Résistance du Cytomégalovirus aux antiviraux

Résistance du Cytomégalovirus aux antiviraux
Sophie Alain
Sébastien Cotin
Sébastien Hantz
Service de bactériologie-
virologie-hygiène, CHU de Limoges,
Centre national de référence
des cytomégalovirus, EA3175,
Faculté de médecine de Limoges
<[email protected]>
Résumé. La résistance du cytomégalovirus aux antiviraux est un véritable
problème en transplantation, mais aussi chez d’autres patients immuno-
déprimés, conduisant parfois à l’impasse thérapeutique. Elle concerne près de
5 % des patients receveurs d’organe ou de cellules souches hématopoïétiques,
et représente un facteur d’évolution défavorable après greffe. Elle est la consé-
quence de l’usage intensif, en prévention ou en traitement prolongé, sur un
terrain favorable à la réplication virale, des molécules disponibles. Ces molé-
cules sont le ganciclovir et sa prodrogue le valganciclovir, le cidofovir et le
foscarnet, qui toutes ciblent l’ADN polymérase virale. La détection des sou-
ches résistantes, indiquée lorsque la réplication virale persiste au-delà de trois
semaines, repose sur le phénotype qui nécessite l’isolement de la souche, et le
génotype, qui correspond à la détection des mutations responsables de résis-
tance, le plus souvent par séquençage des gènes concernés : UL97 et UL54.
Les mutations de UL97 sont les premières à apparaître et confèrent une résis-
tance au ganciclovir. Les mutations de UL54, plus tardives, peuvent conduire à
une résistance croisée au ganciclovir et au cidofovir, à une résistance au fos-
carnet ou à une résistance croisée aux trois antiviraux. L’ajustement des doses
d’antiviral, disponible pour le ganciclovir, la réduction de l’immunosuppres-
sion, le changement d’antiviral voire l’utilisation de nouveaux antiviraux gui-
dée par le génotype et le phénotype sont associés dans la prise en charge des
patients en cas de résistance.
Mots clés
: cytomégalovirus, résistance, antiviraux, kinase UL97, polymérase
Abstract. Antiviral resistance of cytomegalovirus strains is a growing problem
in the transplant setting as it can concern 5% of patients with CMV replication.
It is a consequence of the intensive and prolonged use of the three clinically
approved inhibitors of the viral polymerase UL54, ganciclovir cidofovir and
foscarnet. Resistance to ganciclovir can result from either mutations of the
UL97 kinase, dispensable for its activation, which may appear within one
month of therapy, or later from mutations in the UL54 viral polymerase, that
can confer resistance to all antivirals. Screening for resistance is based on
genotyping from clinical sample or isolates, and has to be associated whenever
isolates are obtained to phenotype to evaluate the fitness of the virus and to test
new drugs in the pipeline. Plasmatic dosage of the molecules, available for
ganciclovir, reduction of immunosuppression, and if necessary modification
of the antiviral regimen guided by genotype and/or phenotype are associated
to control CMV infection in case of resistance.
Key words
: cytomegalovirus, resistance, antiviral therapy, UL97 kinase,
polymerase
Virologie 2009, 13 (4) : 215-22
doi: 10.1684/vir.2009.0263 Tirés à part : S. Alain
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Introduction
Le cytomégalovirus est un bêta herpesvirus ubiquitaire, qui
infecte 40 à 60 % de la population française, et persiste
sous forme latente après la primo-infection. La gravité
des infections à CMV au cours du sida, après transplanta-
tion d’organe ou de cellules souches hématopoïétiques, et
au cours de toute pathologie nécessitant ou entraînant une
immunodépression cellulaire importante (lymphome, corti-
cothérapie prolongée) justifie l’utilisation de traitements
antiviraux, curatifs et préventifs. Chez ces patients immu-
nodéprimés, l’émergence de souches résistantes est une
préoccupation, du fait de l’exposition prolongée ou répétée
aux antiviraux, de charges virales parfois élevées ou persis-
tant à faible taux de manière prolongée sous traitement, et
de la difficulté de maintenir des doses efficaces d’anti-
viraux, en raison de leur toxicité hématologique ou
néphrologique.
