[tel-00820984, v1] Caractérisation biochimique

UNIVERSITE PARIS-SUD
ÉCOLE DOCTORALE DE CANCEROLOGIE
Champs disciplinaires :
Cancérologie, Immunologie, Biologie cellulaire, Biochimie
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
THÈSE DE DOCTORAT
soutenue le 05/02/2013
par
Clément BARJON
CARACTERISATION BIOCHIMIQUE ET FONCTIONNELLE
DE NOUVEAUX ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-GALECTINE-9
EN VUE D’APPLICATIONS DIAGNOSTIQUES ET THERAPEUTIQUES
Directeur de thèse :
Dr Pierre BUSSON
Co-directeur de thèse :
Dr Ming WEI
Composition du jury :
Président du jury :
Pr Christian AUCLAIR
Rapporteurs :
Dr Frédéric DUCANCEL
Dr Michel VIDAL
Examinateur :
Dr Stéphane DEPIL
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
REMERCIEMENTS
Tout d’abord, je remercie les membres du jury qui ont accepté de donner de leur temps pour
évaluer ce travail. Un grand merci au Professeur Christian Auclair, président du jury. Je remercie les
Docteurs Frédéric Ducancel et Michel Vidal pour leurs rapports très complets et très intéressants.
Enfin je remercie le Docteur Stéphane Depil pour sa présence en tant qu’examinateur au sein de ce
jury.
Un grand merci aux Docteurs Joëlle Wiels et Marc Lipinski qui m’ont accueilli au sein de
l’UMR 8126. Je suis très reconnaissant pour votre regard critique et vos remarques toujours
constructives au cours des séminaires d’unité qui ont beaucoup fait avancer mon travail. Je remercie
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
aussi Joëlle pour les nombreux gâteaux et autres confiseries distribuées au retour des vacances, il est
vrai que nous partageons la même passion pour le chocolat !
Je remercie chaleureusement mes directeurs de thèse, les Docteurs Pierre Busson et Ming Wei.
Merci Pierre pour ton immense savoir bibliographique, pour tes conseils et ton aide, et pour la grande
liberté que tu m’as laissé durant ma thèse. Tu m’as laissé suivre mes intuitions, les bonnes comme (de
manière extrêmement rare !) les mauvaises, et je t’en suis très reconnaissant. J’ai énormément appris.
Merci Ming pour ta confiance lorsque tu m’as confié des projets de clients de Cellvax. La réalisation de
ces projets m’a permis d’apprendre beaucoup sur le monde de l’entreprise.
Je n’oublie pas mon premier maître de stage, le Docteur Philippe Delepelaire. A la suite d’un
entretien... moyennement convaincant, vous avez accepté ma candidature et encadré mon stage en
faisant preuve d’une grande patience, parfois mise à rude épreuve (bec Bunsen et bécher d’alcool ne
font pas bon ménage). Vous m’avez transmis votre goût pour la recherche et je vous en remercie !
Merci à l’ensemble des collaborateurs avec qui j’ai eu l’occasion de travailler au cours de ces
années. Merci donc à PX’Therapeutics et en particulier Stéphanie Blanchin pour sa disponibilité et ses
conseils. Merci à Paule Opolon et Olivia Bawa pour l’immunohistologie et les commentaires toujours
pertinents. Merci à Nadira Delhem, Olivier Moralès et Dhafer Mrizak pour toute l’énergie apportée
sur les expériences réalisées avec nos anticorps, et pour les très intéressantes discussions scientifiques.
Merci à Gérard Pierron et Sylvie Souquère pour la microscopie électronique, les interprétations et les
conseils et aussi leur grande disponibilité. Merci Olivier Dellis pour les expériences sur les flux
2
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
calciques, pour sa motivation, sa disponibilité et sa bonne humeur. Enfin, un grand merci à Toshiro
Niki pour tous les réactifs galectine-9, les conseils, les expériences réalisées. Et vive le Japon !
