tutorat physique

FACULTE
de
PHARMACIE
TUTORAT UE spécifiques 2010-2011
Méthodes d’étude et d’analyse du génome
Eric Badia, Bernard Carcy
CORRECTIONS
QCM n°1 : Ligature d'extrémités d'ADNs coupés par des enzymes de restriction
de type II différentes
=> si les extrémités libérées par les 2 enzymes de restriction différentes sont
franches, on pourra toujours effectuer la ligature.
=> si les extrémités libérées par les 2 enzymes de restriction différentes sont
cohésives, on ne pourra effectuer la ligature que si les extrémités cohésives libérées
sont complémentaires.
=> On ne peut ligaturer une extrémité cohésive avec une extrémité franche.
Sur le plasmide étudié il y a 2 sites SmaI (1 et 2), 1 MxaI, 1 PvuI, 1 AbrI et 1 NopI.
Mxa1
AbrI
SmaI(1)
NopI
PvuI
SmaI(2)
A- VRAI: cas d'une ligature MxaI/SmaI. La coupure du plasmide circulaire par ces 2
enzymes libérerait 3 fragments linéaires : MxaI-SmaI(1) contenant le fragment noir,
SmaI(1)-SmaI(2), et SmaI(2)-MxaI contenant le fragment grisé d'intérêt. Les 2
enzymes libérant des extrémités franches différentes, on pourrait donc effectuer
leur ligature des deux extrémités franches SmaI(2) et MxaI. Il en résulterait une
séquence GAGggg (GAG provenant de l'extrémité MxaI et ggg de l'extrémité
SmaI(2)) qui permettrait de recirculariser un plasmide ne contenant plus le fragment
noir mais toujours le fragment grisé. Notez que cette séquence ne pourrait plus être
coupée par ces 2 enzymes une fois les 2 extrémités ligaturées.
B- FAUX: cas d'une ligature SmaI seul. La coupure du plasmide circulaire par
l'enzyme SmaI libérerait 2 fragments linéaires SmaI(1)-SmaI(2). Un des deux
fragments ne contiendrait ni la séquence noire ni la séquence grisée alors que
l'autre contiendrait ces 2 séquences.
C- VRAI: cas d'une ligature AbrI/NopI. La coupure du plasmide circulaire par
ces 2 enzymes libèrerait 2 fragments linéaires NopI-AbrI. Un des deux
2010-2011
Tutorat UE spécifiques – Méthodes d’étude et d’analyse du génome
1/8
fragments ne contiendrait que la séquence noire alors que l'autre ne
contiendrait que la séquence grisée d'intérêt. Ces 2 enzymes, bien que
possédant des sites de reconnaissance différents, libèrent des extrémités
cohésives simple brin identiques (5'TCGA).
AbrI:
5' C/TCGAG=>
3' GAGCT/C
5'C3'
+
3'GAGCT5'
5'TCGAG-3'
C-5'
NopI:
5' g/tcgac=>
3' cagct/g
5'g
3'cagct5'
5'tcgac-3'
g-5'
+
Il serait alors possible de recirculariser le plasmide avec le fragment
grisé d'intérêt par ligature des 2 extrémités cohésives comme suit:
5'Ctcgac3'
ou
3'GAGCTg5'
5'gTCGAG3''
3'cagctC5'
D- FAUX: cas d'une ligature AbrI/PvuI. La coupure du plasmide circulaire par
ces 2 enzymes libèrerait 2 fragments linéaires AbrI-PvuI. Un des deux
fragments ne contiendrait que la séquence noire alors que l'autre ne
contiendrait que la séquence grisée d'intérêt. Cependant ces 2 enzymes, qui
possédent des sites de reconnaissance différents, libèrent des extrémités
cohésives simple brin non complémentaires (5'TCGA pour AbrI et 5'CG pour
PvuI).
