Étude du profil des populations cellulaires du sang en vue d’une application au diagnostic du lupus érythémateux disséminé Mémoire Jennifer Lemieux Maîtrise en microbiologie Maître ès sciences (M.Sc.) Québec, Canada © Jennifer Lemieux, 2016 Étude du profil des populations cellulaires du sang en vue d’une application au diagnostic du lupus érythémateux disséminé Mémoire Jennifer Lemieux Sous la direction de : André Darveau, directeur de recherche Sonia Néron, codirectrice de recherche Résumé Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune systémique dont le diagnostic est très complexe. Le clinicien doit baser son diagnostic sur une liste de 11 critères reliés à des observations cliniques et à des mesures sérologiques. Afin de faciliter ce diagnostic, plusieurs groupes recherchent de nouveaux marqueurs biologiques quantifiables. C’est dans ce but que la cytométrie en flux a été utilisée afin de comparer les cellules du sang des patients et celles de sujets sains. La caractérisation exhaustive des sous-populations cellulaires montre que l’expression de HLA-DR est amplifiée chez les patients même si la maladie est inactive. De plus, l’analyse du contenu sérique en cytokines inflammatoires a montré que la quantité de GM-CSF était plus importante chez les patients LED. Nos travaux suggèrent que HLA-DR et GM-CSF pourraient être considérés comme des candidats intéressants dans les études sur le diagnostic du LED. iii Table des matières Résumé ........................................................................................................................................... iii Table des matières ...........................................................................................................................iv Liste des tableaux .......................................................................................................................... vii Liste des figures ........................................................................................................................... viii Liste des abréviations ......................................................................................................................ix Avant-propos ...................................................................................................................................xi 1. Introduction .................................................................................................................................. 1 1.1 Immunité ................................................................................................................................. 1 1.1.1 Réponse immunitaire et intermédiaires cellulaires .......................................................... 1 1.1.1.1 Réponse immunitaire innée ....................................................................................... 1 1.1.1.2 Réponse immunitaire adaptative ............................................................................... 2 1.1.2 Les lymphocytes B .......................................................................................................... 3 1.1.3 Les lymphocytes T ........................................................................................................... 4 1.1.4 Messagers ......................................................................................................................... 5 1.2 Lupus érythémateux disséminé .............................................................................................. 6 1.2.1 Causes .............................................................................................................................. 6 1.2.2 Diagnostic ........................................................................................................................ 7 1.2.3 Évaluation thérapeutique ................................................................................................. 8 1.2.4 Traitements .................................................................................................................... 11 1.2.5 Cellules impliquées dans la pathogénèse ....................................................................... 11 1.2.5.1 Modèles de souris .................................................................................................... 11 1.2.5.2 Lymphocytes T ........................................................................................................ 12 1.2.5.3 Lymphocytes B ....................................................................................................... 13 1.2.6 Cytokines ....................................................................................................................... 14 1.2.6.1 IL-6 .......................................................................................................................... 14 1.2.6.2 IL-10 ........................................................................................................................ 14 1.2.6.3 IL-17 ........................................................................................................................ 14 1.2.6.4 Interférons ............................................................................................................... 15 1.2.6.5 B-cell-activating factor ............................................................................................ 15 iv 1.3 Cytométrie en flux et usage clinique .................................................................................... 16 1.3.1 Human Immunophenotyping Consortium ..................................................................... 16 1.3.2 Outils d’analyses de données multiparamétriques ......................................................... 18 1.3.2.1 SPADE et viSNE ..................................................................................................... 18 2. Hypothèse ................................................................................................................................... 19 3. Objectifs ..................................................................................................................................... 20 4. Méthodologie ............................................................................................................................. 21 4.1 Source des cellules mononucléées du sang, du sérum et du plasma .................................... 21 4.1.1 Participants en santé ....................................................................................................... 21 4.1.2 Patients LED .................................................................................................................. 22 4.2 Analyses phénotypiques ....................................................................................................... 23 4.2.1 Marquage extracellulaire ............................................................................................... 23 4.2.2 Anticorps ........................................................................................................................ 23 4.2.3 Acquisition et analyse des données ................................................................................ 26 4.2.3.1 Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events (SPADE) ...... 27 4.3 Dosage des facteurs solubles ................................................................................................ 28 4.3.1 ELISArray ...................................................................................................................... 28 4.3.2 Essai Bioplex ................................................................................................................. 28 4.4 Activation in vitro ................................................................................................................. 29 4.4.1 Milieu de culture ............................................................................................................ 29 4.4.2 Essais d’activation ......................................................................................................... 29 4.4.3 Mesure des facteurs solubles dans les surnageants de culture ....................................... 30 4.5 Analyses statistiques ............................................................................................................. 30 5. Résultats ..................................................................................................................................... 32 5.1 Caractéristiques médicales des patients et des participants à l’étude ................................... 32 5.2 Patron des cytokines ............................................................................................................. 35 5.2.1 Facteurs solubles dans le sérum des patients LED ........................................................ 37 5.2.3 Sécrétion in vitro ............................................................................................................ 43 5.3 Étude comparative de l’effet de la congélation sur les PBMC ............................................. 45 5.3.1 Effets de la congélation sur les lymphocytes et les monocytes ..................................... 45 5.3.2 Effets de la congélation sur les sous-populations des lymphocytes T ........................... 47 v 5.4 Caractérisation du phénotype LED....................................................................................... 52 5.4.1 Stratégie pour l’établissement des arbres SPADE ......................................................... 52 5.4.2 Monocytes, cellules dendritiques et cellules NK ........................................................... 54 5.4.3 Lymphocytes B .............................................................................................................. 59 5.4.4 Vue d’ensemble des cellules B, NK, DC et monocytes chez les patients LED ............. 59 5.4.5 Lymphocytes T .............................................................................................................. 64 5.4.5.1 Fine distribution des cellules CD4+ et CD8+ ........................................................... 64 5.4.5.2 Visualisation avec SPADE des lymphocytes T....................................................... 66 5.4.5.3 Proportion des cellules T HLA-DR+ ..................................................................... 74 5.4.6 Lymphocytes T auxiliaires ............................................................................................. 76 5.4.7 Lymphocytes T régulateurs............................................................................................ 80 6. Discussion .................................................................................................................................. 84 6.1 Des concentrations sériques de GM-CSF plus élevées chez les patients LED .................... 84 6.2 Les cellules des patients LED sont plus activées ................................................................. 85 6.2.1 Survol des variations dans les populations .................................................................... 86 6.2.2 Expression élevée de HLA-DR ...................................................................................... 86 6.3 Une période de repos de 1h est bénéfique pour les cellules congelées ................................ 87 7. Conclusion .................................................................................................................................. 89 Bibliographie .................................................................................................................................. 90 vi Liste des tableaux Tableau 1.1: Médicaments impliqués dans le DILE. ....................................................................... 7 Tableau 4.1: Liste des anticorps monoclonaux utilisés pour la caractérisation des PBMC ........... 25 Tableau 4.2 : Panels des cibles cellulaires en fonction des marqueurs de surface. ........................ 26 Tableau 5.1 : Caractéristiques médicales des patients atteints de LED. ........................................ 34 Tableau 5.2 : Niveau des cytokines dans le sérum de patients sélectionnés. ................................. 42 Tableau 5.3 : Effet de la congélation sur la distribution des sous-populations de lymphocytes T 51 Tableau 5.4 : Disposition des arbres SPADE pour les participants en santé. ................................ 53 Tableau 5.5 : Disposition des arbres SPADE pour les patients LED. ............................................ 53 Tableau 5.6 : Distribution des monocytes, des cellules DC et NK, et des lymphocytes B chez les patients. .......................................................................................................................................... 63 Tableau 5.7 : Distribution des sous-populations de lymphocytes T chez les patients. .................. 65 Tableau 5.8 : Proportion de cellules HLA-DR+ au sein des lymphocytes T des patients. ............. 75 vii Liste des figures Figure 1.1 : Étapes de la réponse immunitaire adaptative................................................................ 2 Figure 1.2 : Critères de diagnostic du LED ...................................................................................... 8 Figure 1.3 : Critères d’évaluation de l’activité de la maladie selon le SLEDAI. ........................... 10 Figure 1.4 : Sous-populations cellulaires des PBMC. .................................................................... 17 Figure 5.1 : Niveau des cytokines inflammatoires dans le sérum des patients. ............................. 35 Figure 5.2 : Patron de sécrétion des cytokines inflammatoires dans le sérum des patients ........... 37 Figure 5.3 : Niveau de RANTES suite à l’activation in vitro des PBMC. ..................................... 42 Figure 5.4 : Effet de la congélation sur la distribution des cellules mononucléées. ...................... 44 Figure 5.5 : Effet de la congélation sur la distribution des cellules mononucléées. ...................... 46 Figure 5.6 : Variation des populations de lymphocytes T CD4+ et CD8+ avant et après congélation ..................................................................................................................................... 47 Figure 5.7 : Délinéation des monocytes, des cellules dendritiques et des cellules NK. ................ 53 Figure 5.8 : Expression de HLA-DR sur les monocytes, DC et NK de participants en santé. ...... 55 Figure 5.9 : Expression de HLA-DR sur les monocytes, DC et NK des patients LED. ................ 56 Figure 5.10 : Délinéation des cellules mémoires dans les lymphocytes B CD19+ ........................ 58 Figure 5.11 : Expression de CD38 sur des lymphocytes B CD19+ des participants en santé. ....... 59 Figure 5.12 : Expression de CD3 sur des lymphocytes B CD19+ des patients LED. .................... 60 Figure 5.13 : Délinéation des sous-populations de lymphocytes T CD3+. .................................... 65 Figure 5.14 : Expression de CD38 sur des lymphocytes T CD3+ de participants en santé ............ 66 Figure 5.15 : Expression de CD38 sur des lymphocytes T CD3+ de patients LED. ...................... 67 Figure 5.16 : Expression de HLA-DR sur les lymphocytes T CD3+ de participants en santé. ...... 70 Figure 5.17 : Expression de HLA-DR sur les lymphocytes T CD3+ de patients LED .................. 71 Figure 5.18 : Délinéation des sous-populations de lymphocytes T auxiliaires. ............................. 75 Figure 5.19 : Expression de HLA-DR sur les lymphocytes T auxiliaires de participants en santé. ........................................................................................................................................................ 76 Figure 5.20 : Expression de HLA-DR sur des lymphocytes T auxiliaires des patients LED. ....... 77 Figure 5.21 : Délinéation des lymphocytes T régulateurs .............................................................. 79 Figure 5.22 : Expression de HLA-DR sur les lymphocytes T régulateurs des participants en santé. ........................................................................................................................................................ 80 Figure 5.23 : Expression de HLA-DR sur des lymphocytes T régulateurs des patients. ............... 