Mécanisme de perméabilisation membranaire par les ultrasons et

Mécanisme de perméabilisation membranaire par les ultrasons et les microbulles de contraste
T.A. Tran2-3, S. Roger2-3, J.Y. Le Guennec2-3, F. Tranquart3-4 and A. Bouakaz1-3
1. Inserm U619, 37000 Tours, France
2. Inserm E0211, 37000 Tours, France
3. Université F. Rabelais, Tours, France
4. CIT, CHU Bretonneau, ours, France
Résumé
Introduction
L’échographie de contraste est une
technique récente d’imagerie non invasive
qui permet, via l’utilisation d’agents de
contraste, d’améliorer la qualité des images
échographiques. Ces agents de contraste
sont en fait des microsphères de gaz
recouvertes d’une paroi biocompatible
(e.g., phospholipides). De nouvelles études
ont montré que ces microbulles sont
également capables de vectoriser des
principes actifs, médicaments ou gènes,
permettant ainsi un traitement ciblé de
pathologies tel le cancer. De plus, sous
activation ultrasonore, elles augmentent
temporairement et réversiblement la
perméabilité de la membrane cellulaire et
améliorent ainsi l’intégration des principes
actifs dans la cellule (Taniyama et al.
2002 ; Christiansen et al. 2003 ; Dijmans et
al. 2004). Cependant leurs effets sur les
cellules restent encore mal connus. L’étude
de l’action des microbulles sur les cellules
est donc nécessaire pour explorer et
améliorer cette nouvelle voie
thérapeutique. Cette étude porte
principalement sur les modifications de la
viabilité et des activités électriques des
cellules cancéreuses mammaires de la
lignée MDA-MB-231.
Matériels et méthodes
Les cellules cancéreuses mammaires
MDA- MB-231
Les cellules cancéreuses
mammaires étudiées sont issues de la
lignée MDA-MB-231. Cette lignée a été
choisie car elle fait partie des lignées de
référence dans l’étude in vitro des
mécanismes impliqués dans le cancer du
sein (Soule et al. 1973). Les cellules sont
cultivées dans du milieu de culture,
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s
Medium, Cambrex, Belgique) supplémenté
avec 5% de sérum de veau fœtal (SVF).
Les cellules sont maintenues dans une
atmosphère à 5% de CO2, saturée en H2O
et à 37°c.
Les microbulles de contraste
Les microbulles utilisées dans cette
étude sont des microbulles expérimentales
de Sonovue® et ont été généreusement
fournies par Bracco (Genève). Le produit
de contraste (Sonovue®, Bracco Pharma,
Italie). Les solutions aqueuses utilisées
pour la préparation des microbulles sont
pour chaque expérience, les mêmes que
celles où sont placées les cellules. La
solution mère dont la concentration est de
109 microbulles/ml est diluée au 1/250 et
est perfusée au niveau des cellules grâce à
une pompe péristaltique (1ml/min).
Le dispositif ultrasonore
Les ultrasons (US) sont générés
grâce à un transducteur relié à un
amplificateur de puissance (50dB) lui-
même connecté à un générateur de
signaux. Le transducteur de 1MHz est
focalisé à 14mm. Les ondes ultrasonores
CFA 2006
151

ont une durée de 20 cycles et une
amplitude variant de 100 mV à 1 V. Afin
d’éliminer les bruits électriques provenant
du transducteur, ce dernier sera recouvert
de latex. Cependant pour que la
transmission des US soit maximale, du gel
ultrasonore est placé comme milieu de
propagation entre le transducteur et le
latex.
Le dispositif d’électrophysiologie
La pipette de patch, permettant à la
fois d’imposer des potentiels, et de
recueillir les courants ioniques de la cellule
(Neher et Sackmann 1976 ; Hamill et al.
1981), est relié à un convertisseur courant-
voltage, lui-même relié à un amplificateur
(Axopatch 200-B, Axon Instrument, USA).
La liaison entre la pipette et l’amplificateur
se fait grâce à un filament d’argent
chloruré immergé dans un liquide
conducteur. Une seconde électrode
baignant dans le milieu où se trouvent les
cellules, sert d’électrode de référence et
permet de fermer le circuit électrique.
