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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Pharmacologie cellulaire
JURY
M Patrice CODOGNO, Directeur de recherche à l'INSERM, Villejuif Rapporteur
M Stephen MANON, Chargé de recherche CNRS, Bordeaux Rapporteur
M Jean-François SAVOURET, Directeur de recherche à l'INSERM, Paris Examinateur
Mme Marie-Bernadette DELISLE, Professeur à l'Université Paul Sabatier, Toulouse Examinateur
M Marc POIROT, Directeur de recherche à l'INSERM, Toulouse Directeur de Thèse
Ecole doctorale : Ecole Doctorale Biologie-Santé-Biotechnologies de Toulouse
Unité de recherche : Equipe métabolisme, oncogenèse et différenciation cellulaire, U 563 INSERM
Directeur(s) de Thèse : Dr Marc POIROT
Présentée et soutenue par PAYRE Bruno
Le 30 septembre 2008
Titre : Identification de nouvelles cibles du Tamoxifène impliquées dans
son activité pharmacologique

Ce travail a été effectué au sein de l’unité 563 de l’INSERM. Je remercie Monsieur le
Professeur Georges Delsol de m’avoir accueilli dans son unité de recherche et Monsieur le
Professeur Gilles Favre de m’avoir accueilli dans son département oncogenèse, signalisation
et innovation thérapeutique.
Je tiens à remercier les membres du jury qui ont accepté de juger ce travail, Messieurs
les Docteurs Patrice Codogno, Stephen Manon, Jean-françois Savouret et le Professeur Marie-
Bernadette Delisle.
Une grande gratitude à Monsieur le Professeur Claude Caratero qui a été mon chef de
service de 1999 à 2005 et à Madame le Professeur Marie-Bernadette Delisle qui a pris sa
succession, pour m’avoir permis de poursuivre et d’intégrer ce travail de thèse à mon travail
de responsable technique du centre de microscopie électronique.
Un grand remerciement à mon directeur de thèse, le Docteur Marc Poirot, qui a
accepté de m’intégrer à son équipe et m’a beaucoup apporté dans l’apprentissage de la
recherche. En espérant continuer cette collaboration encore de nombreuses années.
Je tiens à remercier tous les membres de l’équipe de Marc pour leur gentillesse et leur
soutien, et tout particulièrement Nadia Boubekeur, Loubna Mhamdi et mon ami Philippe de
Medina pour leur participation active à l’aboutissement de ce travail.
Merci à tous les membres de l’équipe du centre de microscopie, Jean-luc Duteyrat,
Isabelle Fourquaux et Dominique Goudounèche qui m’ont toujours soutenu dans le travail du
centre afin de me permettre de réaliser cette thèse.
Merci à Justine Bertrand-Michel et à François Tercé du plateau technique de
lipidomique de l’IFR31 ainsi qu’à Bernard Pipy et José Bernad de l’UPRESA 2405 pour leur
aide.
A Christelle qui partage ma vie depuis de nombreuses années, qui m’a toujours épaulé
durant cette thèse et qui m’a aidé à la réalisation de ce manuscrit,
A mes filles Lili et Manon, à ma nièce Inès, qui éclairent ma vie tous les jours,
A mes parents qui sans limite m’ont toujours soutenu dans mes études et dans ma vie,
A mon frère Serge et à son fils Vincent qui me sont indispensables,
A Solange, Georgia et Henri pour leur affection,
A Claudine, Eric, Agnes et Michel pour leur gentillesse,
A toute ma famille,
A mes amis d’enfance Jacques et Pierre et à leurs compagnes, pour leur fidèle amitié,
A tous les amis qui partagent notre vie avec une pensée particulière pour Hélène, Jean
Olivier, Hélène, Bertrand et leurs enfants.
A vous tous, un grand merci pour votre soutien.

Résumé
Le tamoxifène (Tam) est le principal médicament utilisé dans le monde en hormonothérapie des
cancers du sein qui expriment les récepteurs des oestrogènes (RE). Le Tam est également utilisé en
Amérique du Nord à titre préventif chez les sujets à risque. Ce médicament a été conçu comme un
antagoniste des RE et bloque par ce mécanisme les effets mitogènes de l’oestradiol qui est le
régulateur endogène de ces récepteurs. Le Tam présente malheureusement une activité agoniste des
RE dans certains tissus qui provoque des effets secondaires indésirables et la stimulation de
l’apparition de cancers de l’endomètre chez un patient sur 1000. En revanche, le Tam présente des
effets pharmacologiques qui n’impliquent pas forcément les RE tels que des effets athéroprotecteurs et
une activité antiproliférative sur certaines tumeurs qui n’expriment pas les RE. Ces observations ont
conduit à la recherche de nouvelles cibles du tamoxifène pouvant expliquer ces effets bénéfiques. Mon
travail de thèse a permis l’identification de deux cibles nouvelles du Tam qui expliquent ces effets.
