PCR Toxoplasma et Pneumocystis : infection ou colonisation

PCR Toxoplasma et
Pneumocystis :
infection ou colonisation ?
Jean Menotti
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie
Hôpital Saint-Louis / Université Paris-Diderot
[email protected]
Diagnostic de la toxoplasmose chez le
patient immunodéprimé
•  Attitude pragmatique :
–  imagerie +++
–  sérologie positive
–  épreuve thérapeutique
IRM cérébrale
•  Mise en évidence directe du
parasite difficile :
–  examen direct peu sensible
–  inoculation à l’animal ou
culture cellulaire : délai trop long
⇒ diagnostic par PCR +++
Toxoplasmes dans un LBA
Diagnosis of toxoplasmosis by PCR
  PCR
assays on B1 gene, P30 gene,
rRNA gene…
Burg et al., 1989; Franzen et al., 1997;
Lamoril et al., 1996; Robert-Gangneux et
 conventional PCR al., 1999; MacPherson et al., 1993;
Ostergaard et al., 1993
 real-time
PCR
Costa et al., 2000; Lin et al., 2000;
Kupferschmidt et al., 2001 ; Joss et al., 2008
  PCR
assays on a genomic 300-fold
repetitive 529 bp DNA fragment
Homan et al., 2000; Reischl et al., 2003;
Cassaing et al., 2006 ; Fekkar et al., 2008
Development and evaluation of a
5’-nuclease real-time PCR assay
for quantitative detection of
Toxoplasma gondii DNA
Aim:
 
To develop a new 5’-nuclease real-time PCR assay
that targets the 200- to 300-fold repetitive AF146527
gene
 
To assess its performances for diagnosis and
treatment follow-up of toxoplasmosis
Real-time PCR for the quantitation
of Toxoplasma gondii DNA:
primers and probe design
T. gondii AF146527 gene (529 bp)
398
483
TG-R
primer
TG-F
primer
TaqMan probe
(432-457)
Standard curve
Retrospective analysis
 
Clinical specimens: 144 clinical specimens
previously analyzed for the presence of T. gondii
DNA by a PCR-ELISA assay that targets the B1 gene
of T. gondii (Robert-Gangneux et al., 1999)
 
DNA extraction from blood, blood buffy coats, sera,
cerebrospinal fluid, BAL fluid, aqueous humor,
biopsies or placenta by using QIAamp DNA Mini Kit
(Qiagen)
Retrospective analysis: results
PCR-ELISA on B1 gene
Real-time PCR on
AF146527 gene
positive
negative
positive
72
15
87
negative
0
57
57
72
72
144
Observation
 
 
 
 
 
 
 
Patient de 43 ans présentant une leucémie myéloïde
chronique (sérologie T. gondii positive)
greffe de moelle allogénique (sang de cordon
séronégatif pour T. gondii)
à J40, 41 et 42 : fièvre, céphalées, photophobie
TDM cérébrale : plusieurs lésions hypodenses mais
sans halo périlésionnel
Traitement par sulfadiazine (6 g/j) + pyriméthamine (75
mg/j)
Apyrexie 48 h après initiation du traitement
Amélioration progressive des images radiologiques sous
traitement
Menotti et al., JCM 2003
Quantitation of T. gondii DNA by real-time
PCR assay targeting AF146527 gene
Whole blood
Initiation of treatment by pyrimethamine + sulfadiazine
No. of tachyzoites/ml
10000
1000
100
10
1
0.1
0
25
50
75
Days
100
125
Comparison between real-time PCR
assays using 2 different targets
Whole blood
45
B1 gene
AF146527
40
35
Ct
Mean gain of
7.7 cycles
30
25
20
0
25
50
75
Days
100
125
Prospective analysis
 
203 clinical specimens: all clinical specimens
received at Saint-Louis Hospital during a 4-month
period.
 
