Histologie Générale, Techniques d`imagerie cellulaire

ASEP ¤ Prérentrée
2008-2009
Histologie Générale ¤ Techniques d’imagerie cellulaire
D’après le cours 2007-2008 du professeur Vago
© ASEP – 2008
1/13
Histologie Générale, Techniques d’imagerie
cellulaire
Par Célian BERTIN
A. La cellule
Elle est l’unité fondamentale de la vie. C’est la plus petite quantité de matière vivante capable de subsister à l’état
autonome et de se reproduire.
La cellule associée à la matrice extracellulaire forme les tissus fondamentaux :
1. Les épithéliums de revêtement et glandulaires
2. Les tissus conjonctifs et squelettiques
3. Les cellules sanguines et les tissus hématopoïétiques (tissus responsables de la production des éléments
cellulaires du sang)
4. Le tissu musculaire
5. Le tissu nerveux
Les tissus forment des organes, appareils et systèmes :
1. Système circulatoire
2. Système immunitaire
3. Appareil respiratoire
4. Appareil digestif
5. Système endocrinien
6. Appareil urinaire
7. Appareil tégumentaire
8. Appareil de reproduction
9. Système nerveux
10. Les organes des sens
B. La taille de la cellule
- Taille des cellules (¢) = 5 à 20µm donc non visible à l’œil nu, d’où la nécessité du recours à
des techniques d’imagerie cellulaire :
Microscopie (observation)
Cytométrie (mesures)
C. Pouvoir séparateur/Echelles biologiques
- Pouvoir séparateur = distance la plus petite entre deux points vus séparément
Œil = 0,2mm 200µm > ¢ (la ¢ n’est donc pas visible à l’ œil nue)
Microscopie Optique (MO) =0,2µm 200nm > organites
 Vision des cellules
Microscopie Electronique (ME) =0,2nm > molécule
 Vision des organites

ASEP ¤ Prérentrée
2008-2009
Histologie Générale ¤ Techniques d’imagerie cellulaire
D’après le cours 2007-2008 du professeur Vago
© ASEP – 2008
2/13
D. Grandes étapes de l’imagerie cellulaire
1. Description morphologique des biostructures
- Microscopie optique (photonique) : source lumineuse = faisceau de photons
- Microscopie électronique : source lumineuse = faisceau d’électrons
2. Caractérisation et localisation des constituants biochimiques in situ
- Histochimie
o Réaction chimique sur préparation histologique
- Histoenzymologie
Réaction enzymatique sur préparation histologique, met en évidence une activité
enzymatique
3. Analyse moléculaire in situ
- Immunohistologie
o Avec des anticorps pour reconnaître des protéines (qui se comportent alors comme des
antigènes)
- Hybridation in situ
o Avec des sondes nucléiques pour explorer l’ADN et l’ARN
- Autoradiographie
o Avec des précurseurs des macromolécules marquées avec des isotopes radioactifs
4. Approche quantitative
- Techniques de cytométrie
o Réalisation de « mesures » à un échelon cellulaire

ASEP ¤ Prérentrée
2008-2009
Histologie Générale ¤ Techniques d’imagerie cellulaire
D’après le cours 2007-2008 du professeur Vago
© ASEP – 2008
3/13
I. Différentes types d’échantillon
A. Cellules vivantes
2 possibilités : la cellule peut être en survie (ex vivo) / en culture (in vitro)
(NB : ex vivo il n’y a pas de multiplication cellulaire possible, de ce fait la préparation a une durée de vie limitée, tandis
qu’in vitro la durée est quasi illimitée, une multiplication se réalisant).
La réalisation de la préparation se fait entre lames et lamelles ou boîtes de Pétri ou flacons de culture. On ajoute un
milieu de culture (sérum physiologique pour le plus simple jusqu’à des milieux de synthèse très élaborés)
On peut placer les cultures longues dans une étuve à 37°C avec du CO2 (pour tamponner les produits du métabolisme
cellulaire) afin de se rapprocher des conditions de l’organisme. Une saturation en H2O est également possible pour que
la culture ne se dessèche pas.
Pour l’observation de cellules vivantes on utilise un microscope inversé à contraste de phases, ou un cytomètre.
L’adjonction de colorants vitaux (bleu trypan, sondes fluorescentes) peut aussi être réalisée pour mettre une
caractéristique cellulaire particulière en exergue.
B. Frottis/Etalement/Cytocentrifugation
- Pour les liquides (biologiques, pathologiques, d’exploration)
- Pour les produits de grattage ou de brassage
- L’observation est réalisée sur lame
C. Empreintes/Appositions
- Pour les échantillons solides (organes, tumeurs…)
o Tranche de section appuyée sur la lame, les cellules de la tranche restent donc fixées sur la lame.
D. Préparation à plat
- Pour les organes très fins (après microdissection)
- Sur lame (par exemple pour de la peau)
E. Coupes
- Le plus fréquent car les organes sont trop épais pour observation directe au microscope. Cette technique
nécessite de réaliser des coupes fines (après fixation et inclusion)
- Sur lame (MO) ou grille (ME)
-

