Optique à l - Hervé Klein Microscopie
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LE MILLA MICROSCOPIE CROSCOPE OPTIQUE LA MICROSCOPIE OPTIQUE LE PRINCIPE DE BASE • Le principe de base de la microscopie est simple. Les propriétés d'un faisceau de lumière sont modifiées lorsqu'il traverse un échantillon. Ces modifications contiennent des informations spécifiques de l'échantillon. Les lentilles des objectifs intégrés au microscope permettent l'amplification et la transformation de ces informations en une image visible à l’œil. • La lumière utilisée est une lumière blanche visible à l ’œil et qui irradie dans toutes les directions. On la schématise à l ’aide d ’une courbe sinusoïdale LA LUMIERE • La lumière est un ensemble d’ondes électro magnétiques qui stimulent les cellules nerveuses (cônes et bâtonnets) de l’œil. • Notre œil est plus sensible aux variations de couleurs que d’intensité. ONDE ELECTRO MAGNETIQUE • Une onde électro magnétique est un phénomène ondulatoire définie • Par sa longueur d’onde ou sa fréquence • Elle possède un axe de propagation • Une vitesse C =299 792458 m/s • Deux axes perpendiculaires d’oscillation électrique et magnétique • Une grain d'énergie le photon E=h/λ Spectre de la lumière visible L’œil ne perçoit qu’une infime partie des ondes électromagnétiques LES SOURCES DE LUMIERE Soleil Lampe à incandescence Lampe à arc LED LASER SOLEIL • • • • Notre référence naturelle Température à la surface 5300 K (degré Kelvin) Lumière filtrée par l’atmosphère Spectre bleuté Lampe a incandescence • • • • Usage général Faible coût Température 3400 K Le spectre dépend de la tension exercée • Faible intensité dans les couleurs froides • Chauffe Variation du spectre en fonction de la tension de la lampe Lampe a arc • Usage Fluorescence (mercure métal- halide) Métallo (xénon) Loupe (néon) • Intensité constante • Forte concentration lumineuse • Durée de vie limitée. • Prix élevé Spectre lampe mercure Une lampe HBO n'a pas un spectre constant Spectre Lampe Xénon Utiliser en épiscopie pour des objets opaques Comparaison HBO/Métal Halide Source Métal Halide • Avantage • Spectre dans le visible • Lampe pré centré • Intensité variable • 2000 h • Par contre coût lampe : 1000 € LED • Avantage : longue durée de vie (100.000 H pour 1.000 H pour lampe classique) • Faible consommation • Intensité constante • Ne chauffe pas • Lumière Blanche • LED colorée pour fluo • Température couleur constante Laser • Usage : Confocal ,Découpe laser • • • • Lumière mono chromatique Polarisée Cohérente (ne se disperse pas) Prix élevé Source Laser Spectre de différentes sources lumineuses QUELQUES NOTIONS D’ OPTIQUE La Lentille • La lentille est définie : • Par son grossissement, son rayon de courbure, sa distance focale. REFRACTION L'angle d'une onde est modifié en changeant de milieu REFLEXION A partir d'un certain angle la lumière est réfléchie Diffraction L'angle de réfraction dépend aussi de la longueur d'onde Aberration chromatique Avec une lentille simple le plan focal dépend de la longueur d'onde Aberration Sphérique Courbure du Champs Un lentille projette une image sur une portion de sphère Déformation d'un objet effet Coma LES OBJECTIFS Pièce maîtresse d’un microscope ils en déterminent la qualité mais aussi le prix Sur un objectif est gravé ces caractéristiques : Spécification d un objectif Grossissement • • • • • C’est le facteur le plus connu Sur un microscope de 2.5X à 100X Sur un stéréo microscope soit Grossissement fixe ( 2X, 4X) Zoom ( 0.7 à 15X) ABERRATION CHROMATIQUE ET PLANEITE • ABERRATION CHROMATIQUE Achromat corrigé sur 2 couleurs Apochromate corrigé sur 3 couleurs • PLANEITE Semi plan : planéité sur 90 % de la surface Plan : planéité sur 100 % Comparaison Achro/Apo Plus un objectif est corrigé en planéité et en chromatisme plus le nombre de lentille augmente ainsi que son prix. OUVERTURE NUMERIQUE • La formule est ON = Ir x sinus a • Ir : indice réfraction du milieu • • • • AIR = 1 EAU = 1,33 HUILE = 1,515 A = moitié de l’angle d’ouverture de l’objectif OUVERTURE NUMERIQUE Pouvoir Séparateur Profondeur de Champs Distance de Travail Luminosité POUVOIR SEPARATEUR • Capacité d’un système optique de distinguer 2 points distincts • La résolution dépend de O.N. et de longueur d’onde • R en micron = 0,61 (L /O.N.) • • L: longueur d’onde ( O,55 nm) ON : ouverture numérique • En faite elle dépend aussi du condenseur • R=1,22xL/(ON.obj+ON.cond) • Soit une résolution maximale latérale de 0,23 micron (ON : 1,45) Haute Résolution • Pour une haute résolution il faut en