81 viii Liste des abréviations ACD : Acid–Citrate-Dextrose ACR : American College of Rheumatology ADNsb : Acide désoxyribonucléique simple brin ADNdb : Acide désoxyribonucléique double brin AF-488 : Alexa-Fluor 488 APC : Allophycocyanin BAFF : B cell-activating factor BAFF-R : B cell-activating factor receptor BCMA : B-cell maturation antigen BCR : B-cell receptor BILAG : British Isles Lupus Assessment Group BPFM : Bovine protein free medium BSA : Bovine serum albumin BV421 : Brilliant Violet 421 CCR : CC-chemokine receptor CD : Cluster of differenciation, marqueur de surface CMH : Complexe majeur d'histocompatibilité CHUS : Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke CXCL : CXC-chemokine ligand CXCR : CXC-chemokine receptor DC : Dendritic cell DILE : Drug-induced lupus erythematosus DMSO : Diméthysulfoxyde DNAse : Deoxyribonucléase DPBS : Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ECLAM : European Consensus Lupus Activity Measurement ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay FBS : Fetal bovine serum FCB : Fluorescent Cell Barcoding FDA: Food and Drug Administration FMO : Fluorescent Minus One FoxP3 : Forkhead box P3 GM-CSF : Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor HIC : Human Immunophenotyping Consortium HIV : Human immunodeficiency virus HLTV : Human T-lymphotropic virus HSA : Human serum albumin IFN: Interféron ix Ig : Immunoglobuline IGF : Insulin-like growth factor IL : Interleukine IMDM : Iscove’s modified Dulbecco’s medium ITS : Insuline, transferrine et sélénium IVIg : Immunoglobulines intraveineuses LDL : Low-density lipoprotein LED : Lupus érythémateux disséminé LP-1 : Mélange lipidique défini LPS : Lipopolysaccharide MFI : Mean fluorescence intensity MRL/lpr : Murphy Roths Large/lymphoproliferation NIAID : National Institute of Allergy and Infectious Disease NFκB : Nuclear factor-B NK : Natural killer NZB : New Zealand Black NZM : New Zealand Mixed NZW : New Zealand White PAMP : Pathogen-associated molecular pattern PBMC : Peripheral blood mononuclear cells PMA : Phorbol 12-myristate 13-acetate PE : Phycoerythrin PE-Cy7 : PE-cyanine 7 PerCP-Cy5.5 : Peridin-chlorophyll protein-cyanine 5.5 PRR : Pattern recognition receptor RANTES : Regulated on Activation, Normal T Cell Expressed and Secreted SLAM : Systemic Lupus Erythematosus Activity Measure SLE : Systemic lupus erythematosus SLEDAI : SLE disease activity index SLICC : Systemic Lupus International Collaborating Clinics SPADE : Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events Syk : Spleen tyrosine kinase TACI : Transmembrane activator and CAML interactor TCR: T cell receptor, récepteur des lymphocytes T Th : T helper, lymphocyte T auxiliaire TMB : 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine TLR: Toll-like receptor Treg : Regulatory T cell, lymphocyte T régulateur V450 : Violet 450 Yaa : Y-linked autoimmune accelerator x Avant-propos Ces belles années de maîtrise à Héma-Québec n’auraient pas été possibles sans ma directrice de recherche, Dr. Sonia Néron, qui m’a d’abord acceptée dans l’équipe en tant que stagiaire et, par la suite, en tant qu’étudiante à la maîtrise. Je tiens à la remercier pour ses bons conseils, pour sa grande disponibilité et surtout pour ses encouragements à persévérer. Je voudrais également remercier mon co-directeur, André Darveau, pour ses idées et ses commentaires pertinents dans l’avancement de ma maîtrise. Je voudrais remercier les autres membres de mon comité d’encadrement, Fatiha Chandad et Caroline Gilbert, pour leurs précieux conseils et pour l’intérêt porté à mon projet de maîtrise. Je tiens également à remercier Éric Boilard d’avoir accepté à la dernière minute de faire partie de mes examinateurs. Ce projet de maîtrise n’aurait pas été possible sans la collaboration de Dr Gilles Boire, de ses collaborateurs et de son équipe au Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. Je remercie aussi Mme Marie-Ève Allard, infirmière coordonnatrice de Héma-Québec, pour son efficacité. Je tiens à remercier tout spécialement les patients de Dr Boire et les donneurs de plaquettes du Centre Globule à Place Laurier pour leur participation à cette étude. Je tiens aussi à remercier les membres de l’équipe du Dr. Néron (autant actuels qu’anciens) qui ont contribué à ma réussite : Annie Roy, Carl Simard, Marc Cloutier, Philippe Nadeau, Guillaume Bonnaure, Rayelle Itoua Maïga, Catherine Gervais St-Amour et David Gaumond. Je ne voudrais surtout pas oublier de remercier tous les autres étudiants pour les moments de réflexion, mais aussi pour les moments de divertissement. Évidemment, je ne serais peut-être pas rendue où je suis en ce moment sans le support inconditionnel et les encouragements de mes amis et de ma famille. Je pense plus spécifiquement à ma mère qui m’a toujours rappelé l’importance de ne pas abandonner, en particulier lorsqu’on est si près du but. Malgré mon parcours qui semblait interminable, je peux enfin dire mission accomplie! xi 1. Introduction 1.1 Immunité 1.1.1 Réponse immunitaire et intermédiaires cellulaires 1.1.1.1 Réponse immunitaire innée Les pathogènes qui franchissent les épithéliums, première barrière physique contre les infections, peuvent ensuite coloniser les tissus et établir un foyer infectieux. Lorsque les pathogènes traversent cette barrière, c’est la réponse immunitaire innée qui prend la relève. Les pathogènes portent des motifs moléculaires appelé PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) qui sont des motifs hautement conservés présents sur les membranes des pathogènes [1]. Les cellules du système immunitaire reconnaissent ces PAMPs grâce à des récepteurs appelés pattern recognition receptors (PRRs), dont font partie les récepteurs de type Toll (TLR, Toll-Like Receptors) [2]. Ces derniers sont localisés à la surface des cellules immunitaires ou à l’intérieur de la cellule, sur la paroi des endosomes, ce qui permet la reconnaissance des motifs microbiens comme l’ADN. Ainsi, la liaison des cellules immunitaires et des agents infectieux provoque la phagocytose de ces derniers grâce aux macrophages, cellules dérivant des monocytes [3]. Cette étape donne une réponse immédiate qui ne prend que quelques heures, c’est la phase innée. Par la suite, c’est la réponse innée induite qui est déclenchée. Une réaction inflammatoire se produit en raison de l’interaction entre le pathogène et les phagocytes. L’inflammation joue un rôle important dans l’immunité puisqu’elle induit la coagulation, elle aide à la réparation des tissus et elle permet d’attirer diverses molécules et cellules sur le site de l’infection. Ainsi, cette phase permet la migration de cytokines, de neutrophiles et de monocytes pour combattre l’infection [4]. Chez l’humain, d’autres acteurs cellulaires sont impliqués dans la réponse innée comme les basophiles, les éosinophiles, les cellules dendritiques et les cellules tueuses (natural killers ou NK). Un autre mécanisme important lors de la réponse innée est le système du complément. Ce dernier est un système composé de protéines plasmatiques et qui peut être activé par l’une des trois voies suivantes : la voie classique, la voie des lectines et la voie alternative [5]. Bien que la défense innée permette l’élimination constante de pathogènes, certains résistent et doivent, par la suite, s’attaquer à la réponse immunitaire adaptative. 1 1.1.1.2 Réponse immunitaire adaptative C’est grâce à l’immunité innée que peut commencer la réponse immunitaire adaptative puisque ce sont les cellules dendritiques immatures qui, une fois un pathogène phagocyté, vont se déplacer dans les ganglions lymphatiques et présenter les antigènes microbiens aux lymphocytes T [6]. La réponse adaptative fait appel à des récepteurs d’antigènes spécialisés pour éliminer les pathogènes et, contrairement à la réponse immunitaire innée, elle se produit plus tardivement puisqu’elle implique un réarrangement génique V(D)J. Cette réponse permet donc une élimination plus spécifique du pathogène. De plus, lorsqu’un antigène est rencontré à plusieurs reprises, la mémoire immunologique se développe, ce qui permet une réponse immunitaire plus rapide et plus efficace à chaque nouvelle infection avec ce même antigène [7]. Figure 1.1: Étapes de la réponse immunitaire adaptative. Résumé des différentes étapes menant à la mémoire immunologique. Cette figure a été adaptée de http://gopixdatabase.com/adaptive+immunity+diagram. 2 Les cellules du système immunitaire adaptatif sont les lymphocytes T et les lymphocytes B [8]. Les lymphocytes T sont impliqués dans la réponse à médiation cellulaire. Les lymphocytes T CD8+ ont des propriétés cytotoxiques qui induisent la destruction des pathogènes. Lorsqu’elles sont à l’état naïf, ces cellules sont activées par la présentation de complexe peptide-CMH de classe I. Les lymphocytes T CD4+ sont plutôt activés par des complexes impliquant le CMH de classe II. Une fois activées, ces cellules peuvent activer les macrophages, contribuer à la production d’anticorps par les lymphocytes B ou inhiber les réponses des lymphocytes T au besoin. Pour leur part, les lymphocytes B sont des acteurs importants dans l’immunité humorale grâce aux anticorps qu’ils produisent. Ils sont également impliqués dans la présentation antigénique comme les cellules dendritiques et les macrophages. En plus de la recombinaison des gènes, cette réponse immunitaire repose aussi sur le principe de l’expansion clonale qui permet la prolifération des lymphocytes spécifiques aux antigènes rencontrés [9, 10]. 1.1.2 Les lymphocytes B Les cellules hématopoïétiques pluripotentes de la moelle osseuse se divisent en progéniteurs lymphoïdes communs et en progéniteurs myéloïdes communs. C’est à partir de la lignée lymphoïde que se forment les lymphocytes B, mais également les lymphocytes T et les cellules NK [11]. La différenciation des lymphocytes B a lieu dans la moelle osseuse. Une fois différenciées, ces cellules matures, mais encore naïves, prennent la circulation sanguine pour se rendre dans les organes lymphoïdes périphériques comme les ganglions lymphatiques, la rate et les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses [12]. C’est à ces endroits que les lymphocytes sont activés suite à la rencontre avec leur antigène spécifique. Avant d’en arriver à l’étape du lymphocyte B mature, il est important de mentionner que le progéniteur lymphoïde commun est, en fait, le précurseur de la cellule la plus précoce, la cellule pro-B. Grâce aux interactions avec les cellules stromales, les progéniteurs B peuvent réarranger leurs gènes d’immunoglobulines. La production de la chaîne lourde est le premier réarrangement génique qui se produit chez la lignée B [13]. Son association à des chaînes légères de substitution donne lieu au récepteur de la cellule pré-B, ce qui envoie le signal que la production de la chaîne lourde μ est réussie. Le réarrangement génique de la chaîne lourde peut donc arrêter et fait place au réarrangement des gènes des chaînes légères. Une fois ces dernières produites, elles s’associent à la chaîne lourde pour ainsi former des immunoglobulines de surface fonctionnelles, 3 les IgM. Le stade des cellules B immatures est maintenant atteint [14]. Le récepteur d’antigène nouvellement formé est soumis à un test d’autoréactivité [15]. Si les cellules ne réagissent pas aux autoantigènes, elles peuvent quitter la moelle osseuse pour devenir des cellules B matures. Les cellules naïves entrent dans les ganglions lymphatiques où elles peuvent rencontrer leur antigène spécifique [16]. Leur activation a lieu lorsqu’elles se lient également à un lymphocyte T activé par le même antigène. Certains lymphocytes B activés peuvent migrer dans un follicule primaire pour former un centre germinatif [17]. C’est à cet endroit que les lymphocytes B vont proliférer et continuer leur différenciation. Certains vont devenir des lymphocytes B mémoires alors que les autres vont devenir des cellules sécrétrices d’anticorps, les plasmocytes. À chaque stade de différenciation cellulaire, des marqueurs de surface permettent la distinction des différentes sous-populations de lymphocytes B. Les marqueurs de surface CD19 et CD20 sont les plus précoces puisqu’ils sont exprimés dès le stade pro-B précoce et tardif respectivement [18]. Ils sont également présents tout au long du développement de la cellule sauf sur les plasmablastes dans le cas du CD20. Le marqueur CD24 est fortement exprimé (CD24hi) sur les lymphocytes B transitionnels, qui sont en fait des cellules immatures qui transitent de la moelle osseuse à un organe lymphoïde périphérique pour terminer leur développement en cellules matures naïves [19]. Il est possible de distinguer les cellules mémoires grâce au marqueur CD27, alors que les cellules naïves ne l’expriment pas à leur surface [20]. Le marqueur CD38, quant à lui, est exprimé à la surface des plasmablastes, en plus d’être fortement exprimé sur les lymphocytes B transitionnels [21]. Il est possible de reconnaître les plasmocytes à l’aide du marqueur CD138 [22]. Les lymphocytes B peuvent également exprimer des immunoglobulines de surface comme IgD [23]. Elles se retrouvent particulièrement sur les cellules matures naïves, mais certaines cellules mémoires l’expriment également. 1.1.3 Les lymphocytes T Alors que la maturation des lymphocytes B a lieu dans la moelle osseuse, celle des lymphocytes T se fait plutôt dans le thymus où les gènes du récepteur y sont réarrangés. À cette étape, les gènes de la chaîne β sont réarrangés pour former un pré-TCR, correspondant à une association de la chaîne β et de la chaîne préTα. Par la suite, la sélection positive a lieu; les récepteurs des cellules T immatures qui reconnaissent les molécules du CMH du soi transmettent un signal de survie [24]. Il existe également une étape de sélection négative pour les cellules qui réagissent 4 fortement avec les antigènes du soi. Un signal est transmis pour éliminer ces cellules autoréactives. Par la suite, les cellules naïves simples positives CD4+ ou CD8+ migrent dans les organes lymphoïdes périphériques pour continuer la différenciation des sous-populations lymphocytaires. Le répertoire lymphocytaire T est composé de plusieurs sous-populations dont les différentes fonctions permettent une meilleure protection contre les infections. On retrouve les lymphocytes T CD4+ auxiliaires dont la fonction est principalement d’aider les lymphocytes B dans la production d’anticorps suite à une réponse à un antigène [25]. Il existe 3 sous-populations qui peuvent se distinguer par leur fonction mais également par leurs marqueurs extracellulaires : TH1 (CXCR3+CCR6-), TH2 (CXCR3-CCR6-) et TH17 (CXCR3-CCR6+) [26]. Les lymphocytes T CD4+ régulateurs (Treg) inhibent la réponse des cellules T en produisant des cytokines ayant un pouvoir inhibiteur. Ces cellules possèdent entre autres le marqueur CD25. D’autres études montrent que ces cellules portent également les marqueurs CCR4 et FoxP3 et qu’elles expriment faiblement le marqueur CD127 (CD127lo) [27, 28]. Les prochaines sous-populations sont présentes autant chez les lymphocytes T CD4+ que chez les CD8+. Les cellules naïves (CD45RA+CCR7+) n’ont pas encore rencontré leur antigène spécifique alors que les cellules effectrices (CD45RA+CCR7-) ont déjà fait la rencontre avec l’antigène et peuvent ainsi exercer leurs fonctions immunes pour éliminer le pathogène [29]. Les cellules mémoires contribuent à la mémoire immunologique puisqu’elles ont un niveau de sensibilité plus élevé et répondent plus rapidement à un antigène que les cellules naïves. Il existe les cellules mémoires centrales (CD45RA-CCR7+) et les cellules mémoires effectrices (CD45RA-CCR7-) [30]. Les premières se situent davantage dans les organes lymphoïdes pour proliférer et générer de nouvelles cellules effectrices alors que les secondes se retrouvent dans les tissus périphériques pour agir de façon immédiate. 1.1.4 Messagers Au cours de la réponse immunitaire, des cytokines sont sécrétées par les macrophages activés par la reconnaissance d’agents infectieux. D’autres cellules peuvent également contribuer à la production de cytokines comme les lymphocytes T auxiliaires et régulateurs. Les cytokines sont de petites protéines qui contribuent de différentes façons pour combattre une infection. En effet, l’action autocrine de certaines permet de changer le comportement de la cellule sécrétrice alors 5 que l’action paracrine se concentre sur les cellules voisines [31]. Ces molécules jouent un rôle important dans l’inflammation en stimulant la migration et l’activation des cellules. Selon leur fonction, certaines cytokines peuvent être qualifiées de pro-inflammatoires ou d’antiinflammatoires. 1.2 Lupus érythémateux disséminé Normalement, les cellules du système immunitaire défendent l’organisme des attaques contre son intégrité, c’est-à-dire des infections, des cellules provenant d’autres individus, des cellules infectées ou cancéreuses, ayant des caractéristiques aberrantes, toutes considérées comme des antigènes du non-soi. En temps normal, des mécanismes d’auto-tolérance sont présents afin d’empêcher l’organisme de réagir contre les antigènes du soi. Par contre, un débalancement du système immunitaire peut entraîner ce dernier à s’attaquer aux autoantigènes et provoquer ce que l’on appelle les maladies auto-immunes [32]. Ces dernières peuvent être divisées en deux catégories : les maladies spécifiques à un organe et les maladies auto-immunes systémiques [33]. Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune systémique caractérisée par un déséquilibre du système immunitaire affectant plusieurs organes. Cette maladie est aussi associée à des poussées de l’intensité des symptômes (périodes de la maladie active, « flares ») et à des rémissions. Environ 50 000 Canadiens seraient atteints de cette maladie dont 90% sont des femmes [34]. Les personnes les plus à risque sont les femmes entre 15 et 45 ans, en particulier les Afro-Américaines, les Asiatiques et les Hispaniques [35]. 1.2.1 Causes En général, les causes des maladies auto-immunes sont complexes et dans la majorité des cas elles ne sont pas encore bien établies. C’est le cas pour le lupus érythémateux disséminé. Par contre, il existe plusieurs facteurs de risque qui pourraient jouer un rôle dans le développement de la maladie comme l’hérédité, l’exposition à la lumière ultraviolette et le stress [36]. Les hormones et les chromosomes sexuels ont également un rôle important à jouer dans le développement de la maladie puisque 9 fois plus de femmes sont atteintes de la maladie. En effet, il a été démontré chez un modèle murin du lupus, induit au pristane, que la maladie était plus susceptible de se développer chez les souris XX contrairement aux souris XY- (Modèles de souris; section 1.2.5.1) [37]. Un autre groupe, Lahita et al., a démontré l’importance des 6 hormones sexuelles, en particulier l’estrogène, dans la pathogénèse de la maladie en utilisant deux autres modèles murins de la maladie soit les NZB/NZW et les MLR/lpr (Modèle de souris; section 1.2.5.1) [36, 38]. Ils ont démontré que le taux de survie chez les femelles stériles (ayant subi l’ablation des ovaires) est augmenté contrairement aux mâles castrés. De plus, le fait d’administrer des suppléments d’androgène aux femelles et aux mâles castrés améliore l’état de la maladie alors que l’administration d’estrogène le détériore [38]. D’un autre côté, depuis la première description connue du LED, il a été rapporté que plus de 80 médicaments induisent le lupus (drug-induced lupus erythematosus, DILE) [39, 40] incluant des antibiotiques, en particulier ceux de la classe des sulfonamides [41], des anticonvulsants [42], des antiinflammatoires non-stéroïdiens [43] et des estrogènes. En fait, les médicaments causant le DILE sont regroupés en trois catégories selon la probabilité de causer la condition [44] (Fig. 1.2). Le premier groupe concernant les médicaments dont le rôle pathologique est avéré selon des études contrôlées. Le deuxième groupe montre une association possible basée sur des cas rapportés provenant de plusieurs cohortes alors que le troisième groupe ne montre qu’une possible association selon quelques cas documentés. Tableau 1.1: Médicaments impliqués dans le DILE. Adapté de [44]. Avéré Hydralazine Procainamide Probable Sulfasalazine Anticonvulsivants Isoniazide Méthyldopa Quinidine Minocycline Chlorpromazine Anti-thyroïdiens Statines Terbinafine Pénicillamine Agents fluorouraciles Hydrochlorthiazide Possible Antibiotiques Agents anti-inflammatoires non-stéroïdiens Antihypertenseurs Lithium Interférons Sels d’or Cas récents Infliximab Etanercept Interleukine-2 Zafirlukast Clobazam Tocainide Lisinopril Bupropion 1.2.2 Diagnostic Le diagnostic de la maladie est assez complexe et se fait selon les critères révisés de l’American College of Rheumatology (ACR) [45, 46]. Ces derniers comprennent des critères cliniques et des marqueurs sérologiques. En fait, un résultat positif pour au moins 4 des 11 critères constitue un diagnostic confirmé de lupus. Ces critères sont : un érythème malaire, un érythème discoïde, la 7 photosensibilité, des ulcères oraux, l’arthrite, une sérite, des problèmes rénaux, neurologiques, hématologiques, immunologiques et la présence d’anticorps antinucléaires (Fig. 1.2). Malgré tout, la maladie est souvent difficile à diagnostiquer car elle est très variable en fonction du temps. Il est possible que le patient ne montre pas de symptômes apparents de la maladie le jour de la consultation ou qu’un diagnostic erroné soit posé par le médecin. De plus, les symptômes peuvent prendre des années avant de se faire ressentir [36]. Figure 1.2: Critères de diagnostic du LED. Illustration tirée de la référence [47]. 