Each specimen was tested both by:
the new real-time PCR assay
  the PCR-ELISA assay that targets the B1 gene of T. gondii
(Robert-Gangneux et al., 1999)
 
Prospective analysis: results
Patient
Clinical background
Specimen
Date
PCR-ELISA
Real-time PCR
(No. of tachyzoites/ml)
P1
HIV infection
CSF
Oct. 11th
+
3600
P2
HIV infection
CSF
Oct. 15th
+
71
P3
HIV infection
CSF
Nov. 22nd
+
67
P4
HIV infection
Whole blood
Dec. 4th
+
7.9
Whole blood
Dec. 6th
+
180
BAL fluid
Dec. 11th
+
6200
Whole blood
Dec. 13th
+
3900
Buffy coat
Dec. 13th
+
360
Bone marrow
Dec. 13th
+
16000
P5
HIV infection
Serum
Dec. 21st
-
3.3
P6
Toxoplasmic
seroconversion
during pregnancy
Placenta
Dec. 23rd
-
140
P7-P61
Various
Various
Various
-
Undetectable
Menotti et al., CMI 2010
Conclusions
 
Très bonnes sensibilité et spécificité de la technique de
PCR en temps réel amplifiant le gène AF146527
 
Confirmation de l’intérêt d’utiliser ce gène hautement
répété pour améliorer le diagnostic de la toxoplasmose
 
Intérêt majeur de la PCR en temps réel pour le suivi
thérapeutique
 
Diagnostic plus précoce, parfois avant l’apparition des
signes cliniques
Classification des toxoplasmoses
survenant après allogreffe de moelle
Martino et al. for the European Group for Blood and Marrow
Transplantation Infectious Diseases Working Party
Martino et al, CID 2005
 
Etude prospective de 106 patients allogreffés de moelle
osseuse pour l’incidence de la réactivation toxoplasmique
dans les 6 premiers mois après la greffe :
Incidence de la toxoplasmose-infection : 16% (IC95 : 8-21%)
  Incidence de la toxoplasmose-maladie : 6% (IC95 : 1-10%)
  Chez la plupart des patients, le début de la maladie ou du
traitement de l’infection était précédé par une augmentation
des charges parasitaires sanguines
 
 
Conclusions :
Incidence élevée de la toxoplasmose après HSCT allogénique
  PCR = outil approprié pour décider d’un traitement préemptif
chez des patients à haut risque de toxoplasmose
 
Genre Pneumocystis
 
Micromycètes atypiques (classe des Ascomycètes)
 
Etroite spécificité d’hôte :
 
 
 
 
P. jirovecii : homme
P. carinii et P. wakefieldiae : rat
P. murina : souris
P. oryctolagi : lapin
 
Liaison spécifique aux pneumocytes de type I
 
Prolifération dans les alvéoles pulmonaires
→ pneumonie à Pneumocystis (PCP) chez les sujets
immunodéprimés
Pneumonie à Pneumocystis (PCP)
Triade classique d’apparition progressive de :
- fièvre
- toux sèche
- dyspnée d’intensité croissante
VIH +
VIH -
Début
insidieux
brutal
Fièvre
+
+
Toux sèche
+
+
Dyspnée
+/-
+
Evolution
lente
rapide
Mortalité
10 à 20 %
30 à 60 %
Imagerie : pneumopathie interstitielle
(absence dans 10-15% des cas)
Scanner : verre dépoli irrégulier
Hypoxie ++
Thomas et Limper, 2004
Populations à risque :
-
Infection VIH
Hémopathies malignes
Greffe de moelle osseuse
Transplantation d’organes solides
- Cancers solides
- Maladies inflammatoires et auto- immunes
- Traitements immunosuppresseurs
- Nourrissons prématurés ou atteints de déficits
immunitaires
Diagnostic microscopique
Prélèvements: LBA, expectoration induite, biopsie
 
Examen à frais
  Amas spumeux
 
Colorations
  Formes trophiques (MGG, RAL)
  Kystes (Gomori Grocott, Bleu toluidine)
A
 
B
Immunofluorescence
  Directe
  Indirecte
C
 
Source des photos CD-ROM ANOFEL 3
22
Diagnostic moléculaire
PCR classique
Nested PCR
Wakefield et al., 1990
ARNr
Wakefield et al., 1996
ARNr
Risque de
contaminations +
++
PCR en temps réel
21 références depuis 2001
ARNr, MSG, DHPS, DHFR, HSP70
- plus rapide
- moins de manipulation
Très bonne VPN
de la PCR
Pneumocystis
(Azoulay et al.,
2009)
Question:
interprétation
d’une PCR
positive ?
- Infection ?
- quantification (PCP / colonisation)
Larsen et al., 2002
Flori et al., 2004
Bandt et al, 2007
Huggett et al., 2008
Alanio et al., 2011
- Pneumocystose ?
- Portage ?
Diagnostic moléculaire
PCR quantitative sur LBA et expectorations induites
•  Charge supérieure
chez patients VIH+
par rapport à VIH•  Discrimination
possible entre
portage et PCP, en
utilisant 2 valeurs
de cut-off
Alanio et al., CMI 2011
Diagnostic moléculaire
PCR quantitative sur LBA et expectorations induites
•  Charge supérieure
chez patients VIH+
par rapport à VIH•  Discrimination
possible entre
portage et PCP, en
utilisant 2 valeurs
de cut-off
Alanio et al., CMI 2011
Eur Respir J 2012
Conclusions
 
