Le devenir d`un spécimen de mollusque récupéré lors de

La Planète Revisitée : Expéditions Papouasie Nouvelle-Guinée :: Le devenir d’un spécimen de mollusque récupéré lors de l’expédition
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La Planète Revisitée : Expéditions Papouasie Nouvelle-Guinée
Approche SVT
Le devenir d’un spécimen de mollusque récupéré lors de l’expédition
[© Nicolas Puillandre]
Niveau de seconde et 1S
Le devenir d’un spécimen de
mollusque récupéré lors de
l’expédition
Objectifs :
Montrer aux élèves comment est extrait l’ADN à partir des tissus de spécimens
récoltés lors des missions puis quelles sont les manipulations effectuées dessus (PCR,
séquençage) avant de pouvoir les exploiter. Cette fiche peut notamment servir à
illustrer la réplication de l’ADN via la PCR mais aussi à explorer la structure de la
cellule pour bien comprendre les étapes d’extraction de l’ADN.
Contexte :
Lors des expéditions, les scientifiques du Muséum National d’Histoire Naturelle vont
récolter un certain nombre de spécimens qui seront inventoriés et classifiés. En plus
de cette classification macroscopique, l’ADN de ces spécimens sera aussi analysé
principalement afin de les classer de manière phylogénétique. Pour cela une partie de
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L'EXPÉDITION
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du vivant
- Réaliser un herbier à partir
d’algues marines
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d’algue : du terrain à
l’herbier national
- La dérive génétique illustrée
à partir d’une comparaison
entre populations humaines
- Influence des épaves sous-
marines sur le milieu
- De fausses forêts vierges
en Papouasie ?
- Répartition des faunes
actuelles et mobilité des
masses continentales
- Influences des exploitations
minières sur l’environnement
- Identification des couleurs
chez les Papous
- Des coraux multipliés ou les
reproductions des coraux
- L'implication des zoos dans
la conservation des espèces
animales de Papouasie
Nouvelle-Guinée
- La respiration des animaux
du récif corallien
- Le devenir d’un spécimen
de mollusque récupéré lors
de l’expédition
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milieu équatorial
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FORUM

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Exemple de spécimen de mollusque
[© Barbara Buge | MNHN]
Exemple de spécimen de mollusque
[© Barbara Buge | MNHN]
leurs tissus sera prélevée dans le but d’en extraire l’ADN.
Nous prendrons ici l’exemple d’un mollusque comme spécimen et aborderont 4 étapes
: le prélèvement du tissu l’extraction de l’ADN, l’amplification de l’ADN par PCR
(nécessaire à son utilisation et pouvant servir de base à la compréhension de la
réplication), le séquençage de cet ADN. Enfin des pistes d’utilisations des données
générées seront évoquées.
Documents :
Doc 1 : Manipulations sur le terrain
Photographie du spécimen :
Le spécimen doit d’abord être photographié pour pouvoir garder une trace de son
aspect macroscopique vivant. Pour cela :
1) Le spécimen est nettoyé au pinceau, en particulier la coquille
2) Le spécimen est photographié vivant dans de l’eau sur un fond noir
3) Après le prélèvement du tissu, la coquille sera séchée et conservée. De retour au
laboratoire, elle sera photographiée sur fond noir.
PRESSE
MÉCÈNES
PARTENAIRES
LA PLANÈTE REVISITÉE
MADAGASCAR 2010
MOZAMBIQUE 2009
SANTO 2006
LETTRE D'INFORMATION

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Exemple de dispositif photographique pour la prise de vue des spécimens
[© Tin-Yam Chan | MNHN]
Exemple de coquille photographiée sur fond noir d’un Turridae
[© Barbara Buge | MNHN]
Prélèvement de tissu chez un mollusque :
Pour prélever les tissus, il est important de travailler avec du matériel propre afin
d’éviter les contaminations par d’autres ADN. Idéalement, le matériel devrait être
stérilisé avec une flamme ou à la javel mais sur le terrain le matériel est souvent
simplement passé à l’alcool (moins efficace).
Pour les spécimens de mollusques sans coquille, un morceau de tissu peut directement
être prélevé et mis dans de l’alcool supérieur à 95°C pour la conservation.
Dans le cas d’un spécimen avec une coquille plusieurs options sont possibles :
Le spécimen peut être anesthésié dans du MgCl2 (ce qui va relâcher les muscles)
pendant environ 2 h à 4°C
Ou le spécimen peut être plongé 1 à 2 minutes dans de l’eau bouillante afin de
forcer l’ouverture ou la sortie de la coquille
Ou en cas d’échec des 2 premières méthodes notamment si le spécimen a un
opercule qui se ferme à l’entrée de la coquille, il faut percer la coquille afin de pouvoir
prélever du tissu :