fond clair un objectif avec une très grande ouverture numérique couplé à un condenseur apochromate à immersion. • La fluorescence permet la haute résolution l'objectif servant de condenseur. • Autre technique le DIC PROFONDEUR DE CHAMP • Épaisseur de la préparation ou l’image est nette. • La profondeur de champ est liée à l ouverture numérique de l'objectif (NA) • L'indice de réfraction du milieu (n) • La longueur d'onde (λ) • Plus l'ouverture numérique de l'objectif est élevé plus la profondeur de champ est faible • O.N. et distance de travail (WD) • De manière générale plus un objectif à une O.N. élevé, plus sa distance de travail est faible. • Ex 3 objectifs 40 • • • Plan 40X/0.65 WD 0.6mm Plan Apo 40X/0.9 WD 0.18mm Plan LWD 40X/0.6 WD 2.6 mm LUMINOSITE Un objectif à grande ouverture numérique laisse passer plus de lumière •Intensité lumineuse = O.N.4/Grossissement2 PARFOCALITE/DISTANCE DE TRAVAIL • Parfocalité : • Propriété d'une gamme d’objectifs d'avoir la même distance entre le plan focal et le revolver (classiquement 45 mm) • Distance de travail : • Distance entre la lentille frontal et le plan focal (pour un objectif corrigé pour une lame couvre objet : distance entre la lentille frontale et la lame couvre objet) Optique à 160 MM Optique à l'infini 160 mm ou Infini • Deux constructions optiques existent pour les microscopes droits et inversés • Optique à 160 mm : le faisceau est convergent à la sortie de l'objectif, plan image à 160 mm • Optique à l'infini : le faisceau est parallèle à la sortie de l'objectif et la convergence ce fait par une lentille au niveau de la tête. COMPATIBILITE DES OBJECTIFS • Optique 160mm • La plus part des optiques à 160 mm pour la biologie sont sur le standard Parfocalité : 45 mm Pas de vis 20,32 mm • Optique à l 'infinie • Pas de standard Lame couvre objet • Pour les objectifs ayant une O.N. Supérieur à 0,3 (10X) il est nécessaire de tenir compte de la lame couvre objet (0,17 mm) • Objectif « bio » corrigé 0,17 mm • Objectif « métallo » non corrigé • Objectif à correction variable (0-2 mm) Bague de Correction • • • • • Certains objectifs possèdent une bague de correction : Correction de l'épaisseur de lamelle (ex 0-2 mm) Modification de l'ouverture numérique (ex 1-1,3) Modification de l'indice de réfraction du milieu Ajustement de la parfocalité TABLEAU RECAPITULATIF POUR QUELQUES OBJECTIFS GROSSISSEMENTS, RESOLUTIONS ET PROFONDEURS DE CHAMP Objectif Diam. Distance Prof. de Résolution Ouverture Observe frontale Champ (microns) numérique en mm en mm. (microns) U.PL.APO.2 0,08 11,00 6,00 398,00 4,19 U.PL.FL.4 0,13 5,50 17,00 70,00 2,58 U.M.PL.5 0,10 4,40 19,60 98,00 3,36 U.PL.10 0,25 2,20 10,25 28,00 1,34 U.PL.FL.20 0,50 1,10 1,60 7,00 0,67 L.MPLFL.20 0,40 1,10 12,00 6,09 0,84 U.PL.FL.40 0,75 0,55 0,51 2,52 0,45 U.PL.50 (oil) 0,90 0,44 0,20 1,75 0,37 UMPL.FL100 0,95 0,22 0,31 0,67 0,35 U.PL.apo.100 (oil) 1,40 0,22 0,10 0,59 0,24 Grossissement et Agrandissement • Pour les microscopes récents, le grossissement total est le produit du grossissement de l’objectif par celui de l’oculaire. • Les oculaires ne servent qu’à grandir l’image mais n’apporte rien au pouvoir séparateur. • En pratique un objectif est exploitable jusqu’à 1000 fois son ouverture numérique. • Soit pour les meilleurs 100X ON 1.45 = 1450 X • • Grossissement : J’augmente la taille de l’objet observé et la finesse des détails Agrandissement : J’augmente uniquement la taille de l’objet observé. LES MODES D'OBSERVATION • LE FOND CLAIR : Le plus courant. Éclairage coaxial qui permet le contrôle des motifs et restitue les couleurs. • LA LUMIERE POLARISEE: Permet le contrôle de la biréfringence des substances. • LE CONTRASTE DE PHASE : Il permet l'observation de coupes non colorées • LE FOND NOIR : Éclairage rasant. Il permet le contrôle des contours. • LE CONTRASTE INTERFERENTIEL : Il permet de connaître le relief de surface des échantillons. • L'EPIFLUORESCENCE : Ce mode permet d'observer et de localiser des substances organiques qui fluorescent sous des longueurs d'ondes définies. • L'INFRA ROUGE : L'observation se fait à l'aide de caméra dans des longueurs d'ondes qui ne sont plus visible à l’œil. • LE CONFOCAL : La lumière est focalisée sur une très petite zone d'un plan donné de l'échantillon. On évite ainsi beaucoup de diffraction. Un système de balayage permet de reconstituer l'image sur une surface correcte. LE FOND CLAIR (BF) • • • • • • • Le plus courant Microscope Droit Transmission/Réflexion Microscope Inversé Transmission/Réflexion Stéréo Microscope Transmission/Réflexion