AbrI:
5' C/TCGAG=>
3' GAGCT/C
5'C3'
+
3'GAGCT5'
5'TCGAG-3'
C-5'
PvuI:
5' tt/cgaa=>
3'aagc/tt
5'tt
3'aagc5'
5'cgaa-3'
tt-5'
+
Malgré l'existence d'un fragment grisé d'intérêt après coupure du plasmide par
AbrI/PvuI, il est donc impossible de recirculariser le plasmide.
E- FAUX: cas d'une ligature NopI/MxaI. La coupure du plasmide circulaire par
ces 2 enzymes libèrerait 2 fragments linéaires NopI-MxaI. Cependant, aucun
des 2 fragments ne contiendrait que la séquence grisée. De plus il serait
impossible de religaturer le plasmide après coupure puisqu'une des enzymes
libère des extrémités cohésives (NopI) et l'autre (MxaI) des extrémités
franches. Donc il serait impossible de les ligaturer.
QCM2: Synthèse d'une protéine recombinante
A- VRAI: la boite de petri contenant de l'ampicilline, seules les bactéries
transformées par des plasmides peuvent croître sur cette boite. En effet, le gène
AmpR est présent sur le plasmide et les bactéries transformées sont donc
résistantes à l'antibiotique. A l'inverse, les bactéries non transformées par un
plasmide sont sensibles à l'antibiotique et sont donc éliminées par l'ampicilline.
B- FAUX: la coloration bleue signifie que le substrat X-gal (incolore) a été dégradé
en bromo-chloro-indol (bleu). La dégradation du substrat X-gal signifie donc qu'il y a
une activité -galactosidase et qu’il y a donc eu -complémentation (association des
peptides  et ) dans la bactérie. Or l' -complémentation n'est possible que si le
peptide  n'est pas recombinant, donc s'il n'y a pas eu insertion de l’ADNc dans le
2010-2011
Tutorat UE spécifiques – Méthodes d’étude et d’analyse du génome
2/8
gène lacZ porté par le plasmide. Ainsi, la coloration bleue signifie que la bactérie
est transformée par un plasmide non recombinant.
C- FAUX: Puisque le clonage concerne un seul ADNc, il suffit d'un seul clone blanc
sur la boite pour que le clonage soit réussi. Par contre si l'on avait voulu construire
une banque d'ADN, il faudrait au moins 95% de clones blancs pour considérer que la
banque est représentative du génome fragmenté.
D- FAUX: C'est l'IPTG qui assure ce rôle dans la bactérie. En fixant le répresseur
codé par lacI, il l'empêche de se fixer sur l'opérateur présent en amont du gène
lacZ. Ceci permet donc la fixation de l'ARN polymérase sur le promoteur et donc la
transcription/traduction de l’ADNc cloné. On dit que l'IPTG est l'inducteur de la
synthèse du peptide  (recombinant ou non) codé par lacZ.
E- FAUX: Le choc thermique des cellules compétentes (dont la paroi est
préalablement fragilisée au CaCl2) de 0 à 42°C est une autre méthode de
transformation bactérienne.
QCM3: digestion par les enzymes de restriction de type II.
A- FAUX : le champ pulsé est utilisé pour la séparation électrophorétique de
fragments d'ADN de grande taille (>20kpb).
B- FAUX: Si l'enzyme A était inactive, le profil A+B serait identique au profil B. La
taille du plasmide étant identique qu'il soit ou non digéré par l'enzyme de restriction A
indique qu'il existe un seul site de restriction A sur ce vecteur. A a donc linéarisé le
plasmide après coupure.
C- VRAI: le profil B révèle un seul fragment de 1000pb alors que le plasmide fait
3000pb. Cela indique qu'il y a bien 3 sites B équidistants.
D- VRAI: La digestion A+B génère des fragments de 500 et 1000pb. Vu qu'il y a 3
fragments de restriction B de 1000pb, la révélation d'un fragment de restriction de
500 pb dans la digestion A+B indique obligatoirement que l'unique site A est situé au
centre d'un fragment de restriction B de 1000pb. Par conséquent, A est en position
diamétralement opposé à un site B (A localisé a 1500pb de B1 sur le schéma).
