obtenus est facilitée par l’absence de biais liés aux variations intra- et interindividuelles qu’aurait inévitablement entraînés l’utilisation respective de lots cellulaires issus de sites anatomiques différents d’un même patient ou de patients différents. 163 4 Discussion PEAU, IMMUNITÉ ET MALADIES À TRANSMISSION VECTORIELLE Dans notre travail, nous nous sommes intéressés spécifiquement à l’étude des interactions entre Borrelia et les cellules résidentes principales de la peau (kératinocytes et fibroblastes). Néanmoins, dans la peau, les interactions de Borrelia avec l’hôte ne se résument pas qu’aux seules cellules résidentes majoritaires de la peau : les cellules spécialisées de la réponse immunitaire sont fortement impliquées dans la réponse de l’hôte à l’infection par Borrelia. Si les interactions de Borrelia avec les monocytes/macrophages [Cruz et coll., 2008; Salazar et coll., 2009], les cellules dendritiques [Filgueira et coll., 1996; Suhonen et coll., 2003], ou encore les lymphocytes [Knigge et coll., 1996; Kalish et coll., 2003; Kinjo et coll., 2006; Collins et coll., 2008], sont des données largement reprises dans la littérature, d’autres types cellulaires jusqu’ici peu étudiés dans le cadre la borréliose de Lyme participent probablement à la réponse de l’hôte contre l’infection et mériteraient d’être étudiés de façon plus approfondie. C’est le cas notamment des mastocytes [Talkington et coll., 1999], dont le rôle dans la reconnaissance des pathogènes et les effets sur la modulation de la réponse immunitaire (innée et adaptative) n’ont été que très récemment mis en évidence [Abraham et coll., 2010; Kumar et coll., 2010]. Dans la triade hôte/pathogène/vecteur, l’interface cutanée et ses défenses immunitaires jouent un rôle clé dans la borréliose de Lyme, mais aussi dans de nombreuses autres maladies à transmission vectorielles – comme l’anaplasmose, la peste, la dengue ou encore le paludisme – ; la diversité des stratégies d’invasion puis d’échappement aux réponses immunitaires de l’hôte, que combinent les différents pathogènes à transmission vectorielle et leurs vecteurs, montre à quel point pathogènes et vecteurs se sont adaptés à leurs hôtes respectifs [Frischknecht, 2007]. Dans le cadre de ces maladies à transmission vectorielle, l’étude de l’interface cutanée (et en particulier son versant immunitaire) suscite un intérêt 164 Discussion croissant dans la communauté scientifique, et les nouvelles techniques d’imagerie in vivo ont permis d’établir de nouveaux concepts, voire de remettre en question certains paradigmes. C’est le cas notamment dans l’étude du paludisme. Ainsi, il semblait établi qu’après l’inoculation cutanée, le parasite quittait rapidement la peau et que la transformation des sporozoïtes (formes infestantes du parasite injectées avec la salive du moustique vecteur) en mérozoïtes (formes du parasite capables d’infecter les hématies) ne pouvait survenir que dans le foie. De nouvelles données indiquent au contraire que le parasite est capable d’établir, au sein des différentes structures de la peau – épiderme, derme et follicules pileux [Gueirard et coll., 2010] – une niche dans laquelle survient une transformation complète des sporozoïtes en mérozoïtes [Gueirard et coll., 2010]. Dans les ganglions lymphatiques de drainage, le parasite est également capable d’initier une maturation, même si celle-ci n’est que partielle [Amino et coll., 2006]. Ces nouveaux éléments physiopathologiques clés de l’infection palustre établissent clairement l’existence d’une véritable « phase cutanée » pré-érythrocytaire dans le cycle infectieux du parasite [Sinnis et coll., 2008]. Le virus de la dengue, dont la transmission vectorielle est assurée par des moustiques hématophages du genre Aedes, amorce aussi son processus infectieux par une phase de multiplication cutanée, qui précède une éventuelle dissémination hématogène du virus (responsable de la fièvre dengue) et son passage vers les hépatocytes et les cellules endothéliales (dont l’infection participe aux mécanismes physiopathologiques responsables de la fièvre hémorragique de dengue [Green et coll., 2006]). Si la « cible » cellulaire cutanée principale du virus de la dengue demeure les cellules dendritiques immatures (dans lesquelles il pénètre en utilisant le récepteur DC-SIGN [Tassaneetrithep et coll., 2003]), des données récentes indiquent que les kératinocytes sont également des cellules permissives pour ce virus [Surasombatpattana et coll., 2011] (les kératinocytes sont aussi permissifs pour un autre flavivirius, le virus West Nile, transmis par les moustiques du genre Culex [Lim et coll., 165 Discussion 2011]). La réponse antivirale des kératinocytes à l’infection par le virus de la dengue (synthèse d’interférons et de peptides antimicrobiens [Surasombatpattana et coll., 2011]) souligne une fois encore le rôle de sentinelles des cellules résidentes cutanées dans les mécanismes immunitaires de défense de la peau [Nestle et coll., 2009]. Les leishmanies, protistes flagellés transmis à l’homme par piqûre de certaines espèces de phlébotomes161 (comprenant les genres Phlebotomus et Lutzomia), sont un autre exemple de pathogène à transmission vectorielle, dont la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’atteinte cutanée de la maladie a sensiblement évolué au cours des dernières années. Les leishmanies ont longtemps été considérées comme des parasites intracellulaires stricts du système réticulo-histiocytaire, mais de nouvelles données indiquent que les cellules cibles initiales de Leishmania major sont, comme pour A. phagocytophilum [Dumler et coll., 2005], les polynucléaires neutrophiles [Ritter et coll., 