Travaux Dirigé N°3 D. Schneider

Travaux dirigés BIO24c
Dominique Schneider
Séance 3 : Biofilms.
La bactérie Gram-positive Listeria monocytogenes est un pathogène opportuniste présent dans
les aliments, capable de provoquer des maladies mortelles chez des sujets à risque. Après
colonisation de différents organes, les cellules bactériennes sont disséminées et provoquent
une septicémie. Pendant le cycle infectieux, L. monocytogenes doit faire face à des
environnements et stress variés dont des carences nutritionnelles, des fluctuations d’un certain
nombre de paramètres physiques (température, pH, stress acide), et le système immunitaire de
l’hôte. La coordination de la résistance à ces stress et de l’expression des gènes est donc
cruciale pour le pathogène. L’un des mécanismes impliqués chez d’autres bactéries est le
Quorum-Sensing (QS). Un tel système a été suggéré chez L. monocytogenes. En effet, un
gène agrD a été identifié après séquençage du génome de la souche de référence de L.
monocytogenes, qui présente des homologies de séquence avec des gènes de synthèse d’auto-
inducteurs de systèmes de QS chez d’autres bactéries. Un mutant de L. monocytogenes, délété
du gène agrD, a été fabriqué et utilisé dans cette étude pour analyser son impact éventuel sur
les propriétés de virulence de la bactérie pathogène, en particulier sur sa capacité à former des
biofilms.
1) Une délétion du gène agrD respectant son cadre de lecture a été construite dans la
souche de référence EGDe de L. monocytogenes (Figure 1). La souche mutante
obtenue a été appelée EGDe∆agrD. En parallèle, le gène agrD a été cloné sur un
plasmide pIMK2. Le plasmide obtenu a été appelé pIMK2agrD et introduit par
transformation dans la souche mutante EGDe∆agrD. Les différentes souches ont été
cultivées en milieu riche BHI et la croissance a été suivie au cours du temps par la
mesure de la densité optique à 600nm (DO600nm, Figure 2).
Figure 1 : Carte de la région chromosomique de L. monocytogenes EGDe portant le
gène agrD.
La séquence nucléotidique de agrD (incluant le chevauchement avec agrB) est donnée, ainsi
que celle de l’allèle délété ∆agrD.

Figure 2 : Courbes de croissance de différentes souches de L. monocytogenes.
Les trois souches de L. monocytogenes EGDe, EGDe∆agrD et EGDe∆agrD::pIMK2agrD ont
été mises en culture dans du milieu riche BHI et la DO600nm a été mesurée au cours du
temps.
a. En quoi une délétion respectant le cadre de lecture de agrD est-elle nécessaire ?
b. Quelle est l’utilité de la souche EGDe∆agrD ::pIMK2agrD ?
c. Commentez les courbes obtenues. Que montrent-elles ? En quoi ces expériences
sont-elles importantes pour la suite ?
2) La capacité des différentes souches à former des biofilms a été analysée. Les souches
ont été cultivées dans des plaques 96-puits et incubées pendant 24 heures à
température ambiante. Après lavage au PBS, les cellules sont incubées en présence de
crystal violet. Puis, de l’éthanol 96% est ajouté et la densité optique à 600nm est
mesurée (Figure 3).
log DO600nm
Temps (heure)

Figure 3 : Mesures de la capacité à former des biofilms.
A. Les trois souches de L. monocytogenes EGDe, EGDe∆agrD et
EGDe∆agrD::pIMK2agrD ont été mises en culture dans des plaques 96-
puits. Après 24 heures de cultures, les cellules ont été lavées au PBS et
colorées au crystal violet.
B. Après ajout d’éthanol, des mesures de DO600nm ont été réalisées à partir
de trois expériences indépendantes. Les valeurs représentent la moyenne
et l’erreur standard.
a. A quoi sert la souche EGDe∆agrD ::pIMK2agrD ?
b. Que montrent ces expériences ?
A.
EGDe
EGDe
∆ agrD
EGDe
∆ agrD
pIMK2
agrD
B.
DO600nm