B1
1000pb
1000pb
B3
500pb
B2
A
500pb
E- FAUX: La digestion A+B génère 2 fragments de 1000pb (B1-B2 et B1-B3) et 2 de
500pb (B3-A et B2-A).
QCM n°4 : PCR
A- FAUX : pour trouver la T°d'hybridation (Th) des amorces il faut calculer le point de
fusion (Tm) des 2 amorces et se placer 5°C en dessous du plus petit point de fusion
des 2 amorces.
Les séquences des 2 amorces utilisées pour amplifier la séquence d'intérêt sont
5'ATCGGGATTC3' (amorce sens) et 5'CGCTAGGTTT3' (amorce anti-sens). Le point
2010-2011
Tutorat UE spécifiques – Méthodes d’étude et d’analyse du génome
3/8
de fusion de ces 2 amorces est donc de (4x5)+(2x5) soit 30°C. Ainsi, la Th de la PCR
serait réglée à 25°C.
B- FAUX: Elle est choisie aux alentours de 70°C car on utilise une ADN polymerase
thermorésistante (par exemple la Taq ADN polymerase extraite de la bactérie
thermophile Thermus aquaticus). La découverte de cette enzyme thermorésistante
(qui n'est pas dénaturée même à une T° de dénaturation de l'ADN d'environ 90°C) a
permis d'automatiser la technique et de développer les thermocycleurs.
C- FAUX: La taille du fragment amplifié comprend la taille des 2 amorces
puisqu'elles font partie des fragments d'ADN synthétisés de 5'->3' par l'ADN
polymerase (la polymérisation s'effectue par ajout de dNTP libre à l'extrémité 3' OH
de l'amorce). Le fragment amplifié fait donc 70pb.
D- FAUX: Une amorce a une orientation 5'->3'. L'hybridation d'une amorce ne peut
donc se faire que sur sa séquence complémentaire mais également uniquement de
façon anti-parallèle (sur un brin d'orientation 3'->5') afin de reconstituer un ADN
double brin anti-parallèle.
En D, les deux amorces proposées sont bien complémentaires des deux séquences
matricielles. Cependant, elles ne pourront pas s'hybrider puisque chaque amorce et
sa matrice correspondante contenant la séquence complémentaire ont la même
orientation 5'->3'.
E- VRAI: A l'inverse de D, ces deux amorces s'hybrideront sur leur séquence
matricielle complémentaire respective et de façon anti-parallèle. Il en résultera donc
une polymérisation de chaque brin de 5'->3' et donc l'amplification génique
(exponentielle) de la séquence comprise entre les 2 amorces.
QCM n°5 : Enzymes de restriction de type II
A) FAUX: La spécificité de reconnaissance des enzymes de restriction de type II est
le plus souvent absolue mais pas toujours. Par exemple, l’enzyme NspIV
reconnaît un site de 5 paires de bases 5’G/GNCC3’ où N est A,C,G ou T. Ainsi,
quel que soit N, s’il est encadré en 5’GG et CC3’ alors NspIV coupe l’ADN.
B) VRAI pour la majorité des enzymes de restriction de type II. Palindromique
signifie que la séquence d’ADN double brin se lit de la même manière de 5’ vers
3’ quel que soit le brin étudié (Ex : 5’GAATTC3’)
C) FAUX : Une fois la séquence reconnue, une enzyme de restriction de type II clive
généralement au niveau du site de reconnaissance.
D) VRAI : Dans la forme non mutée, A et B correspondent à 2 sites reconnus à la
fois par AatI (AGG/CCT) et HaeII (GG/CC). Ainsi, même si la séquence reconnue
par les deux enzymes n’est pas la même, les deux enzymes coupent au même
endroit (entre G et C) au niveau des séquences A et B. Les fragments de
restriction résultants (3+2+5kpb) sont donc les mêmes.