1.2.3 Évaluation thérapeutique Différentes méthodes ont été mises au point au fil des ans pour l’évaluation thérapeutique des maladies systémiques comme le LED. Deux concepts importants doivent être pris en considération dans la conception de scores. La première est l’activité de la maladie qui correspond principalement aux manifestations réversibles alors que la seconde est la sévérité et correspond aux lésions qui sont irréversibles [48]. Plusieurs scores ont été proposés comme le SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index) [45, 46], le BILAG (British Isles Lupus Assessment Group) [49, 50], le SLAM (Systemic Lupus Erythematosus Activity Measure) [51] et l’ECLAM (European Consensus Lupus Activity Measurement) [52]. Parmi ces différents scores, le BILAG et le SLEDAI sont les 2 indices les plus fréquemment utilisés. À l’origine, le BILAG évaluait les critères associés aux 4 semaines qui précédaient l’examen. Il était composé de 86 critères divisés selon 9 domaines tels que les signes généraux, les atteintes 8 cutanées, neurologiques, articulaires, cardiaques, respiratoires, rénales et hématologiques [49]. C’est un indice qui détecte bien les poussées de la maladie, mais il ne peut être considéré pour un score global. Le SLEDAI est l’autre score très répandu pour l’évaluation thérapeutique. Bien que plusieurs modifications aient été proposées, la version du groupe SELENA (Safety of Estrogens in Lupus Erythematosus, National Assessment) est sans aucun doute la plus utilisée [53]. Il est possible de déterminer l’activité de la maladie en fonction de la présence ou non de 24 critères (Fig. 1.3). Les manifestations sont prises en considération si elles sont présentes le jour de la consultation ou dans les 10 jours précédents. Parmi ces critères, 16 sont des manifestations cliniques alors que les autres concernent des résultats d’analyses de laboratoire. Le SLEDAI peut évaluer les systèmes touchés et peut déterminer l’amélioration ou non de la condition. Contrairement au BILAG, il ne peut être utilisé domaine par domaine, mais il est plutôt utilisé pour évaluer l’ensemble global. Bien que ces indices se servent d’éléments hématologiques, il pourrait être intéressant d’introduire de nouveaux marqueurs biologiques quantifiables, comme l’activité cellulaire. 9 Figure 1.3 : Critères d’évaluation de l’activité de la maladie selon le SLEDAI. Tirée de Société française de rhumatologie, Critères d'activité SLEDAI. http://www.rhumatologie.asso.fr 10 1.2.4 Traitements Actuellement, très peu de traitements sont disponibles pour soigner spécifiquement le LED. Ceux qui sont à la disposition des patients sont très variés et ne sont pas curatifs, ils atténuent les symptômes de la maladie pour ainsi améliorer la qualité de vie des patients. D’ailleurs, puisque ces symptômes sont très variables d’une personne à l’autre, les traitements sont personnalisés et adaptés selon les besoins des patients. Les traitements utilisés incluent les anti-inflammatoires, les corticostéroïdes, les antipaludiques, les immunosuppresseurs, les anticoagulants et les anticorps monoclonaux [54]. D’ailleurs, le Benlysta, un anticorps monoclonal dirigé contre le facteur soluble BAFF (B-cell activating factor) (voir section 1.2.6.5) est le premier traitement approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) depuis plus de 50 ans [55]. D’autres études sont en cours afin de développer des traitements plus spécifiques en utilisant les cytokines, les lymphocytes B et les lymphocytes T comme cibles thérapeutiques [56-58]. 1.2.5 Cellules impliquées dans la pathogénèse 1.2.5.1 Modèles de souris Plusieurs modèles murins du lupus ont permis l’avancement des connaissances sur la maladie. Certains modèles sont classés dans la catégorie des modèles murins classiques de lupus spontané tels que le modèle NZB/W F1 et ses modèles dérivés, le MRL/lpr et le BXSB/Yaa [59]. Le modèle NZB/W F1 est l’hybride F1 entre New Zealand Black (NZB) et New Zealand White (NZW). Ces souris sont largement utilisées puisqu’elles développent un phénotype s’apparentant aux patients LED, ce qui inclut un sérum riche en autoanticorps antinucléaires, une lymphodénopathie, une splénomégalie et des problèmes rénaux importants [60]. Un fort biais est présent chez ce modèle puisque les femelles développent plus souvent la maladie. Les modèles dérivés NZM2328 et NZM2410 proviennent de la souche de New Zealand Mixed (NZM), née d’une combinaison entre NZB/W F1 et NZW suivie d’une série de recombinaisons [61-63]. Ces modèles ont permis d’approfondir les analyses génétiques de la maladie notamment en identifiant des loci et des gènes impliqués dans la pathogénèse de la maladie tels que les loci Sle1-3 et le gène Fcgr2b [62]. Le modèle MRL/lpr provient d’une combinaison de plusieurs souches telles que LG/J, C3H/Di, C57BL/6 et AKR/J [60]. Les caractéristiques associées à ce modèle sont une accumulation de lymphocytes T CD4-CD8- et B220+ et un sérum riche en autoanticorps antinucléaires et en facteurs rhumatoïdes [64]. Les travaux de Reap ont démontré que la mutation 11 lpr affectant la transcription de Fas cause un défaut d’apoptose chez les lymphocytes B et T de ce modèle [65]. Le modèle BXSB/Yaa provient d’une recombinaison entre une F1 (C57BL6/J x SB/Le) et SB/Le. Dans ce modèle, la maladie se développe de façon accélérée chez les mâles, ce qui est expliqué par l’élément Y-linked autoimmune accelerator (Yaa) [66, 67]. Alors que ces derniers modèles murins montrent un développement spontané de la maladie en raison de facteurs génétiques, d’autres sont des modèles où le lupus est induit par des facteurs environnementaux. Un modèle induit est préparé par des injections intrapéritonéales de pristane chez des souris BALB/c, ce qui provoque la production d’autoanticorps et de complexes immuns menant à des problèmes rénaux [68]. Ce modèle murin a permis de comprendre l’influence des cytokines sur la production d’autoanticorps. En effet, les souris BALB/c IL-6 -/- ont permis de comprendre que les anticorps dirigés contre les ADNsb, les ADNdb et la chromatine sont hautement dépendant de l’IL-6 [69]. C’est aussi le seul modèle animal qui présente la signature d’interférons typique au LED. Finalement, le modèle induit par la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) se développe chez des souris semi-allogéniques qui reçoivent une greffe de lymphocytes [70]. Ainsi, les cellules greffées réagissent contre l’hôte, alors que l’hôte est tolérant à la greffe. Les modifications apportées aux cellules du donneur ou à celles de l’hôte peuvent être facilement étudiées par cytométrie en flux puisque les lymphocytes T du donneur passent par des étapes d’activation et d’expansion à la suite de la greffe. Ces études effectuées sur des modèles murins ont permis l’avancement des connaissances reliées à la pathogénèse du LED en plus d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles. 1.2.5.2 Lymphocytes T Les lymphocytes T sont grandement impliqués dans la pathogénèse du LED puisque leurs propriétés sont affectées. En effet, ces cellules ont tendance à promouvoir l’inflammation et la sécrétion de cytokines puisqu’elles sont dans un état d’hyperactivation [71]. Ce phénomène peut s’expliquer par différents facteurs. Tout d’abord, les molécules CD3ζ, par lesquelles passe la signalisation intracellulaire induite lorsque le TCR (T-cell receptor) se lie à un antigène, se trouvent en quantité réduite [72]. Dans le cas de ces lymphocytes T hyperactifs, la signalisation intracellulaire transite plutôt par la chaîne FcRγ, favorisant ainsi le recrutement de Syk (spleen tyrosine kinase) [73]. Ce changement résulte donc d’un apport plus important de calcium qui cause l’hyperactivation des cellules. Il a aussi été montré que, dans les cellules de patients LED, 12 le radeau lipidique de la membrane a tendance à s’agréger à un pôle de la cellule avant la liaison du TCR à son antigène [74]. En plus de leur état d’hyperactivation, certaines sous-populations de lymphocytes T sont débalancées comparativement aux cellules de sujets sains. Il a été mentionné que les lymphocytes T CD8+ sont plus nombreux, mais l’activité cytotoxique de ces cellules est diminuée [75, 76]. De plus, le nombre de cellules doubles négatives (CD4-CD8-) est plus important. Les patients LED ont également plus de cellules TH17 et des niveaux sériques plus élevés en IL-17 [77]. Les cellules T régulatrices (Treg), une sous-population de lymphocytes CD4+, sont nécessaires au maintien de la tolérance immunologique. Chez les patients LED, les cellules Treg sont présentes en faible quantité [78-80]. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que la production d’IL-2, cytokine essentielle au développement de ces cellules, est également affectée. Les connaissances acquises sur les lymphocytes T poussent donc les recherches vers de nouvelles cibles thérapeutiques. 1.2.5.3 Lymphocytes B Les lymphocytes B occupent un rôle important dans le développement et l’évolution du LED, et ce, à plusieurs niveaux. Les lymphocytes B produisent des cytokines jouant un rôle clé dans l’état inflammatoire de la maladie. Parmi celles-ci, on retrouve l’IL-4, IL-6, IL-10 et IFN-γ [81]. Plusieurs de ces cytokines se retrouvent en quantité augmentée dans le sérum des patients LED et le niveau de celles-ci peut même être proportionnel à l’activité de la maladie mesurée sur l’échelle SLEDAI. De plus, le rôle des lymphocytes B comme présentateurs d’antigènes et comme sécréteurs de cytokines a été démontré avec le modèle murin MRL/lpr. En effet, l’élimination de cette population permet l’élimination de la maladie [82]. Ce sont également les lymphocytes B qui produisent les autoanticorps présents dans le sang des patients LED contribuant à la pathogénèse de la maladie. La présence de ces autoanticorps, comme les antiADNdb, est utilisée comme facteur déterminant dans le diagnostic de la maladie. Il a longtemps été démontré qu’une signalisation plus forte du BCR (B-cell receptor), due à une surexpression de la molécule CD19, pouvait mener à l’auto-immunité [83]. Par contre, une nouvelle étude a montré le contraire, expliquant qu’un faible signal du BCR permet aux cellules auto-réactives d’échapper au contrôle de la sélection négative [84] promouvant ainsi l’auto-immunité. 13 1.2.6 Cytokines Des études ont mis en évidence que le sérum de patients LED pouvait contenir des concentrations de cytokines plus élevées que celles des sujets sains [56]; dans certains cas elles étaient proportionnelles à l’activité de la maladie, ce qui en fait des cibles thérapeutiques potentielles. En effet, plusieurs études cliniques de phases I, II et III sont en cours afin de trouver de nouveaux traitements visant ces cibles potentielles. Cette stratégie est considérée comme une voie très importante puisque le débalancement des cytokines contribue fortement à l’état d’inflammation et à la perte de tolérance immune observés chez ces patients. 1.2.6.1 IL-6 L’interleukine-6 est une cytokine dont la concentration sérique est plus importante chez des patients LED que chez des sujets sains [56]. Cette protéine stimule la croissance des lymphocytes B et leur production d’immunoglobulines. Elle joue également un rôle important dans le processus d’inflammation en contribuant à la différenciation des cellules TH17 et en inhibant la différenciation des cellules Treg [85]. Des études cliniques utilisant l’IL-6 comme cible thérapeutique sont en cours avec le tocilizumab [86]. Cette molécule est un anticorps monoclonal humanisé ciblant le récepteur soluble et membranaire de l’IL-6 pour empêcher sa liaison [85]. Ce traitement a montré des résultats prometteurs dans une étude de phase I chez des patients LED en diminuant l’activité de la maladie [87]. 1.2.6.2 IL-10 Des concentrations plus élevées d’IL-10 sont retrouvées dans le sérum de patients LED en plus d’être reliées proportionnellement à l’activité de la maladie [88]. Les rôles joués par l’IL-10 dans la pathogénèse de la maladie se situent au niveau de l’activation des lymphocytes B et de son effet suppresseur sur les cellules présentatrices d’antigènes (APC) et sur les lymphocytes T [89]. Une étude clinique pilote a montré des résultats intéressants lors d’injection d’anticorps monoclonaux anti-IL-10 à des sujets humains [90]. Les résultats montraient une amélioration des lésions cutanées, des douleurs articulaires et une diminution du score SLEDAI. 1.2.6.3 IL-17 L’interleukine-17 est une autre cytokine pro-inflammatoire dont la concentration sérique est augmentée chez les patients atteints du LED comparativement à des sujets sains [91]. L’effet 14 inflammatoire de cette cytokine se traduit par l’activation de médiateurs et de chimiokines impliqués dans le processus d’inflammation, qui à leur tour, engendrent l’accumulation de neutrophiles. L’IL-17 participe également à la production de cytokines inflammatoires permettant la génération de cellules TH17 [92]. Bien que plusieurs études cliniques aient eu lieu dans des cas de maladies inflammatoires comme l’arthrite rhumatoïde et le psoriasis, cette cible thérapeutique doit être étudiée dans des cas de LED. 1.2.6.4 Interférons Des études ont démontré que les patients LED ont des concentrations sériques plus élevées d’IFN-γ et d’IFN-α, qui sont en plus reliées directement à l’activité de la maladie [93-95]. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes sont les principaux producteurs d’IFN-α. La sécrétion de cet interféron stimule le processus d’auto-immunité à plusieurs niveaux que ce soit pour l’activation des cellules dendritiques, la différenciation des monocytes, l’élimination des cellules Treg, la différenciation des lymphocytes B ou encore la production d’anticorps [96, 97]. De son côté, l’IFN-γ est un acteur important de l’immunité puisqu’il permet d’activer les macrophages, les cellules NK et les lymphocytes T cytotoxiques en plus de réguler quelques cytokines inflammatoires. Ce sont les cellules NK qui produisent l’IFN-γ au commencement de la réponse immune, puis les lymphocytes T prennent la relève une fois que la réponse immune adaptative est activée [98, 99]. Les interférons et sont aussi utilisées dans le cadre d’études cliniques comme cibles thérapeutiques pour le traitement du LED [100]. 1.2.6.5 B-cell-activating factor La molécule B-cell-activating factor (BAFF) est un important facteur de survie pour les lymphocytes B, en particulier les lymphocytes B transitionnels et matures [101]. BAFF est principalement sécrété par les cellules myéloïdes lors d’une réaction inflammatoire. Cette molécule peut se lier à trois récepteurs : TACI, BAFF-R et BCMA. Chez les patients atteints de LED, la concentration sérique de BAFF est supérieure à celle retrouvée chez des sujets sains et elle est en corrélation avec l’activité de la maladie [102]. Plusieurs agents biologiques ciblant BAFF ont été mis au point au cours des dernières années, mais seul le belimumab s’est retrouvé dans des études cliniques de phase III. Le belimumab est un anticorps monoclonal qui est capable d’inhiber, non pas la forme membranaire de BAFF, mais plutôt la forme soluble de la molécule [103]. Cet anticorps est commercialisé sous le nom de Benlysta (voir 1.2.4). 15 1.3 Cytométrie en flux et usage clinique La cytométrie en flux est un outil d’analyse très puissant et rapide et comporte des applications cliniques très utiles. En effet, il est possible d’étudier des populations cellulaires du sang comme les érythrocytes, les leucocytes et les plaquettes grâce à la disponibilité d’anticorps dirigés contre des marqueurs de surface et des protéines intracellulaires [104]. Ainsi, la cytométrie en flux peut être utilisée dans le but de détecter des anomalies immunologiques et hématologiques. Par exemple, dans les années 1980, on se servait de ce genre d’analyses pour montrer qu’un contenu anormal en ADN était indicateur de la présence d’un cancer [105]. On peut aussi se servir de cet outil pour détecter des immunodéficiences [106], analyser des clones anormaux de la maladie d’hémoglobinurie paroxystique nocturne [107] et énumérer les cellules hématopoïétiques progénitrices [108]. D’autres études se servent de la méthode du Fluorescent Cell Barcoding (FCB) pour analyser rapidement le profil de phosphorylation dans des échantillons de sang pour le diagnostic de cancer [109-111]. Cette méthode a été utilisée par notre équipe pour caractériser des échantillons de moelle osseuse de patients atteints de myélomes multiples [112]. Ce ne sont là que de brefs exemples qui montrent l’énorme potentiel de la cytométrie en flux pour des applications cliniques. 1.3.1 Human Immunophenotyping Consortium Le Human Immunophenotyping Consortium (HIC) s’insère dans un projet de grande envergure : Human Immunolgy Project Consortium. Ce programme a débuté en 2010 au National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) et a pour but de créer une banque de données caractérisant les phénotypes de cellules provenant d’individus sains et atteints de différentes maladies [113]. De plus, ce groupe propose que le phénotype ne se caractérise pas seulement par les proportions des sous-populations cellulaires, mais peut aussi inclure la réponse à des stimuli et leur état d’activation. Leur projet est basé sur l’utilisation de la cytométrie en flux. Afin d’uniformiser la méthode d’analyse, le HIC propose une sélection de marqueurs extracellulaires pour cibler les populations cellulaires du sang [26]. La figure 1.5 montre les différentes populations qui peuvent être ciblées selon les marqueurs qui les caractérisent. Ce consortium a publié une liste de panels composés de 8 anticorps ciblant ces marqueurs et qui peuvent être utilisés pour des analyses de cytométrie en flux. 16 Figure 1.4 : Sous-populations cellulaires des PBMC. Cette figure a été traduite de [26]. 