2009]. Le parasite est non seulement capable de survivre dans ces cellules phagocytaires [Laufs et coll., 2002], mais il est également transmis par les neutrophiles apoptotiques aux macrophages [van Zandbergen et coll., 2004], et son « passage » initial dans les polynucléaires neutrophiles semble nécessaire au maintien de sa virulence [Peters et coll., 2008]. Les leishmanies se servent ainsi des polynucléaires neutrophiles comme « cheval de Troie » pour infecter leurs cellules hôtes définitives, les macrophages [Laskay et coll., 2003]. Outre la borréliose de Lyme, ces quelques exemples de pathologies à transmission vectorielle nous montrent la complexité des mécanismes mis en jeu à la fois par l’organisme pour se défendre, mais aussi par les pathogènes et leurs vecteurs pour les contourner, et ils soulignent l’importance de l’interface cutanée dans le déterminisme évolutif des maladies qu’ils induisent. 161 La transmission des leishmanies à l’hôte vertébré se fait par régurgitation du contenu intestinal lors de la piqûre de la peau par ces petits insectes diptères. 166 Conclusions CONCLUSIONS Les études que nous avons réalisées in vitro nous ont permis de confirmer la participation des deux principales cellules résidentes de la peau – les kératinocytes et les fibroblastes –, dans la réaction inflammatoire dont l’infection cutanée à Borrelia s’accompagne. Aucune « signature » transcriptionnelle liée à la souche n’a pu être mise en évidence dans le modèle fibroblaste, mais la poursuite de ce travail avec des souches d’espèces différentes pourrait permettre l’identification de voies transcriptionnelles spécifiques, en lien avec le déterminisme évolutif de la maladie. De plus, si nous avons identifié les principaux déterminants antigéniques de Borrelia responsables de la réponse inflammatoire des kératinocytes (OspC et OspA), il serait intéressant de poursuivre l’étude des déterminants de surface responsables de la stimulation des fibroblastes. L’utilisation de souches mutantes pour BBK32, DbpA et DbpB, ou d’autres lipoprotéines de surface pourrait permettre de répondre à cette question. Par ailleurs, le modèle expérimental utilisé nous a permis de mettre en évidence deux nouveaux rôles de la salive de tique : une fonction « antialarmine » sur la réponse des kératinocytes à l’infection par Borrelia, et une toxicité cellulaire sur les fibroblastes dermiques, dont les effets directs ou indirects pourraient favoriser la transmission de Borrelia, son implantation cutanée initiale, et sa dissémination secondaire aux organes cibles. Les effets de Salp15 étant maintenant bien déterminés, notre modèle expérimental sur kératinocytes pourrait constituer un bon outil pour la caractérisation et l’étude d’autres protéines immunomodulatrices de la salive de tique. L’étude de l’immunité innée cutanée dans la borréliose de Lyme ne se résumant pas aux seules cellules résidentes majoritaires de la peau, le rôle d’autres cellules, et notamment des acteurs cellulaires spécialisés principaux de la réponse immunitaire (lymphocytes, cellules dendritiques, mastocytes …) mériterait d’être approfondi plus avant, en bénéficiant de la complémentarité des approches expérimentales in vivo et in vitro maîtrisées dans le laboratoire. 167 Bibliographie BIBLIOGRAPHIE Abbott A (2006) Lyme disease: uphill struggle. Nature 439:524-5. Aberer E, Klade H, Hobisch G (1991a) A clinical, histological, and immunohistochemical comparison of acrodermatitis chronica atrophicans and morphea. The American Journal of dermatopathology 13:334-41. Aberer E, Klade H, Stanek G et coll. (1991b) Borrelia burgdorferi and different types of morphea. Dermatologica 182:145-54. 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Nous avons montré que la salive de tique et la protéine salivaire Salp15 inhibent la réaction inflammatoire (production de chimiokines et de peptides antimicrobiens) des kératinocytes induite par Borrelia. Cet effet anti-« alarmine » de la salive de tique contribue probablement à créer un environnement cutané local favorable à la transmission de Borrelia. Nous avons montré que Borrelia induit également au niveau des fibroblastes cutanés la transcription de nombreux gènes pro-inflammatoires. Nous avons observé un effet toxique direct de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés : cet effet dose-dépendant est de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Ces résultats indiquent que les fibroblastes jouent un rôle important dans l’inflammation cutanée induite par Borrelia. Mots clés : Immunité innée cutanée ; Borréliose de Lyme ; Cellules résidentes de la peau : kératinocytes, fibroblastes ; Peptides antimicrobiens ; Salive de tique. Résumé en anglais We studied the role of the skin innate immunity during the transmission of Borrelia (the infectious agent of Lyme borreliosis) by its vector, a hard tick belonging to the genus Ixodes. We showed that tick saliva and its protein Salp15 both inhibate Borrelia-induced inflammatory reaction of keratinocytes. The antialarmin effect of tick saliva ensure a favorable environment for Borrelia. We also showed that Borrelia induce a strong inflammatory response in dermal fibroblasts. We also demonstrate a dose-dependent lytic effect of tick salivary gland extracts on dermal fibroblasts and that this cytotoxic effect was of proteinaceous nature and not related to Salp15. These results indicate that dermal fibroblasts could be considered as central mediators in immune cell recruitment to the skin site of Borrelia invasion. Key words : Cutaneous innate immunity; Lyme borreliosis; Skin resident cells: keratinocytes, fibroblasts; Antimicrobial peptides; Tick saliva.