Les antiviraux actuellement disponibles en pratique
clinique sont peu nombreux. Le ganciclovir (GCV) et sa
prodrogue orale le valganciclovir (VGCV), le cidofovir
(CDV), et le foscarnet (PFA) inhibent l’ADN polymérase
virale UL54 (figure 1). Le GCV (et donc le VGCV) dépend
pour son activation d’une phosphorylation par la kinase
virale, UL97. Le cidofovir nucléotide monophosphate et
le PFA analogue du pyrophosphate, inhibent directement
la polymérase virale. L’aciclovir (ACV), molécule voisine
du GCV et également phosphorylée par UL97 est très effi-
cace sur les Herpes simplex virus mais 40 fois moins active
que le GCV sur le CMV. La prodrogue de l’ACV, le vala-
ciclovir (VCV) est de ce fait réservée à la prophylaxie de la
maladie à CMV. Le maribavir (MBV) est un nouvel anti-
CMV, actif sur la réplication virale mais aussi sur les étapes
tardives du cycle viral par inhibition directe de la kinase
virale UL97 [1, 2]. Outre son rôle d’effecteur fortuit du
GCV, cette kinase ubiquitaire phosphoryle de nombreux
Valaciclovir
(VCV)
Valganciclovir
(Val-GCV)
Aciclovir
(ACV)
O
O
N
NNN
N
N
N
O
O
O
OH
O
P
HO OH
H
NNOOH
H2N
H2N
NH2
CH2
O–
P
O
O
O–
CH2
HN
ACV-P
ACV-PPP
GCV-P
GCV-PPP CDV-PP PFA
ADN polymérase UL54
Prodrogues
Ganciclovir
(GCV)
UL97
Kinases
cellulaires
Kinases
cellulaires
Cidofovir
(CDV)
Foscarnet
(PFA)
Figure 1. Mécanisme d’action des inhibiteurs de la polymérase.
Toutes ces molécules ont pour cible la polymérase virale UL54. Les analogues de base, ganciclovir, aciclovir et cidofovir, sont des inhi-
biteurs compétitifs de l’incorporation des désoxynucléotides triphosphates et se fixent au niveau du site d’incorporation. Ils sont actifs
sous forme triphosphate. Le ganciclovir, comme l’aciclovir, dépend pour son activation, d’une première phosphorylation par la phospho-
transférase virale UL97. Les phosphorylations ultérieures sont prises en charge par des enzymes cellulaires. Les mutations de la phos-
photransférase UL97 représentent donc la première ligne de résistance à ces molécules. Le cidofovir, est un analogue nucléotidique
monophosphaté, ne dépendant pas de UL97 pour son activité. Le foscarnet, analogue de pyrophosphate inhibe directement la polymé-
rase en bloquant la libération des molécules de pyrophosphate. La résistance de première ligne à ces deux molécules est donc portée
par la polymérase. Les mutations de la polymérase peuvent ainsi, selon leur localisation, conférer une résistance au ganciclovir et à
l’aciclovir, le plus souvent croisée avec la résistance au cidofovir, ou au foscarnet. L’association de plusieurs mutations peut conférer
une résistance à tous les antiviraux disponibles. Le valaciclovir et le valganciclovir, prodrogues de l’aciclovir et du ganciclovir, suivent le
même mécanisme d’action après libération de la molécule de valyl-ester.