17 1.3.2 Outils d’analyses de données multiparamétriques 1.3.2.1 SPADE et viSNE Actuellement, les données obtenues par cytométrie en flux sont analysées en utilisant deux paramètres à la fois avec une séquence de régions et de gates qui s’emboitent. Ces stratégies de gating conventionnel sont dites dirigées. Les données brutes comportant des panels de deux ou trois anticorps sont facilement analysées de cette façon. Cependant, plus le nombre de marqueurs analysés augmente, plus le nombre de combinaisons possibles augmente également, ce qui peut facilement créer des centaines de possibilités différentes. Par exemple, un panel de 8 anticorps peut facilement générer plus de 80 diagrammes en deux dimensions (2D). L’analyse de petites populations, rares ou inattendues est d’autant plus ardue, qu’une analyse dirigée peut très bien ne pas permettre de les observer. Dernièrement, l’équipe de Nolan a mis au point un outil d’analyse basé sur des algorithmes et permettant d’analyser des données de cytométrie en flux en regroupant les cellules qui partagent les mêmes caractéristiques phénotypiques [114]. Le programme SPADE (Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events) élimine les biais d’interprétation créés par la stratégie dirigée [115]. De plus, ce même groupe a développé viSNE, qui permet d’utiliser la représentation schématique en 2D correspondant à tous les paramètres testés [116]. ViSNE établit la position des cellules qui reflète la proximité des cellules entre elles. De plus, cet outil permet de visualiser directement via la gradation de couleur l’expression de chaque marqueur pour chaque cellule analysée. Le développement de tels outils constitue un avancement dans l’interprétation des données de cytométrie en flux car il permet de visualiser la diversité et l’hétérogénéité des cellules en un seul coup d’œil. Les auteurs proposent d’ailleurs ces outils pour établir des diagnostics cliniques [114, 116]. 18 2. Hypothèse Face à la demande des cliniciens pour trouver des tests spécifiques et quantifiables qui seraient applicables au diagnostic du LED, nous suggérons que l’identification de marqueurs biologiques mesurables grâce aux méthodes de cytométrie en flux pourrait faciliter le diagnostic, le pronostic et le traitement de la maladie. Notre hypothèse est qu’il serait possible de détecter les différences phénotypiques des cellules du sang de patients atteints de lupus érythémateux disséminé en les comparant avec des cellules provenant d’individus sains. 19 3. Objectifs 1. Criblage des profils de cytokines présentes dans le sérum des patients LED comme indicateur de leur état inflammatoire lors du prélèvement. 2. Détermination de la répartition des sous-populations de lymphocytes, de monocytes et de cellules dendritiques dans le sang des patients. 3. Évaluation de l’impact de la congélation sur la répartition des sous-populations des cellules mononucléées du sang. 20 4. Méthodologie 4.1 Source des cellules mononucléées du sang, du sérum et du plasma Le processus de recrutement, le protocole de recherche et les formulaires de consentement étaient tous approuvés par le comité d’éthique de la recherche d’Héma-Québec et celui du Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke (CHUS). Tous les participants à cette étude ont signé un formulaire de consentement éclairé. L’identité des participants et les informations personnelles recueillies par le médecin ou dans le cadre du don de sang étaient gardées confidentielles. 4.1.1 Participants en santé Pour chaque participant en santé, tous les tests de dépistage des maladies transmissibles par le sang (HIV-1, HIV-2, HLTV-I et -II, syphilis, hépatite B et C) se sont avérés négatifs. Dans le processus du don de plaquettes, les leucocytes sont captés dans une chambre de leucoréduction (chambre LRS) grâce au système Trima Accel (Gambro BCT, Lakewood, CO, É.-U). Le sang résiduel qui se trouve dans ces chambres LRS a été utilisé afin d’isoler les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC, peripheral blood mononuclear cells). Les chambres LRS ont été préparées de façon aseptique tel que décrit précédemment [117]. Leur contenu a été extrait et les cellules ont été rincées avec la solution saline tamponnée au phosphate modifié de Dulbecco (DPBS) composée de 10 mM de K2PO4, 136 mM de NaCl (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), 8 g/L de glucose (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada) additionnée de 10 % d’un anticoagulant, l’ACD (acid–citrate-dextrose, Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, É.-U.). Le sang récupéré a été déposé sur un coussin de Ficoll-Hypaque (GE HealthCare Biosciences, Baied’Urfé, QC, Canada), puis a été centrifugé à 1000 x g pendant 8 minutes en absence de frein. La centrifugation a permis la séparation et la récupération des composantes d’intérêt, soit le plasma et les PBMC. Le plasma a été conservé à 4°C jusqu’à l’analyse. Par la suite, les PBMC ont été lavés avec la solution de DPBS-glucose-ACD, ont été centrifugés à 230 x g pendant 8 minutes, puis mis à une densité cellulaire de 10, 50 ou 100 x 106 cellules/ml dans un milieu de congélation froid composé de 50 % d’IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s medium, Life Technologies, Burlington, ON, Canada), de 40 % de FBS (fetal bovine serum, Life Technologies) et de 10 % de DMSO (diméthysulfoxyde, Sigma-Aldrich). Chaque échantillon était divisé en plusieurs tubes et les cryovials ont été transférés à -80°C dans une boîte CoolCell (Biocision, Mill Valley, CA, É.U.) qui permet de diminuer la température d’environ 1°C/minute. Le lendemain, soit après 1221 18h à -80°C, les cryovials contenant les cellules ont été transférés dans des contenants d’azote en phase liquide. 4.1.2 Patients LED Ce projet impliquant des échantillons de patients LED a été possible grâce à la collaboration entre l’équipe à Héma-Québec et les collaborateurs de Dr Gilles Boire du CHUS. Les participants étaient recrutés dans le cadre d’une visite à leur médecin traitant. Les patients qui acceptaient de participer à cette étude devaient avoir été diagnostiqués selon les critères de l’American College of Rheumatology pour le LED. De plus, lors de leur visite, le médecin établissait l’activité de la maladie mesurée selon le SLE Disease Activity Index (SLEDAI), le Systemic Lupus International Collaborating Clinics (SLICC) et le SLE Activity Measure (SLAM). Une fois recruté, l’infirmière coordonnatrice complétait une liste des médicaments pris au moment de la visite et un bref questionnaire sur l’état de santé du patient. Tous ces documents étaient fournis pour chaque échantillon relié à notre étude. Dans le cadre de cette étude, 36 échantillons de sang ont été récoltés entre juillet 2005 et décembre 2013 (LED-24 à LED-59). Les échantillons des patients LED-24 à LED-54, prélevés entre juillet 2005 et avril 2011, avaient été prélevés dans des tubes (< 10 tubes) contenant de l’héparine et transportés dans des boîtes de styromousse avec une cassette réfrigérante pour les maintenir entre 4°C et 8°C. Par la suite, la méthode de transport fut modifiée afin d’obtenir une meilleure récupération en cellules totales. Pour les échantillons LED-55 à LED-59, entre 8 et 15 tubes de sang contenant de l’ACD (anticoagulant-citrate-dextrose BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada) ont été prélevés ainsi qu’un tube sans anticoagulant permettant de récupérer le sérum. Les tubes ont été transportés à la température de la pièce dans des boîtes isolées en polystyrène et envoyés par transport rapide au centre de Québec. Tous les tubes ont été traités dans un maximum de 24h après le prélèvement de l’échantillon (incluant le temps de transport). Les tubes ont été ouverts et laissés au repos pendant 10 minutes, puis le contenu a été dilué 1:1 avec une solution de DPBS-glucose additionnée de 2% de sérum bovin fœtal (FBS). Les PBMC ont été isolés et congelés tel que décrit à la section 4.1.1. Le tube sans anticoagulant a été centrifugé à 800 x g pendant 30 minutes en absence de frein, puis le sérum récupéré a été conservé à 4°C jusqu’à l’analyse. 22 4.2 Analyses phénotypiques 4.2.1 Marquage extracellulaire Habituellement, un tube de chaque échantillon de cellules était décongelé et utilisé pour une série d’analyses de cytométrie en flux. Les tubes de cellules ont été décongelés dans un bainmarie à 37°C jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau de glace, puis leur contenu a été transféré goutte à goutte dans une solution froide de DPBS-glucose contenant 50% de FBS. Selon la qualité des échantillons, une solution de DNAse (Sigma-Aldrich) pouvait être ajoutée afin de briser les agrégats formés par l’éclatement des cellules. Ce problème a été observé dans 3 échantillons. Les analyses phénotypiques ont été faites à partir de 1 x 106 cellules/panel d’anticorps. Les cellules ont été centrifugées à 230 x g pendant 6 minutes, puis mises en suspension dans 0,1 ml de PBS (solution de saline tamponnée 10mM). Par la suite, les cellules ont été incubées en présence d’un marqueur de viabilité, l’Alexa-fluor 488 à 1,25 µg/mL (Invitrogen), pendant 30 minutes. Les cellules ont été lavées avec une solution de PBS et mises en suspension dans du PBS contenant 1% (v/v) FBS et 0,01% (p/v) NaN3 (Sigma-Aldrich). Afin d’éliminer la liaison non-spécifique, du sérum de souris (Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, PA, É.-U.) préalablement décomplémenté à 55°C pendant 30 minutes a été ajouté à une concentration finale de 5% (v/v). Les anticorps listés plus bas (section 4.3.2) ont été ajoutés aux cellules selon les instructions des manufacturiers pour une période de 15 à 30 minutes à la température de la pièce (TP) et conservés à la noirceur. Les cellules marquées ont ensuite été fixées à l’aide d’une solution de formaldéhyde à 2% pendant 10 minutes à TP. Les cellules fixées ont été lavées et remises en suspension dans la solution de PBS-FBS-NaN3. Les cellules ont été conservées à 4°C jusqu’à leur analyses avec le cytomètre en flux. Une série d’essais a été réalisée avec 10 échantillons de chambres LRS afin de déterminer l’impact de la congélation sur la détection des marqueurs. Les cellules ont été analysées avant la congélation, immédiatement après la décongélation et à la suite de périodes de repos de 1h et 24h post-décongélation. Pour les périodes de repos, les cellules étaient remises en suspension dans un milieu IMDM contenant 10% FBS et incubées à 37°C dans un incubateur à CO2. 4.2.2 Anticorps La liste des anticorps utilisés pour réaliser la caractérisation des cellules est présentée au tableau 4.1. Tous les anticorps étaient des IgG et des anticorps monoclonaux de souris couplés à des 23 molécules fluorescentes. Plusieurs populations de cellules ont été ciblées à l’aide d’un panel constitué de 7 anticorps couplés à des fluorochromes différents et permettant de détecter spécifiquement les lymphocytes T, les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes T auxiliaires, les lymphocytes B et un groupe composé de cellules dendritiques, de monocytes et de cellules NK. À une exception près, la composition de ces panels était telle que proposée par le consortium Human Immunology Project pour la standardisation du phénotypage des cellules humaines [26] (Tableau 4.2). L’exception étant qu’un anticorps anti-CD138 a été substitué à l’anti-HLA-DR dans le panel ciblant les lymphocytes B pour détecter les plasmocytes. Finalement, une série supplémentaire de marquages extracellulaires a été ajoutée afin de déterminer la fréquence des populations cellulaires majeures de leucocytes soit les lymphocytes B et T, les monocytes et les cellules NK (Tableau 4.2). 24 Tableau 4.1: Liste des anticorps monoclonaux utilisés pour la caractérisation des PBMC Fluorochrome1 Marqueur Clone AF488 PE Fabricant Viabilité Invitrogen CCR7 150503 BD Biosciences CD25 M-A251 BD Biosciences CD24 ML5 Biolegend CD56 MEM-188 Biolegend CXCR3 1C6/CXCR3 BD Biosciences PerCP-Cy5.5 CD4 RPA-TA Biolegend CD14 MϕP9 BD Biosciences CD19 SJ25C1 eBioscience CD123 6H6 Biolegend PE-Cy7 CCR4 1G1 BD Biosciences CCR6 R6H1 eBioscience CD11c 3.9 Biolegend CD27 O323 eBioscience CD45RA H100 BD Biosciences APC CD16 3G8 Biolegend CD38 HB7 BD Biosciences CD127 eBioRDR5 eBioscience APC-H7 CD3 SK7 BD Biosciences CD8 SK1 BD Biosciences CD19 SJ25C1 BD Biosciences CD20 2H7 BD Biosciences CD45RO UCHL1 BD Biosciences V450 CD3 UCHT1 BD Biosciences CD14 MϕP9 BD Biosciences V500 HLA-DR G46-6 BD Biosciences CD45 HI30 BD Biosciences BV 421 IgD IA6-2 BD Biosciences Pacific Orange CD138 BA-38 Exbio 1. AF (Alexa Fluor), PE (phycoerythrin) ; PerCP-Cy5.5 (peridine-chlorophyll protein –cyanine 5.5); PE-Cy7 (PE-cyanine 7) ; APC (allophycocyanin) ; APC-H7 (APCcyanin H7). ; BV 421 (Brilliant violet 421). 25 Tableau 4.2 : Panels des cibles cellulaires en fonction des marqueurs de surface. Adapté de [26]. Marqueurs 2 Lymphocytes T 1 FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 Couleur AF 488 PE PerCP* PE-Cy7 APC Totaux T reg CCR7 CD4 CD45RA CD25 CD4 CCR4 CD38 CD127 Lymphocytes T aux B Viabilité CXCR3 CD24 CD4 CD19 CCR6 CD27 CD38 CD38 DC, Mɸ et NK Populations majeures3 CD56 CD123 CD11C CD56 CD14 CD19 CD16 ou CD19 CD16 CD3, CD19, CD20 CD14 HLA-DR FL6 APC-H7 CD8 CD45RO CD8 CD20 NA FL7 V450 CD3 CD3 CD3 CD138 CD3 FL8 V500 HLA-DR HLA-DR HLA-DR IgD CD45 1. AF (Alexa Fluor); PerCP* (PerCP-Cy 5 .5) 2. Les lymphocytes T mémoires et naïfs (Totaux), les sous-populations de lymphocytes T régulateurs (reg) et auxiliaires (aux; TH1, TH2, TH17). 3. Les cellules dendritiques (DC) les cellules NK et les monocytes (Mɸ). 4. Les lymphocytes T et B, les cellules NK et les monocytes. 4.2.3 Acquisition et analyse des données L’acquisition des données a été effectuée avec le cytomètre en flux CyFlow ML et le logiciel FlowMax 3.0 (Partec, Münster, Allemagne). Les débris ont été exclus des analyses en délimitant une région basée sur la taille (FSC) et la granularité (SSC) attendues des cellules. Cette région a servi de paramètre afin de faire l’acquisition de 50 000 à 70 000 évènements correspondant à des cellules pour chaque panel de marquage réalisé. Pour chaque échantillon de cellules, un témoin de cellules non marquées a été utilisé afin d’éliminer l’autofluorescence. De plus, pour chaque panel, des tubes contrôles FMO (fluorescent minus one) [118] ont été utilisés pour déterminer l’emplacement des quadrants pour séparer les cellules positives et les cellules négatives pour un marqueur donné en fonction du fluorochrome utilisé. Des billes de compensation (Compbeads; BD Biosciences) ont été préparées pour chaque fluorochrome et utilisées pour calculer et éliminer le chevauchement entre les différents fluorochromes. Les analyses ont toujours été réalisées sur les données compensées. À la suite de l’acquisition, l’analyse des données a été effectuée avec le logiciel FCS Express version 4 (De Novo Software, Los Angeles, CA, É.-U.). 26 4.2.3.1 Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events (SPADE) Les données brutes ont aussi été analysées afin de minimiser l’impact des limites imposées par l’utilisation de quadrants et le concept classique des cellules positives ou négatives pour un marqueur. Le logiciel SPADE a été mis au point par l’équipe de Garry P. Nolan [109] et permet l’analyse multiparamétrique de données brutes de cytométrie en flux ou de cytométrie de masse en utilisant directement les valeurs compensées. Il est possible de travailler avec SPADE en passant par Cytobank, une plateforme de partage et d’analyse de données de cytométrie. Cet outil peut être utilisé de façon complémentaire au logiciel FCS Express afin de visualiser globalement les cellules selon toutes les cibles utilisées dans chaque panel. SPADE utilise des algorithmes complexes pour regrouper en nœuds les cellules ayant des caractéristiques communes selon leurs marqueurs de surface. SPADE permet de visualiser une arborisation représentative de l’intensité de l’expression des différents marqueurs extracellulaires. SPADE permet aussi d’établir un ratio à partir de l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) de fichiers de référence. Dans cette étude, le fichier de référence utilisé était constitué de la moyenne de tous les échantillons de participants en santé (21). Par la suite, chaque analyse pour chacun des échantillons de patients LED ou de participants en santé a été comparée à cette arborisation moyenne/référence afin de visualiser les similitudes et les écarts. Les évènements analysés dans FCS express ont d’abord été restreints par une région dessinée autour des cellules vivantes en excluant les cellules positives pour le marquage Alexa-fluor 488. Ces fichiers de données (cellules vivantes) et la matrice de compensation ont été exportés à la plateforme Cytobank afin de construire une arborisation prédéterminée de 100 nœuds. Une fois créée, cette arborisation a été utilisée afin de visualiser l’intensité de fluorescence (échelle de couleurs) pour chaque marqueur de tous les panels (Tableau 4.2), et ce, pour chaque échantillon de cellules de patients et de participants en santé. Les six panels utilisés ont générés à eux seuls 42 pages de données regroupant chacun les 18 ou 21 échantillons de patients LED ou de participants en santé respectivement. 27 4.3 Dosage des facteurs solubles 4.3.1 ELISArray Le sérum des échantillons des patients ou le plasma des échantillons des participants en santé ont été analysés pour leur contenu en facteurs solubles. Une analyse qualitative des facteurs solubles retrouvés dans le sérum de patients LED et dans le plasma de participants en santé a été faite par la méthode d’ELISArray selon les instructions du manufacturier (Qiagen, Toronto, ON, Canada). La trousse (Human Inflammatory Cytokines Multi-Analyte ELISArray) permettait la détection simultanée de 12 cytokines et chimiokines : IL-1A, IL-1B, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17A, IFN-γ, TNF-α et GM-CSF. Tous les enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ont été réalisés avec les réactifs, incluant les contrôles, les solutions et le plateau de la trousse. Les lavages ont été faits à la main et les incubations ont été réalisées à la température de la pièce. Brièvement, les échantillons et le cocktail d’antigènes ajouté au plateau ont été incubés pendant 2h pour ensuite être lavés 3 fois. Par la suite, les anticorps de détection couplés à la biotine ont été ajoutés et le plateau a été incubé pendant 1h. Les échantillons ont été lavés trois fois avant l’addition de la peroxydase couplée à l’avidine et incubés pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. Finalement, le plateau a été lavé à quatre reprises et la solution de développement a été ajoutée. Le plateau a été incubé pendant 15 minutes à l’abri de la lumière et la solution d’arrêt de la réaction enzymatique a ensuite été ajoutée. Les densités optiques ont été mesurées à une longueur d’onde de 450 nm et une référence de 570 nm avec le lecteur de plaque ELISA MRW 386-4RD (Dynatech Laboratories, Billinghurst, Royaume-Uni). 