Permet de visualiser un échantillon naturellement ou artificiellement coloré Réflexion Transmission • λ LA POLARISATION (POL) • Usage générale • Microscope droit • transmission/réflexion • Microscope inversé • transmission/réflexion • Stéréo microscope • transmission/réflexion • But : visualiser et mesurer tous objets (structure cristalline) modifiant une lumière polarisée PRINCIPE • • • Un filtre (le polariseur) sélectionne les ondes par rapport à un axe de vibration privilégié (ondes polarisées) Un deuxième filtre (l’analyseur) va soit laisser passer les ondes polarisées s’ il a le même plan de polarisation que le polariseur Soit bloquer les ondes si son plan de polarisation est à 90° de l’analyseur (polarisation croisée ou extinction) Cristal biréfringent • Le cristal va modifier l’onde incidente en deux ondes polarisées dans deux plans différent qui se propagent à une vitesse différente. POLARISATION SIMPLIFIEE • Simple visualisation des cristaux par l’adjonction à un microscope en fond clair En transmission :un polarisateur avant le condenseur et un analyseur au dessus de l’objectif. • En réflexion : un filtre polarisant sur l’illuminateur avant le miroir et l’analyseur au dessus du miroir. Le microscope Polarisant • Principales caractéristique • Polariseur et analyseur tournant et gradués sur 360° • Platine circulaire tournant gradué sur 360° et centrable • Optiques détensionnées (Pol) • Objectifs centrables • Fente pour compensateurs • Lunette de Bertrand escamotable ORTHOSCOPIE • Orthoscopique d’une lame mince de roche est utilisé pour examiner sa structure, les caractéristiques optiques de ces cristaux et identifier les minéraux qui la compose. Acier Conoscopie • En utilisant la lunette de Bertrand on observe à 40X ou 100X les cristaux d’une lame mince de roche. On peut déterminer si un cristal est uni axial ou bi axial, la direction et les angles de ces axes optiques. LE CONSTRATE DE PHASE ( PH) – Microscope droit et inversé de biologie en transmission – But : augmenter les contrastes d’objet peu ou pas coloré. PRINCIPE • On utilise les propriétés ondulatoires de la lumière. • 2 ondes en phase s’additionnent • 2 ondes en contraste de phase s’annulent Fente d Young Expérience démontrant la propriété ondulatoire de la lumière • La lumière en traversant un objet va modifier son trajet optique et donc va être en déphasage par rapport à la lumière ayant traversé le milieu. • Le PH permet d'atténuer la lumière en phase Matériel nécessaire • Des objectifs Phase (PH) • Des anneaux de phase correspondant aux objectifs utilisées dans un condenseur à tourelle ou sur une barrette. • Une lunette de centrage (facultative) Comptage dans cellule de Malassez LE FOND NOIR (DF) • Microscope droit • transmission réflexion • Microscope inversé • transmission réflexion • Stéréo Microscope • transmission • En transmission il permet d’accentuer les contours • En réflexion donne une idée du relief. PRINCIPE en transmission • La préparation est éclairé par un lumière oblique, l'objectif est dans un cône non éclairé. • DF à sec jusqu’à l’objectif 40X • DF à immersion au 100X nécessitent un condenseur à immersion et un objectif immersion à diaphragme iris. DF en réflexion • Cube DF avec anneau noir occultant la lumière qui pourrait passer par l’objectif • Objectif DF/BF à double enveloppe • L'objet est éclairé par un anneau lumineux qui passe autour de l'objectif DF transmission LE CONSTRASTE INTERFERENTIEL (DIC) • Microscope droit et inversé • transmission et réflexion • Permet d’avoir une idée du relief de la préparation PRINICIPE Principe (wikipédia) Contrainte du DIC en transmission • Échantillon peu ou pas coloré • Objectif à haute O.N. • Prisme onéreux • Demande un éclairage • puissant • Faible profondeur de champs mais haute résolution Utilisation du DIC en électronique • La haute résolution et la faible profondeur de champ d’une observation en DIC permet de visualiser des plans successifs d’un pièce en relief. Autres Contrastes Le DIC fonctionne mal sur les plastiques qui dépolarisent la lumières Les constructeurs ont mis au point d'autres techniques Le contraste d’Hoffmann Le Relief Phase Contraste Le PlasDIC …... Contraste de Rheinberg • Peu connu • Le principe est d'éclairer la préparation avec un disque colorée • Un deuxième disque d'une couleur complémentaire fait office de fond noir L’infra rouge (IR) • Technique utilisée pour l'analyse de tranche épaisse de cerveau • Visualisation en DIC entre 750 et 1100 nm • LA FLUORESCENCE (FL) • Microscope droit ou inversé