E) VRAI : Dans la forme mutée, la mutation A->T du site B fait qu’il ne pourra plus
être reconnu par l’enzyme AatI (site de reconnaissance absolue de 6pb). Ainsi,
contrairement à la forme non mutée où la digestion par AatI produit 3 fragments
de restriction (3+2+5kpb), une telle digestion de la forme mutée du gène ne
produira plus que 2 fragments de restriction (3+7kpb). Cette variation dans la
taille des fragments de restriction montre que la mutation sera donc décelable
grâce à AatI. A l’inverse, la mutation A->T du site B n’altère pas la coupure de ce
site par HaeIII puisque son site de reconnaissance absolue GG/CC est toujours
présent. Hae III ne pourra donc pas différencier les allèles mutés et non mutés.
2010-2011
Tutorat UE spécifiques – Méthodes d’étude et d’analyse du génome
4/8
QCM n°6 : Détection de la mutation par Southern blot
Dans le cas d’un individu homozygote pour la mutation : seul le site A du fragment
de 10kpb d’intérêt sera coupé par AatI et ceci sur les 2 allèles. Le site A étant situé à
3kpb de la région de référence (0kpb), on obtiendra donc deux fragments de
restriction de 3 et 7kpb. La sonde radioactive s’hybridant dans la région 2-4 kpb, elle
sera capable de s’hybrider (bien que partiellement) sur ces 2 fragments. On
observera donc un profil autoradiographique avec deux bandes de 3 et 7 kpb dans le
cas d’un individu homozygote pour la mutation (profil D).
Dans le cas d’un individu hétérozygote : l’allèle normal sera coupé par AatI au
niveau des sites A et B alors que l’allèle muté ne sera coupé qu’au site A. Il en
résulte la libération de 3 fragments de restriction de 3+2+5kpb sur la copie normale
et de 2 fragments de 3+7kpb sur la copie mutée. La sonde hybridant dans la région
2-4 kpb, elle sera capable de s’hybrider (partiellement) sur les 2 fragments de la
copie mutée mais uniquement sur les fragments de 2 et 3 kpb de la copie normale.
En effet le fragment de 5 kpb étant situé en dehors de la région d’hybridation, il ne
sera pas décelable par la sonde et donc ne sera pas visible sur l’autoradiographie.
Ainsi les seuls fragments visibles par autoradiographie seront ceux de 2, 3 et 7 kpb.
Un tel profil correspond au profil E. Il s’agit donc de l’hétérozygote.
(Attention, le profil E indiqué n’est pas le même pour certaines versions imprimées)
QCM7: Détection de la mutation par PCR-restriction
A- FAUX : C’est la PCR en temps réel qui permettrait de quantifier.
La PCR restriction permet de savoir si un individu est homozygote ou hétérozygote au
niveau d’un locus donné pour une mutation touchant un site de restriction (cette
mutation peut créer ou abolir un site de restriction). Pour ce faire, on amplifie par PCR
la région portant la mutation et l’on digère le fragment PCR par l’enzyme de restriction.
Après analyse du résultat de la digestion par électrophorèse et coloration de l’ADN au
bromure d’éthidium (intercalant de l’ADN qui permet de visualiser l’ADN sous les UV),
la présence ou non de la mutation génère 3 profils distincts selon que les individus
sont homozygote N/N, hétérozygote N/M ou homozygote M/M.
B- VRAI : Chez un sujet homozygote non muté, les séquences A et B sont coupées par
Aatl. La PCR à l’aide d’un couple d’amorces O1/O2 permet d’amplifier un fragment
d’ADN de 2 kpb pour chaque allèle. Chacun de ces fragments contient le site B non
muté situé à 1 kpb de O1 ou O2. La digestion de ce fragment de 2kpb par AatI libère
donc 2 fragments d’1kpb (O1B et BO2) pour chaque allèle normal. Il en résulte 4
fragments d’1kpb. Etant tous à la même taille, on ne visualise qu’une seule bande
d’1kpb sur gel après révélation par le bromure d’éthidium.
C- VRAI : Chez un sujet homozygote muté, seules les séquences A sont coupées par
Aatl. Comme précédemment, la PCR à l’aide d’un couple d’amorces O1/O2 permet
d’amplifier un fragment d’ADN de 2 kpb pour chaque allèle muté et chacun de ces
fragments contient le site B muté situé à 1 kpb de O1 ou O2. Cependant, de part la
mutation A->T dans lez site B, la digestion de ce fragment de 2kpb par AatI n’est plus
possible. Il en résulte donc 2 fragments de 2kpb. Etant tous à la même taille, on ne
visualise qu’une seule bande de 2kpb sur gel après révélation par le bromure
d’éthidium.