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substrats cellulaires et viraux, notamment des facteurs de
régulation du cycle cellulaire, mais surtout la protéine
accessoire (UL44) de la polymérase virale UL54, les pro-
téines associées à la membrane nucléaire, p32, lamine A et
lamine B, permettant ainsi la sortie des nucléocapsides vers
le cytoplasme, et la protéine pp65 (UL83) du CMV, empê-
chant l’agrégation intranucléaire des protéines du tégument
[3-6]. Le mécanisme d’action présumé du MBV est le blo-
cage de l’incorporation de l’ATP dans le site catalytique de
la kinase (figure 2). Sa biodisponibilité son absence de toxi-
cité (limitée à des altérations du goût) [7, 8], et son activité
antivirale in vitro en font une alternative séduisante aux
inhibiteurs de la polymérase. Les premières études clini-
ques montrent que le MBV réduit la réplication du CMV
chez les patients infectés par le virus de l’immunodéfi-
cience humaine (VIH) [8] Son efficacité en prophylaxie
après greffe de cellules souches hématopoïétiques, suggé-
rée par l’étude de phase II, doit être confirmée [7, 9].
Le maribavir n’est donc pas disponible en pratique clinique
à ce jour. D’autres molécules inhibant l’encapsidation et/ou
le clivage des concatémères de génome viral telles que les
benzimidazolés dextrogyres ou les quinolines sont des
molécules peu toxiques, efficaces in vitro, mais n’ayant
pas à ce jour dépassé la phase I. L’artesunate, un anti-
paludéen, a permis d’obtenir une diminution de la réplica-
tion virale, au cours d’observations isolées, et peut être
administré en Autorisation Temporaire d’Utilisation aux
patients infectés par des souches résistantes aux autres anti-
viraux.
Mécanismes de résistance
les résistances au GCV résultent de mutations de UL97 ou
UL54. Ces mutations ont été décrites à la fois dans des
souches de laboratoire et dans des isolats cliniques.
Les mutations de UL97 sont les premières à apparaître.
Elles confèrent une résistance au GCV et au VGCV croisée
avec l’ACV et sa prodrogue, le VCV. Le niveau de résis-
tance est variable selon les mutations. Si le traitement se
prolonge, des mutations secondaires dans la polymérase
peuvent apparaître conférant un niveau de résistance plus
élevé, et le plus souvent une résistance croisée avec le
CDV, parfois avec le PFA. Près de 80 % des mutations de
UL97 portent sur les acides aminés 460 ou 520 ou sur la
région 590 à 607, qui correspond à la région d’interaction
avec le GCV (figure 3). La position 460 est située dans le
site catalytique de UL97 à proximité du site de fixation de
4
5
6
7
8
9
PpUL54
pUL44
pUL97 pUL54
IE E L
gB, gH
pp65
IE72
Terminases
Maribavir
Benzimidazolés
pUL27 ?
pUL44
pUL97
1
2
3
Figure 2. Mécanisme d’action des benzimidazolés, particularité du maribavir.
La comparaison du BDCRB, chef de file des benzimidazolés, et du maribavir souligne bien la différence de structure entre les benzimida-
zolés halogénés dextrogyres, couramment appelés benzimidazolés, et leur dérivé lévogyre, le maribavir. Les benzimidazolés sont une
nouvelle famille de molécules peu toxiques, actives sur le cytomégalovirus in vitro. Leur biodisponibilité médiocre a freiné leur développe-
ment clinique. Le maribavir est le seul composé arrivé au stade d’études cliniques. Il se distingue des autres benzimidazolés par son
squelette indolocarbazole et son mode d’action : alors que les benzimidazolés sont des inhibiteurs du clivage et de l’encapsidation des
virions néoformés, le maribavir est un inhibiteur direct de la phosphotransférase UL97. Il agit donc en empêchant la sortie des particules
virales néoformées hors du noyau, et aurait un effet sur la réplication virale via l’inhibition de la phosphorylation de la protéine accessoire
de la polymérase, UL44 [38]. La protéine UL27 serait un cofacteur de UL97, dont le rôle dans la résistance est à ce jour incertain.
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l’ATP [10]. Les mutations de la polymérase sont très nom-
breuses, réparties sur tout le gène, et situées dans les domai-
nes conservés de la protéine [11, 12] (figure 4). Les mutants
de UL97 conservent une capacité réplicative comparable à
celle des souches sauvages, et ne présentent pas de pouvoir
pathogène particulier, en dehors de leur avantage sélectif.