uniquement en réflexion. • Les constructeurs la proposent maintenant sur Loupe. • But visualiser des détails d’une préparation ou mettre en évidence une catégorie d’objets. • Technique en pleine expansion. • Technique permettant la visualisation d’objet très fin. Principe d’un microscope à fluorescence • On sélectionne une petite partie du spectre de la lumière émise par une lampe généralement à vapeur de mercure grâce à un filtre (filtre d’excitation) • Cette lumière est réfléchit vers l’objectif par un miroir particulier le miroir dichroïque • La lumière émise par le fluo chrome traverse l’objectif puis le miroir vers les oculaires. • Toutes lumières intempestives étant éliminé par un deuxième filtre (filtre d’arrêt) FLUOROCHROME • Molécule ayant la propriété quand elle est excité par une lumière de longueur d’onde adéquate d’émettre une lumière dans une longueur d’onde supérieur. • On peut distinguer • Les fluorochromes naturels • Les fluorochromes de synthèse. • L'Immuno fluorescence Principe de l’épi fluorescence Épi Illuminateur pour Fluorescence • • • • Les caractéristiques d’un cube sont Filtre d’excitation : longueurs d’onde qu’il laisse passer Ex BP 460-490 : band pass de 460 à 490 nm Miroir dichroïque longueur d’onde à partir du quel il ne réfléchit plus la lumière. • Ex DM 505 réfléchit jusqu'à 505 nm et laisse passer au dessus • Filtre d’arrêt : longueur d’onde à partir il laisse passer la lumière. • Ex BA 515 laisse passer la lumière à partir de 515 nm Courbes d'un cube •En abscisse la longueur d ’onde •En ordonnée le pourcentage de passage. •En rouge la courbe du filtre à l ’excitation BP 460-490 •En noir la courbe du filtre d’arrêt BA515IF •En vert la courbe du miroir dichroïque DM505 CHOIX D UN CUBE • Le choix du cube se fait par rapport aux longueur d’onde d ’excitation et d’émission du flurochrome • Attention : souvent les utilisateurs parlent par ex de fluo bleu car ils voient fluorescer dans les bleus leurs préparation. • Les constructeurs ont des tables donnant les choix des cubes pour chaque fluorochrome. • Si on définit un fluorochrome pas son pic d’excitation et d’émission les spectres sont plus larges. Les objectifs dit FLUO • Entre le Plan Achromatique et le Plan Apo chromatique les constructeurs ont une gamme dite FLUO. • Gamme spécialisée pour la Fluorescence ? • En faite ce sont des objectifs traités à la fluorine. La Fluorine • • • • • • Cristal augmentant la transmission du verre particulièrement dans les UV Les objectifs FLUO ont de plus une O.N. plus élevés que les Plans classiques. Ce sont des objectifs recommandés pour la fluorescence UV. Ils ne sont pas obligatoire pour la fluorescence visible. Grâce à leurs grandes ON ils sont utilisées dans des applications comme le DIC. Parfois appelé Universel car permet d'utiliser plusieurs techniques d'observation • Intensité lumineuse : O.N.4/Grossissement2 • Un objectif à grande ON sera plus performant Coupe végétale en fond clair et fluo Multi marquages des chromosomes (fish) LES TECHNIQUES CONFOCALES • On a vu apparaître de nouvelles techniques dite confocal permettant d'améliorer la résolution des observations en fluorescence • Les 3 principes de base • Le confocal laser • Le confocal par disque rotatif • La déconvolution Confocal Laser • Excitation par la lumière d’un laser. • Par un système de 2 miroirs la lame est balayé point par point • La détection de la fluorescence se fait par un photo détecteur Résolution spatiale Confocal Le trou confocal permet d'éliminer la lumière parasite Confocal par disque rotatif • Source de lumière classique • Acquisition par une Caméra • La lumière traverse deux disques rotatifs percés d'une multitude de trous (disque de Nipkow). Déconvolution • Méthode purement mathématique. • On utilise un microscope à fluorescence classique avec une caméra haute résolution • Par calcul on détermine les sources de lumière (la fluorescence) et on élimine les halos autour des points lumineux. Images confocales Comment augmenter la résolution spatiale • • • • • • De nouvelles méthodes on apparues Le bi photon Analyse spectral Le TIRF La lumière structurée Le STED LES 4 TYPE DE MICROSCOPE Droit Inverse Stéreomicroscope Macroscope STRUCTURE D'UN MICROSCOPE • • Il existe 3 structures mécaniques et deux modes d'éclairage diascopie(transmission) et épiscopie (réflexion). Microscope droit Biologie • • Transmission : fond clair, fond noir, contraste de phase , interférentiel, polarisation Réflexion : Fluorescence • Microscope droit Industrie • • Transmission Fond clair, Polarisation