Un énorme merci à mon équipe, aux personnes toujours présentes et à ceux qui l’ont quittée
pour voguer vers d’autres horizons. Merci Anne-Sophie Pailhès-Jimenez, présente depuis (presque) le
début, j’ai beaucoup appris de toi et avec toi. Tu as toujours été disponible quand j’avais besoin de ton
aide, et malgré nos caractères respectifs et quelques périodes un peu délicates ;), on s’entend toujours
aussi bien cinq ans après ton arrivée. Probablement en partie grâce à notre passion commune pour
l’humour un peu nul. Je te souhaite plein de bonnes choses mais je ne me fais pas trop de soucis pour
toi. Merci à Mélanie Gressette, pleine de vie, d’humour, d’histoires à raconter, et toujours très classe ;
je te souhaite également plein de bonnes choses, sans me faire trop de soucis non plus. Merci à
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Benjamin Verillaud pour ses anecdotes médicales et sa capacité poussée à rebondir sur les blagues des
autres, merci à Aurore Gelin pour sa gentillesse et ses chocolats, merci à François-Régis Ferrand pour
son humour déplacé mais drôle, merci à Catherine Durieu pour son aide lors de mes débuts au labo.
Enfin, je souhaite bon courage et bonne chance à Claire Lhuillier pour la poursuite des recherches sur
la galectine-9 !
Un second énorme merci à l’équipe de Joëlle Wiels, mes colocataires de labo et par extension,
mon équipe « d’adoption ». Merci Anaïs Pujals pour ton amitié, ton soutien, ta bonne humeur, pour
les pauses thé où on refait le monde. Merci pour les paris débiles qui m’ont permis de découvrir que la
gym ce n’est pas trop mon truc, et Twilight non plus. Bien que tu sois plutôt nulle à la plupart des jeux
vidéos, je m’incline devant ton inexplicable toute-puissance à Mario Kart. Et crois-moi, en tant que
geek, ce n’est pas facile à écrire. Je remercie Aude Robert, pour les discussion autour de séries, films et
autres sujets geeks, et aussi pour ses conseils sur le plan scientifique. Merci à Sonia Chelouah et à la
nouvelle génération de thésardes : Loëtitia Favre, toujours de bonne humeur et agréable à vivre et
Justine Debernardi, imitatrice professionnelle, presque toujours de bonne humeur et tout aussi
agréable à vivre. Je vous souhaite un futur radieux dans la recherche en cancérologie. Merci à Sandy
Balkaran et Thomas Désille pour les bons moments passés ensemble lors de leurs stages respectifs
dans le laboratoire.
Je remercie également toute l’unité UMR 8126, Chloé Robin, Alexandra Joubert, Licia Silveri,
Andrei Pichugin, Charles-Henry Gattolliat, Romain Algret, Muriel Fuchs et tous les autres membres.
Merci aux ex-UMR 8126 : les docteurs de la première heure Emilie Hollville, Xénia Mergui, Luc
Friboulet, Jeanne Allinne, les jeunes mariés Claire Gourzones et Pietr Dimitriev,
3
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
et enfin Laëtitia Thomas pour les longues discussions ponctuées de débats très importants comme par
exemple « que signifie la fin de Shutter Island ».
Merci à tous mes amis du Master 2 de cancérologie et assimilés, en particulier Aurélie Dupuy,
Thibault Carré et Loubna Chadli, pour les cours passés ensemble dans la bonne humeur, Saint-Malo,
les Roscoffs et autres soirées. Mention spéciale à Aurélie, nous savons tous les deux que les doctorants
CIFRE sont les meilleurs !! Merci à Muriel Nicoletti pour sa patience et sa gestion sans faille ! Merci à
tous mes amis d’enfance, de l’IUT et de la fac, avec, par ordre d’apparition : Vincent « Laloose »
Lamiraux,Anthony « BonBrad » Van Praet, Gary « TDS » Paulini, Cédric « Drixé » Venegas, Anne
Dietlin, Cyril « Frodon » Chambellan, Céline « Chun-li » Trang, Pascal Lagès, Ghislain Accault,
Romain « Roro » Ducroiset, Mattéo Gagliardi, Hugues « Guehu » Remond, Lieng « Laurent » Taing,
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Romain « surnom politiquement incorrect » Chenu, Thomas « surnom politiquement incorrect #2»
Burguière, Soun Banh, Guillaume Arras, Elodie Marquand, Pierre-Arnaud « PA » Comte, Anaïs «Jsuis
troooooooooooop conteeennnnte !!!!!! » Bardet, Nadjia Drici et Sarah Bonnin, la globe-trotteuse. La vie
sans vous, ça serait nul. C’est dit !
Pour terminer, je remercie toute ma famille, cousins, cousines, oncles, tantes, grands-parents,
mon parrain et ma marraine. Dédicasse à Etienne, peut-être futur chercheur ! Merci à mes parents,
soutiens sans faille depuis toujours, quoi que je dise, quoi que je fasse, dans les moments agréables et
ceux plus difficiles. Merci à mon cousin/filleul et quasi-petit frère Antonin, à Philippe son père, et à
Nathalie qui nous manque beaucoup. Et bien sur, merci infiniment, pour tout, à ma sœur
Anne-Sophie, Karine ma belle-sœur et Clovis, votre petit bébé qui est également mon filleul et qui
apporte beaucoup, beaucoup de joie à notre famille.
