maladies dues aux virus hendra et nipah

1344 Manuel terrestre de l’OIE 2008
CHAPITRE 2.9.6.
MALADIES DUES AUX VIRUS HENDRA ET NIPAH
RÉSUMÉ
Le virus Hendra (HeV) et le virus Nipah (NiV) ont émergé durant la dernière décennie du 20e siècle
en tant qu’agents responsables d’épidémies de maladie respiratoire et neurologique qui infectent
plusieurs espèces animales. En 1994, le HeV causait une maladie respiratoire sévère et la mort de
13 chevaux et d’un entraîneur de chevaux dans une écurie à Brisbane en Australie. Entre
septembre 1998 et avril 1999, après dissémination d’une infection respiratoire ou encéphalitique
non reconnue chez des porcs en Malaisie, le NiV est apparu dans la population humaine locale
comme une cause d’encéphalite mortelle. HeV a entraîné la mort de 2 personnes tandis que 400
cas humains de NiV ont été signalés ayant entraîné environ 200 décès, en Malaisie, à Singapour,
au Bengladesh et en Inde. Les chauves-souris frugivores (« flying foxes ») du genre Pteropus sont
les hôtes naturels des deux virus.
L’infection au HeV chez le cheval est caractérisée par une fièvre importante, de la sudation faciale,
des difficultés respiratoires sévères et, enfin, un jetage nasal abondant et mousseux. Quelques
chevaux présentent des signes neurologiques. Les observations post mortem les plus fréquentes
sont la dilatation des vaisseaux lymphatiques pulmonaires, un œdème pulmonaire sévère et de la
congestion. La lésion sous-jacente est une dégénérescence généralisée des petits vaisseaux
sanguins dans beaucoup d’organes. Des syncytiums de cellules endothéliales contenant de
l’antigène viral sont fréquemment observés dans les capillaires et les artérioles. L’infection des
chevaux par le HeV n’est pas toujours fatale et certains chevaux manifestant des signes cliniques
peuvent survivre à l’infection. Des expériences de transmission en laboratoire ont montré que le
HeV n’est pas facilement transmis entre chevaux. Ce résultat correspond à l’observation faite au
cours de l’épizootie d’origine où l’infection ne s’était pas disséminée largement aux chevaux des
propriétés voisines.
L’infection par le NiV des porcs est fortement contagieuse, mais elle n’a pas été identifiée
initialement comme une nouvelle maladie parce que la morbidité et la mortalité n’étaient pas
marquées et que les signes cliniques n’étaient pas significativement différents des autres maladies
porcines connues. Les observations faites durant l’investigation de l’épizootie et durant des
infections expérimentales confirment que l’infection des porcs par le NiV est caractérisée par de la
fièvre avec atteinte du système respiratoire. Chez les animaux qui extériorisent la maladie ; les
signes nerveux ont été fréquemment décrits mais de nombreuses infections passent inaperçues.
Certains animaux infectés présentent une toux sèche inhabituelle. De l’avortement est décrit chez
les truies. Des lésions immunohistochimiques sont visibles sur le système respiratoire (trachéite,
bronchite et pneumonie interstitielle) et/ou le cerveau des animaux infectés. Des syncytiums
cellulaires contenant de l’antigène viral sont observés dans les petits vaisseaux sanguins, les
vaisseaux lymphatiques et l’épithélium respiratoire.
Les deux virus peuvent atteindre les animaux de compagnie. Le HeV cause des maladies
respiratoires chez le chat semblables à celles observées chez les chevaux. L’infection naturelle des
chiens avec le NiV cause un syndrome semblable à la maladie de Carré avec un taux de mortalité
élevé ; des arguments sérologiques existent qui laissent à penser que certains chiens survivent à
l’infection. Expérimentalement, le NiV cause une maladie similaire au HeV chez les chats. Les
syncytiums de cellules endothéliales contenant de l’antigène viral ont été observés dans des
infections par le HeV et le NiV chez le chat et dans des infections par le NiV chez les chiens.
Les hommes contractent l’infection par contact direct, habituellement plutôt à partir d’un hôte
amplificateur (le porc pour le NiV et les chevaux pour le HeV) que directement à partir de l’hôte
réservoir. Néanmoins, les recherches sur les foyers humains à NiV au Bengladesh ont montré que

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les hommes pouvaient s’infecter à partir des chauves-souris Pteropid. La transmission d’homme à
homme n’a pas été observée ni avec le HeV ni avec le NiV en Malaisie ou à Singapour, mais une
transmission d’homme à homme est suspectée dans les récents foyers d’infection par le NiV au
Bangladesh.