Réflexion fond clair, fond noir polarisation interférentiel • • • • • • • • Microscope Inversé Biologie Transmission fond clair, contraste de phase, interférentiel Réflexion Fluorescence Microscope inverse Métallographie Réflexion fond clair fond noir Interférentiel Stéréomicroscope Transmission fond clair fond noir polarisation Réflexion fond clair, polarisation Fluorescence CHOIX DE LA STRUCTURE Il faut d’abord savoir que ce choix ne se fera ni en fonction des optiques (la plupart des objectifs se montent à la fois sur les microscopes droits et les microscopes inversés) ni en fonction du mode d’observation. Ce sera en général la nature des échantillons à observer qui déterminera la structure mécanique du microscope. • LE MICROSCOPE INVERSE (platine fixe) Va être choisi pour observer des échantillons de volume important (métallographie) ou quand l’échantillon est dans un récipient avec du liquide (culture cellulaire) • LE MICROSCOPE DROIT : Va être sélectionné pour tous les échantillons relativement minces (moins de 50 mm.) et pour ceux qui demandent des déplacements supérieurs à 30 mm. • LE STEREOMICROSCOPE pour des faible grossissement en stéréoscopie Sur le plan économique, il faut aussi savoir, qu’à équipement équivalent (même mode d’observation et mêmes optiques) le microscope droit sera toujours plus économique à l’achat. CHOIX DE LA STRUCTURE Il faut d’abord savoir que ce choix ne se fera ni en fonction des optiques (la plupart des objectifs se montent à la fois sur les microscopes droits et les microscopes inversés) ni en fonction du mode d’observation. Ce sera en général la nature des échantillons à observer qui déterminera la structure mécanique du microscope. • LE MICROSCOPE INVERSE (platine fixe) Va être choisi pour observer des échantillons de volume important (métallographie) ou quand l’échantillon est dans un récipient avec du liquide (culture cellulaire) • LE MICROSCOPE DROIT : Va être sélectionné pour tous les échantillons relativement minces (moins de 50 mm.) et pour ceux qui demandent des déplacements supérieurs à 30 mm. • LE STEREOMICROSCOPE pour des faible grossissement en stéréoscopie Sur le plan économique, il faut aussi savoir, qu’à équipement équivalent (même mode d’observation et mêmes optiques) le microscope droit sera toujours plus économique à l’achat. TRAJET OPTIQUE DANS UN MICROSCOPE DROIT Tête d'observation Epi-illuminateur Boîtier lampe pour épiscopie Tourelle porte cubes Tourelle porte objectifs Platine porte échantillon Condenseur OLYMPUS BX60 0 Statif 1 Boîtier lampe pour diascopie En épiscopie on utilise un miroir semi réfléchissant : Réflexion 50 % de la lumière (3) Transmission 50 % de la lumière (2) GROSSISSSEMENT • Entre O,5X et 100X sur un microscope droit • Nécessite un condenseur à lentille escamotable en dessous de 4X • En général plus le grossissement est fort plus la distance entre l’objectif et la préparation est faible (voir ouverture numérique) BIOLOGIE OU METALLOGRAPHIE • BIOLOGIE • Optique corrigée pour travailler à travers une lamelle de 0,17 micron ou lame verre/plastique (pour O.N. sup. à 0,4) • Air Huile • Eau (sans lamelle) • METALLOGRAPHIQUE • Optique non corrigé • Air Eau Microscope d’enseignement Microscope de laboratoire Platine croisée orientable Diaphragme de champs Réglage de Koelher Microscope avec tête ergonomique Microscope de Patch à platine fixe et tourelle mobile Microscope métallographique en épiscopie Microscope à platine large Microscope sur colonne Photo microscope avec plan film et tube de vision macroscopique Lecteur de lame automatisé MICROSCOPE INVERSE • BIOLOGIE • Principalement utilisé pour visualiser a travers un support encombrant type boite de pétri, roller…… • Les microscopes de biologie sont en général équipé d’objectifs et d’un condenseur grande distance de travail (LWD : Long Working Distance) • Grossissement 4 à 60X souvent en contraste de phase • INDUSTRIE • Visualiser des objets encombrants c’est le microscope des métallurgistes.