4.3.2 Essai Bioplex Le dosage de facteurs solubles retrouvés dans le sérum de huit patients LED a été réalisé dans le cadre d’une journée de formation Bio-Plex qui a eu lieu à Québec. Les manipulations ont été effectuées par le spécialiste de la compagnie Bio-Rad, en utilisant la trousse Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada) et en réalisant les analyses sur un Luminex. Les 27 cytokines mesurées lors de cet essai sont listées au tableau 5.2 de la section des résultats. Aucune information concernant la nature de ces échantillons n’a été révélée lors de cette démonstration de méthode. Les données brutes ont été gracieusement fournies sous une forme de fichier Excel et elles ont été analysées par la suite dans le cadre de ce projet. 28 4.4 Activation in vitro 4.4.1 Milieu de culture Les analyses de cytométrie et les ELISA visaient à détecter les cellules et les facteurs solubles tels que présents dans les échantillons de sang au moment du prélèvement. Des essais ont aussi été réalisés afin de visualiser leurs activités physiologiques. Tous les essais d’activation in vitro ont été effectués dans un milieu exempt de protéines animales (BPFM). Ce milieu était composé d’IMDM additionné de 1% (v/v) d’un mélange d’insuline, de transferrine et de sélénium (ITS, provenant tous de Invitrogen), de 20 µg/ml de lipoprotéines de basses densité (LDL, SigmaAldrich), de 70 µg/ml d’acétate d’α-tocophérol (Sigma-Aldrich), de 250 μg/ml d’albumine humaine plasmatique (HSA; Héma-Québec, Québec, QC, Canada), de 60 ng/ml du facteur de croissance insulin-like long R3 humain recombinant (IGF, Sigma-Aldrich), de 100 μM de Trolox (Sigma-Aldrich, < 0,01 EU/ml d’endotoxines), de 5,5 μg/ml d’holotransferrine humaine (BD Biosciences) et de 0,125% d’un mélange lipidique défini (LP-1, Sigma-Aldrich). Le mélange lipidique LP-1 contenait 2 μg/ml d’acide arachidonique, 10 μg/ml des acides linoléique, linolénique, myristique, oléique, palmitique et stéarique, 220 μg/ml cholestérol, 2,2 mg/ml Tween-80, 70 μg/ml d’acétate de tocophérol et 100 mg/ml d’acide pluronique F-68. 4.4.2 Essais d’activation Les cellules (PBMC) ont été décongelées tel que décrit à la section 4.3.1. À la suite de la décongélation, une solution de DNAse a été ajoutée aux cellules afin de faciliter la manipulation des échantillons où l’ADN présente en grande quantité occasionnait la formation d’agrégats. Les cellules ont ensuite été mises en culture dans le milieu BPFM à une densité cellulaire de 1 x 106 cellules/ml dans un plateau de 6 puits Ultra-Low Attachment (Corning, Corning, NY, É.-U.). Les cellules ont été soumises à une activation de 24h réalisée en fonction des conditions suivantes : la première avec des billes anti-CD3/anti-CD28 (Life Technologies) à une concentration de 4 lymphocytes T/bille et de l’IL-2 à 10 ng/ml (équivalent à 100 U/ml) (Peprotech, Rocky Hill, NJ, É.-U.) et la seconde avec un mélange de trois types de lipopolysaccharides (LPS, Sigma-Aldrich) à une concentration finale de 400 ng/ml provenant de différents sérotypes d’Escherichia coli (026 :B6, 0111 :B4 et 055 :B5) et du PMA à 50 ng/ml (Sigma-Aldrich). Un échantillon de cellules non-stimulées servait de contrôle pour mesurer l’impact des activateurs. Les essais ont été faits en parallèle avec un échantillon provenant d’un participant en santé et d’un patient LED. 29 Après 24h d’activation, les surnageants ont été récoltés et conservés à 4°C jusqu’à leur analyse pour leur contenu en facteurs solubles. Le phénotype des cellules à la suite de l’activation a aussi a été analysé par cytométrie en flux en ciblant les cellules vivantes et leur distribution au niveau des populations majeures (Tableau 4.2) et en ciblant spécifiquement les lymphocytes T (CD3) et B (CD19) en fonction de l’expression de CD38. 4.4.3 Mesure des facteurs solubles dans les surnageants de culture Les concentrations d’IL-2, d’IL-6, d’IL-17A, d’IFN-γ (interféron), de RANTES (Regulated on Activation, Normal T Cell Expressed and Secreted) et d’IgM ont été mesurées dans les surnageants des cellules activées et non-activées par ELISA. Le dosage des IgM a été réalisé avec des anticorps polyclonaux de chèvre anti-IgM ciblant la chaine lourde mu des IgM et révélé avec un des anticorps de chèvre polyclonaux couplé à la peroxydase. Tous ces anticorps provenaient du laboratoire Jackson Immunoresearch Laboratories. La courbe étalon en IgM variant entre 10 et 100 ng/mL était réalisée avec un sérum de référence humain (The Binding Site, San Diego, USA). La détermination des concentrations d’IL-2, d’IL-6, d’IL-17A d’IFN-γ et de RANTES a été réalisée avec des anticorps spécifiques polyclonaux et un système d’amplification biotineavidine. Les anticorps ciblant l’IL-2 étaient des anticorps de chèvre polyclonaux non-couplés pour la capture et couplés à la biotine pour la détection. L’avidine couplée à la peroxydase était utilisée en couche finale de révélation. Tous les autres ELISA ciblant IL-6, IL-17A, IFN- et RANTES étaient basés sur un système identique, cette fois-ci avec des anticorps polyclonaux de lapin. Tous les réactifs utilisés provenaient des trousses ELISA development kit human (Peprotech). Le substrat dans tous ces tests ELISA, incluant le dosage des IgM, était le 3,3′,5,5′Tétraméthylbenzidine (TMB) et les densités optiques ont été mesurées à une longueur d’onde de 450 nm et une référence de 630 nm avec le lecteur de plaque ELISA MRW 386-4RD (Dynatech Laboratories). 4.5 Analyses statistiques La distribution des données a été établie selon la loi gaussienne et la variance a été déterminée et utilisée afin de choisir le bon test statistique pour comparer les données de chaque série d’expérimentations avec des tests paramétriques ou non-paramétriques [119]. Les analyses 30 statistiques de comparaison multiple ont été réalisées avec le logiciel GraphPad InStat version 3 (GraphPad Software, San Diego, CA, É.-U.). Les tests post-hoc utilisés sont décrits dans chacune des sections. Des séries de données sont présentées sous forme de boites à moustaches réalisées avec le complément du logiciel Excel soit Analyse-it (Analyse-it Software, Ltd, Leeds, UK). Les boites à moustaches sont limitées par les 1ers et 3ièmes quartiles et la ligne du milieu représente la médiane. Les barres verticales indiquent l’intervalle de confiance de 95% et les carrés positionnent les données aberrantes. Le complément Analyze-it a aussi été utilisé pour faire les analyses avec le t-test de Student. Les données des histogrammes sont présentées en moyenne ± écart type de moyenne (S.E.M.). 31 5. Résultats 5.1 Caractéristiques médicales des patients et des participants à l’étude Les patients atteints de lupus qui ont participé à cette étude ont été recrutés par l’équipe de Dr. Gilles Boire du Service de rhumatologie du centre hospitalier universitaire de Sherbrooke. C’est au moment de leur visite chez leur médecin que les informations sur leur état de santé étaient recueillies et que le prélèvement de sang était réalisé à la suite de leur acceptation de participer à notre étude. Les données présentées dans le tableau 5.1 montrent un résumé des caractéristiques médicales des patients ayant participé à l’étude. Bien que ce tableau de données montrent 21 échantillons, les valeurs proviennent de 18 patients différents puisqu’il était possible de participer à cette étude plus d’une fois. C’est le cas pour LED-45 et LED-48 provenant d’une patiente qui a participé à 7 mois d’intervalle ainsi que LED-35, LED-44 et LED-54 dont les échantillons ont été prélevés à environ 12 mois d’intervalle. Les patients recrutés étaient tous des adultes et étaient principalement des femmes (17/18; 94%). Les traitements suivis par les patients peuvent être classés en trois catégories : antipaludiques, corticostéroïdes et immunosuppresseurs. Certains patients utilisaient également d’autres types de traitements pour traiter diverses conditions médicales comme la haute pression artérielle, le cholestérol, l’ostéoporose et la dépression (données non spécifiées). Le diagnostic de la maladie se fait selon les critères révisés de l’American College of Rheumatology (ACR). Un résultat positif pour au moins 4 critères constitue un diagnostic confirmé. Par contre, bien que les patients LED-46 et LED-50 présentent un nombre inférieur de critères, soit 3 et 2 respectivement, le diagnostic de la maladie avait été établi précédemment lors du premier diagnostic. Il est important de noter que le niveau d’activité de maladie chez la plupart des sujets était plutôt faible. En effet, seulement 2 patients (échantillons 35-44 et 52) avaient un indice SLEDAI supérieur à 6. Les différences entre les indices d’activité de la maladie peuvent s’expliquer par le fait que des critères et des périodes de temps différentes sont évalués pour chacun des index utilisés. Pour l’indice SLEDAI, les symptômes doivent être observés le jour de la consultation ou 10 jours précédents la rencontre, alors que l’intervalle de temps augmente à 6 mois pour l’indice SLICC et à 30 jours pour l’indice SLAM. Les participants en santé qui ont accepté de participer à cette étude étaient tous des hommes. Les échantillons de sang de ces participants, qui étaient tous des donneurs de plaquettes, ont été 32 trouvés négatifs pour tous les tests sur les maladies transmissibles. De plus, le questionnaire de santé complet auquel tous les donneurs de sang sont soumis permet de s’assurer que leur état de santé est excellent. 33 Tableau 5.1 : Caractéristiques médicales des patients atteints de LED. Patients1 Indice d’activité de la maladie2 No. LED Genre ACR3 Traitement4 SLEDAI SLICC SLAM 34 35** 36 37 38 39 40 41 42 43 44** 45* 46 47 48* 49 50 51 52 53 54** F F F F F F F F F F F F H H F F F H H F F 5 8 4 4 6 9 7 4 5 5 9 5 3 4 4 ND 2 5 4 4 9 C A, C, O A, C, I, O A, C, I, O A, C, I, O I, O A, C, I, O O A, I, O A, I A, I, C, O A, C, I, O ND I A, C, I I A A, O 4 8 2 4 4 2 4 4 0 0 10 0 0 4 0 ND 0 2 8 2 5 ND 3 0 4 1 3 0 0 0 0 2 0 1 0 0 ND 3 1 3 0 5 ND 13 3 5 8 3 10 1 1 3 18 0 3 8 0 ND 1 2 2 2 19 1 Les échantillons LED-45 et LED-48 proviennent du même patient (*); les échantillons LED-35, LED-44 et LED-54 (**) proviennent du même patient. 2 Tel qu’établi lors de la visite ou dans les 10 jours précédents la visite pour le Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI). Le Systemic Lupus International Collaborative Clinics (SLICC) note les dommages qui sont arrivés depuis le diagnostic de la maladie et présents pendant au moins 6 mois alors que les symptômes doivent être présents 1 mois précédant la visite pour établir le Systemic Lupus Activity Measure (SLAM). 3 Correspond au nombre de critères positifs selon l'American College of Rheumatology pour établir le diagnostic du LED ; nd : non disponible. 4 Les traitements suivis par les patients sont listés tels que (A) antipaludiques (principalement hydroxychloroquine), (C) cortocostéroïdes (principalement prednisone), (I) immunosuppresseurs comme azathioprine, cyclosporine ou mycophénolate moletil et (O) autres. Note: Les informations médicales du patient 49 n’ont pas été obtenues à cause d’un problème administratif. 34 5.2 Patron des cytokines Les cytokines jouent un rôle important dans la pathogénèse du lupus et leur présence débalancée dans le sang des patients pourrait s’avérer un indice de l’activité de la maladie [56]. Afin de déterminer l’état inflammatoire des échantillons de patients LED en comparaison avec celui des participants en santé (HC, Healthy control), le niveau des cytokines inflammatoires a été déterminé dans le sérum et le plasma. La figure 5.1 montre la moyenne des résultats pour les 21 échantillons LED (LED) et pour 12 participants en santé (HC). Les données sont exprimées en pourcentage du contrôle positif pour IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17A, IFN-γ, TNF-α et GM-CSF. Ce dosage qualitatif montre que plusieurs cytokines étaient plus élevées dans les échantillons LED. En effet, bien que les niveaux soient variables indépendamment des cytokines, il est possible de constater que les cytokines IL-1α, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10 et IL-17A, ainsi que l’IFN-γ étaient présentes en plus fortes concentrations chez les patients atteints de LED. Ces différences sont statistiquement significatives. Par contre, l’augmentation en IL-1α, IL-2, IL-17A et IFN- γ étaient les plus importantes bien que leur quantité relative atteignait entre 5% et 15% du contrôle positif. Dans leur ensemble, ces moyennes ne donnent pas de mesure excessive de facteurs solubles en considérant leurs valeurs relatives face au contrôle positif. 35 36 5.2.1 Facteurs solubles dans le sérum des patients LED Puisque la maladie peut être très hétérogène d’un patient à un autre, les résultats montrés à la figure 5.1 ont été analysés en profondeur pour chaque échantillon de patient. Ainsi, il est plus facile de constater les variations d’un patient à un autre. La figure 5.2 montre le profil des cytokines inflammatoires présentes dans le sérum des patients LED. Les données sont montrées pour tous les échantillons des patients LED qui ont été classées en ordre croissant de SLEDAI. Les valeurs de densité optique ont été transposées en intensité relative de couleur correspondant au ratio du test sur le contrôle négatif de chaque cible. Ainsi, plus la couleur est foncée, plus le niveau de facteurs solubles est élevé. Les résultats obtenus à la figure 5.2 montrent une grande hétérogénéité quant au niveau des différentes cibles solubles chez les patients LED. En effet, parmi les 21 échantillons différents, 14 montrent une sécrétion très faible, voire quasiment nulle, de cytokines dans le sérum alors que les 7 autres échantillons montrent des niveaux plus élevés quoique très variables. Dans les faits, ces 7 échantillons proviennent de 7 patients différents. Il est à noter que les échantillons 45 et 48, qui ont été prélevés à 7 mois d’intervalle, passent d’un niveau négligeable à fort pour 9 cibles. Tout comme les échantillons 35, 44 et 54, où seulement LED-44 montrent un niveau d’IFN- plus élevé, et ce bien que le SLEDAI de ce patient soit respectivement de 8, 10 et 5 lors des trois visites chez le médecin. Bien que certaines études montrent une corrélation entre les indices SLEDAI et les cytokines présentes dans le sérum [56], aucun lien n’a été observé pour nos participants. En effet, les patients ayant une maladie active, c’est-à-dire ceux qui ont un SLEDAI d’au moins 5, n’ont pas nécessairement une plus grande concentration de cytokines inflammatoires. Cette observation va dans le même sens pour les participants dont la maladie est inactive et où on pourrait s’attendre à un niveau négligeable dans tous les cas. Finalement, ces résultats ne permettent pas d’identifier une piste de point commun entre les échantillons LED et donnent une grande variation inter- et intra-individuelle. Les traitements des patients pourraient avoir un rôle à jouer puisque les immunosuppresseurs inhibent l’activité cellulaire et donc la sécrétion de cytokines. Cette explication serait valable pour les échantillons 42, 44, 48 et 53 puisque qu’ils ont un niveau élevé 37 de cytokines et que les patients ne prenaient pas d’immunosuppresseurs. Par contre, les patients 46, 51 et 52 prenant des immunosuppresseurs avaient aussi des profils élevés pour plusieurs cytokines. 38 39 Une sélection de 8 échantillons LED a été analysée dans le cadre d’un atelier donné par Bio-Rad sur l’utilisation de la technologie Luminex. Ces quantifications ont permis de visualiser une sélection de 27 cytokines et facteurs solubles. Le tableau 5.2 présente les données concernant le niveau des cytokines dans le sérum de ces 8 patients LED. Ces concentrations ont été mesurées à l’aide de la trousse Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay. Les résultats montrent les concentrations des cibles en pg/mL. Les 8 échantillons ont été choisis en fonction de leur indice SLEDAI en incluant des patients dont l’indice était nul (0), faible (2-4) ou faiblement élevé (8). À ce moment-là, les patients avec un indice SLEDAI nul ou faible ont été choisis pour servir de contrôle puisqu’aucun sérum de participants en santé n’était disponible pour ces analyses. Dans l’ensemble, plusieurs cytokines avaient des concentrations trop faibles dans le sérum pour être détectables, et ce, dans les sérums des 8 patients. Les concentrations sont donc en deçà des limites de détection de la trousse (LD) pour IL-1b, IL-10, IL-13, MIP-1a et TNF-, qui ne sont pas listés dans ce tableau. Une fois de plus, nous observons que l’indice SLEDAI ne semble pas corréler avec les concentrations des 27 cytokines présentes dans le sérum. Il ne faut pas oublier que 7, soit la majorité des échantillons, avaient un indice SLEDAI faible (≤ 4), le maximum étant de 8 pour LED-52. Aucune tendance générale ne se dégage des données obtenues. Peu importe la cytokine analysée, les valeurs pouvaient être plus ou moins élevées indépendamment des indices d’activité de la maladie. Par ailleurs, 2 échantillons avec le même indice pouvaient donner des résultats très différents, de même qu’un échantillon avec un indice nul comparativement à un échantillon d’indice plus élevé. De plus, aucun lien ne peut être fait avec les autres index de classification ACR, SLICC ou SLAM. Idéalement, il faudrait comparer ces données avec des valeurs obtenues à partir de sérum de participants en santé. Cette trousse est heureusement très utilisée pour cribler les cytokines chez l’humain et il sera possible de comparer nos résultats LED à ceux de Biancotto et collaborateurs [120]. Le but de cette équipe, qui a utilisé la même trousse, était justement de déterminer la concentration de ces 27 cytokines chez 144 participants en santé afin d’avoir des valeurs de référence pour l’humain. En comparant nos résultats obtenus à ceux de l’équipe de Biancotto, la majorité des concentrations de cytokines dans les échantillons LED sont plus faibles que ceux des échantillons provenant de participants en santé, soit entre 2 et 50 fois moins selon les cytokines. La période de conservation de nos échantillons à 4°C, de plus de 1 mois dans tous les cas, peut 40 certainement expliquer ces valeurs plus faibles que la normale attendue. Par contre, la cytokine GM-CSF se démarque par son niveau très élevé par rapport à toutes les autres cytokines. Nos données correspondent à une concentration environ 30 fois plus élevée que les données obtenues par Biancotto et son groupe pour des individus en santé. Cette dernière observation suggère que le GM-CSF serait un candidat possible pour visualiser le débalancement dû au lupus érythémateux disséminé, et ce, même lorsque la maladie est peu active. 