Le HeV et le NiV sont des membres très proches de la famille des Paramyxoviridae. Les
différences entre eux et les autres membres de la famille ont conduit à leur classification dans un
nouveau genre : les Henipavirus, dans la sous famille des Paramyxovirinae. Le HeV et le NiV sont
des agents de niveau 4 de biosécurité. Il est important que les échantillons provenant d’animaux
suspects soient uniquement transportés vers des laboratoires autorisés sous conditions de sécurité
biologique en accord avec des réglementations internationales.
Identification de l’agent pathogène : le HeV et le NiV peuvent être propagés sur une série de
lignées cellulaires. L’isolement du virus à partir d’échantillon de terrain peut être tenté, mais
seulement en situation où la sécurité de l’opérateur peut être assurée. Les procédures
d’identification suivent l’isolement du virus et comprennent des colorations immunohistochimiques
des cellules infectées, la neutralisation par un antisérum spécifique et la caractérisation
moléculaire. Une réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) est maintenant
disponible pour le diagnostic.
L’antigène viral est présent dans l’endothélium vasculaire, et dans le cas du NiV chez le porc on en
retrouve au niveau de l’épithélium respiratoire. Une large gamme de tissus fixés avec du formol
peut être examinée pour détecter les antigènes du HeV et de NiV. Les échantillons soumis à
l’immunohistochimie doivent inclure du cerveau (y compris les méninges), du poumon, de la rate et
du rein. Chez les animaux gestants ou en cas d’avortement, l’utérus, le placenta et les tissus
fœtaux doivent être inclus. Les échantillons pour l’isolement et la détection moléculaire du virus
doivent être des tissus récemment collectés à partir des mêmes organes que ci-dessus, ou de
l’urine ou des écouvillonnages nasaux.
Épreuves sérologiques : les tests de séroneutralisation virale (SN) et immuno-enzymatiques
(ELISA) sont disponibles. Le test de SN est couramment considéré comme la méthode de
référence. Les antisérums dirigés contre HeV et NiV ne présentent de la neutralisation croisée que
jusqu’à un certain degré. Aussi une simple SN utilisant l’un des deux virus ne donne pas une
identification définitive de la spécificité des anticorps. Les anticorps neutralisants envers le HeV et
le NiV peuvent être différenciés par leur plus grande capacité à neutraliser le virus homologue que
le virus hétérologue. Ceci ne devrait pas être un obstacle majeur en situation épidémique où l’agent
causal est connu, mais les échantillons de sérum provenant de cas suspects ou provenant de
région du monde autre que l’Australie et la Malaisie doivent être soumis à des tests de VNT avec
les deux virus, HeV et NiV. L’apparenté sérologique entre le HeV et le NiV assure que l’ELISA
utilisant des antigènes du HeV ou du NiV peut être utilisé pour détecter des anticorps des deux
virus.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : il
n’y a pas de vaccin actuellement disponible pour HeV et NiV.
A. INTRODUCTION
Le virus de Hendra (HeV) et le virus de Nipah (NiV) sont des virus des chauves-souris frugivores communément
connues comme « flying foxes », membres du genre Pteropus. Des anticorps contre le HeV sont trouvés chez
approximativement 50 % des 4 espèces de Pteropus australien (35). Des enquêtes sérologiques des anticorps
contre NiV ont mis en évidence des prévalences de près de 20 % chez les chauves-souris Pteropid de Malaisie
(10, 18). Des anticorps contre NiV ou contre d’éventuels virus étroitement apparentés ont été détectés chez des
chauves-souris Pteropid au Bangladesh (15), au Cambodge (24, 27), en Indonésie (29), à Madagascar (19) et en
Thaïlande (31). Le HeV a aussi été isolé de « flying foxes » australiens (12), et le NiV a été isolé à partir de
chauves-souris en Malaisie et au Cambodge (4, 27). L’ARN du NiV a été détecté par amplification en chaîne par
polymérase (PCR) dans de l’urine, de la salive et du sang de chauve-souris Pteropid en Thaïlande (30, 31).