(Fond clair Fond noir Pol DIC) TRAJET OPTIQUE DANS UN MICROSCOPE INVERSE Boîtier lampe pour diascopie Condenseur Boîtier lampe pour épiscopie Platine porte objet Olympus IX70 Tête d'observa Statif Boîtier photographiqu Microscope inversé métallographique Microscope inversé de biologie Stéréomicroscope ou Loupe • • • • • • Gamme de grossissement 5-50X (200X) Vision stéréoscopique (en relief) 3 niveaux de loupe Grossissement fixe Plusieurs grossissements fixes sur tourelle Zoom grossissement en continu 2 Types de construction optique CMO et GREENOUGH • Il existe deux types de construction des loupes • Greenough la convergence des faisceaux se fait dans le corps de la loupe, ce sont des loupes mono bloc. • CMO ou Galilée la convergence se fait au niveau de l'objectif, loupe modulable généralement en 3 parties : tête, corps et objectif On peut monter une loupe sur différents statifs Fibres Optiques Double bras ou annulaire ? Effet de relief pour la fibre Homogénéité de l’éclairage pour l'annulaire Eclairage transmission ou diascopie • Eclairage simple pour des objets colorés • Eclairage oblique ou avec miroir orientable pour augmenter les contrastes • Fond noir pour des objets non colorés • La réflexion pour des objets opaques Distance de travail ou champ observé Pour augmenter le grossissement soit changer les oculaires ou changer l'objectif • Choisir entre un objectif de 1.5X ou des oculaires de 15X • Objectif de 1.5X distance de travail 45.5 mm champs 22/5 = 4.4mm • Objectif de 1X distance de travail 90 mm Oculaire de 15X/16 (16/5) =3.2 mm (pas de modification du grossissement photo) Macroscope Grossissement d'une loupe mais avec un trajet optique unique LA TERMINOLOGIE • LE STATIF : C'est la pièce maîtresse. Le support mécanique. • • Il doit être d'une grande stabilité. Il reçoit le système de mise au point, le support platine et conditionne l'ergonomie générale de l'appareil. • LE BOITIER LAMPE : Il doit être sécurisé et faciliter le remplacement • • de la lampe. Il peut utiliser des lampes tungstène, halogène, xénon ou à vapeur de mercure. • LA PLATINE : Elle a la tâche de recevoir l'échantillon. Ses dimensions doivent être adaptées au travail et elle doit être très résistante à l'abrasion. Sa mécanique doit aussi être soignée et résistante car elle est toujours l'élément le plus sollicité du microscope et peut être, parfois motorisée . • LA TOURELLE : Elle reçoit les objectifs. Sa capacité peut varier selon les modes d'observation. Dans certains cas elle peut être centrable et dans d'autres cas motorisée. • L'ILLUMINATEUR : Utilisé pour l'épiscopie. Il permet d'amener la lumière sur l'échantillon dans les meilleures conditions possibles. Il comporte un ou deux diaphragmes. • LE CONDENSEUR : Utilisé pour la diascopie. Comme l'illuminateur il sert à éclairer l'échantillon. Son bon réglage est très important. Ses caractéristiques sont liées au mode d'observation (fond clair, fond noir, contraste de phase, etc....) • LE TUBE D'OBSERVATION : Fixe ou orientable. Il est binoculaire ou trinoculaire (pour la microphotographie). Il reçoit les oculaires • L'OBJECTIF : L'élément essentiel pour le résultat final. • • • • Son rôle est de collecter un maximum de lumière à partir de l ’objet et de former une image réelle de haute qualité. Il peut y avoir, de cinq à vingt lentilles dans un seul objectif. Son grossissement peut varier de 1,25 à 250 fois. Un même microscope peut recevoir plusieurs centaines d'objectifs différents . Le choix se fait en fonction du mode d'observation, du grossissement, de l'ouverture numérique, de la distance frontale et aussi du prix. • LE DIAPHRAGME DE CHAMP : Situé dans l ’illuminateur (en épiscopie) ou à la base du statif (en diascopie) il permets de cerner le champ éclairé sur l ’échantillon. • LE DIAPHRAGME D'OUVERTURE : Situé sur l'illuminateur en épiscopie ou sur le condenseur en diascopie. Son ajustement est lié à l'objectif utilisé et est TRES IMPORTANT pour obtenir une bonne image. Il permet de compenser le manque de profondeur de champ de certains objectifs. Il est aussi à signaler que certains objectifs intègrent un diaphragme à iris assimilable à un diaphragme d'ouverture. Les Oculaires • LES OCULAIRES : Ils se montent sur le tube d'observation. Ils • • • • • permettent l'exploitation de l'image Caractéristiques Grandissement de 8 à 20 fois. Indice de champ. Porteur de lunette Réticule CHAMP OBSERVE • Le champ observé dépend de l’indice de champ de l’oculaire (diamètre exprimé en mm) divisé par le grossissement de l’objectif. • Ex Occ 10X/20 OBJECTIF 100X • Diamètre observé 20mm/100 = 0,02 mm • NB Comme la surface d’un cercle est égale au carré du rayon par Pi • Occ 10/20 = 314 mm2 • Occ 10/22 = 380 mm2 (121%) Réticules • On peut insérer dans l’oculaire des disques • Permettant de visualiser une échelle par exemple Ce que tout bon microscopiste doit connaître Pour une bonne image le réglage de Koehler • • • • • Réglage de Koehler (transmission) Mettre au point avec un objectif à faible grossissement (10X) Fermer le diaphragme de champs (sur la statif) Modifier la hauteur du condenseur pour qu’image