4
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
SOMMAIRE
REMERCIEMENTS.................................................................................................................. 2
SOMMAIRE.............................................................................................................................. 5
LISTE DES FIGURES ET TABLES........................................................................................... 8
LISTE DES ABREVIATIONS.................................................................................................. 9
RESUME.................................................................................................................................. 11
INTRODUCTION................................................................................................................... 12
I.Cancer et échappement immunitaire....................................................................... 13
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
1) Cancer et réponse immunitaire anti-tumorale........................................... 13
a) Immunosurveillance........................................................................ 13
b) Immunoédition des cancers............................................................ 15
2) Echappement immunitaire.......................................................................... 16
a) Altération de la machinerie de présentation des antigènes........... 16
b) Résistance à la cytotoxicité.............................................................. 17
c) Induction de l’état d’épuisement des lymphocytes T.................... 18
d) Immunosuppression médiée par les lymphocytes T régulateurs 18
e) Immunosuppression médiée par les cellules myéloïdes
suppressives......................................................................................... 19
f) Facteurs immunosuppressifs produits par les cellules tumorales 20
3) Exosomes tumoraux immunosuppresseurs................................................ 20
a) Structure et composition des exosomes.......................................... 20
b) Aperçu des fonctions biologiques des exosomes.......................... 21
c) Exosomes tumoraux et immunosuppression.................................. 23
II. La galectine-9, protéine immunomodulatrice....................................................... 24
1) Famille des galectines.................................................................................. 24
a) Structure et propriétés générales des galectines............................ 24
b) Distribution tissulaire et localisation sub-cellulaire des
galectines.............................................................................................. 26
5
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
c) Galectines, système immunitaire et cancer.................................... 27
2) Découverte, structure et distribution de la galectine-9.............................. 29
a) Découverte de la galectine-9........................................................... 29
b) Structure du gène LGALS9 et de la protéine galectine-9.............. 29
c) Distribution tissulaire et subcellulaire de la galectine-9............... 31
d) Exosomes et galectine-9................................................................... 32
3) Récepteurs de la galectine-9 et signalisation............................................. 32
a) Récepteur TIM-3.............................................................................. 32
b) Récepteurs alternatifs de la galectine-9.......................................... 34
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
c) Voies de signalisation induites par la galectine-9.......................... 34
4) Galectine-9 et système immunitaire........................................................... 36
a) Galectine-9 et immunosuppression................................................ 36
b) Galectine-9 et inflammation........................................................... 36
c) Galectine-9 et auto-immunité.......................................................... 37
5). Rôle de la galectine-9 dans les infections virales et les cancers associés
aux virus........................................................................................................... 38
a) Virus de l’immunodéficience humaine.......................................... 38
b) Virus Herpès Simplex de type 1..................................................... 39
c) Hepatites virales et hépatocarcinomes............................................ 40
d) Virus d’Epstein-Barr et carcinome nasopharyngé......................... 41
III. Anticorps monoclonaux immunomodulateurs.................................................... 42
1) Historique.................................................................................................... 42
2) Aspects techniques de la production d’hybridome................................... 43
3) Structure et ingénierie des anticorps.......................................................... 43
4) Anticorps monoclonaux et cancer............................................................... 45
5) Anticorps monoclonaux immunomodulateurs.......................................... 47
6
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
OBJECTIFS DE LA THESE..................................................................................................... 48
ARTICLE I (BMC Infectious Agents and Cancer)
« A novel monoclonal antibody for detection of galectin-9 in tissue sections :
application to human tissues infected by oncogenic viruses »............................................ 49
Résumé......................................................................................................................... 50
Article........................................................................................................................... 51