Le HeV a émergé à Brisbane, en Australie, en septembre 1994 comme la cause d’un foyer de maladie
respiratoire aiguë qui a tué 13 chevaux et un entraîneur (22). Le virus était initialement nommé morbillivirus équin,
mais les analyses génétiques subséquentes ont indiqué qu’il ne ressemblait pas assez à un morbillivirus pour
permettre l’insertion dans ce genre. Il y a eu d’autres cas d’infection mortelle à HeV chez des chevaux au Nord du

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Queensland avec des infections humaines subséquentes. Deux chevaux ont développé une maladie aiguë et
sont morts environ 1 mois avant l’épidémie de Brisbane, mais le HeV a été incriminé seulement après l’infection
d’un propriétaire de chevaux, qui a probablement été infecté par le HeV durant l’autopsie. Il est décédé 13 mois
plus tard d’une encéphalite due au HeV (28). Un troisième cheval est mort en janvier 1999 sans maladie humaine
associée (11). Deux autres cas équins sont survenus en 2004 (l’un confirmé l’autre non) ; le cas non confirmé a
été associé à une infection humaine (13). En 2006, deux autres cas ont été signalés en Australie, un dans l’état
de Southern Queensland et l’autre dans le nord de l’état de New South Wales. Tous les foyers enregistrés depuis
1995 ont impliqué seulement un cheval au pâturage sans transmission aux animaux en contact.
Des études rétrospectives d’échantillons histologiques archivés indiquent que le NiV a causé une faible mortalité
chez les porcs de Malaisie depuis 1996, mais est resté inconnu jusqu’en 1999 lorsqu’il a été responsable d’une
épidémie d’encéphalite chez les humains qui avait commencé en 1998 (3, 23). Contrairement à la maladie
respiratoire causée par le HeV chez les chevaux qui est fréquemment fatale mais caractérisée par une faible
contagiosité (33), la maladie respiratoire causée par le NiV chez le porc était souvent subclinique mais fortement
contagieuse. Ces propriétés ont conduit à une dispersion rapide du virus à travers la population de porcs
malaisiens et ont obligé les autorités à choisir l’abattage comme le premier moyen pour contrôler la dispersion
(23). Environ un million de porcs ont été détruits ; 106 des 267 humains infectés sont morts d’encéphalite,
principalement des éleveurs de porcs en Malaisie et des employés d’abattoir à Singapour. Ces personnes avaient
des contacts directs avec les porcs vivants (3, 26).
Par la suite, de nouveaux foyers de maladie humaine due au NiV sont déclarés au Bangladesh et en Inde. Dans
les foyers de 2001 et 2003, aucun animal n’a été retrouvé comme source de l’infection humaine (15), mais des
chauves-souris Pteropid, Pteropus giganteus, étaient présentes et possédaient des anticorps capables de
neutraliser le virus Nipah. Des études séquentielles et de regroupement de cas ont montré qu’une transmission
d’homme à homme est possible mais à un faible niveau (15). Lors d’un autre foyer en 2004 au cours duquel 27
patients sont morts sur 36 infectés, des études épidémiologiques ont démontré la transmission de personne à
personne et des enquêtes sérologiques ont mis en évidence des anticorps chez les chauves-souris frugivores
présentes sur les lieux (1). La boisson de vin de palme contaminé par la salive, l’urine ou les excréments de
chauve souris frugivores a été reconnue comme une voie possible de transmission de l’infection de la faune
sauvage à l’homme (20). Au vu de ces foyers en Malaisie, à Singapore, au Bangladesh et en Inde, on estime le
nombre de cas humains du au NiV à au moins 400 cas humains, ayant occasionné la mort d’environ 200
personnes.
Au plan taxonomique, le NiV et le HeV sont considéré comme des paramyxovirus, dans la sous-famille des
Paramyxovirinae, et ont été regroupés en un nouveau genre, les henipavirus (9).