du diaphragme soit le plus petit et la plus net possible Modifier latéralement le condenseur pour que l’image du diaphragme coïncide avec le champs des oculaires • A/préparation nette • B/remonter le condenseur puis le centrer • C/diaphragme bords nets et concentrique avec le champ observé • D/Ouvrir complètement le diaphragme En réflexion • On centre les diaphragmes de champs et d’ouverture Du bon usage du diaphragme d’ouverture • Diaphragme trop ouvert : image plate • Diaphragme trop fermé : trop de réfringence • Le bon réglage : O.N. condenseur = 80% O.N. objectif • Concrètement fermé de diaphragme jusqu’à un début de perte de luminosité. Réglage des anneaux de phase • • • • • Le réglage de Koehler effectué Pour chaque objectif PH mettre l’anneau de phase du condenseur correspondant( même numéros) Après avoir fait la mise au point sur la préparation, visualiser avec la lunette de centrage les 2 anneaux (sombre et clair) et centrer l’anneau du condenseur pour que des deux anneaux soient concentriques. Répété l’opération pour chaque objectif phase L ACQUISITION D’IMAGES Depuis la révolution de la photo numérique, les techniques traditionnelles photo argentiques et polaroid sont en perte de vitesse. Image Virtuelle • L’image captée sur le capteur est l’image réelle multipliée • Grossissement objectif • Grossissement de l’oculaire ou projectif • L’image acquise est une projection de l’image réel LES NOTIONS DE BASE Le capteur est à la base de tout système d’imagerie numérique. • PRINCIPE DE BASE : Un capteur peut être comparé à une grille composée de minuscules carrés sensibles à la lumière que l’on appelle photosites. Quand un photosite est exposé à la lumière, il change de valeur électrique. La grille complète est lue d’abord par ligne puis par colonne pour mémoriser une image noir et blanc. Pour obtenir de la couleur il faut, au minimum, trois informations par « point image » (un rouge, un vert et un bleu) En fait, pour chaque pixel, il y a quatre photosites pour compenser le manque de sensibilité au vert du silicium. Conséquence : La nécessité d’une miniaturisation extrême. Un capteur de 5 mégapixels supporte 20 millions de photosites. • DEUX TYPES DE CAPTEURS sont couramment utilisés : Le CCD et le Cmos. Le CCD est le plus récent avec deux filtres vert différents pour améliorer le rendu de certaines teintes. Il est le plus sensible Le Cmos, au départ réservé aux webcams car de qualité moindre, est utilisée pour un usage générale. • Pour un usage générale ont utilise un seul capteur, mais pour un meilleur rendu des couleurs il existe des caméras à 3 capteurs (tri CCD) Les tailles de capteur Caméra Les capteurs sont définis par la taille de leur diagonale en pouce Reflex Numériques Capteur de grande taille • BRUIT ELECTRONIQUE ET SENSIBILITE : Plus les capteurs sont de petites tailles, plus les photosites sont minuscules Ils reçoivent peu de lumière. Il faut donc amplifier le signal mais au delà d’un certain seuil il apparaît un bruit électronique (comme pour le son) qui vient détériorer l’image. Pour éviter le bruit électronique et augmenter la sensibilité d’un appareil photo ou d’une caméra il faut donc prendre un capteur plus grand, ne pas lui demander une grande définition et le refroidir. (les capteurs sont plus sensibles par basse température.) • NOMBRE DE PIXELS : • Ce nombre va directement influencer la définition de l’image. Il est donc important d’avoir un grand nombre de pixels mais la qualité des optiques utilisée, la taille des capteurs et la sophistication des circuits qui traitent les données influencent aussi le résultat final. (codage couleur en 24 bits pour avoir un excellent rendu.) Codage couleur BIT • Le codage des niveaux d’intensité de lumière n’est pas linéaire mais par pallier. • Par ex une caméra 2 bit ne restitue que 4 niveaux d’intensité. Filtre de Bayer • Une image couleur est l’addition de 3 fichiers images • Une Rouge • Une verte • Une Bleu REFROIDISSEMENT • Les capteurs sont plus sensible à basse température. • L’électronique d’un caméra chauffe, cette échauffement provoque des sauts électroniques qui provoquent des « faux photons » • Sur des temps d’exposition long on additionne les images mais on accumule aussi ce bruit de fond. • On peut classer les caméras sur 3 niveaux. • Caméra non refroidie pour usage générale. • Caméra rafraîchie (-10° T Ambiante) pour faible luminosité. • Camera refroidie (T°inf. 3°) pour très faible luminosité. Effet de la T° sur le bruit de fond Une fois l’image obtenue, il reste à la transférer et à la