D- FAUX : Chez un sujet homozygote non muté, les séquences A et B sont coupées par
Aatl. La PCR à l’aide d’un couple d’amorces O1/O3 permet d’amplifier un fragment
d’ADN de 4 kpb pour chaque allèle. Chacun de ces fragments contient le site B non
muté situé à 1 kpb de O1 ou 3 kpb de O3. La digestion de ce fragment de 4kpb par
AatI libère donc 1 fragment d’1kpb (O1B) et de 3 kpb (BO3) pour chaque allèle
normal. Il en résulte 4 fragments (2 d’1kpb et 2 de 3kpb). On visualisera donc 2
bandes d’1 et 3kpb sur gel après révélation par le bromure d’éthidium.
2010-2011
Tutorat UE spécifiques – Méthodes d’étude et d’analyse du génome
5/8
E- FAUX : Comme précédemment (réponse D), la PCR à l’aide d’un couple d’amorces
O1/O3 permet d’amplifier un fragment d’ADN de 4kpb pour chaque allèle muté et
chacun de ces fragments contient le site B muté situé à 1 kpb de O1 et 3 kpb de O3.
Cependant, de part la mutation A->T dans lez site B, la digestion de ce fragment de
4kpb par AatI n’est plus possible. Il en résulte donc 2 fragments de 4kpb. Etant tous à la
même taille, on ne visualise qu’une seule bande de 4kpb sur gel après révélation par le
bromure d’éthidium.
QCM8: Caractérisation de la nature de la mutation par séquençage
La séquence 5’TGGCCT3’ correspondant au brin matrice, sa séquence
complémentaire est donc 3’ACCGGA5’. La réaction de séquençage de Sanger et
Coulson est une réaction enzymatique puisqu’elle correspond à une polymérisation
d’ADN par une ADN polymérase. Comme pour toute polymérisation d’ADN, elle
s’effectue dans le sens 5’->3’ et nécessite une amorce qui s’hybride sur le brin
matrice. Ainsi, le brin d’ADN synthétisé dans le sens 5’->3’ après amorçage sera
AGGCCA.
Dans cette technique utilisant 4 types de ddNTP séparément, tous les fragments
synthétisés contiennent un seul ddNTP à leur extrémité et surtout ils sont tous
distincts d’une base. Ainsi pour cet exemple d’une matrice composée de 6 bases on
générerait 6 fragments distincts d’une base qui seraient : 5’ddA, 5’AddG, 5’AGddG,
5’AGGddC, 5’AGGCddC et 5’AGGCCddA. Dans un gel d’électrophorèse, plus le
fragment est petit et plus il migre loin (séparation en fonction de la taille). La lecture
du brin synthétisé dans le sens 5’->3’ se fait donc de bas (plus petits fragments) en
haut (plus grands fragments), dans le sens inverse du sens de migration. Le profil
électrophorétique attendu pour la synthèse d’une séquence AGGCCA de 5’->3’ est
donc le C.
Pour ne jamais se tromper: Sur l’autoradiogramme, on lit la séquence 5’->3’
complémentaire de la matrice dans le sens inverse du sens de migration.
QCM n°9 : Soit une expérience d’analyse de courbes de fusion (HRM) dans le cadre d’un
diagnostic de maladie génétique liée à la délétion d’une partie de séquence (perte d’un
triplet CGC).
A) VRAI : Le matériel de départ étant souvent de l’ADN génomique, il faut l’amplifier pour disposer
de suffisamment de copies afin que le signal de fluorescence soit suffisant.
B) FAUX : Ce n’est pas le cas actuellement.
C) VRAI : Cet agent devient fluorescent lorsqu’il est intercalé dans de l’ADN double brin.