Le diagnostic d’une maladie causée par un henipavirus se fait par isolement viral, par détection de l’ARN viral
dans les échantillons cliniques, ou par détection d’antigène viral dans les échantillons de tissus prélevés à
l’autopsie (8). La détection d’anticorps spécifiques peut aussi être utile particulièrement chez les porcs où
l’infection par le NiV n’est pas remarquée. L’identification des anticorps contre le HeV chez les chevaux est moins
utile vu le taux élevé de cas mortels dans cette espèce. Il a été possible de diagnostiquer rétrospectivement par
sérologie les infections humaines dues au NiV ou au HeV. La présence d’anticorps spécifiques contre le HeV ou
le NiV, tant chez l’animal que chez l’homme, constitue un élément diagnostic significatif en raison de la rareté de
l’infection et de l’implication zoonotique grave de la transmission de l’infection.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l’agent pathogène
a) Isolement du virus et caractérisation
Le HeV et le NiV sont classés comme des agents de niveau de biosécurité 4 (BSL4), du fait qu’ils sont de
dangereux agents pathogènes pour l’homme entraînant un taux de mortalité élevé et pour lesquels il
n’existe pas de vaccin ou de traitement antiviral efficace. Le niveau BSL4 est semblable au groupe de
confinement 4 décrit dans les directives de biosécurité déterminées par l’OIE dans le Chapitre 1.1.2.,
« Biosécurité et Biosûreté au laboratoire de microbiologie vétérinaire et dans les animaleries ». Des
informations complémentaires sont également mentionnées dans ce chapitre. Cependant, en raison du
risque important d’infection humaine dans le laboratoire, les conditions BSL4 surpassent les conditions de
confinement de niveau 4 de l’OIE. L’isolement du virus facilite fortement les procédures d’identification. Le
diagnostic définitif ne devrait être réalisé que lorsque la sécurité de l’opérateur peut être garantie.
L’isolement est spécialement pertinent dans tout nouveau cas ou nouvelle épidémie, particulièrement dans
les pays ou les régions géographiques où l’infection par le HeV ou le NiV n’a pas été documentée
auparavant. La preuve que les espèces sauvages agissent comme hôtes naturels du virus demande soit

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une réponse sérologique positive, soit l’identification positive par PCR, soit l’isolement à partir d’animaux
capturés (7).
i) Échantillonnage et traitement des échantillons
Les échantillons pour le diagnostic doivent être envoyés vers un laboratoire agréé dans des containers
spéciaux. Selon l’association internationale de transport aérien (IATA), la réglementation pour les
marchandises dangereuses (DGR, Dangerous Goods Regulations) doit être respectée pour l’envoi
d’échantillons provenant d’une maladie zoonotique suspecte (17). Les conditions sont résumées dans
le Chapitre 1.1.1., « Prélèvement et expédition des échantillons pour le diagnostic ».
Les tissus produisant du virus dans les cas naturels et expérimentaux ont été résumés (6). Le cerveau,
le poumon, le rein et la rate doivent toujours être envoyés. Les échantillons doivent être transportés sur
de la glace ou à 4 °C s’ils peuvent arriver au laboratoire dans les 48 h suivant la collecte. Si le temps
de transport est supérieur, les échantillons seront envoyés congelés sur carboglace ou dans des
vapeurs d’azote liquide. Ils ne doivent pas être maintenus à –20 °C pendant une longue période.
ii) Isolement en culture de cellules
La propagation du virus doit être conduite sous conditions de biosécurité de niveau 4. Le respect strict
de cette condition limite les possibilités d’analyse d’échantillons à diagnostiquer quand la présence de
HeV ou NiV peut être suspectée. Dès lors, l’isolement du virus à partir d’échantillons suspects peut
être conduit si nécessaire sous conditions de biosécurité de niveau 3. Cependant, si ceci est tenté, des
directives locales rigoureuses doivent être respectées pour assurer la sécurité de l’opérateur et
appliquées si un « paramyxovirus-like » à effet cytopathogène (ECP) se développe dans les cultures
infectées. De telles directives seront en accord avec les bonnes pratiques de laboratoire, et l’utilisation
soit d’enceinte de sécurité biologique de classe II avec des combinaisons appropriées pour le
personnel, soit d’enceinte de sécurité biologique de classe III. Il faut exiger une fixation à l’acétone des
cellules infectées, pour détruire le virus infectieux, et pour ensuite permettre la détection par
immunofluorescence des antigènes d’Henipavirus. Le milieu de culture provenant de cellules positives
au Henipavirus doit être transféré dans un laboratoire de biosécurité de niveau 4.