stocker sur un ordinateur. • COMMUNICATION : • Analogique ancienne norme (télévision) • Numérique USB2 et les ports « Firewire » (ou IEEE1394.) Dans les deux cas il s’agit d’un transfert à haut débit (environ 400Mb/s) • STOCKAGE : De multiples « formats images » existent Les deux plus répandus sont le « TIF » et le « JPEG » Les logiciels ont souvent des formats dédiés pouvant aussi conserver des informations complémentaires comme barre d’échelle, grandissement ou commentaires. CHOIX D’UNE CAMERA OU D’UN APPAREIL PHOTOGRAPHIQUE NUMERIQUE POUR EQUIPER UN MICROSCOPE Plusieurs questions sont à poser : Le microscope et le type d'observation : -le quantité de lumière -le grossissement -l'usage de la photo (illustration compte rendu ou poster) Grossissement ou champ observé -détermine le choix du capteur et du projectif Visualisation (caméra) ou qualité de la photo (reflex) Objet mobile ou immobile N/B ou couleur et rendu des couleurs EXEMPLE : Diagramme présentant toutes les possibilités de raccordement pour équiper un seul microscope d ’une caméra vidéo ou d ’un appareil photographique numérique ADAPTATEURS VIDEO U-TV 1x U-TV 0,5x U-TV 0,25x PE 2,5x + U-PMTVC PE 3,3x (0,3x) PE 4x PE 5x GROSSISSEMENT INDICE (en mm.) SELON LES DIMENSIONS DES CAPTEURS CCD DES CAMERAS ET APPAREILS NUMERIQUES 2/3 1/2 1/3 1x 11 8 5,5 0,5 x 22 16 11 0,25 x / / 22 0,75 x 14,7 10,7 7,35 1x 11 8 5,5 1,2 x 9,2 6,7 4,6 1,5 x 7,3 5,3 3,65 • 3° ELEMENT : • Le nombre de pixels nécessaire pour bénéficier pleinement de la résolution du microscope. Il va dépendre du grossissement et de la résolution de l’objectif, de la dimension du capteur et du grandissement du projectif vidéo. La formule est la suivante : • NP=[1000 /(R x Go)] x Gv x Dc x 3 NP= Nombre de pixels R= Résolution de l’objectif en micron Go= Grossissement de l’objectif Gv= Grandissement de la sortie vidéo Dc= Dimension du capteur en millimètres (longueur ou largeur.) 3= Coefficient communément admis et qui correspond au nombre minimum de pixels pour visualiser une ligne. TABLEAU RECAPITULATIF DU NOMBRE DE PIXELS NECESSAIRE POUR QUELQUES OBJECTIFS Objectif Résolution (microns) GRANDISSEMENT VIDEO = 1 FOIS Capteur ½ pouce Capteur 2/3pouce (Diagonale 6mm.) (diagonale 11mm.) Larg. 6,4mm. Haut. 4,8mm. Larg. 8,8mm. Haut. 6,6mm. U.PL.APO.2 U.PL.FL.4 U.M.PL.5 U.PL.10 U.PL.FL.20 L.MPLFL.20 U.PL.FL.40 U.PL.50 UMPL.FL100 U.PL.apo.100 4,19 2,58 3,36 1,34 0,67 0,84 0,45 0,37 0,35 0,24 2291 1860 1143 1433 1433 1143 1067 1038 549 800 1718 1395 857 1075 1075 857 800 778 412 600 3151 2558 1572 1970 1970 1572 1467 1427 755 1100 2363 1919 1179 1478 1478 1179 1100 1070 566 825 La course aux pixels • Les fabricants proposent des caméras de plus en plus sophistiqués allant jusqu’à 20 millions de pixels. • Quelques remarques • 1/ Comme on vient de le voir les systèmes optiques ont des limites physiques • 2/ La taille des fichiers à exporter et à stocker sont proportionnels aux nombres de pixels • 3/ Les écrans informatiques et les disques dures ont aussi des limites physiques. QUELQUES CONSEILS PRATIQUES POUR UNE BONNE ACQUISITION • D’abord avoir un microscope bien réglé et des optiques propres. • Deuxièmement utilisé les bon filtres • Filtre lumière de jour, éventuellement filtre neutre. • Régler correctement l’intensité de sa lampe (en générale 80% de l’intenté maximale) • Comme nous l’avons vu au début une lampe halogène à son spectre qui varie suivant la tension exercée. Une des erreurs les plus classiques est de travailler en sous tension. Les principaux problèmes • • • • En microphotographie trois problèmes Balance des blancs Temps d’exposition Rendu des couleurs Balance des blancs • Il faut régler le gain des 3 canaux RGB • Pour certaine application il fonctionne mal (PH.DF.POL.DIC.FLUO) • Dans ce cas en manuel se positionner sur une partie blanche de la préparation et valider le blanc caméra ou faire un blanc préalable sur un support blanc Temps d’exposition • Sur une lame fortement contrastée commen en contraste de phase, en fond noir, en fluorescence le temps d’exposition automatique ne fonctionne pas. • Il faut positionner la mesure du temps d'exposition sur une partie colorée de la préparation et valider le temps ou faire un réglage manuel. Rendu des Couleurs • Réglages des gamma permet de régler la couleur moyenne • Réglages de la saturation permet de régler l’intensité maximales des couleurs • Réglages du contraste permet de régler la dynamique entre les noirs et les blancs • On peut aussi régler l’intensification des canaux RGB. • A manier avec précaution