D) FAUX : Cette technique utilise la mesure de l’émission de fluorescence de l’agent intercalant.
E) FAUX : La mutation étant une délétion, l’ADN muté sera plus court (et en plus avec moins de
CG) donc son Tm sera plus faible : il sera donc dénaturé (totalement ou partiellement) à la
température de fusion de l’ADN non muté.
QCM n°10 : Concernant le pyroséquençage : Quelle(s) est (sont) la (ou les)
propositions(s) exactes(s) ?
A) FAUX : L’analyse de fait par mesure séquentielle de la réaction de luminescence qui résulte de
l’incorporation du « bon » nucléotide (pas de migration sur gel).
B) FAUX: La réaction séquentielle se fait sur une même matrice au même endroit.
C) FAUX : Les dNTPs ne sont pas mélangés mais au contraire sont présentés séquentiellement à
cette matrice.
D) VRAI: le flash lumineux ne se produit que si le « bon » nucléotide est présenté en face du
nucléotide du brin matriciel présent à cet instant au niveau du site catalytique de la polymérase.
2010-2011
Tutorat UE spécifiques – Méthodes d’étude et d’analyse du génome
6/8
E) VRAI: l’apyrase détruit les nucléotides résiduels à chaque cycle, juste avant de présenter le
nucléotide suivant.
QCM n°11 : Les puces à ADN : Quelle(s) est (sont) la (ou les) propositions(s) exactes(s) ?
A) VRAI : Dans ces deux techniques, les acides nucléiques qui vont s’hybrider sur la puce (ARN
pour les puces d’expression ou ADN sur les CGH arrays) sont marqués par des molécules
fluorescentes.
B) VRAI : L’analyse du transcriptome désigne l’analyse de l’expression des ARN de la cellule.
C) VRAI : Les polynucléotides déposés ou synthétisés sur la puce sont forcément simple brin pour
permettre à l’hybridation de se réaliser.
D) VRAI : Ici, c’est de l’ADN génomique qui est marqué, puis hybridé sur la puce.
E) FAUX : cf cours : la puce Mammaprint analyse l’expression d’environ 70 gènes chez des patients
atteints de cancer du sein, ce qui permet une meilleure orientation thérapeutique.
QCM n°12 et 13 liés :
QCM n°12 : Soit la séquence suivante possédant un motif CpG éventuellement méthylé :
ATATGCCGTCT
On souhaite mettre en évidence sur l’ADN d’un patient l’absence ou le caractère
homozygote/hétérozygote de cette méthylation. Quelle(s) est (sont) la (ou les)
propositions(s) exactes(s) ?
A) VRAI : car la transformation ne se fait pas si l’ADN est sous forme double brin.
B) FAUX : Le U n’est pas méthylé (c’est le C qui peut l’être).
C) FAUX : Il y a généralement perte de complémentarité des deux brins d’ADN après traitement
au bisulfite (puisque si un C est changé en U, le G qui était complémentaire de ce C restera un
G). De ce fait, un des deux brins sera choisi pour être amplifié, avec une élongation préalable de
la première amorce pour créer un double brin qui sera ensuite amplifié classiquement.
D) VRAI : Ici les deux allèles sont méthylés, donc le C du motif CpG n’est pas transformé par le
bisulfite (En fait la transformation par le bisulfite est empêchée par la présence du méthyl dans la
5 méthyl-cytosine) et restera un C.
E) VRAI: Ici les deux allèles sont non méthylés, le bisulfite transforme donc tous les C en U (ces U
seront ensuite remplacés au cours de la PCR par des T).
QCM n°13 : Vous choisissez de réaliser une analyse par chromatographie DHPLC des
brins courts obtenus. On représente sur le graphe suivant en abscisse le volume d’élution,
en ordonnée le niveau d’absorbance à 260 nm (présence d’un capteur à la sortie de la
colonne).
A) VRAI : La présence de 4 pics indique la présence de deux homoduplexes + deux
hétéroduplexes (ce qui n’est possible que pour un sujet hétérozygote). Pour un sujet homozygote,
un seul pic apparaitrait.