ARTICLE II (En préparation)
« Monoclonal antibodies neutralizing human galectin-9 :
comparative assessment using various biological assays ».................................................. 62
Résumé......................................................................................................................... 63
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Article........................................................................................................................... 64
DISCUSSION.......................................................................................................................... 87
1) Production et caractérisation des anticorps 1G3 et 2E12....................................... 87
2) Expression de la galectine-9 dans les tissus humains infectés par des virus
oncogènes..................................................................................................................... 88
3) Neutralisation de l’apoptose induite par la galectine-9 sur lignées T humaines 90
4) Effets des exosomes porteurs de galectine-9.......................................................... 92
5) Nouveaux tests in vitro de neutralisation des effets de la galectine-9................. 94
6) Modèles in vivo de neutralisation des effets de la galectine-9............................. 95
BIBLIOGRAPHIE.................................................................................................................... 97
7
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : « Hallmarks of cancer »
Figure 2 : Immunoédition
Figure 3 : Biogenèse des exosomes
Figure 4 : Composition chimique des exosomes
Figure 5 : Famille des galectines
Figure 6 : Structure tridimensionnelle de la galectine-1
Figure 7 : Alignement structurel des galectines
Figure 8 : Spécificités de ligation de la galectine-9
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 9 : Structures tridimensionnelles des domaines CRD de la galectine-9
Figure 10 : Famille des protéines TIM
Figure 11 : Structure tridimensionnelle du domaine IgV de la protéine TIM-3 murine
Figure 12 : Modèles d’interaction entre TIM-3 et la galectine-9
Figure 13 : Principe de production des hybridomes
Figure 14 : Structure des anticorps
Figure 15 : Amélioration de l’efficacité des anticorps par ingénierie
Table 1 : Spécificités de ligation des galectines
Table 2 : Nomenclature des anticorps monoclonaux
Table 3 : Anticorps monoclonaux actuellement approuvés en oncologie
8
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
LISTE DES ABREVIATIONS
2-APB : 2-Aminoethoxydiphenyl borate
ADCC : Antibody-dependant cell-mediated cytotoxicity
ADN : Acide désoxyribonucléique
AMP : Adénoside monophosphate
ARN : Acide ribonucléique
ATP : Adénoside triphosphate
BCR-ABL : Breakpoint cluster region-Abelson
CDC : Complement-dependent cytotoxicity
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
CTL : Cytotoxic T lymphocyte
CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité
CDR : Complementary determining regions
CRD : Carbohydrates recognition domain
DAMP : Danger-associated molecular pattern
EBV : Epstein-Barr Virus
EGFR : Epidermal growth factor receptor
EpCam : Epithelial cell adhesion molecule
ERK : Extracellular signal-regulated kinase
FDA : Food and drug administration
FoxP3 : Forkhead box P3
GM-CSF : Granulocyte macrophage colony stimulating factor
HAT : Hypoxanthine aminopterine thymidine
HDAC3 : Histone déacétylase 3
HER : Human epidermal growth factor receptor
HGPRT : Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase
HMGB1 : High mobility group box 1
HSP : Heat shock protein
HSV-1 : Herpes simplex virus de type 1
IDO : Indoleamine-pyrrole 2,3 dioxygénase
IFN-γ : Interféron-γ
9
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
IL-10 : Interleukine-10
INOS : Inducible nitric oxyde synthase
IP3 : Inositol triphosphate
NPC : Nasopharyngeal carcinoma
MCA : Méthylcholanthrène
MDSC : Myeloid-derived suppressor cell
MIC : Human MHC class I chain related
NK : Natural killer
NKG2D : Natural killer group 2, member D
PDI : Protein disulfide-isomerase
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
RAG-2 : Recombination activating gene-2
ScFv : Single chain fragment variable
SCID : Severe combined immunodeficiency
SH2 : Src homology 2
TAA : Tumor-associated antigen
TGF-β : Transforming growth factor-β
TIM-3 : T cell immunoglobulin mucin-3
TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand
Treg : Lymphocyte T régulateur
TSG-101 : Tumor susceptibility gene 101
ULBP : UL-16 binding protein
VEGF : Vascular endothelial growth factor
VHB : Virus de l’hépatite B
VHC : Virus de l’hépatite C
VIH : Virus de l’immunodéficience humaine
10
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
RESUME
La galectine-9 est une lectine animale principalement exprimée dans un contexte
inflammatoire et possèdant des propriétés à la fois inflammatoires et immunosuppressives. Elle induit
la production de cytokines inflammatoires par les cellules du système immunitaire inné tandis qu’elle
induit l’apoptose des lymphocytes Th1 CD4+ et favorise l’expansion des lymphocytes Treg. Les
propriétés immunomodulatrices de la galectine-9 dépendent en grande partie de son interaction avec
le récepteur TIM-3. Cependant, ces deux molécules interagissent chacune avec d’autres protéines et
dans plusieurs contextes la responsabilité de l’interaction galectine-9/TIM-3 n’a pas été formellement
démontrée. Le développement d’un anticorps neutralisant les effets de la galectine-9 permettrait de
préciser son rôle exact dans ces contextes. Par ailleurs, le blocage des voies de signalisations
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
inhibitrices du système immunitaire est aujourd’hui un enjeu majeur en oncologie, comme le
démontre le succès récent de la neutralisation du récepteur inhibiteur CTLA-4 pour le traitement des
mélanomes.