Au laboratoire receveur, les tissus sont manipulés en conditions stériles, et des suspensions à
10 % (w/v) sont générées en broyant les tissus dans un système d’homogénéisation fermé, par
exemple un stomacher/mélangeur utilisant un récipient en plastique ou un mélangeur broyeur utilisant
des billes d’acier autoclavables dans des cylindres métalliques fermés. Toutes les manipulations
doivent être réalisées dans des enceintes de sécurité biologique de classe III ou de classe II si le
personnel est protégé de façon appropriée, le stomacher et les pots de centrifugation étant remplis et
vidés dans l’enceinte. Ensuite, après clarification de l’homogénat par centrifugation à 300 g, le
surnageant est ajouté à une culture de cellules en monocouche. L’isolement du virus est facilité par le
fait que les HeV et NiV se multiplient rapidement à haut titre en culture de cellules. Les cellules rénales
de singe vert africain (Vero) et de lapin (RK-13) sont particulièrement sensibles. Le HeV se réplique
aussi sur cerveau de souriceau non sevré et sur œufs embryonnés. Bien que le premier soit une
méthode valable pour l’isolement primaire, il n’y a pas de données sur la sensibilité relative des
systèmes in vivo. La sensibilité de l’isolement en culture de cellules a, quant à elle, été testée. Un ECP
se développe habituellement en 3 jours, mais un deuxième passage après 5 jours est recommandé
avant de déclarer un échantillon négatif. En condition de faible multiplicité d’infection, l’ECP est
caractérisé par la formation de syncytiums qui peuvent, après 24 à 48 h, contenir 60 noyaux ou plus.
Les syncytiums formés par le NiV sur les monocouches de cellules Vero sont significativement plus
grands que ceux induits par le HeV pendant le même délai. La distribution des noyaux dans les
syncytiums induits par le NiV au début de l’infection ressemble à celle induite par le HeV, avec les
noyaux agglomérés au centre du syncytium. Ensuite, les noyaux dans les syncytiums mûrs induits par
le NiV sont distribués au pourtour de la cellule géante (16).
iii) Méthodes d’identification
• Coloration immunologique des cellules fixées
La vitesse avec laquelle le HeV et le NiV se réplique et la forte concentration d’antigène viral générée
dans les cellules infectées fait de l’immunofluorescence une méthode de choix pour identifier
rapidement la présence d’Henipavirus par l’utilisation des sérums anti-NiV ou anti-HeV. A l’heure
actuelle, le genre Henipavirus ne comprend que le HeV et le NiV et il n’y a pas d’autre virus
antigéniquement semblable connu.
La réaction sérologique croisée entre les HeV et NiV signifie qu’un antisérum polyclonal envers l’un et
l’autre virus ou un antisérum mono-spécifique contre des protéines individuelles de l’un et de l’autre
virus, ne peut pas faire la différence entre le HeV et le NiV. Des anticorps monoclonaux (AcM) ont été
générés et testés pour remplir cette fonction dans l’identification primaire du virus lors d’isolement. Ces
AcMs sont aussi utilisés pour des examens immunohistochimiques de tissus provenant de cas
suspects.

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• Protocole
En condition de biosécurité L4, les monocouches de cellules Vero ou RK-13 qui ont été cultivées sur
des lames couvre-objet en verre ou sur une plaque sont infectées avec le virus isolé. Les
monocouches sont analysées pour détecter la présence de syncytium après incubation de 24 à 48 h à
37 °C. Il est recommandé qu’une série de dilution virale (non dilué, 1/10, 1/100) soit testée car les
syncytiums sont plus facilement observés après infection à faible multiplicité. Une fois que les
syncytiums sont détectés, les cellules infectées sont fixées par immersion dans un récipient d’acétone.
Le récipient est fermé hermétiquement et la surface externe est stérilisée avant de déplacer le
prélèvement vers un endroit du laboratoire moins sécurisé, par exemple de niveau L2, où les plaques
sont séchées à l’air. L’antigène viral est mis en évidence par un antisérum anti-HeV ou anti-NiV et
suivant les procédures normalisées d’immunofluorescence. Une caractéristique des syncytiums induits
par les Henipavirus est la présence de grandes structures polygonales contenant l’antigène viral. Cela
est plus facilement observé avec des anticorps monospécifiques et des AcMs dirigés contre la protéine
de la nucléocapside N et de la phosphoprotéine P.