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Spécimens plongés dans du MgCl2
[© Barbara Buge | MNHN]
a) Percer la coquille à l’opposé de l’ouverture
b) Vérifier que le spécimen ne s’est pas rétracté plus haut
c) Pousser le tissu hors de la coquille à l’aide de pinces et d’un morceau de serviette
en papier humidifié l’alcool. Récupérer idéalement tout le tissu mais si c’est impossible
au moins 30mm3
Une nouvelle méthode a récemment été mise au point. Elle consiste à passer de
quelques secondes à quelques minutes le spécimen au micro-onde ce qui permet
l’ouverture ou la sortie de la coquille évitant ainsi l’étape fastidieuse de perçage de la
coquille. Cependant cette technique n’est pas accessible dans certains cas (il est rare
d’avoir un micro-onde sur un bateau).
Conservation et conditionnement des tissus dans de l’alcool
[© Barbara Buge | MNHN]
Conservation des tissus :
Le tissu extrait est placé dans de l’alcool supérieur à 90°C et conservé dans les tubes
vissés à bouchon rouge. Le surplus de tissus est soit placés dans les pots à bouchons
jaunes ou les sachets plastiques avec de l’alcool à 80°C
Les échantillons sont soigneusement identifiés, numérotés et associés à leur photo. Ils
sont ensuite conditionner pour être envoyés aux collections du Muséum national
d’Histoire naturelle.
Doc 2 : De retour au laboratoire, travail sur l’ADN

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Extraction d’ADN
[© Laëtita Préau | MNHN]
Extraction d’ADN :
L’ADN que l’on souhaite extraire se trouve au sein du noyau de la cellule. Afin
d’extraire cet ADN, il va falloir lyser les cellules afin d’en libérer l’ADN.
La cellule possède de nombreuses membranes dont notamment la membrane
plasmique qui entoure la cellule et la membrane nucléaire. Ces membranes protègent
la cellule et isolent les différents compartiments. Ces membranes sont constituées
majoritairement de lipides qu’il faut solubiliser afin de libérer le contenu de la cellule.
De plus dans la cellule, il y a un grand nombre de protéines qu’il faut séparer de
l’ADN afin d’obtenir de l’ADN purifié, indispensable pour pouvoir effectuer les
différentes analyses.
Comment réaliser la libération puis la purification de l’ADN ? Peut-on s’appuyer sur les
propriétés de solubilité (hydrophile ou hydrophobe) des différentes molécules (lipides,
protéines, ADN) puis le mettre en lumière par rapport au protocole d’extraction d’ADN
exposé ci-dessous ?
Amplification de l’ADN
[© Laëtita Préau | MNHN]
Amplification de l’ADN :
Afin de pouvoir utiliser l’ADN préalablement extrait, il est nécessaire de l’amplifier afin
d’en augmenter la quantité disponible. En effet après l’extraction, on obtient une
petite quantité d’ADN génomique qui n’est pas suffisante pour la plupart des analyses.
On ne va pas amplifier tout l’ADN génomique mais seulement le ou les fragments qui
nous intéressent. Pour cela on utilise la PCR (Polymerase Reaction Chain) qui se base
sur le même principe que la réplication de l’ADN.
La PCR est une technique qui imite ce que l’on sait de la réplication et qui implique les
mêmes éléments (ouverture de l’ADN, amorces, polymérases). Pour cela on va répéter
les cycles de température : 92°C -55°C -72°C pour réaliser plusieurs cycles de
synthèse et ainsi copier les molécules d’ADN afin de les obtenir en très grand nombre.
On obtient théoriquement 2n copie d’ADN par cycle avec n correspondant au nombre
de cycle. On fait en moyenne 30-40 cycles. Cependant ce rendement n’est pas
forcément optimal et est surtout limité à un certains nombres de cycles car au bout
d’une vingtaine de cycle la quantité de polymérase devient un facteur limitant puis par
la suite on atteint un plateau quand les nucléotides viennent à manquer.
La PCR peut être utilisée sur tous les êtres vivants de la bactérie à l’Homme en
passant par les végétaux. Cet état de fait montre bien que l’ADN est présent dans
tous les êtres vivants où il a la même structure et que les mécanismes de sa
réplications sont très similaires ce qui montre bien son « universalité » et l’unicité du
vivant.
Doc 3 : Les applications de cette extraction d’ADN
Séquençage et analyse de l’ADN
Après l’amplification du fragment d’ADN d’intérêt, celui-ci peut ensuite être séquencé
(c’est-à-dire décoder l’enchainement de sa séquence en base azotées). Dans le cas du
Museum national d’Histoire naturelle, la plupart des échantillons sont séquencés au
Genoscope à Ivry. Après le séquençage, la séquence est généralement rentrée dans
une base de données.
A partir des séquences amplifiées, différentes analyses sont possibles :
Les séquences peuvent être utilisées en complément d’autres caractères
(morphologique, géographique, écologique….) pour faire de la taxonomie. La
taxonomie est la science qui s’occupe de décrire, d’identifier, de classer en taxon et
de nommer les organismes vivants. Cela permet en fait de savoir à quelle espèce peut
appartenir un nouvel organisme vivant découvert ou si c’est une nouvelle espèce.