Nous avons produits de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés contre la galectine-9 par
immunisation de souris avec la partie C-terminale de la protéine. Parmi ces anticorps, 1G3 permet la
détection de la galectine-9 sur coupes de tissus humains d’une manière très sensible et spécifique en
immunohistochimie. Son utilisation nous a permis de confirmer l’expression constante et intense de la
galectine-9 dans les cellules malignes de carcinome nasopharyngé et la forte expression de la
galectine-9 dans les cellules de Kupffer présentes dans les tissus hépatiques infectés par le virus de
l’hépatite C. Pour la première fois, nous avons mis en évidence une expression de la galectine-9 dans
les leukocytes infiltrant les tissus hépatiques infectés par le virus de l’hépatite B. De plus, nous
observons une expression de la galectine-9 dans les hépatocytes infectés par ces deux virus, ce qui
n’avait pas été démontré jusqu’à présent.
Nous avons également caractérisé les capacités fonctionelles de nos anticorps lors de tests in
vitro. L’anticorps 2E12 bloque la fixation de la galectine-9 au récepteur TIM-3 dans un test acellulaire,
neutralise l’apoptose induite par la galectine-9 sur cellules de lymphomes T humaines et réduit
considérablement l’augmentation de calcium cytosolique induite par la galectine-9 dans les cellules
Jurkat. Ces effets de la galectine-9 sont indépendants de TIM-3 dans ce modèle cellulaire. L’anticorps
2E12 constitue un outil puissant pour étudier les fonctions de la galectine-9 à la fois dépendantes et
indépendantes de TIM-3.
11
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
INTRODUCTION
12
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
A
B
Figure 1 : « Hallmarks of cancer ». (Adapté de Hanahan et al, 2000 ; Hanahan et al, 2011).
(A) En 2000, Douglas Hanahan et Robert Weinberg présentaient six caractéristiques
fondamentales communes à tous les cancers. (B) En 2011, les deux auteurs publient une
mise à jour de leur article synthétique en prenant en compte les dix années de recherches
écoulées. Dans cette publication, l’échappement immunitaire est considéré comme l’un
des « hallmarks » émergents.
INTRODUCTION
I. Cancer et échappement immunitaire
1) Cancer et réponse immunitaire anti-tumorale
a) Immunosurveillance
Il est généralement admis que plusieurs propriétés cellulaires intrinsèques
caractérisent l’oncogénèse. Ces phénomènes, ou « hallmarks of cancer », furent décrits au
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
nombre de six par Douglas Hanahan et Robert A. Weinberg au début du siècle, dans un essai
de synthèse de l’immense quantité de données générées par la recherche sur le cancer durant
les trois décennies précédentes [1]. Les six phénomènes caractérisant la cellule cancéreuse
décrits dans cette publication sont l’autosuffisance en facteurs de croissance, l’insensibilité
aux facteurs inhibiteurs de croissance, la résistance aux mécanismes d’apoptose, une capacité
réplicative illimitée, une faculté à favoriser l’angiogénèse et enfin la capacité à envahir les
tissus et à générer des métastases (Figure 1). Les auteurs soulignaient également
l’importance d’étudier le cancer comme une maladie systèmique et non uniquement du
point de vue de la cellule cancéreuse. Les progrès considérables réalisés ces dernières années
en oncologie cellulaire et moléculaire ont effectivement démontré l’importance de ne plus
considérer la cellule cancéreuse comme une entité unique, mais comme faisant partie d’un
tissu complexe composé de cellules tumorales et de cellules de l’hôte telles que les
fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules du système immunitaire [2].
Parmi les différents aspects des relations entre l’hôte et la tumeur, le rôle du système
immunitaire dans l’élimination des cellules tumorales fut longtemps controversé. En 1909,
Paul Ehrlich émit l’hypothèse que le système immunitaire devait être capable de reconnaître
les tumeurs et de les détruire, car dans le cas contraire les êtres vivants ayant une longue
durée de vie seraient atteints plus fréquemment par le cancer. A l’époque, Ehrlich de
disposait pas des moyens nécessaires pour prouver son hypothèse. Celle-ci fut reprise un
demi-siècle plus tard par Burnet et Thomas, qui posèrent les bases de la « théorie de
13
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
l’immunosurveillance » [3]. En considérant les connaissances récemment acquises en
transplantation et en immunité tumorale, ils proposèrent que les lymphocytes devaient
éliminer continuellement les cellules normales nouvellement transformées. Cette hypothèse
fut mise à mal par les travaux d’Osias Stutman en 1974. Celui-ci montra que le
développement tumoral de sarcomes induit par le méthylcholanthrène (MCA) chez la souris
n’était pas différent chez les souris athymiques CBA/H par rapport aux souris sauvages [4].