Test sensible pour la détection d’ADN de P. jirovecii
 
Nouvel outil pour discriminer PCP et colonisation :
  Charge
fongique élevée ⇒ PCP
  Charge fongique intermédiaire ⇒ PCP ou colonisation
  Charge fongique faible ⇒ colonisation (sous réserve de la
qualité du prélèvement)
Concept de colonisation
 
Détection de Pneumocystis ou de son ADN chez
un hôte qui ne présente pas de signe de
pneumonie
 
Mise en évidence grâce au développement des
méthodes moléculaires de détection (PCR, PCR
en temps réel)
Populations colonisées
Population
Colonisation
Facteurs de risque
Références
Enfants
immunocompétents
(primo-infection)
16 à 32%
Patients infectés par le
VIH
10 à 68% (nPCR)
CD4 < 400 (p=0,03)
Tabagisme (p=0,02)
Résidence (p=0,002)
Leigh 1993 ; Nevez 2001 ;
Matos 2001 ; Wakefield 2003 ;
Morris 2004 ; Davis 2008 ;
Alanio 2011
Immunodépression hors
VIH
11 à 60%
Transplantation
CD4 < 400 (p<0,001)
Corticoïdes (p<0,001)
Grossesse (p=0,04)
Nevez 1999 ; Helweg-Larsen
2002 ; Maskell 2003 ; Vargas
2003 ; Mori 2009 ; Alanio 2011
Pathologie pulmonaire
sous-jacente
Mucoviscidose : 1,3-22%
BPCO : 16-55%
Personnels hospitaliers
8 à 37%
Vargas 2001 ; Nevez 2001 ;
Totet 2003 ; Larsen 2007
Sévérité BPCO
Cancer petites cellules
Tabagisme (p=0,02)
Sing 1999 ; Probst 2000 ; Sing
2001 ; Helweg-Larsen 2002 ;
Matos 2003 ; Calderon 2004 ;
Morris 2004 ; de la Horra
2004 ; Respaldiza 2005 ;
Nevez 2006 ; Vidal 2006 ;
Calderon 2007 ; Le Gal 2010
Contact avec patients ayant
une PCP
Vargas 2000 ; Miller 2001 ;
Durand-Joly 2003 ; Medrano
2005
Colonisation : conséquences
 
Conséquences cliniques et physiopathologiques
  Risque évolutif d’une colonisation en PCP: mal évalué
  Simple marqueur du processus pathogène sous-jacent ?
  Pathogénicité de la colonisation ?
Persistent pneumocystis colonization leads to the development of chronic
obstructive pulmonary disease in a nonhuman primate model of AIDS.
Shipley TW, Kling HM, Morris A, Patil S, Kristoff J, Guyach SE, Murphy
JE, Shao X, Sciurba FC, Rogers RM, Richards T, Thompson P, Montelaro
RC, Coxson HO, Hogg JC, Norris KA. J Infect Dis. 2010 Jul 15;202(2):
302-12
Airway obstruction is increased in pneumocystis-colonized human
immunodeficiency virus-infected outpatients. Morris A, Alexander T,
Radhi S, Lucht L, Sciurba FC, Kolls JK, Srivastava R, Steele C, Norris KA. J
Clin Microbiol. 2009 Nov;47(11):3773-6.
Colonisation : conséquences
 
 
 
Conséquences cliniques et physiopathologiques
  Risque évolutif d’une colonisation en PCP: mal évalué
  Simple marqueur du processus pathogène sous-jacent ?
  Pathogénicité de la colonisation ?
Prise en charge des patients colonisés
  Faut-il traiter ?
  Bénéfice collectif: diminution du réservoir
  Bénéfice individuel: ?
Conséquences environnementales et épidémiologiques
–  Colonisés = réservoir de Pneumocystis ?
–  Isolement des patients colonisés vis-à-vis des patients
immunodéprimés ?
–  Évaluation du risque d’aérotransmission
Connaissance des conditions de transmission/infection
Voies de transmission