3) La capacité à former des biofilms a maintenant été étudiée soit en utilisant des
mélanges des souches précédentes, soit en utilisant des surnageants de cultures des
différentes souches. Dans un premier temps, la formation de biofilms a été analysée en
mélangeant les deux souches EGDe et EGDe∆agrD (Figure 4A) et, dans un deuxième
temps, en mélangeant chacune des deux souches avec uniquement le surnageant
provenant d’une culture de chaque souche respective (Figure 4B).
Figure 4 : Mesures de la capacité à former des biofilms.
A. Des expériences similaires à celles décrites dans la Figure 3 ont été réalisées avec
les souches EGDe et EGDe∆agrD. En plus, la capacité à former des biofilms
(représentée par les valeurs de DO600nm) a été analysée en mélangeant les deux
souches à trois proportions différentes.
B. Idem que pour la partie A, mais cette fois des surnageants provenant de cultures de
EGDe (Wt) ou EGDe∆agrD (∆) ont été mélangées à des cultures de chacune des
deux souches avant de réaliser les tests de biofilms.
Que permettent de conclure ces expériences ? Que mettent-elles en évidence ?
4) Des tests d’invasion de cellules de lignées humaines de colon Caco-2 ont été réalisés
avec les trois souches EGDe, EGDe∆agrD et EGDe∆agrD::pIMK2agrD. Les souches
bactériennes et les cellules humaines ont été mélangées (les quantités des différentes
cellules ont été déterminées dans le mélange). Les co-cultures ont alors été incubées
pendant 30 minutes, puis les mélanges ont été lavés et incubés pendant 1 heure avec
du milieu de culture contenant l’antibiotique gentamycine. Les cellules hôtes ont
ensuite été lysées et le lysat dilué puis étalé sur du milieu solide BHI agar pour
dénombrer les cellules bactériennes (Figure 5A). En parallèle, le processus infectieux
a été poursuivi pendant 6 heures au cours desquelles des co-cultures ont été arrêtées
toutes les heures, puis les cellules hôtes ont été lysées, diluées et étalées sur du milieu
solide BHI agar pour dénombrer les cellules bactériennes (Figure 5B).
DO600nm
A.
EGDe
EGDe
∆ agrD
90%
10%
99%
1%
99,9%
0,1%
EGDe
∆ agrD
EGDe
B.
DO600nm
Wt
∆
Wt
∆
Wt
∆
+ SurnWt
+ Surn
∆

Figure 5 : Tests d’invasion de cellules de lignées humaines de colon.
A. Des cellules Caco-2 ont été infectées par chacune des trois souches bactériennes
EGDe (Wt), EGDe∆agrD (∆) et EGDe∆agrD::pIMK2agrD (OE). Le dénombrement des
cellules bactériennes dans chaque puit de culture (CFU per well) a été suivi lors de
tests d’invasion (voir texte).
B. Les mêmes infections ont été poursuivies au cours du temps et la prolifération
intracellulaire a été mesurée relativement au pourcentage de bactéries au temps 0
lors de l’invasion (% intracellular bacteria).
a. Expliquez le principe de ces expériences. Que mesurent-elles ?
b. Que montrent ces expériences ? Quelles sont les étapes de l’infection qui sont
affectées ?
5) L’effet de agrD sur la virulence de L. monocytogenes a ensuite été analysé dans un
modèle in vivo d’infection murine. Des souris BALB/c (10 par groupe) ont été
infectées par les souches EGDe et EGDe∆agrD, qui ont été préalablement modifiées
de façon à les rendre bioluminescentes. En effet, les gènes de l’opéron luxABCDE qui
confèrent la capacité d’émettre des photons ont été insérés dans le chromosome de
chacune des deux souches. Les deux souches obtenues sont appelées EGDelux et
EGDelux∆agrD. Le processus infectieux a été analysé par imagerie en mesurant le
niveau de luminescence trois jours post-infection (Figure 6A et C). De plus, le foie et
la rate des animaux ont été prélevés et également analysés quant à leur niveau de
luminescence (Figure 6 B et D). Des extraits de foie et de rate ont également été
préparés, dilués et étalés sur du milieu solide BHI agar pour dénombrer les cellules
bactériennes (Figure 6E).
Temps (heures)