A
la
publication
de
ces
résultats,
l’enthousiasme
autour
de
la
théorie
de
l’immunosurveillance se dissipa et la plupart des recherches dans ce domaine furent
abandonnées.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Des années plus tard, l’intérêt pour la théorie de l’immunosurveillance fut ravivé
lorsqu’une étude démontra le rôle crucial de l’Interféron-γ (IFN-γ) endogène dans la réponse
immunitaire anti-tumorale. Les auteurs de cette étude mirent en évidence une
tumorigénécité accrue de cellules tumorales rendues insensibles à l’IFN-γ dans des souris
BALB/c immunocompétentes [5]. Par la suite, il fut montré que des souris invalidées pour
l’IFN-γ ou pour l’ensemble des membres de la famille Interféron développaient des tumeurs
plus rapidement et plus fréquemment lorsqu’elles étaient exposées au MCA [6]. Des résultats
similaires furent obtenus avec des souris invalidées pour la perforine, protéine clé de la
cytotoxicité médiée par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules Natural Killer
(NK) [7]. Quelques année plus tard, il fut démontré que souris invalidées pour le gène
Recombination Activating Gene-2 (RAG-2) et ainsi atteintes d’immunodéficience combinée
sévère (SCID) (ne produisant pas de lymphocytes B, T et NKT) développaient plus de
tumeurs spontanées et plus de sarcomes induits par le MCA [8]. A la lumière de ces
résultats, l’existence d’une réponse immune anti-tumorale fut largement acceptée par la
communauté scientifique.
Les antigènes tumoraux (Tumor-Associated Antigens ou TAA) exprimés par les
tumeurs et reconnus par le système immunitaire peuvent être classés en trois catégories : les
antigènes du soi, les antigènes du soi modifié et les néo-antigènes. Les antigènes du soi sont
des antigènes normaux surexprimés (exemple : HER-2 [9]) ou des antigènes non exprimés
par le tissu d’origine de la tumeur (exemple : NY-ESO-1 [10]). Les antigènes du soi
14
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 2 : Immunoédition. (Adapté de Schreiber et al, 2012). L’immunoédition des cancers
comporte trois phases séquentielles : élimination, équilibre, échappement. Dans la phase
d’élimination, l’immunité innée et l’immunité adaptative coopère pour détruire les
tumeurs en développement. Les cellules tumorales non éliminées durant cette étape
peuvent entrer en phase d’équilibre. Lors de cette phase, le développement tumoral est
limité par la réponse immune. La pression exercée par le système immunitaire favorise la
sélection de cellules tumorales peu immunogènes et immunoévasives : c’est la phase
d’échappement. Les cellules tumorales échappant au système immunitaire vont se
développer de manière incontrôlée et former une tumeur visible.
modifié sont les protéines du soi mutées et dont la fonction est altérée (exemple : RAS [11]).
Les néo-antigènes sont les protéines de fusions issues de mutations ou de réarrangements
chromosomiques aberrants (exemple : BCR-ABL [12]) et les antigènes provenant de virus
oncogéniques (exemple : LMP1, LMP2, EBNA1 et BARF1 dans le carcinome nasopharyngé
(NPC) associé à l’EBV [13]).
b) Immunoédition des cancers
En dépit des preuves démontrant l’existence de l’immunosurveillance, il est
impossible d’ignorer le fait que des cancers se développent fréquemment chez des individus
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
immunocompétents. Robert D. Schreiber et ses collaborateurs proposent que le système
immunitaire de l’hôte « sculpte » la tumeur en éliminant les cellules malignes hautement
immunogènes et en favorisant de ce fait le développement de tumeurs peu immunogènes
et/ou ayant acquis des propriétés lui permettant d’échapper à la réponse immune [14, 15].
Cette « immunoédition » des cancers se déroulerait en trois phases séquentielles :
élimination, équilibre et échappement (Figure 2).
La phase d’élimination est une réactualisation de la théorie de l’immunosurveillance.