Les mutations de la polymérase sont au contraire souvent
défavorables à la réplication virale [13]. Si de nombreuses
mutations de résistance ont été identifiées à ce jour, l’étude
des échantillons cliniques issus de patients résistant au
traitement montre l’émergence continue, bien que peu
fréquente, de nouvelles mutations non encore incriminées.
Une approche structurale, fondée sur des modèles tridimen-
sionnels théoriques de UL97 ou de UL54 (qui n’ont pas été
cristallisées à ce jour) permet de suspecter le rôle de certai-
nes mutations [13-15]. Celui-ci doit toutefois être démontré
par l’obtention de virus recombinants résistants après
transfert de la mutation à étudier.
Aucune mutation de résistance au MBV n’a été identifiée à
ce jour au cours des essais cliniques de phase II. Des mutants
de laboratoire possédant des niveaux de résistance variés
ont été obtenus en culture par sélection en présence de
concentrations croissantes de MBV. Les mutations de résis-
tance sont situées dans la partie N terminale de UL97, au
voisinage du site de fixation de l’ATP [10] (figure 3).
Ces résistances ne sont pas croisées avec les résistances au
GCV. Toutefois l’inhibition de l’activité kinase de UL97 par
le maribavir risque d’inactiver le ganciclovir et conduit à ne
pas recommander son association au GCV. L’analyse des
mutants de laboratoire a mis en évidence des mutations
Site d'autophosphorylation
Modèle tridimensionnel :
Site kinase
III
NLS
205
II
IV VIA
VIB
VIIV
I
III
460
353
397
409
411
520, 592 ... 607
Résistance au
ganciclovir
Résistance au
maribavir*
353
397
409
411
460 520 594
595
591
592
590-593
595-603
596 601
599 603
600 606
601-603
607
NH2 COOH
IVb V VI VII VIII IX X XI
Figure 3. Localisation des mutations de UL97 conférant une résistance au ganciclovir et au maribavir.
Représentation linéaire de la phosphotransférase UL97 et représentation tridimensionnelle à partir du modèle de la CAMP kinase,
associé à une molécule d’ATP dans son site de fixation [15]. Les domaines conservés sont encadrés. Près de 70 % des mutations de
résistances portent sur les codons 460, 520 et 592 à 595 [10]. On note l’existence d’une mutation compensatoire en position 205. Toutes
les mutations sont situées dans la partie C-terminale de la protéine, dans les domaines IX à XI (à l’exception des mutations M460V/I
et H520Q) qui correspondent aux domaines de liaison au substrat et plus particulièrement au domaine de laison au ganciclovir. Le domaine
kinase est conservé parmi les herpès virus et couvre les domaines I à IX. Le domaine I correspond au site de fixation de l’ATP, le domaine
VIb participe au transfert de phosphate. Un long domaine N terminal moins conservé comporte le signal de localisation nucléaire (NLS) et
le site de fixation à la pRB ainsi que 9 sites d’autophosphorylation sur les sérines et les thréonines [6]. Les chiffres indiquent les acides
aminés les plus fréquemment modifiés en cas de résistance. Sur le modèle tridimensionnel, Les flèches et le cercle indiquent les régions
dans lesquelles sont localisées les mutations de résistance aux deux antiviraux. On observe que les mutations de résistance au maribavir
sont situées au niveau du site d’incorporation de l’ATP, alors que les mutations de résistance au ganciclovir sont situées à l’opposé, dans
le sillon de fixation du ganciclovir et pour la méthionine 460 de l’autre côté du site catalytique, au contact de l’ATP.
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d’une deuxième protéine virale, UL27, conférant un bas
niveau de résistance au MBV [16, 17]. Le bas niveau de
résistance conféré par ces mutations, et la présence de
mutations de UL27 dans les souches portant des mutations
de UL97 suggère que UL27 ne serait pas directement
une cible du maribavir mais régulerait l’activité de UL97
[16, 18, 19].