41 Tableau 5.2 : Niveau des cytokines dans le sérum de patients sélectionnés. Patients No. LED Cibles3,4 IL-1Ra IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-12(p70) IL-15 IL-17 Eotaxin FGF-b G-CSF GM-CSF IFN-g CXCL-10 MCAF/MCP-1 PDGF-bb MIP-1b RANTES VEGF 34 36 19,3 nd 0,3 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 30,3 nd nd 84,0 81,9 15,4 38,6 45,7 65,2 21,6 nd 3,1 5,2 nd nd nd nd 22,2 nd 19,9 nd nd 20,4 8,9 nd 18,6 27,6 16,0 nd 42,1 Activité4 ACR SLEDAI SLICC SLAM 5 4 ND ND 4 4 4 3 39 41 48 51 52 Concentration des cytokines (pg/mL)1 nd 28,0 17,7 22,7 17,7 3,9 nd 4,1 5,2 3,3 nd 0,6 0,5 0,5 1,0 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 2,2 3,4 2,2 nd 2,4 2,9 3,6 2,8 nd nd nd 17,2 12,1 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 6,3 4,7 5,6 20,0 9,3 nd nd nd nd 18,3 nd 29,6 35,0 18,7 35,9 nd 8,9 11,7 19,5 13,1 nd 551,3 15,8 43,9 34,6 28,3 20,3 15,8 75,6 33,6 21,9 33,5 263,7 66,0 770,7 11,6 15,3 31,3 24,5 15,6 67,3 583,9 146,7 248,4 242,4 151,5 85,8 109,2 31,5 27,9 9 2 3 3 4 4 0 1 4 0 0 0 1 5 2 1 2 4 8 3 2 53 LD nd 4,1 1,1 nd nd 2,5 2,8 3,4 nd nd 8,0 nd 13,6 nd 55,7 19,5 24,2 26,6 1250,6 15,3 144,7 21,5 16,4 3,2 0,3 2,3 1,7 2,3 1,7 2,4 9,2 6,9 6,7 6,7 3,7 9,2 4,9 7,4 4,4 6,1 8,8 3,4 8,5 9,1 4 2 0 2 La trousse Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay a été utilisée pour ces dosages. nd signifie non-détecté, i.e. en deçà de la limite de détection (LD). 3 Les facteurs solubles suivants : IL-1b, IL-10, IL-13, MIP-1a et TNF-α n’ont pas été détectés dans aucun des 8 sérums testés. 4 Les indices d’activité de la maladie tels qu’enregistrés le jour du prélèvement du sérum sont indiqués pour chaque patient. ND; non déterminé. 2 42 5.2.3 Sécrétion in vitro Le niveau de cytokines sécrétées directement par les cellules peut aussi être une bonne indication du niveau de maladie des patients LED. Le contenu du sérum étant tributaire des conditions de conservation des échantillons qui, dans notre cas, était à 4°C pendant plusieurs mois. Pour ce faire, les cellules mononucléées de 3 patients LED (41, 46 et 47) et de 3 participants en santé ont été mises en culture pendant 24 heures avec ou sans agents mitogéniques dans le but de générer une activation des populations cellulaires. Les conditions utilisées permettaient d’activer les lymphocytes T, les lymphocytes B et les monocytes. La figure 5.3 montre les résultats obtenus pour la mesure de RANTES dans les surnageants à la suite de l’activation des cellules. Tel qu’attendu, les cellules des participants en santé (HC) produisent une plus grande quantité de RANTES à la suite d’une activation polyclonale via CD3/CD28 ou en présence du mélange LPS/PMA comparativement à la condition non-stimulée (NS) qui servait de contrôle. En comparaison, les cellules de patients LED produisent un niveau de RANTES sensiblement identique indépendamment de la condition à l’essai. Par contre, il n’y avait aucune différence significative entre les valeurs LED et HC. Nos essais ont aussi permis d’observer une forte sécrétion d’IL-2 à la suite de la stimulation avec CD3/CD28 et une sécrétion d’IL-6 et IgM à la suite de la stimulation avec LPS/PMA. Tous ces résultats confirment que les conditions d’activation ont bien fonctionné (données non montrées). Il est important de noter que parmi les 3 échantillons LED à l’essai, seulement LED-41 s’est démarqué contrairement aux 2 autres échantillons avec une concentration moyenne de RANTES d’environ 5 fois plus élevée. Des essais supplémentaires avec deux autres échantillons LED (46 et 47) ont permis d’observer la même augmentation de RANTES dans les cellules non-stimulées et cette augmentation était aussi comparable à celle des cellules stimulées avec le mélange LSP/PMA. Il y aurait donc une possibilité que RANTES puisse être un candidat comme marqueur biologique de la maladie. 43 44 5.3 Étude comparative de l’effet de la congélation sur les PBMC 5.3.1 Effets de la congélation sur les lymphocytes et les monocytes La deuxième partie de cette étude visait directement le phénotype cellulaire des cellules mononucléées du sang (PBMC) des patients LED, qui avaient été isolées et congelées suite à leur réception. Afin de déterminer l’effet de la congélation sur les PBMC, une étude a été effectuée pour comparer la fréquence des populations cellulaires provenant d’échantillons de participants en santé. Lors de ces essais, l’effet d’une période de rééquilibre post-congélation a aussi été testé. Les PBMC provenant d’échantillons indépendants ont été analysés pour déterminer leur phénotype par cytométrie en flux. Les analyses ont été réalisées avant la congélation (frais; n=10), immédiatement après un cycle de congélation-décongélation (0h; n=10) ou suivant une période de repos de 1h (n=10) ou de 24h (n=9) à 37°C (fig. 5.4). Les analyses ont été effectuées uniquement sur les cellules vivantes (AF488-). La répartition des populations de lymphocytes T CD3+, de monocytes CD14+, de lymphocytes B CD19+ et de cellules NK CD56+ a été déterminée à partir de la population CD45+AF488- à l’aide d’une stratégie de «gating» conventionnelle ciblant deux marqueurs à la fois, aussi appelée «gating» binaire. La population Lin- correspond aux cellules CD45+ dont l’expression des marqueurs CD3, CD14, CD19 et CD56 est négative, ce qui correspond à environ 10% à 25% des cellules. La proportion des monocytes CD14+ était plus élevée immédiatement après un cycle de congélationdécongélation. Par contre, aucune différence n’a été observée entre les résultats provenant d’échantillons frais et ceux provenant d’échantillons analysés après une période de repos de 1h ou de 24h. Lors de ces essais, la population de lymphocytes T CD3+ a été la plus affectée par le cycle de congélation-décongélation puisque la proportion de ces cellules correspond à 60% dans les échantillons frais, mais diminue à moins de 30% immédiatement après la congélation. Par contre, la proportion des cellules CD3+ semblait se stabiliser suivant une période de repos de 1h, ce qui représentait 38% ± 12%. En contrepartie, la proportion de la population Lin- augmente d’environ 2 fois entre les échantillons frais et ceux ayant subi un cycle de congélationdécongélation, ce qui suggère que les lymphocytes T pourraient se retrouver dans cette population non-identifiable. Les autres sous-populations, lymphocytes B CD19+ et NK CD56+ ne semblaient pas être affectées par la décongélation suivant une période de repos de 1h. 45 Les PBMC de participants en santé ont été soumis à un cycle de congélation-décongélation. Les cellules décongelées ont été marquées directement (0h; n=10) ou encore mises en culture pour une période de 1h (n=10) ou de 24h (n=9) à 37°C et comparées aux cellules marquées avant la congélation (frais). Toutes les analyses ont été réalisées sur la population de cellules marquées, soit les cellules négatives pour le marqueur AF488. Les analyses statistiques ont été réalisées afin de comparer toutes les combinaisons des conditions testées. Les valeurs p sont indiquées uniquement pour les différences significatives soit, p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) et p < 0.001 (***). Les différences ont été évaluées avec le test de comparaison multiple de TurkeyKramer pour les groupes CD3 et CD56. Le test non-paramétrique a été utilisé pour les séries de données des groupes CD14, CD19, CD45 et Lin-. 46 Les résultats obtenus à la figure 5.4 ont été réalisés par cytométrie en flux à l’aide de la méthode conventionnelle de « gating » binaire et présentés sous la forme de moyenne des valeurs obtenues. En comparaison, les mêmes données ont été analysées en utilisant SPADE, une nouvelle façon de visualiser l’hétérogénéité de populations complexes comme les PBMC (fig. 5.5). Dans cette analyse, les sous-populations ont été délimitées selon l’intensité de leur marqueur principal tel que CD3, CD14, CD19 et CD56 (fig. 5.5A). Tel qu’illustré, il est possible de visualiser l’intensité de fluorescence pour chaque marqueur à l’aide de l’échelle de couleur. Par la suite, les populations ont été regroupées selon leur marqueur pour ainsi former les populations de lymphocytes T CD3+, de monocytes CD14+, de lymphocytes B CD19+ et de cellules NK CD56+ (fig. 5.5B). Les arbres SPADE montrés en 5.5C représentent chacun des échantillons à l’état frais ou immédiatement après un cycle de congélation-décongélation (0h) et suivant une période de repos de 1h ou de 24h. Dans ce cas-ci, l’échelle de couleur correspond au nombre de cellules dans chaque nœud. Par exemple, un nœud rouge contient donc plus de cellules qu’un nœud bleu. Les variations obtenues sont comparables à celles observées à l’aide de la méthode conventionnelle. Une baisse de la proportion de lymphocytes CD3+ est présente pour les conditions 0h et 24h. Par contre, dans la condition 1h, la proportion de ces cellules semble plus représentative des échantillons frais. 5.3.2 Effets de la congélation sur les sous-populations des lymphocytes T La distribution de lymphocytes T CD4+ et CD8+ parmi les cellules CD3+ a été analysée afin de déterminer si la diminution observée à la suite de la congélation pouvait induire un biais dans ces deux populations de lymphocytes T (fig. 5.6). Aucune différence statistique n’a été observée pour la proportion de cellules CD8+ suivant la congélation dans toutes les conditions. Il n’y a aucune différence statistique pour la proportion de lymphocytes CD4+ et le ratio CD4/CD8 si les cellules sont soumises à une période de repos de 1h. Par contre, parmi les lymphocytes CD3+, la proportion de cellules CD4+ diminue significativement à la suite d’un cycle de congélationdécongélation, c’est-à-dire sans repos (0h) ou suivant une période de repos de 24h. 47 48 49 Le criblage des sous-populations des lymphocytes T a été réalisé en utilisant 3 panels de 7 marqueurs afin de visualiser les populations selon leur évolution. Toutes les analyses ont été effectuées avec la méthode conventionnelle de « gating » (« gating » binaire) et les résultats sont présentés dans le tableau 5.3. Ainsi, il a été possible de déterminer au sein des lymphocytes T CD4+ et CD8+ les sous-populations cellulaires suivantes : cellules naïves (CCR7+CD45RA+), cellules effectrices (CCR7-CD45RA+), cellules mémoires centrales (CCR7+CD45RA-) et cellules mémoires effectrices (CCR7-CD45RA-). De plus, les cellules activées étaient identifiées par l’expression positive pour les marqueurs CD38 et HLA-DR. Les lymphocytes T CD4+ ont également été analysés pour déterminer les proportions des T régulateurs (Treg, CCR4+CD25+CD127lo), des T auxiliaires TH1 (CCR6-CXCR3+) et TH2 (CCR6-CXCR3-) et des TH17 (CCR6+CXCR3-). Généralement, nos résultats montrent que les variations avant et après sont plus importantes lorsque les analyses sont faites immédiatement après le cycle de congélation-décongélation (0h). Sans période de repos avant le marquage, les proportions de cellules mémoires centrales CD4+ et CD8+ et des cellules naïves CD4+ diminuent. Dans la même condition, c’est la tendance inverse qui se produit chez les cellules mémoires effectrices CD4+ et CD8+ et chez les cellules activées. Dans la condition où les cellules sont mises au repos pendant 24h, nous observons une nette augmentation de la proportion de cellules activées, autant chez les lymphocytes CD4 que CD8. Les proportions des cellules TH17 et Treg, déjà très faibles dans les échantillons frais, ont diminué dans toutes les conditions testées suivant un cycle de congélation-décongélation. Suivant une période de repos de 1h, une faible diminution des cellules centrales mémoires CD4+ est observable. Dans l’ensemble, les cellules analysées après une période de repos de 1h semblaient donner des proportions plus similaires à celles observées dans les échantillons frais. De plus, la proportion de cellules actives est retournée aux valeurs normales. Les résultats indiquent qu’une période de repos de 1h pourrait être bénéfique pour les analyses de cytométrie en flux utilisant des échantillons congelés. Toutefois, l’important étant de toujours traiter les cellules contrôles et les cellules testées de la même façon. 50 Tableau 5.3 : Effet de la congélation sur la distribution des sous-populations de lymphocytes T. Fréquence des sous-populations de cellules CD3+ vivantes1 Frais Moyenne Intervalle Moyenne 0h Intervalle P2 Moyenne 1h Intervalle P2 24h Moyenne Intervalle P2 CD4 Naïve 18.2 ± 8.8 Mémoire centrale 38.1 ± 6.1 Effectrice 6.2 ± 2.7 Mémoire effectrice 37.4 ± 9.6 Activée 1.8 ± 1.2 9.5 - 40 29 - 46 3.7-12 21 - 55 0.1 - 4.5 9.2 ± 16.7 ± 8.6 ± 66.6 ± 4.4 ± 7.1 6.7 5.3 10.2 1.3 1.4 -22 6.6 -25 4 - 22 52 - 88 2.8 -6.5 * *** ns *** ** 16.5 ± 24.8 ± 9.5 ± 49.2 ± 2.6 ± 10.5 7.8 4.7 11.6 1.2 6 -22.5 13 - 39 2.6 -19.8 28 - 61 1.3 - 4.8 ns * ns ns ns 14.3 ± 39.6 ± 5.4 ± 40.7 ± 7.6 ± 8.4 3 - 25 16.9 8.4 - 71 2.6 0.7 – 7.7 18.3 27 - 82 4.7 2.4 - 23 ns ns ns ns *** CD4 Th1 Th2 Th17 Treg 23.9 ± 75.0 ± 0.9 ± 1.2± 7.9 8.2 0.2 0.5 11 - 38 61 - 89 0.6 – 1.2 0.4 – 2.2 27.9 ± 71.4 ± 0.4 ± 0.6 ± 9.5 9.6 0.1 0.5 13 - 45 55 - 80 0.2 – 0.6 0.1 -1.3 ns ns ** ns 24.0 ± 75.5 ± 0.4 ± 0.4 ± 7.1 7.2 0.2 0.5 15 - 35 64 -85 0.3 -0.8 0.05 -1.5 ns ns ** ** 40.5 ± 58.2 ± 0.5 ± 0.5 ± 18.5 19.2 0.4 0.4 ns ns ** * CD8 Naïve Mémoire centrale Effectrice Mémoire effectrice Activée 18.6 ± 10.8 ± 20.0 ± 50.6 ± 1.8 ± 11.4 5.2 6.7 10.4 1.5 2.8 - 35 5.8 -23 12 - 37 38 - 69 0 -5.5 9.1 ± 2.8 ± 26.6 ± 61.5 ± 2.8 ± 7.1 1.5 – 24 1.4 1.1 – 5.9 7.4 16 - 40 10.8 44 - 78 1.1 1.7 – 4.9 ns *** ns *** *** 19.7 ± 5.7 ± 25.2 ± 49.3 ± 2.3 ± 12.7 2.9 9.2 12.7 1.2 6 -33 1.8 – 12 13 – 43 36 – 66 1 – 4.6 ns ns ns ns ns 13.7 ± 9.9 ± 21.8 ± 54.5 ± 4.1 ± 10.2 1.9 – 31 4.6 3.7 - 17 9.7 8 – 41 16.2 31 -74 2.3 0.9 – 7.2 1 16 -75 24 -83 0.2 -1.2 0.1 -1.2 ns ns ns ns *** La fréquence des cellules CD3+ vivantes a été déterminée à partir d’échantillons frais et d’échantillons ayant subi un cycle de congélation-décongélation suivant une période de repos de 0h, 1h ou 24h à 37°C dans un milieu contenant 10% de FBS. Les lymphocytes T CD4 + et les lymphocytes T CD8+ sont chacun divisés en 4 sous-populations: cellules naïves CCR7+CD45RA+, cellules mémoires centrales CCR7+CD45RA¯, cellules effectrices CCR7¯CD45RA+ et cellules mémoires effectrices CCR7¯CD45RA-. Les lymphocytes T CD4+ sont également divisés en cellules TH1 CCR6¯CXCR3+, en cellules TH2 CCR6¯CXCR3¯, en cellules TH17 CCR6+CXCR3¯ et en cellules Treg CCR4+CD25+CD127lo. Les lymphocytes T CD4+ activés et les lymphocytes T CD8+ activés ont un phénotype CD38+ HLADR+. 2 La comparaison entre les échantillons frais et ceux ayant subi un cycle de congélation-décongélation a été faite en utilisant le test non-paramétrique KruskalWallis et le test comparatif multiple de Dunn p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) et p < 0.001(***). 51 5.4 Caractérisation du phénotype LED 5.4.1 Stratégie pour l’établissement des arbres SPADE Le phénotype des patients LED et des participants en santé a été caractérisé par cytométrie en flux à l’aide de 5, chacun composé de 8 marqueurs. Cette approche multiparamétrique, basé sur la proposition de Maecker [26], permet de définir les lymphocytes T, les lymphocytes T auxiliaires, les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes B et un groupe composé de monocytes, de cellules dendritiques et de cellules NK. À l’intérieur de ces populations, les souspopulations fonctionnelles ou les composantes cellulaires plus spécifiques ont été déterminées. Les résultats montrés dans les sections suivantes proviennent de 18 échantillons indépendants de patients LED, incluant les trois échantillons provenant du même patient sur une période de trois ans (**), et de 21 échantillons de participants en santé. Pour toutes les figures qui suivront, le tableau 5.4 montre la disposition des arbres SPADE pour les participants en santé et le tableau 5.5 représente celle pour les patients LED. Ces dispositions seront identiques pour tous les arbres SPADE, et ce, peu importe les sous-populations de cellules analysées. Pour toutes ces figures, les arbres SPADE sont composés de 100 nœuds et ont été établis en fonction de l’intensité de fluorescence des marqueurs utilisés. Une échelle de couleur variant du rouge au bleu permet de déterminer les cellules positives pour un marqueur donné. Les nœuds sont un regroupement de cellules qui ont les mêmes caractéristiques. La grosseur des nœuds est relativement proportionnelle au nombre de cellules qui ont ces caractéristiques. L’expression des marqueurs est présentée sous la forme d’un ratio calculé à partir des données de tous les échantillons de participants en santé qui étaient considérés comme notre niveau de base. Chaque échantillon, autant ceux provenant de patients LED que ceux de participants en santé, a été comparé à ce niveau de base et pour chacun des marqueurs d’intérêt. Dans ces essais, la couleur allant vers le rouge indique que l’expression du marqueur est plus importante que le niveau de base moyen déterminé à l’aide des échantillons de participants en santé. De même, une couleur allant vers le bleu indique, au contraire, que l’expression du marqueur est moins importante que ce niveau de base. Les teintes de couleur verte sont centrales à cette échelle de ratio et indique une expression semblable au niveau de base. 52 Tableau 5.4 : Disposition des arbres SPADE pour les participants en santé. HC-01 HC-02 HC-03 HC-04 HC-05 HC-06 HC-07 HC-08 HC-09 HC-10 HC-11 HC-12 HC-13 HC-14 HC-15 HC-16 HC-17 HC-18 HC-19 HC-20 HC-21 Tableau 5.5 : Disposition des arbres SPADE pour les patients LED. LED-34 LED-35** LED-36 LED-37 LED-38 LED-39 LED-40 LED-41 LED-42 LED-43 LED-44** LED-45 LED-46 LED-47 LED-50 LED-51 LED-53 LED-54** 53 5.4.2 Monocytes, cellules dendritiques et cellules NK La figure 5.7 représente la stratégie utilisée pour la délinéation des monocytes, des cellules dendritiques et des cellules NK. Dans ce cas-ci, les évènements analysés avec SPADE ont été présélectionnés pour enrichir la population qui était négative pour les marqueurs CD3, CD19 et CD20. Cette présélection permettait de mieux visualiser les populations ciblées. Par la suite, les nœuds ont été regroupés selon l’intensité des marqueurs CD14, CD16, CD56 et HLA-DR afin de déterminer la position de chaque population dans l’arbre SPADE (fig. 5.7A). Ainsi, il est possible de distinguer (fig 5.7B) une grande population de monocytes CD14+ (région rouge) qui inclut une petite sous-population de monocytes CD14+CD16+ (région rosée). La population CD14+CD16+ est nommée monocytes non classiques. La région bleue montre les cellules NK CD16+/-CD56+ et la région verte les cellules dendritiques HLA-DR+. La distribution des arbres SPADE (fig. 5.8 et 5.9) ainsi créée est identique pour les échantillons de patients LED et ceux des participants en santé. Cette représentation facilite la comparaison directe des différentes sous-populations d’intérêt telles qu’identifiées à la figure 5.7. 