Durant cette phase, le système immunitaire détecte la tumeur en développement grâce à la
présence de signaux de « dangers » (Danger-Associated Molecular Pattern, DAMP) tels que
les familles de protéines de stress cellulaire MIC et ULBP ou la protéine HMGB1 associée à
l’ADN et relarguée par les cellules tumorales nécrotiques. Ces ligands activent les récepteurs
des cellules de l’immunité innée qui vont alors produire des cytokines inflammatoires,
facilitant le recrutement des cellules de l’immunité adaptative [16-18]. Les antigènes
tumoraux exprimés par la cellule permettent la mise en place d’une réponse spécifique des
cellules T CD4+ et CD8+ [19, 20].
Les cellules tumorales ayant survécu à la phase d’élimination entrerait alors dans un
état d’équilibre avec le système immunitaire. Lors de cette phase, l’immunité adaptative
limiterait la croissance tumorale et exercerait une pression de sélection favorisant les cellules
les moins immunogènes. Il est possible que cette phase de latence tumorale se déroule sur de
15
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
nombreuses années, voire durant toute la vie de l’hôte. L’existence de cette phase est difficile
à prouver chez l’homme. Toutefois, chez des souris traitées par de faibles doses de MCA, il
est possible de détecter des cellules malignes sans observer le développement de tumeurs
apparentes sur une longue période [21]. De plus, l’élimination des cellules T et de l’IFN-γ
chez ces souris provoquent l’apparition de tumeurs au point d’injection du MCA chez la
moitié d’entre elles, ce qui tend à prouver l’existence d’un équilibre entre l’immunité
adaptative et la tumeur.
Les cellules tumorales peuvent parvenir à briser cet équilibre en échappant au
système immunitaire de l’hôte, ce qui ce traduit par l’apparition d’une tumeur visible. Cette
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
faculté d’échappement est devenu officiellement l’un des « hallmarks » du cancer dans la
liste de Douglas Hanahan et Robert A. Weinberg mise à jour en 2011 (Figure 1) [22]. Comme
nous allons le voir maintenant, les moyens mis en œuvre par les tumeurs pour se soustraire
au système immunitaire sont nombreux : perte d’expression des antigènes tumoraux,
résistance à la cytotoxicité, diffusion de molécules immunosuppressives ou encore le
recrutement de cellules immunosuppressives.
2) Echappement immunitaire
a) Altération de la machinerie de présentation des antigènes
Selon la théorie de l’immunoédition, le système immunitaire exerce une pression de
sélection sur les cellules tumorales et favorise le développement de cellules malignes peu
immunogènes. Les cellules sélectionnées peuvent devenir « invisibles » pour le système
immunitaire et lui échapper de cette manière. La perte d’immunogénicité peut s’opérer par
au moins trois mécanismes : l’émergence de cellules tumorales n’exprimant pas d’antigènes
fortement immunogènes, la perte d’expression du complexe majeur d’histocompatibilité de
classe I (CMH I) et l’altération des mécanismes d’apprêtement des antigènes.
La sous-expression ou la perte complète de l’expression du CMH I a été mise en
évidence dans plusieurs cancers, tels que les cancers de la prostate, les cancers du poumon,
16
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
ou les cancers issus de l’épithélium malpighien de la tête et du coup [23-25]. Ce défaut
d’expression peut être dû à des mutations ponctuelles du gène du CMH I, à une régulation
négative de son expression ou bien à des pertes d’hétérozygotie ayant pour conséquence la
délétion de larges portions du gène [26-28]. La perte de réactivité à l’IFN-γ, régulateur
majeur de la machinerie de présentation des antigènes, peut également conduire à une
réduction drastique de l’expression du CMH I [29].
Enfin, les mécanismes d’apprêtement des antigènes peuvent être altérés. L’expression
des protéines TAP1 et TAP2, requises pour le transport des antigènes, peut être inhibée [30].
Un autre exemple est la mutation de la microglobuline β2, qui a pour conséquence un défaut
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
de transport de la molécule CMH I à la surface des cellules tumorales [31].
b) Résistance à la cytotoxicité
Les cellules du système immunitaire, telles que les lymphocytes T cytotoxiques et les
NK, peuvent éliminer directement les cellules tumorales induire l’apoptose par la voie des
perforines/granzymes et par la voie des récepteurs à domaine de mort (Fas, DR4 et DR5
récepteurs de TRAIL). Perforines et granzymes sont présentes dans les granules libérées par
les CTL et les NK. Après la dégranulation, ces molécules pénètrent dans la cellule et induise
l’apoptose par voie caspase-dépendante et/ou caspase-indépendante. Les cellules malignes
de mélanome, de cancer utérin ou de cancer du sein résistent à ce mode d’action en
exprimant la protéine PI-9/SPI-6, inhibitrice de granzyme B [32].