Méthodes de recherche des résistances :
génotype/phénotype
Le phénotype de résistance permet de mesurer, à partir du
virus en culture, les concentrations inhibant 50 % et 90 %
(CI50 et CI90) de la croissance des souches. La réalisation
des essais antiviraux nécessite l’isolement préalable du virus
en culture, et l’obtention d’un stock de virus ou de cellules
infectées, avec le risque de sélection d’une souche mieux
adaptée à la réplication in vitro. Il est parfois possible de
s’affranchir de cette contrainte lorsque le prélèvement à
inoculer contient de grandes quantités de virions. C’est le
cas des urines ou de certains liquides de lavage broncho-
alvéolaires riches en virus, pour lesquels le prélèvement
peut être directement inoculé en présence de concentrations
croissantes de l’antiviral à tester [20]. L’étude du phéno-
type de résistance reste la méthode de référence, indispen-
sable pour mesurer l’efficacité de nouveaux antiviraux,
apprécier le retentissement de mutations nouvelles sur la
réplication virale et la sensibilité aux antiviraux, ou étudier
les synergies et antagonismes entre les molécules.
La méthode la plus utilisée est la mesure du nombre de
foyers d’effet cytopathogènes en cinq jours [21]. La mesure
de la réplication de l’ADN viral par PCR en temps réel
standardise la lecture [22]. Les résultats de CI50 peuvent
différer entre la lecture des foyers et la mesure de la répli-
cation de l’ADN viral en hybridation ou par PCR en temps
réel. En pratique, par la méthode des foyers, les concentra-
tions inhibitrices des isolats cliniques vis-à-vis de ces molé-
cules sont respectivement < 6μM, < 2μM et < 400μM pour
GCV, CDV et PFA [21, 23]. Toutefois, les difficultés
rencontrées pour standardiser l’inoculum et la lecture des
essais antiviraux conduisent à utiliser un index de sensibilité
(CI50 de la souche à tester/CI50 de la souche de référence
AD169 testée dans la même manipulation), considérant une
souche comme résistante si son index est supérieur à 3 [21].
Les CI50 du MBV sur fibroblastes embryonnaires humains
sont < 1μM en foyers, mais peuvent être augmentées dans
d’autres types cellulaires [24].
Le génotype permet de rechercher directement les mutations
de résistance à partir de l’ADN viral extrait d’échantillons
cliniques. L’amplification de la totalité des gènes UL97 et
UL54 est possible, avec un seuil de détection de
1 000 copies/mL lorsqu’elle est appliquée au sang total
[18]. Elle permet d’identifier mutations connues et mutations
nouvelles, directement au site de l’infection et de préciser les
associations de mutations dans UL97 ou UL54. Elle détecte
Résistance au cidofovir :
Résistance au ganciclovir et au cidofovir :
Résistance au foscarnet :
Résistance au ganciclovir et au foscarnet :
Résistance aux trois antiviraux :
NH2 COOH
301 393 408 501 545 722
751
756773
787
781
802897
D981-982
987
1052
805
809
821
812
834
841
838
503
513
515
516
521
522
495 588 700
715
410
412
413
419
415
304
Domaine 3'-5' exonucléasique
Exo I Exo II/IV Exo III/δ-C II VI III I VII V
Site 5'-3' polymérasique
Figure 4. Localisation des mutations de la polymérase virale UL54 conférant une résistance au ganciclovir, au cidofovir et au foscarnet.
Sur cette représentation linéaire indiquant les domaines conservés (rectangles gris, de I à VII) et leurs fonctions, on distingue les domai-
nes portant l’activité exonucléasique (N terminaux) et les domaines portant l’activité polymérasique. On observe que les mutations
impliquées dans la résistance (pour la plupart validées par transfert de marqueur) sont réparties sur tout le gène, et localisées dans les
domaines conservés. Certaines mutations sont associées à une résistance croisée aux trois antiviraux. [12, 14, 39].
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