54 55 Lors de l’établissement des arbres SPADE, l’expression des marqueurs d’intérêt a donc été évaluée pour chaque échantillon de patients (LED) et pour chaque échantillon de participants en santé (HC). Cette méthode d’analyse a été utilisée pour comparer l’expression de HLA-DR sur les monocytes, les cellules dendritiques et les cellules NK des participants en santé et ceux provenant de patients LED. Pour ces trois groupes de cellules, le marqueur HLA-DR est un indicateur de l’activation puisque les cellules activées ont un niveau d’expression plus élevé de HLA-DR à leur surface [128]. Les figures 5.8 et 5.9 présentent le ratio de l’expression de HLA-DR, pour les participants en santé et pour les patients LED respectivement, sur les monocytes, les cellules dendritiques et les cellules NK. En comparant le niveau d’expression de HLA-DR du groupe LED à celui des cellules de participants en santé, il est possible de constater une diminution de l’expression de HLA-DR dans plusieurs nœuds au sein des monocytes et des cellules dendritiques. Cette baisse est observée de façon très constante pour tous les échantillons au niveau des trois nœuds des monocytes non classiques. En contraste, entre 1 et 8 nœuds parmi les 23 nœuds de cellules NK expriment davantage le marqueur HLA-DR comparativement au niveau de base moyen des cellules en santé. De plus, l’unique nœud rouge observé dans l’échantillon LED-39 dans cette région des NK est aussi de couleur rouge pour 16 des 17 autres échantillons LED, l’exception étant LED-43. Les trois échantillons, 35, 44 et 54, du même patient montrent des petites variations entre eux, mais présentent les mêmes tendances que l’ensemble des autres échantillons LED. Également, il est possible d’observer que le nombre de nœuds retrouvés pour les monocytes dans les échantillons LED est moindre que celui observé dans les arbres des échantillons des participants en santé. Ceci indique que le nombre absolu de monocytes pour les échantillons LED est généralement inférieur et, par le fait même, suggère que certaines sous-populations de monocytes sont absentes. 56 57 58 5.4.3 Lymphocytes B La délinéation des cellules mémoires chez les lymphocytes B CD19+ a été réalisée de la même manière que celle décrite à la figure 5.7. Pour les lymphocytes B, les arbres SPADE ont été constitués en ciblant préalablement les cellules négatives pour le marqueur CD3 et positives pour le marqueur CD19. Par la suite, les cellules CD19+ ont été groupées selon l’intensité du marqueur CD27 afin de déterminer l’emplacement des lymphocytes B mémoires (fig. 5.10). Les arbres ainsi établis sont présentés à la figure 5.11 pour les échantillons HC et à la figure 5.12 pour les échantillons LED. Le marqueur CD38 qui est normalement exprimé plus fortement sur les cellules activées a été choisi pour comparer l’état des cellules B entre les participants en santé et les patients LED. Aucune tendance générale ne peut être notée. Autant chez les cellules HC que chez les cellules LED, certains nœuds expriment plus fortement CD38 alors que d’autres nœuds montrent l’inverse. La variation interindividuelle est aussi importante dans les deux types d’échantillons. 5.4.4 Vue d’ensemble des cellules B, NK, DC et monocytes chez les patients LED Le criblage des grandes populations cellulaires excluant les lymphocytes T a été réalisé en utilisant les deux panels de 7 marqueurs et en réalisant les analyses avec la méthode conventionnelle de « gating ». Les résultats sont présentés dans le tableau 5.6 pour chacun des échantillons LED et une moyenne de tous les échantillons des participants en santé est utilisée pour fin de comparaison. Ainsi, à l’intérieur de la population CD45+CD3-, il a été possible de délimiter les lymphocytes B (CD19+), les monocytes (CD19-CD20-CD14+), les cellules DC (CD19-CD20-CD14-HLA-DR+) et les cellules NK (CD19-CD20-CD14-CD56+). De plus, les cellules NK ont été divisées selon l’expression de CD16 soit en cellules CD56+CD16+ et en cellules CD56+CD16-. Les cellules dendritiques (DC) ont également été divisées en DC myéloïdes (CD11c+) et en DC plasmacytoïdes (CD123+). Les cellules NK CD16+, les monocytes et les deux types de DC ont des proportions significativement plus faibles chez les patients LED que chez les participants HC. Les lymphocytes B se retrouvent à l’opposé en plus grande proportion chez les patients LED alors qu’aucune différence n’a été observée pour les cellules NK CD16-. Il est à noter qu’une variation interindividuelle importante est observée au sein des différents échantillons LED. 59 60 61 62 Tableau 5.6 : Distribution des monocytes, des cellules DC et NK, et des lymphocytes B chez les patients. Proportion de cellules (%)1 NK NK Monocytes DC DC Ly. B CD16+ CD16CD14+ myéloïde plasmacytoïde CD19+ LED-34 2,1 7,2 5,6 28,0 8,2 11,0 LED-35 2,4 9,3 11,8 16,8 3,6 11,3 LED-36 4,4 8,1 0,5 18,0 0,4 6,7 LED-37 0,9 7,9 2,3 19,3 2,9 11,7 LED-38 5,3 3,3 0,6 15,6 6,0 6,5 LED-39 9,5 5,3 0,8 39,7 1,9 17,5 LED-40 1,4 6,3 0,8 -4 -4 5,5 4 LED-41 2,7 7,1 0,5 -4 16,1 LED-46 3,3 5,4 4,4 29,4 3,4 19,3 LED-47 3,6 4,2 7,9 19,2 1,7 12,1 LED-50 4,2 4,8 1,7 -4 -4 11,5 LED-51 3,7 7,1 1,6 -4 -4 10,0 LED-53 11,5 17,3 0,6 38,3 3,1 39,1 LED-54 2,2 11,6 1,7 44,8 3,3 23,1 2 Moyenne LED 4,1 ± 0,8 7,5 ± 1,0 2,9 ± 0,9 36,9 ± 3,4 3,4 ± 0,7 14,4 ± 2,3 Moyenne HC2 18,3 ± 1,9 9,6 ± 1,1 21,2 ± 3,7 50,1 ± 3,5 10,2 ± 1,7 8,9 ± 1,5 Valeur de p3 < 0,0001 ns < 0,0001 < 0,0001 0,0088 0,0176 3 Test statistiques Mann-Whitney Mann-Whitney Student Mann-Whitney Mann-Whitney non-pairé Welch 1 Les proportions de monocytes, de cellules dendritiques (DC), de cellules NK et de lymphocytes B (Ly B) ont été déterminées au sein de la population CD45+ viables (AF488-) avec le logiciel FCS express. Les cellules NK, les monocytes et les DC ont été sélectionnées selon la stratégie décrite par Maecker et al (Tableau 4.2) et correspondent aux cellules négatives pour CD3, CD19, CD20. Les NK sont également CD14- et CD56+ divisés en fonction de l’expression de CD16. Les cellules dendritiques sont CD14CD56-HLA-DR+ et peuvent être divisées en cellules myéloïdes CD11c+ ou plasmacytoïdes CD123+. Les lymphocytes B sont CD3CD19+. 2 La moyenne ± S.E.M. pour les 18 échantillons LED et pour les 21 échantillons de participants en santé (HC). 3 La différence entre LED et HC pour chaque population a été statistiquement évaluée. 4 Les données n’ont pas été montrées dû à un nombre de cellules négligeables (<10) pour ces populations cellulaires. 63 5.4.5 Lymphocytes T 5.4.5.1 Fine distribution des cellules CD4+ et CD8+ Dans le cadre de cette étude, une attention particulière a été portée aux sous-populations de lymphocytes T qui sont des acteurs très importants dans les désordres immunitaires. Dans un premier temps, la distribution des sous-populations de lymphocytes T présentes chez les patients LED et chez les participants HC a été réalisée avec la méthode conventionnelle de « gating » binaire. Le criblage des sous-populations a été fait en utilisant le panel de 7 anticorps ciblant les populations de cellules T CD4+ et CD8+ et leur distribution parmi les cellules naïves, mémoires centrales, effectrices et mémoires effectrices (Tableau 5.7). La moyenne des proportions obtenues pour les 21 échantillons de participants en santé et les proportions obtenues pour chacun des 14 échantillons de patients LED sont présentées. Les données pour les échantillons où une solution de DNAse a été ajoutée ne sont pas montrées. Des analyses statistiques ont été réalisées afin de comparer les deux groupes d’échantillons. La tendance générale qui se dégage de ces résultats montre que les cellules naïves sont significativement plus élevées pour les échantillons de patients LED, soit de 1.7 et 2.7 fois plus élevé respectivement pour les cellules CD4+ et CD8+. Une tendance contraire est observable au sein des cellules mémoires effectrices, et ce, autant chez les lymphocytes T CD4+ que chez les CD8+, soit des proportions de 1.7 et 1.4 fois moins élevées. Il est également à noter que la proportion de lymphocytes T CD8+ effecteurs est significativement plus faible parmi les patients LED contrairement aux participants en santé, respectivement 22,6% et 25,8%. Cependant, ces différences bien que significatives pourraient ne pas avoir un grand impact au point de vue des manifestations cliniques. Aucune différence significative n’est observable parmi les cellules mémoires et les cellules mémoires effectrices au sein des lymphocytes T CD4+. Il n’y a pas non plus de différence significative parmi les échantillons LED et HC en ce qui concerne les cellules mémoires centrales CD8+. Tout comme il a été observé pour les populations de cellules B, NK, DC et monocytes, des variations interindividuelles sont également présentes pour les échantillons de patients LED. Cette variabilité est très importante et peut varier dans certains cas de valeurs presque nulles à des valeurs très élevées comme 53% (CD8+ naïves) et 62% (CD4+ naïves). Les échantillons 35 et 54 provenant du même patient à deux ans d’intervalle montrent aussi quelques variations. 64 Tableau 5.7 : Distribution des sous-populations de lymphocytes T chez les patients. 1 LED-34 LED-35 LED-36 LED-37 LED-38 LED-39 LED-40 LED-41 LED-46 LED-47 LED-50 LED-51 LED-53 LED-54 Moyenne LED6 Moyenne HC5,6 Valeur de p7 Test statistique7 N 43,7 15,4 55,1 52,6 0,0 28,3 14,3 26,6 14,6 59,8 51,1 62,2 50,3 15,7 35,0 ± 5,5 20,6 ± 2,4 0,0008 Student non pairé CD4 2 3 MC 42,5 60,1 31,6 33,6 17,8 56,2 42,9 63,3 52,6 25,0 36,3 23,6 31,3 30,7 39,1 ± 3,8 38,1± 3,0 ns E 2,8 1,5 5,2 2,7 4,4 3,5 14,3 2,2 3,4 10,6 3,5 9,3 5,5 5,5 5,3 ± 1,0 6,7 ± 0,9 ns - - 4 ME 11,1 23,0 8,2 11,1 77,8 12,0 28,6 8,0 29,4 4,7 9,1 4,8 13,0 48,2 20,6 ± 5,5 34,6 ± 3,4 0,0001 MannWithney 1 1 N 44,4 13,4 44,8 18,5 1,0 23,5 5,9 21,9 0,6 47,6 20,8 23,9 53,0 36,8 25,4 ± 4,7 9,5 ± 1,8 < 0,0001 Student non pairé 2 CD8 MC E3 ME4 29,2 11,3 15,1 24,0 8,2 54,3 7,4 23,1 24,8 12,2 32,3 37,1 2,5 55,3 41,2 16,9 19,8 39,8 7,2 44,1 42,8 12,7 13,0 52,3 22,6 5,1 71,7 4,1 27,7 20,6 10,8 19,5 49,0 4,3 30,6 41,2 7,2 15,4 24,4 12,3 10,8 40,1 12,4 ± 2,2 22,6 ± 3,8 39,6 ± 4,0 11,2 ± 2,2 25,8 ± 2,4 53,5 ± 2,9 ns 0,0473 0,0094 Student Student non pairé non pairé La proportion des cellules naïves a été déterminée pour des cellules CCR7+CD45RA+ et celle des cellules mémoires centrales à l’aide des marqueurs CCR7+CD45RA- (2). 3 La fréquence des cellules effectrices a été déterminée pour des cellules CCR7CD45RA+ alors que celle des cellules effectrices mémoires a été déterminée à l’aide des marqueurs CCR7-CD45RA- (4). 5 Ces données représentent les moyennes des 21 échantillons indépendants provenant de participants en santé. 6 La moyenne ± S.E.M. pour 14 échantillons LED et pour les 21 échantillons de participants en santé (HC). 7 La différence entre LED et HC pour chaque population a été statistiquement évaluée. 65 5.4.5.2 Visualisation avec SPADE des lymphocytes T Afin de pouvoir déterminer le profil des sous-populations de lymphocytes T, des arbres SPADE ont été établis pour chaque échantillons LED et HC. Une stratégie de délimitation des souspopulations telle que présentée au tableau 5.7 est illustrée à la figure 5.13. Dans cette suite de figures, uniquement les cellules CD3+ ont été analysées pour établir les arbres SPADE. Les cellules CD3+ ont d’abord été regroupées selon l’intensité des marqueurs CD4, CD8, CCR7 et CD45RA (fig. 5.13A). Le diagramme montre les deux grandes populations de cellules positives pour le marqueur CD4 et pour le marqueur CD8. Chacune de ces populations est par la suite divisée en populations de cellules CCR7+ et de cellules CD45RA+. Ces regroupements permettent d’établir les régions des 4 sous-populations de lymphocytes T (fig. 5.13B). Dans chaque ensemble gris, quatre sous-populations sont délimitées autant chez les lymphocytes T CD4+ que chez les lymphocytes T CD8+. En vert, on retrouve les cellules naïves (N) CCR7+CD45RA+, en orangé ou jaune les cellules effectrices (E) CCR7-CD45RA+, en rose ou brun, les cellules mémoires centrales (MC) CCR7+CD45RA- et finalement en bleu les cellules mémoires effectrices (ME) CCR7-CD45RA-. L’intersection des deux zones grises montre les cellules qui sont positives pour les marqueurs CD4 et CD8 (CD4+CD8+). Les cellules qui sont à l’extérieur des zones grises sont les cellules CD3+ qui n’expriment pas les marqueurs CD4 et CD8. Cette arborisation a été utilisée afin de comparer le niveau d’expression chez les lymphocytes T des marqueurs d’activation CD38 (fig. 5.14 et 5.15) et HLA-DR (fig. 5.16 et 5.17) pour les échantillons des participants en santé et ceux des patients LED. En un premier temps, la comparaison du ratio de l’expression de CD38 par rapport au niveau de base des échantillons HC est présentée aux figures 5.14 pour les HC et à la figure 5.15 pour les LED. Il est difficile d’y noter une tendance qui permettrait de distinguer les échantillons LED. Par contre, 2 échantillons LED se démarquent du lot avec une expression de CD38 plus élevée que tous les autres HC et LED confondu. Ces deux échantillons, LED-35 et LED-44, proviennent du même patient et ont été prélevés à une année d’intervalle. Certains nœuds parmi les lymphocytes CD4+ mémoires centrales des LED montrent très souvent une plus forte expression de CD38. Par contre, la même tendance apparait aussi chez les cellules MC de plusieurs participants en santé. 66 67 68 69 Dans un deuxième temps, les sous-populations de lymphocytes T ont été analysées pour le niveau d’expression de HLA-DR. Les arbres SPADE montrant cette analyse pour l’expression de HLADR sont présentés à la figure 5.16 pour les échantillons de participants en santé et à la figure 5.17 pour ceux des patients LED. Tel qu’attendu, la figure 5.16 montre que les résultats de l’expression de HLA-DR chez les lymphocytes T de chaque participant en santé sont plutôt comparables au niveau de base moyen. Par contre, il est à noter qu’un seul échantillon sort du lot avec une expression de HLA-DR beaucoup plus faible que la moyenne. Bien que l’expression de ce marqueur soit assez constante parmi les différents échantillons, quelques nœuds rouges montrent une expression plus importante. Chaque échantillon HC, à l’exception de celui qui a un arbre presque entièrement bleu, a des regroupements de cellules qui ont une intensité de HLA-DR plus élevée que la moyenne. D’ailleurs, la majorité de ces cellules se retrouve chez les lymphocytes T CD4+ et semble principalement localisée parmi les cellules naïves et les cellules mémoires centrales. Chez les lymphocytes T CD8+, il y a une plus faible variation que chez les lymphocytes T CD4+. Par contre, les légères variations observables sont situées chez les cellules naïves et impliquent autant des augmentations que des diminutions de l’expression de HLA-DR comparativement au niveau de base. La figure 5.17 montre que les arbres SPADE sont très hétérogènes en ce qui concerne l’expression de HLA-DR chez les lymphocytes T de patients LED. En effet, quelques échantillons ressemblent au niveau observé pour les échantillons HC (fig. 5.16), d’autres échantillons ont plusieurs nœuds de cellules ayant une expression de HLA-DR supérieure et 6 échantillons sur 18 présentent une grande majorité de nœuds exprimant fortement le marqueur HLA-DR. Chez les lymphocytes T CD8+, les sous-populations présentant une plus forte expression de HLA-DR sont les cellules naïves, les cellules mémoires centrales et les cellules effectrices. Il est à noter que, autant chez les participants en santé que chez les patients LED, les cellules mémoires effectrices semblent moins exprimer le marqueur HLA-DR que les autres sous-populations présentes chez les lymphocytes T. Chez les lymphocytes T CD4+, les souspopulations qui présentent une plus forte expression de HLA-DR sont plus variables d’un échantillon à l’autre. Cependant, pour les 6 échantillons présentant une forte expression de HLADR sur la majorité de leurs nœuds, il est possible d’observer une très forte proportion de nœuds rouges dans les populations naïves et mémoires centrales. La sous-population la plus affectée 70 chez les lymphocytes T CD4+ est effectivement celle des cellules naïves qui compte le plus grand nombres de nœuds rouges dans la majorité des échantillons LED. 71 72 73 5.4.5.3 Proportion des cellules T HLA-DR+ Les données obtenues à l’aide de SPADE concernant l’expression de HLA-DR sur les lymphocytes T de patients LED et de participants en santé permettent de voir la variation pour chaque échantillon. Afin de visualiser l’ensemble des populations de lymphocytes en fonction de HLA-DR, les phénotypes ont également été comparés avec la méthode de « gating » conventionnelle. La proportion de cellules positives pour l’expression du marqueur HLA-DR au sein des lymphocytes T est présentée dans le tableau 5.8. Les données sont montrées pour les lymphocytes T CD3+, mais également pour les lymphocytes CD4+ ainsi que les lymphocytes CD8+. Tel qu’observé avec les arbres SPADE, la proportion de cellules HLA-DR+ est significativement plus élevée chez les patients LED pour toutes les sous-populations présentées. En effet, la proportion moyenne chez les patients LED varie de 13,7% à 22,3% selon la souspopulation contrairement à des variations de 8,1% à 13,3% chez les participants en santé. Il est à noter que la plus grande proportion de cellules positives pour HLA-DR est présente chez les lymphocytes T CD8+ autant pour les patients LED que pour les échantillons de participants en santé. Le fait que HLA-DR soit fortement exprimé sur les cellules T et que cette différence soit significative suggère que HLA-DR pourrait être un marqueur biologique intéressant. 