Dans une première partie de ma thèse j’ai participé à l’identification d’une nouvelle cible du Tam qui
est l’acétyl-CoA cholestérol acyl transférase (ACAT). Elle agit sur le développement de la plaque
athéromateuse en favorisant l’accumulation d’esters de cholestérol. L’observation d’analogies de
structure entre le Tam et un inhibiteur de l’ACAT nous a incité à étudier l’impact du Tam sur l’activité
catalytique de l’ACAT. Nous avons montré in vitro, sur des microsomes de foie de rat, que le Tam est
un inhibiteur de l’ACAT à des concentrations thérapeutiques. Nous avons ensuite montré qu’il inhibe
la transformation des macrophages en cellules spumeuses en bloquant l’activité ACAT sur ces
cellules. Ce mécanisme peut donc expliquer les effets athéroprotecteurs du Tam.
Il est établi depuis de nombreuses années que le Tam se fixe avec haute affinité sur le site de liaison
microsomal des antioestrogènes (AEBS) qui n’avait pas été identifié. Nous avons dans une seconde
partie étudié l’implication des AEBS dans le contrôle de la prolifération de cellules tumorales
mammaires. L’équipe a identifié le site AEBS en démontrant qu’il est constitué par l’association de
deux enzymes impliquées dans la biosynthèse du cholestérol. Nous avons montré que les ligands
d’AEBS dont le Tam et un ligand sélectif le N,N pyrrolidino [4 benzyl) phenoxy éthanamine] (PBPE),
entraînent l’accumulation massive des substrats de ces enzymes dans les cellules : le zymostenol et le
7-déhydrocholestérol. Nous avons étudié l’impact de cette inhibition sur le contrôle de la prolifération
de cellules tumorales mammaires. Nous montrons que le PBPE et la Tam induisent un blocage du
cycle cellulaire et des caractéristiques de différenciation sur les cellules tumorales mammaires
humaines (MCF7). Le PBPE et le Tam induisent l’accumulation et la sécrétion de lipides et de
protéines du lait. Ces effets apparaissent indépendants du récepteur des œstrogènes puisqu’observés
avec le PBPE. Cependant, des lignées tumorales mammaires qui n’expriment pas ou peu de RE ont
une moindre sensibilité aux drogues. Les effets différenciants observés avec le PBPE et le Tam sont
aussi produits par le zymosténol et le 7-dehydrocholesterol. Ces observations établissent donc un lien
entre le site AEBS et le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules tumorales
mammaires humaines. De plus, nous avons établi que cet effet est conditionné par la production de
produits d’oxydation du zymostenol et du 7-déhydrocholestérol. En effet, l’addition d’antioxydants
tels que la vitamine E inhibe la transformation des stérols en oxystérols et les caractéristiques de
différenciation observées avec les drogues et les stérols.
Enfin, nous avons mis en évidence que l’utilisation de concentrations plus élevées et de temps
d’incubation plus longs de ligands d’AEBS induisent une mort cellulaire active. Nous avons pu
caractériser cette mort cellulaire par des modifications mitochondriales (potentiel de membrane,
relargage du cytochrome C, nucléarisation du facteur AIF), par l’accumulation de marqueurs
autophagiques ( LC3 II, autophagosomes) ainsi que par la régulation de protéines des voies
d’activation de l’autophagie comme Beclin et Bcl-2.
Lors de ces travaux nous avons donc pu mettre en évidence deux cibles importantes du tamoxifène qui
participent à son activité thérapeutique. Ces études montrent que le site AEBS constitue une cible
potentielle pour le développement d’agents anticancéreux et chémopréventifs.