ASEP ¤ Prérentrée
2008-2009
Histologie Générale ¤ Techniques d’imagerie cellulaire
D’après le cours 2007-2008 du professeur Vago
© ASEP – 2008
4/13
II. Descriptions morphologiques
A. Microscopie optique
1. Préparation standard des échantillons
= préparation d’un fragment d’organe pour examen au MO
Différentes étapes : (fixation, inclusion, coupe, coloration, montage)
a) Fixation
- Indispensable pour préserver les structures biologiques
- A réaliser le plus rapidement possible après exérèse
- De petits blocs d’organes sont immergés dans un grand volume de liquide fixateur
- Fixateurs
o Acide acétique – méthanol
o Paraformaldéhyde
o Liquide de BOUIN (formol + acide picrique)
b) Inclusion
- Pour durcir le prélèvement afin d’en permettre la coupe
- Après déshydratation, dans des bains d’alcool de degré de croissant puis de toluène (qui est le solvant de
la paraffine)
- Dans la paraffine fondue (chauffage à 56°) qui se mélange au toluène et envahit tout l’échantillon (parfois
utilisation de résines plastiques ou congélation)
c) Coupe
- Coupes fines (2 à 10 µm)
- Avec un microtome (à avance mécanique, couteau en acier)
- Déposer et coller sur des lames de verre
(Coupes en congélation avec un cryostat, permettant la préservation des protéines et des lipides)
d) Coloration
- Pour augmenter les contrastes et faire apparaitre différents composants
- Après déparaffinage (par la chaleur (56°C) et par des bains de toluène)
- Et réhydratation (par bains d’alcool de degré décroissant puis eau distillée)

ASEP ¤ Prérentrée
2008-2009
Histologie Générale ¤ Techniques d’imagerie cellulaire
D’après le cours 2007-2008 du professeur Vago
© ASEP – 2008
5/13
- Colorations les plus utilisées
o Hématéine - Eosine (HE) :
H= colore le noyau en violet
E=cytoplasme en rose
o HE – Safran (HES) :
 S=fibres de collagène en jaune
o Trichrome de Masson : qui est l’association de :
 Hématoxyline  noyau en brun
 Fuschine acide  cytoplasme en rouge
 Vert lumière  collagène en vert
o May Grunwald Giemsa (MGG) :
 utilisé pour colorer les cellules sanguines
e) Montage
- Après coloration puis déshydratation (bains d’alcool de degré croissant puis de toluène)
- Coupe montée entre lame et lamelle
- Avec un milieu de montage (résine synthétique) dont l’indice de réfraction est voisin de celui du verre.
2. Le MO
Etude et observation des préparations et production + traitement d’images
a) Le microscope « standard »
- Partie mécanique avec :
o La potence
o Le tube optique
o La platine
- Source de lumière (photonique)
- Partie optique avec :
- Le condensateur (focalise le faisceau de photons sur
l’échantillon)
- L’objectif (focalise sur l’oculaire)
- L’oculaire (focalise sur la rétine)
b) Capteur d’image (appareil photo/caméra digitale)