74 Tableau 5.8 : Proportion de cellules HLA-DR+ au sein des lymphocytes T des patients. LED-34 LED-35 LED-36 LED-37 LED-38 LED-39 LED-40 LED-41 LED-42 LED-43 LED-44 LED-45 LED-46 LED-47 LED-50 LED-51 LED-53 LED-54 CD31 27,9 40,1 10,8 15,3 36,8 9,2 13,8 7,1 18,8 4,6 14,6 6,6 21,9 28,1 36,8 18,1 13,6 19,2 CD41 21,1 34,3 6,5 8,5 8,9 6,2 0,0 4,4 14,7 3,4 11,6 5,4 23,4 22,3 33,6 14,0 12,4 15,0 CD81 32,1 40,8 13,4 25,4 41,9 11,3 12,2 13,8 21,6 8,6 18,5 12,9 24,0 25,7 42,6 21,9 13,5 21,3 Moyenne LED2 Moyenne HC2 Valeur de p3 19,1 ± 2,6 11,1 ± 0,9 0.0079 13,7 ± 2,3 8,1 ± 0,8 0.0358 22,3 ± 2,6 13,3 ± 1,3 0.0042 1 Les proportions de lymphocytes T positifs pour l’expression de HLA-DR ont été déterminées au sein de la population CD3+ viables (AF488-) et des populations CD4+CD3+ et CD8+CD3+ viables avec le logiciel FCS express. 2 La moyenne ± S.E.M. pour les 18 échantillons LED et pour les 21 échantillons de participants en santé (HC). 3 La différence entre LED et HC pour chaque population a été statistiquement évaluée avec le test de Student non-pairé corrigé avec Welch. 75 5.4.6 Lymphocytes T auxiliaires Afin de poursuivre nos investigations au sein des sous-populations de lymphocytes T, les arbres SPADE ont été formés pour cibler les populations de lymphocytes T auxiliaires. La figure 5.18 représente la stratégie utilisée pour identifier les sous-populations de lymphocytes T auxiliaires, Th1, Th2 et Th17. Les cellules ont d’abord été groupées selon l’intensité des marqueurs CD4 et CD8, puis les populations de T auxiliaires ont été définies au sein des cellules CD4+ avec CXCR3 et CCR6 (fig. 5.18A). À l’intérieur des cellules CD4+ (fig. 5.18B) se retrouvent les cellules Th1 CXCR3+CCR6-, les cellules Th2 CXCR3-CCR6- et les cellules Th17 CXCR3-CCR6+. Les arbres SPADE créés pour les échantillons de participants en santé et de patients LED sont présentés à la figure 5.19 et à la figure 5.20 respectivement. Du côté des échantillons HC, une expression généralement faible de HLA-DR est observée pour 19 des 21 échantillons (fig. 5.19). Deux échantillons (HC-02 et HC-018) ont des niveaux d’expression plus élevés que la moyenne dont un présente une majorité de nœuds dans les tons de rouge (HC-02). Les arbres des échantillons LED présentent des niveaux d’expression de HLA-DR beaucoup plus élevés que la moyenne des HC. La tendance générale qui se dégage de cette figure montre un niveau d’expression plus élevé chez les cellules T auxiliaires de patients LED. Parmi ces arbres, 2 échantillons (LED-35 et LED-38) ont une expression de HLA-DR beaucoup plus forte que les contrôles et que l’ensemble des LED. D’autres échantillons tels que LED-34, LED-36, LED-37, LED-43, LED-44, LED-45, LED-47 et LED-50 montrent plusieurs nœuds rouges et jaunes, ce qui les distinguent de l’expression de HLA-DR sur le niveau de base. En général, les trois populations de T auxiliaires ont des niveaux augmentés de HLA-DR. Dans leur ensemble, même les autres échantillons expriment HLA-DR à un niveau plus élevé que les HC. 76 77 78 79 5.4.7 Lymphocytes T régulateurs Finalement, la même stratégie de délimitation a été appliquée afin de visualiser les populations de T régulateurs au sein des échantillons de patients LED. La figure 5.21 montre les étapes et les marqueurs utilisés pour déterminer la position des nœuds correspondant aux cellules Treg naïves et mémoires. Les cellules analysées ont été préalablement sélectionnées pour être positives pour les marqueurs CD3 et CD4. Par la suite, les lymphocytes T régulateurs ont été délimités en fonction de l’expression des marqueurs CD25 et CCR4. À l’intérieur de la population CD25+, on distingue une population CCR4+ (naïve) et une autre CCR4- (mémoire). Les figures 5.22 et 5.23 présentent les arbres SPADE pour l’expression de HLA-DR établis respectivement pour les échantillons de participants en santé et pour ceux des patients LED. La comparaison des profils obtenus à la figure 5.23 avec ceux des HC montre une fois de plus que l’expression de HLA-DR est plus forte pour les échantillons LED que pour dans ceux des participants en santé (fig. 5.22). En effet, 6 échantillons LED (34, 35, 37, 47, 50 et 53) montrent une grande proportion de nœuds rouges ou orange dans les nœuds de Treg. Une fois de plus (fig. 5.9), certains nœuds sont absents chez les cellules LED indiquant qu’il n’y a pas de cellules avec les caractéristiques correspondant à ces nœuds. Cette forte expression de HLA-DR dans les Treg des échantillons LED est en accord avec les observations précédentes faites sur les T auxiliaires et sur l’ensemble des populations de T CD4+et CD8+. 80 Les cellules analysées ont été préalablement sélectionnées comme étant positives pour l’expression des marqueurs CD3 et CD4. (A) Afin de déterminer la position des cellules Treg, les cellules ont été regroupées selon l’intensité des marqueurs CD25 et CCR4. (B) Le positionnement de ces deux marqueurs dans les nœuds a ensuite été utilisé afin de délimiter une région contenant les cellules CD25+. Les cellules CCR4+ permettent de délimiter deux souspopulations à l’intérieur de la population CD25+, soit une population positive et une autre négative. 81 82 83 6. Discussion Le lupus érythémateux disséminé est reconnu pour être une maladie plutôt complexe à diagnostiquer puisqu’elle est très variable dans le temps en plus de se manifester de différentes façons chez les individus qui en sont atteints. Cette complexité s’illustre facilement par les nombreux systèmes d’évaluation de l’activité et de la sévérité de la maladie (voir section 1.2.3). Pour faciliter le suivi de la maladie chez les patients, plusieurs études cherchent à identifier des marqueurs biologiques facilement quantifiables. Étant donné le déséquilibre dans les populations immunes de cette maladie, nous avons avancé que le niveau anormal des cellules sanguines pourrait être observable et quantifiable. Ces différences pourraient se traduire indirectement par la présence de cytokines dans le sérum et directement par des changements phénotypiques dans les populations cellulaires circulantes dans le sang. 6.1 Des concentrations sériques de GM-CSF plus élevées chez les patients LED Puisqu’il est connu que les cellules du système immunitaire des patients atteints de LED sont souvent dans un état inflammatoire [36], des analyses semi-quantitatives et quantitatives ont été menées afin de déterminer le profil des cytokines présentes dans le sérum de 18 patients LED. Au moment du prélèvement, ces patients avaient un niveau d’activité de la maladie (SLEDAI, SLAM, SLICC) de faible à négligeable. Nos résultats montrent que la majorité des cytokines mesurées avec les deux méthodes, soit par ELISA et par Luminex, se trouvaient à des concentrations négligeables. Certaines cytokines telles qu’IL-2, IL-4 et IL-17 étaient détectables à des niveaux plus élevés uniquement dans certains échantillons, mais cependant sans lien avec un niveau d’activité de la maladie. Une seule cytokine, le GM-CSF, a été détectée en plus grande concentration dans le sérum de 7 sur 8 patients testés avec la méthode du Luminex (Tableau 5.2). Il est malheureusement difficile de conclure car nos analyses en Luminex ont été effectuées uniquement sur des échantillons de patients. Cependant, nous pouvons avoir des indices en nous basant sur les travaux effectués par Biancotto réalisés avec la même trousse de Luminex [120]. Les travaux de Biancotto rapportent une étude comparative du niveau de base et de la stabilité de 27 cytokines dans le sérum de sujets sains grâce à la même méthode que celle que nous avons utilisée. Ceci est intéressant pour nos observations car le niveau de GM-CSF est indétectable dans le sérum de sujets sains alors que nous obtenons entre 18,7 et 55,7 pg/mL pour 7 des 8 patients testés (une valeur moyenne de 32,2 ± 12,2 pg/mL). En fait, le lien entre les concentrations 84 élevées de GM-CSF et les maladies auto-immunes a déjà été observé. Deux études montrent une concentration plus élevée dans le sérum de patients atteints de lymphadénite tuberculeuse [121] ainsi que dans le plasma de patients atteints d’arthrite rhumatoïde et de lupus érythémateux [122]. Récemment, une étude réalisée avec la même méthode Luminex a aussi mis en évidence que le GM-CSF était un marqueur de l’arthrite rhumatoïde et les concentrations détectées dans le sang de ces patients étaient très similaires à celles que nous avons observées dans nos 7 échantillons de patients LED [123]. Nos observations comportent aussi un biais en fonction du genre, car le lupus est majoritairement diagnostiqué chez des femmes, soit plus 90% de nos participants, 13 sur 14 patients. Cependant, il a été montré qu’il ne semble pas avoir de différence significative pour le niveau de GM-CSF puisque des concentrations similaires ont été obtenues autant chez l’homme que chez la femme [120]. De plus, cette étude de Biancotto qui a été réalisée avec 144 participants incluait une majorité de femmes (65%). Bien que les résultats obtenus proviennent d’un faible nombre d’échantillons, nous pouvons conclure que le niveau sanguin de la cytokine GM-CSF pourrait servir de marqueur dans l’établissement d’un profil inflammatoire sans toutefois être exclusif au LED. De plus, il est intéressant de noter que nous avons détecté un niveau inflammatoire de GMCSF dans le sérum de 7 patients sur 8, et ce, bien que les prélèvements aient été effectués dans une période d’accalmie de leur maladie (SLEDAI > 6) [124]. 6.2 Les cellules des patients LED sont plus activées La plus grande partie de ces travaux visait à établir s’il y avait des différences phénotypiques caractéristiques au niveau des cellules sanguines de patients LED comparativement à celles de sujets sains. Cette étude comparative a été réalisée en utilisant une sélection de cibles faisant partie de panels multiparamétriques qui sont maintenant proposés dans un système automatisé de cytométrie en flux [125]. Ces combinaisons de marqueurs avaient été proposées en 2012 par un comité international d’experts comme base pour générer des données standardisées et faciliter leur comparaison entre les laboratoires [26]. Notre étude a donc pu mettre en application cet outil afin de visualiser les lymphocytes T, les lymphocytes T auxiliaires, les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes B, les monocytes, les cellules dendritiques et les cellules NK. À cet outil, nous avons ajouté des analyses multiparamétriques qui nous ont permis de voir en deux dimensions et en un seul coup d’œil [115] les caractéristiques phénotypiques des cellules reliées à 85 7 marqueurs distincts. Cette étude basée sur l’utilisation de SPADE et combinée à un panel d’anticorps standardisé est une première en ce qui concerne le lupus érythémateux disséminée. 6.2.1 Survol des variations dans les populations Au cours de cette étude, nous avons observé une diminution de la proportion des monocytes dans les échantillons des patients. Nous suspectons que cette variation serait une conséquence indirecte de la température choisie pour le transport des échantillons entre le Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke et les laboratoires de Héma-Québec. Des blocs réfrigérants ont été utilisés pour maintenir les tubes à une température ambiante froide. Une baisse de température trop abrupte a mené à l’activation des plaquettes et a contribué à une perte plus importante des monocytes lors de la préparation des cellules mononucléées par centrifugation sur un coussin de Ficoll. Nous savons maintenant que les monocytes sont sensibles à l’agrégation avec les plaquettes lors de ces baisses de température alors que les autres lymphocytes ne sont pas touchés. En ce qui concerne les autres cellules, des diminutions ont été observées pour les cellules NK CD16+, les cellules dendritiques myéloïdes et les cellules dendritiques plasmacytoïdes alors qu’une augmentation a été observée pour les lymphocytes B. Au sein des populations de lymphocytes T, des diminutions ont été notées au niveau des cellules CD4+ mémoires effectrices et CD8+ mémoires effectrices alors que les proportions des cellules naïves CD4+ et CD8+ augmentaient. Le débalancement entre les populations de lymphocytes T naïves et mémoires a déjà été rapporté chez des patients LED [126, 127]. Cependant, ces travaux rapportent plutôt une baisse des cellules T naïves chez les patients ayant une maladie très active. Nos résultats vont dans le sens contraire. Cependant, il est possible que les périodes de faible activité de la maladie aient aussi une influence inverse sur les cellules T naïves et mémoires. Pour l’instant, il n’est pas possible de conclure davantage sur l’importance de ce débalancement cellulaire dans nos échantillons de patients ayant une maladie peu active. 6.2.2 Expression élevée de HLA-DR La caractérisation exhaustive des marqueurs a permis de mettre en évidence que l’expression de HLA-DR était plus élevée à la surface des lymphocytes T des patients LED. L’expression de ce marqueur permet d’avoir un indice sur l’état de l’activation des cellules comme les lymphocytes 86 T. D’ailleurs, il a déjà été montré que ce marqueur pouvait être utilisé comme marqueur de l’activité de la maladie chez des patients avec une maladie plus active [128]. En fait, l’activation des lymphocytes T LED pourrait être facilitée et exacerbée par un seuil de stimulation plus bas, ce qui rend l’activation plus facile [129]. Dans cette étude, il est important de mentionner qu’un seul de nos 18 échantillons de patients LED provenait d’un patient masculin alors que cette proportion est de 100% pour les échantillons de sujets sains, soit des donneurs réguliers de plaquettes. Par contre, des études montrent que le genre des participants, homme ou femme, a une faible répercussion sur l’expression de HLA-DR sur les monocytes de sujets sains [130]. De plus, une étude montre que la population de lymphocytes T circulant dans le sang ayant un phénotype activé, soit CD3+HLA-DR+ est légèrement plus élevée chez les hommes que chez les femmes [131]. Ces données suggèrent que les résultats de nos travaux, reliant une forte expression de HLA-DR sur les cellules des patients LED, est dû à l’état de santé des patients. Un autre point important à mentionner est le fait que la plupart des patients qui participaient à cette étude avaient un indice SLEDAI inférieur à 6, ce qui est considéré comme une maladie inactive [124]. Nos travaux indiquent donc que l’expression de HLA-DR est plus élevée chez les patients LED, même lorsque la maladie est inactive. Bien que d’autres maladies auto-immunes soient caractérisées par une augmentation de l’expression de HLA-DR, ce marqueur pourrait peut-être servir comme critère supplémentaire dans l’établissement du diagnostic de la maladie. 6.3 Une période de repos de 1h est bénéfique pour les cellules congelées Puisque la congélation est une étape importante dans la conservation à long terme d’échantillons sanguins, une évaluation de son impact sur les sous-populations était primordiale. Des cellules mononucléées du sang provenant de participants en santé ont donc été congelées puis décongelées pour être analysées immédiatement après la décongélation ou suivant une période de repos de 1h ou de 24h. Cette vérification nous a permis d’établir qu’il aurait été préférable de procéder à une période de repos de 1h avant d’effectuer les marquages pour établir le phénotype des cellules. Les proportions des cellules ayant bénéficié d’un repos de 1h étaient plus similaires qu’à celles observées pour les cellules fraîchement isolées. Nos résultats ont aussi montré que les variations phénotypiques observées après 24h corrélaient avec des résultats d’étude indiquant qu’une telle période de repos peut moduler les fonctions et le phénotype de lymphocytes T [132134]. Cet aspect fonctionnel n’est pas démontré dans notre étude, car les variations observées 87 étaient au niveau des marqueurs. Les cellules analysées immédiatement et suivant 24h de culture semblaient donc les plus affectées par la cryopréservation. Il est possible que certaines molécules soient plus sensibles au froid que d’autres en fonction de la composition des protéines. En effet, la diminution de lymphocytes T pourrait s’expliquer par le fait que la congélation module l’expression du marqueur CD3+ pour ainsi changer les lymphocytes T en cellules Lin- [135]. Évidemment, il est important de noter que même si une période de repos de 1h suite à la décongélation est profitable pour rétablir le phénotype de base, l’important est d’utiliser les mêmes conditions pour traiter les cellules contrôles et les cellules testées, ce qui a été fait dans notre étude sur le LED. 88 7. Conclusion Cette étude a permis de démontrer que la cytométrie en flux pourrait permettre de distinguer les différences existantes entre des échantillons sanguins provenant de patients LED et de sujets sains. La présence d’une expression élevée de la molécule HLA-DR sur les lymphocytes T confirme un niveau d’activation plus élevé de ces cellules chez les patients LED. Ces résultats sont observés autant chez les lymphocytes T CD4+ auxiliaires que chez les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Le niveau élevé de la cytokine GM-CSF est une indication que les patients qui ont participé à l’étude, bien qu’ayant une maladie inactive, avaient tout de même un profil de cytokines plus inflammatoire. Il serait intéressant de voir si de nouveaux marqueurs tels que GMCSF et HLA-DR pourraient éventuellement faire partie des critères pour aider à diagnostiquer la maladie. Cette étude a aussi montré qu’un temps de repos de 1h à la suite de la décongélation d’échantillons sanguins est avantageux pour rétablir le phénotype des sous-populations cellulaires si on veut les comparer à des échantillons frais. Toutes nos données expérimentales de cytométrie sont une source importante de renseignements. Ces données peuvent être ré-analysées et utilisées pour établir des comparaisons entre les différentes populations cibles de cellules nouvellement étudiées dans le cadre du LED. Par exemple, une étude récente montre qu’il existe un déséquilibre de niveau cellulaire entre les cellules dendritiques plasmacytoïdes et les lymphocytes B régulateurs [136]. De ce point de vue, la somme importante de tous ces résultats pourraient aussi faire partie de la base de données proposée par le Human Immunology Project Consortium pour aider à caractériser et comprendre la partie cellulaire de 89 la maladie. Bibliographie 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Janeway, C.A., Jr. and R. Medzhitov, Innate immune recognition. Annu Rev Immunol, 2002. 20: p. 197-216. Kawai, T. and S. Akira, The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat Immunol, 2010. 11(5): p. 373-84. Medzhitov, R., Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature, 2007. 449(7164): p. 819-26. Medzhitov, R., Origin and physiological roles of inflammation. Nature, 2008. 454(7203): p. 428-35. 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