TD 4 : Réplication

TD REPLICATION
Exercice 1.
L’ADN mitochondrial de Crithidia fasciculata (un parasite des insectes), également
appelé ADN kinétoplaste (KDNA), est constitué d’une série de chaînons circulaires
dont l’unité de base est un monomère de 2.5Kb
Après avoir été extrait, cet ADN est soumis à l’action de différentes enzymes.
Un premier aliquot est traité par la topoisomérase II eucaryote, un deuxième aliquot
par Hind III une enzyme de restriction qui ne coupe chaque monomère qu’une seule
fois et le dernier aliquot par une ADN gyrase (correspond à une topoisomérase
procaryote qui possède des propriétés particulières pour le surenroulement de
l’ADN).
Les produits de chaque digestion sont analysés par une électrophorèse sur un gel
d'agarose après coloration au bromure d’éthidium.
1) KDNA non traité
2) TopoII
3) HindIII
4) DNA gyrase
Analyser la figure. Que pouvez-vous en déduire ?
Exercice 2. Question posée à l’examen IGM – 2ème session 2005-06
Faites le schéma d’un œil de réplication et celui d’une bulle de transcription.
Attachez une attention particulière aux légendes (définissez les molécules présentes
et orientez les polymères d’acides nucléiques). Comparez les 2 situations en
soulignant quelles sont les similitudes et les principales différences.
Exercice 3.
Le microscope électronique est un important outil d’étude de la réplication de l’ADN
car il permet d’observer directement la fourche de réplication et, pour de petites
molécules d’ADN, la structure réplicative dans sa totalité. De plus, on peut distinguer
un ADN double brin d’un ADN simple brin. Dans cet exercice, une série de molécules
théoriques en réplication est schématisée, les régions d’ADN simple brin étant
indiquées en trait fin.
Lors d’une des premières études importantes au microscope électronique de la
réplication du bactériophage lambda, certaines de ces structures ont été
fréquemment observées, d’autres jamais.
A partir de vos connaissances sur la réplication de l’ADN, choisissez les 4 structures
les plus fréquemment observées.
Exercice 4.
Dès l’origine, la structure moléculaire de l’ADN a permis de concevoir 3 modèles
théoriques de réplication :
a) le modèle conservatif : la double hélice parentale entière est conservée dans
une des doubles hélices filles ; l’autre double hélice est entièrement néo-synthétisée.
b) le modèle semi-conservatif : un brin de la double hélice parentale est conservé
dans chacune des doubles hélices filles, le brin complémentaire est néo-synthétisé.
c) le modèle dispersif : chacun des brins des doubles hélices filles est constitué de
parties provenant de brins de la double hélice parentale et de parties néosynthétisées.
Le protocole suivant (basé sur l’expérience de Meselson & Stahl), est mis en oeuvre
pour établir in vivo le modèle utilisé. Les molécules d’ADN sont modifiées par
l’incorporation de 5-bromodésoxyuridine (5-BrdU) à la place de la thymidine. Les
molécules d’ADN sont ensuite séparées par centrifugation à l’équilibre dans un
gradient de densité et repérées dans ce gradient par le bromure d’éthidium (= BET,
ce produit à de l’affinité pour l’ADN et devient fluorescent sous UV).
1) Des colibacilles sont cultivés pendant plusieurs générations en présence de 5BrdU. L’ADN bactérien est extrait d’une fraction aliquote de la culture ; 0,5 mg de cet
ADN est centrifugé dans un gradient de chlorure de césium jusqu’à l’obtention de
l’équilibre ; une seule bande d’ADN est alors mise en évidence dans le tube de
centrifugation (= tube 0).
2) Les bactéries du reste de la culture sont lavées pour éliminer la 5-BrdU et remises
en suspension à DO 0,1 dans un milieu contenant de la thymidine en excès. La
culture est incubée pendant 40 min à la fin desquels est effectué un premier
prélèvement ; un second prélèvement est effectué après 1 h 20 min.
Les DO de ces prélèvements sont respectivement de 0,2 et 0,4. L’ADN est extrait et
analysé par centrifugation (0,5mg d’ADN par tube) ; les résultats de ces analyses
sont présentés dans les tubes 1 et 2.
0
1
2
3
Q1- En quoi l’ADN ayant incorporé la 5-BrdU diffère-t-il de l’ADN normal ?
Pourquoi ?
Q2- représenter les tubes 0, 1 et 2 en appliquant chacun des 3 modèles.
Quantifier l’ADN de chacune des bandes. Quel est celui des 3 modèles en accord
avec les résultats expérimentaux présentés ci-dessus ?
3) Un 3ème prélèvement est effectué à DO 0,8 ; l’ADN est extrait et 0,5 mg sont
analysés comme précédemment (tube3)
Q3- Après combien d’heures de culture le 3ème prélèvement a-t-il été effectué ?
Q4- En appliquant le modèle choisi, donner l’emplacement de l’ADN dans le
tube 3. Quantifier l’ADN contenu dans chacune des bandes.
Exercice 5 : questions de cours
- Qu’entend-on par amorce et pourquoi les amorces sont-elles nécessaires à la
réplication de l’ADN ?
- Pourquoi la synthèse de l’ADN est-elle continue sur un brin et discontinue sur le
brin opposé ?
- Que sont les hélicases et les topoisomérases ?
Exercice 6.
L’ADN polymérase I possède une activité 3’-5’ exonucléasique en plus de son
activité polymérase. Cette activité intervient dans la fonction de « correction sur
épreuves » pour enlever les bases incorrectes de l’extrémité du brin d’ADN néosynthétisé. Afin d’étudier cette activité, vous préparez un substrat artificiel comportant
un brin poly(dA) et un brin poly(dT) contenant quelques résidus dT marqués au 32P
suivis à l’extrémité 3’ de quelques résidus dC tritiés (3H). Vous mesurez la perte de
résidus dT et dC marqués, soit en absence de dTTP, de sorte qu’aucune synthèse
d’ADN n’est possible, soit en présence de dTTP, de sorte une synthèse d’ADN peut
avoir lieu.
Q1- Pourquoi a-t-on marqué les résidus T et C avec des radioisotopes
différents ?
Q2- Pourquoi l’enzyme a-t-elle mis plus de temps pour enlever les résidus T
que pour enlever les résidus C en l’absence de dTTP ?
Q3- Pourquoi n’y a-t-il aucun résidu T enlevé en présence de dTTP, alors que
les résidus C sont retirés indifféremment en présence et en absence de dTTP ?
Q4- Attendez-vous des résultats différents si vous ajoutez du dCTP et du
dTTP ?