L’enregistrement des courants et le
contrôle des potentiels imposés se font via
un ordinateur. L’existence d’une interface
convertissant les données analogiques en
données numériques (Digidata 1322A,
Axon Instrument, USA) est donc
indispensable pour la communication entre
l’amplificateur et l’ordinateur.
L’expérience est visualisée via un
microscope inversé (Nikon, Eclipse TE
300). Ce microscope permet la mise en
place d’un dispositif vidéo basé sur une
caméra analogique reliée à un ordinateur.
L’ensemble du poste de « patch clamp »
repose sur une table anti-vibrante (Ealing,
USA) et se situe dans une cage de Faraday
afin de permettre une isolation électrique.
Résultats
Les expériences en patch rompu
montrent qu’au contact de la membrane de
la cellule les microbulles, qui oscillent
sous les effets des US, entraînent une
hyperpolarisation de la membrane
cellulaire, alors que les microbulles seules
ou les ultrasons seuls n’engendrent aucun
effet sur le potentiel de la membrane
(figure1A et B). Cette hyperpolarisation est
reproductible tant qu’une microbulle
oscillante reste fixée à la membrane
cellulaire (figure 1C). Il est à noter qu’un
contact physique entre les membranes de la
cellule et de la microbulle est
indispensable et semble jouer un rôle sur
l’amplitude des hyperpolarisations. En
effet, on remarque sur le tracé de la figure
2, que sans microbulle, il n’y pas d’effet
des US. Ces variations du potentiel de
membrane cellulaire (Em) ont une
amplitude de 25 ± 1,4 mV (n=6). Sachant
qu’il s’agit d’une hyperpolarisation et que
les potentiels d’équilibre du chlore et du
potassium sont respectivement de -47 et -
90 mV, la réponse cellulaire aux
microbulles semble être provoqué par une
3
Figure 1 : Mesure des variations du potentiel de
membrane par la technique de patch rompu e
n
configuration « Whole Cell ». Les US sont générés par u
n
transducteur de 1 MHz, à raison de 40 cycles/pulse,
répétés toutes les 100 µs, à une amplitude de 100 mV. (A)
Il n’y pas d’effet significatif des US utilisées seules. (B)
Une hyperpolarisation est observée lorsque les US son
t
appliqués et qu’une microbulle est jouxté à la cellule. (C)
cette hyperpolarisation est reproductible tant que l
a
microbulle reste fixer à la cellule et tant qu’elle es
t
stimulable par les ultrasons.
B
A
-25 mV
-25 mV
Potentiel de membrane
Ultrason
-25 mV
C
CFA 2006
152

entrée d’ions Cl- ou bien par une sortie
d’ions K+.
L’hyperpolarisation pouvant être
consécutive à la contrainte mécanique
engendré par le massage de la microbulle
excitée par les US, nous avons testé cette
hypothèse en appliquant une tige de verre
rodée contre la cellule (figure 2A). Ainsi,
des hyperpolarisations similaires (figure
2B), d’une amplitude de 17 ± 1,9 mV
(n=5), sont observées suite à l’application
d’une pression mécanique sur la membrane.
Discussions et conclusion
De nombreuses études ont permis
de montrer la possibilité d’utiliser les
microbulles échographiques comme
vecteurs lors d’une thérapie cellulaire
ciblée et contrôlée (Nelson et al. 2002 ;
Unger et al. 2002 ; Rosenthal et al. 2004 ;
Unger et al. 2004). Cependant aucune
étude n’a pu mettre en évidence les
mécanismes de perméabilisation
membranaire et les effets de microbulles
sur la cellule.
Cette étude a permis de mettre au
point un système expérimental pour
observer en temps réel les modifications
électrophysiologiques induites par les
microbulles sous l’action des US sur les
cellules cancéreuses mammaires de la
lignée MDA-MB-231. Ces modifications
électrophysiologiques se manifestent par
une hyperpolarisation cellulaire
synchronisée avec la stimulation
ultrasonore et est dépendante de l’adhésion
de la microbulle sur la membrane cellulaire.