Abstract
Tamoxifen (Tam) is the principal drug used for the hormonoterapy of estrogen receptor (ER)
positive breast cancer throughout the world. Tam also used in North America for the
prevention of breast cancer. It has been used as an antagonist of ER and in this way blocks the
mitogenic action of estradiol. Estradiol is the endogenous regulator of ER. Unfortunately, in
certain tissues, Tam can cause an agonistic effect on ER and induce undesirable side effects
such as the stimulation of endometrious cancer in one patient in a 1000. On the other hand,
Tam can produce pharmacological effects independent of ER such as atheroprotection and
certain anti proliferative effects on tumours that are ERE negative. These observations have
led to the search of new targets for Tam. The aim of my PhD was to identify such new targets.
In the first part of my thesis, I described the identification of a the acetyl-CoA cholesterol
acyl transferase (ACAT) as a new target for Tam. ACAT catalyzed the synthesis of
cholesteryl esters, which are the major lipid found in the atheromatous plaque. We observed
structural similarities between Tam and ACAT inhibitors which prompted us to look at the
effect of Tam on ACAT activity. We showed that Tam is a potent inhibitor of ACAT from rat
liver microsomes at therapeutical concentrations. We then showed than Tam inhibits the
formation of foam cell in mouse macrophage through the inhibition of ACAT. This
mechanism may explain the atheroprotective effects of Tam.
High affinity binding of Tam on the microsomal anti estrogen binding site (AEBS) has been
known for several years but the AEBS remains unidentified. In the second part of my thesis
we have studied the implication of AEBS on the growth control of breast cancer cells. Our
team has identified that the AEBS results from the association of two enzymes involved in the
biosynthesis of cholesterol. We have demonstrated than AEBS ligands, such as Tam and the
selectve AEBS ligand N,N pyrrolidine [4 benzyl) phenoxy ethanamine] (PBPE), lead to
massive cells accumulation of sterol substrates of these enzymes: zymostenol and 7-
dehydrocholesterol. We studied the impact of this inhibition on the proliferation of breast
cancer cells. We observed that PBPE and Tam induced a blockage of the cell cycle in human
mammary cancer cells (MCF-7) with differentiation characteristics, such as the accumulation
and the secretion of lipids and protein normally found in milk. The effect of AEBS ligands
was independent of ER and observed in ER-negative breast cancer cell lines, but with a
weaker efficiency. Differentiaton was also observed with zymostenol and 7-
dehydrocholesterol. This observation established a link between the AEBS and growth
control and differentiation of breast cancer cells. Moreover, we established than this effect
was conditionned by production of zymostenol and 7-dehydrocholesterol oxidation product
and inhibited in the presence of antioxidant such as vitamin E.
Finally, we showed that longer time exposure of cells to AEBS ligands induced an active cell
death with characteristics of macro-autophagy. We identified that this cell death was
characterised by mitochondrial modifications (membrane potential, release of cytochrome C,
nuclearisation of the AIF factor), the appearance of markers of autophagy (LC3 II,
autophagosomes) and by the modulation of autophagic proteins such as Beclin and Bcl-2.
This work identifies two new targets for Tam that may be involved in the therapeutic activity
of Tam. Moreover, our study shows than the AEBS represent a potential target for the
development of anticancer and chemopreventive agents.

Abréviations
ACAT : Acyl Coenzyme A : Cholestérol Acyl Transférase
ADN : acide désoxyribonucléique
AEBS : AntioEstrogèn Binding Site (site de liaison des anti oestrogènes)
AIF : facteur inducteur de l’apoptose
AMPc : adénosine mono phosphate cyclique
ARN : acide ribonucléique
ATP : adénosine triphosphate
BTN : butyrophiline
CML : Corps Multi Lamellaire
DAG : diacyl glycérol
DPPE : N,N-Diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine
E2 : oestrogène
EGF : Epidermal Grow Factor (facteur de croissance de l’épiderme)
FSH : hormone à stimulation folliculaire
hCG : hormone chorionique gonadotropique humaine
HDAC : histones deacetylase
HIC : récepteur intracellulaire à l’histamine
LCAT : lécithine cholestérol acylltransférase
LDL : Lipoprotéines de faible densité
LDLox : Lipoprotéines de faible densité oxydées
LH : hormone lutéinisante
LH-RH : Luteinising hormone releasing hormone
MCP-1 : protéine de controle des macrophages de type 1
MDC : monodansylcadavérine
MDGI : mammary-derived growth inhibitor
mTOR : mammalian target of rapamycin (mTOR)
NPC : maladie de Niemann-Pick
mEH : époxyde hydrolase microsomale