B) VRAI: Les billes sont hydrophobes et vont lier les « pattes » carbonées du réactif bifonctionnel
lui-même lié à l’ADN par sa partie chargée.
C) FAUX : les hétéroduplexes sortent en premier car moins liés aux billes (ce sont les pics A et B)
et les homoduplexes sortent plus tard (pics C et D) .
D) FAUX:
E) VRAI: oui et dans ce cas la PCR sera réalisée dans l’appareil de PCR en temps réel et sera
suivie de l’analyse de la courbe de fusion.
2010-2011
Tutorat UE spécifiques – Méthodes d’étude et d’analyse du génome
7/8
QCM14 : généralités sur le transfert de gène
A- VRAI.
B- FAUX. L’expression peut être post-intégration ou indépendante.
Exemple 1 : c’est le cas d’un transgène porté par un plasmide. Chez les procaryotes
pour l’expression d’une protéine thérapeutique (réplication autonome du plasmide =
épisomale) ou chez les eucaryotes lors d’une injection d’ADN nu dans les muscles
(ou le plasmide ne sera pas intégré au génome nucléaire).
Exemple 2 : dans le cas d’un transfert de gène par virus en thérapie génique, le
transgène porté par un rétrovirus est intégré dans le génome nucléaire mais pas
celui porté par un adénovirus.
C- FAUX. Il en existe de nombreuses :
1) chez les bactéries : les 2 méthodes principales pour effectuer la transformation
bactérienne sont l’électroporation ou le choc thermique dans des bactéries
compétentes (préalablement fragilisées pour recevoir le transgène porté par un
plasmide)
2) chez les eucaryotes : transfert par des virus, injection ADN nu, biolistique,
électroporation, lipofection, microinjection, …
D- FAUX : Problème éthique car il est interdit en France de modifier les cellules
germinales d’un individu (et donc de sa descendance).
E- VRAI. Tag (His)6 ou Glutathion-S-Transférase.
QCM15 : le transfert de gène via un rétrovirus en thérapie génique humaine
A- FAUX. A la fois in vivo et ex-vivo (après biopsie).
B- VRAI.
C- VRAI. Dans cette cellule, l’ARN simple brin viral issu de l’ADN proviral auxiliaire
défectif sera ψ- (c’est-à-dire non transmissible) mais vir+ car il pourra synthétiser les
protéines virales nécessaires à la formation de virions thérapeutiques complets qui
eux seront ψ+vir-. En effet dans cette même cellule, l’ADN viral thérapeutique intégré
dans le génome produira un ARN simple brin thérapeutique ψ+ (c’est-à-dire
transmissible) mais vir- car incapable de coder pour des protéines virales (les gènes
codant les protéines virales ayant été substitués par un gène codant pour la protéine
thérapeutique).
D- FAUX. L’ARN thérapeutique étant vir-, il est incapable de synthétiser les protéines
virales. Or lors de la formation des virions thérapeutiques dans la cellule vecteur, la
transcriptase reverse, codée par le gène pol de l’ADN proviral auxiliaire, sera
encapsidée dans la particule virale thérapeutique lors de sa formation dans la cellule
vecteur. Si ça n’était pas le cas, la transcriptase reverse étant une ADN polymerase
ARN dépendante, lorsque les particules virales thérapeutiques entrent dans les
cellules à traiter, l’ARN simple brin thérapeutique ne pourrait être transformer en
ADN double brin et donc ne pourrait pas s’intégrer dans le génome nucléaire. La
conséquence serait l’absence d’ARNm thérapeutique et donc il n’y aurait pas de
traduction de cette protéine thérapeutique.
E- FAUX. L’ARN thérapeutique est certes transmissible, mais comme il est incapable de traduire
les protéines virales, une fois entré dans une cellule, il ne pourra plus s’assembler à des protéines
virales pour former de nouveaux virions et aller infecter d’autres cellules. Il ne peut donc infecter
une cellule qu’une fois.
2010-2011
Tutorat UE spécifiques – Méthodes d’étude et d’analyse du génome
8/8