• Immuno-microscopie électronique
Le titre élevé généré par les HeV et NiV dans les cellules in vitro permet leur visualisation dans le
milieu de culture par microscopie électronique en contraste de phase négatif sans étape de
concentration par centrifugation. La détection de complexes virus-anticorps par immuno-microscopie
électronique fournit des informations précieuses sur la structure du virus et la réactivité antigénique,
même durant le premier isolement du virus. D’autres techniques ultrastructurales sont possibles. La
culture cellulaire sur grille peut être réalisée (13). Dans cette technique, les cellules sont cultivées,
infectées et visualisées sur des grilles au microscope électronique. Il est aussi possible d’identifier la
réplication des virus et des corps d’inclusion dans des coupes ultrafines de cultures cellulaire fixées. Le
détail de ces techniques et leur application dans la détection et l’analyse des HeV et NiV ont été
décrits (16).
b) Test de séroneutralisation virale : différenciation entre HeV et NiV
Les tests de neutralisation reposent sur des méthodes de quantification. Trois procédures sont disponibles
pour titrer les HeV et NiV. Dans les méthodes de plages et de microtitrage traditionnelles, le titre est calculé
respectivement par la technique des unités formant plages (UFP) et par la dose infectieuse capable de
causer un ECP dans 50 % des puits inoculés (DICT50). Dans une procédure alternative, les virus sont titrés
sur des monocouches de cellules Vero dans des plaques de 96 puits. Après 18 à 24 h, les foyers d’infection
sont détectés immunologiquement sur les cellules fixées à l’acétone en utilisant un sérum anti-viral (5). Le
titre viral est exprimé comme une unité formant un foyer (UFF)/ml.
Les tests de séroneutralisation utilisant ces 3 méthodes sont décrits plus loin. Un isolat viral qui réagit avec
un antisérum anti-HeV et/ou anti-NiV dans un test d’immunofluorescence est considéré comme
sérologiquement identique à l’un et l’autre HeV ou NiV s’il présente la même sensibilité à la neutralisation
par un antisérum anti-HeV et anti-NiV. L’antisérum anti-HeV neutralise le HeV à une dilution généralement
4 fois plus grande que celle qui neutralise le NiV. Réciproquement, l’antisérum anti-NiV neutralise le NiV
approximativement 4 fois plus efficacement que le HeV (3). Les techniques de titrage du virus doivent être
réalisées dans des conditions de confinement de niveau 4 (BSL 4). Une nouvelle version du test de
séroneutralisation différentielle a été décrite récemment qui évite la manipulation de virus infectieux par
l’emploi de microbilles liées à l’éphrine-B2 (2). Bien que ce test doive encore être validé formellement, il
apparaît d’ores et déjà comme un outil de criblage utile dans les pays qui ne possèdent pas de structures de
confinement de niveau 4.
i) Réduction du nombre de plages
Les stocks de HeV et NiV et les échantillons d’Henipavirus non identifiés sont dilués dans un milieu.
Les réplicats de chaque virus contenant approximativement 100 UFP dans 50 à 100 μl sont mélangés
avec un volume égal constitué soit d’un milieu minimum essentiel de Eagle (EMEM), soit d’une série
de dilutions d’antisérum anti-HeV ou anti-NiV dans du EMEM. Les mélanges virus-antisérum sont
incubés à 37 °C pendant 45 min. Après cette incubation, les mélanges virus-dilutions sériques sont
adsorbés sur des monocouches de cellules Vero à 37 °C pendant 45 min. Le nombre de plages est
déterminé par des méthodes traditionnelles de plages après incubation à 37 °C pendant 3 jours.
ii) Neutralisation par microtitrage
Les HeV et NiV de stock et les échantillons d’Henipavirus non identifiés sont dilués de manière à
obtenir des réplicats de chaque virus contenant approximativement 100 UFP dans 50 à 100 μl. Ces
suspensions virales sont déposées dans des puits tests d’une plaque microtitre de 96 puits à fond plat.
Les suspensions virales sont mélangées avec un volume égal de EMEM ou une série de dilutions
d’antisérum anti-HeV ou anti-NiV dans du EMEM. Les mélanges sont incubés à 37 °C pendant 45 min.
Après cette incubation, on ajoute environ 2,4 × 104 cellules à chaque puits pour atteindre un volume