Des hyperpolarisations sont observées lors
d’un stress mécanique.
Cependant il reste à caractériser
pharmacologiquement les canaux ioniques
impliqués dans ces hyperpolarisations.
Ceci permettra de démontrer l’intervention
de ces mêmes canaux au cours des
hyperpolarisations consécutives à l’action
conjointe des microbulles et des US et du
stress mécanique.
L’hyperpolarisation ne semble pas
l’unique conséquence de l’oscillation des
microbulles contre la membrane plasmique
mais au contraire, semble masquer d’autres
effets tout aussi importants. Il important de
noter que ces hyperpolarisations peuvent
être un phénomène indirect lié à la
stimulation des microbulles oscillantes.
Ainsi, la mise en évidence de la
modification des propriétés
électrophysiologiques, donc la
modification des échanges à travers la
membrane plasmique de la cellule, induite
par les US et les microbulles pourrait être
une explication à l’augmentation de la
perméabilité membranaire classiquement
observée car la plupart des expériences
sont basées sur la mesure de la variation de
la résistance membranaire. Cependant,
cette hypothèse ne suffit pas à expliquer
l’augmentation de la capacité cellulaire à
incorporer les éléments vectorisés par les
microbulles. Il est donc nécessaire de bien
connaître les perturbations mécaniques
induites par les microbulles dans
différentes conditions expérimentales afin
de mettre en évidence les mécanismes
sous-jacents.
Références
Figure 2 : Application d’une pipette de verre rodée
pour induire une contrainte mécanique sur la cellule.
Des hyperpolarisations sont également déclenchées
Potentiel de membrane
Pression mécani
q
ue
A
B
Cellule
Baguette de verre
Pipette de
p
atch
10 µm
CFA 2006
153

Christiansen J., French B., Klibanov A.,
Kaul S. and Lindner J. 2003, Targeted
tissue transfection with ultrasound
destruction of plasmid-bearing cationic
microbubbles - Ultrasound Med Biol.
29(12): 1759-1767.
Dijmans P., Juffermans L., Musters R.,
Van Wamel A., Ten Cate F., Van Gilst W.,
Visser C. and Kamp O. 2004,
Microbubbles and ultrasound: from
diagnosis to therapy - Eur J Echo-cardio. 5:
245-256.
Hamill O., Marty A., Neher E., Sakmann B.
and Sigworth F. 1981, Improved patch-
clamp techniques for high-resolution
current recording from cells and cell-free
membrane patches - Pflug Arch Eur J Phys.
391(2): 85-100.
Neher E. and Sakmann B. 1976, Single
channel currents recorded from membrane
of denervated frog muscle fiber - Nature.
260: 799-802.
Nelson J., Roeder B., Carmen J., Roloff
F. and Pitt W. 2002, Ultrasonically
activated chemotherapeutic drug delivery
in a rat model - Cancer Res. 62(24): 72-80.
Rosenthal I., Sostaric J.Z. and Riesz P.
2004, Sonodynamic therapy - a eview of
the synergistic effects of drugs and
ultrasound - Ultrason Sonochem. 11(6):
349-343.
Soule H., Vasquez J, Long A, Albert S
and Brennan M. 1973, A human cell line
from a pleural effusion derived from a
breast carcinoma - J Natl Cancer I. 51:
1409-1416.
Taniyama Y., Tachibana K., Hiraoka K.,
Namba T., Yamasaki K., Hashiya N., Aoki
M., Ogihara T., Yasufumi K. and
Morishita R. 2002, Local delivery of
plasmid DNA into Rat carotid artery using
ultrasound - Circulation. 105(10): 1233-
1239.
Unger E., Matsunaga T., McCreery T.,
Schumann P., Sweitzer R. and Quigley R.
2002, Therapeutic applications of
microbubbles - Eur J Radiol. 42: 160-168.
Unger E., Porter T., Culp W.,
Labella R., Matsunaga T. and Zutshi R.
2004, Therapeutic applications of lipid-
coated microbubbles - Adv Drug Deliver
Rev. 56: 1291-1314.
CFA 2006
154