La liaison des récepteurs à domaine de mort avec leur ligand induit la formation du
complexe DISC. La formation de ce complexe permet le recrutement de la pro-caspase 8. La
cascade d’évènement ainsi déclenchée aboutit à la libération du cytochrome C par les
mitochondries et à l’activation des caspases effectrices. Les cellules tumorales peuvent
résister à ce mode d’action en surexprimant la protéine anti-apoptotique C-FLIP. Celle-ci se
fixe sur le complexe DISC et empêche le clivage de la pro-caspase 8 [33]. Un second
mécanisme de résistance est la régulation négative par les cellules tumorales des récepteurs
de mort Fas et DR4/5 ou l’acquisition de mutations délétères les rendant ceux-ci non-
17
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
fonctionnels [34, 35]. Enfin, les cellules tumorales peuvent exprimer de « faux » récepteurs
non fonctionnels, transmembranaires ou solubles, qui vont servir de « leurre » [36, 37].
c) Induction de l’état d’épuisement des lymphocytes T
Les lymphocytes T activés expriment les co-récepteurs inhibiteurs CTLA-4 et PD-1
qui interagissent avec les membres de la famille B7, respectivement B7.1 et B7.2 et B7-H1
(PD-L1), exprimés par les cellules présentatrices d’antigènes. L’engagement de ces récepteurs
fait basculer les lymphocytes T activés dans un état d’épuisement, ou « exhaustion », qui se
caractérise par une production réduite d’IL-2, un défaut de signalisation du TCR et un arrêt
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
du cycle cellulaire [38]. L’expression de B7-H1 a été mise en évidence dans plusieurs cancers,
ce qui laisse à penser que les cellules tumorales participeraient directement à l’induction de
cet état d’épuisement chez les lymphocytes T infiltrant la tumeur [39]. Le blocage des voies
CTLA-4 et PD-1 permet la réactivation de la réponse immunitaire anti-tumorale et constitue
une approche thérapeutique très prometteuse [40].
d) Immunosuppression médiée par les lymphocytes T régulateurs
Les lymphocytes T régulateurs (Treg) sont généralement caractérisés par l’expression
des marqueurs CD4, CD25 et FoxP3 [41]. Les Treg peuvent être issus de lymphocytes T
FoxP3+ originaire du thymus, ou bien dériver de précurseurs T CD4+ naïfs circulants [42].
L’enrichissement en lymphocytes Treg dans le microenvironnement tumoral fut démontré
pour la première fois dans les cancers du poumon et les cancers ovariens, il y a maintenant
plus de dix ans [43]. Aujourd’hui, nous savons qu’ils infiltrent la plupart des tumeurs solides
et qu’il protègent les cellules tumorales contre le système immunitaire [44-46]. Leur
accumulation dans le microenvironnement tumoral peut être liée à un pronostic vital
sombre, par exemple chez les patients atteints de cancer du sein, des ovaires ou gastriques.
Paradoxalement, il existe des cas où la présence de Treg est synonyme de bon pronostic [49].
Les Treg sont activement recrutés par les cellules du microenvironnement tumoral grâce à
plusieurs chimiokines, comme le CCL22 dans le carcinome ovarien [47]. Les fortes
concentrations intratumorales de TGF-β favorisent la conversion des lymphocytes CD4+ [50].
18
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Les Treg exercent leur activité suppressive par de nombreux moyens. Ils sécrètent des
molécules immunosuppressives telles que l’IL-10 ou le TGF-β et limitent de cette manière les
réponses anti-tumorales des cellules CD4+, CD8+ et NK. En outre, ils exercent une activité
cytolytique directe sur les cellules T effectrices et les cellules dendritiques par l’intermédiaire
des granzymes, de TRAIL et de la galectine-1 [51-54]. Ils expriment la molécule CTLA-4 et
son invalidation réduit considérablement leur activité suppressive [55]. Enfin, ils
appauvrissent le microenvironnement tumoral en IL-2 et catalysent la transformation de
l’ATP en adénosine, inhibiteur des fonctions anti-tumorales des cellules T effectrices [56, 57].
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
e) Immunosupression médiée par les cellules myéloides suppressives
Les cellules myéloïdes suppressives (MDSC) constituent une population hétérogène
de cellules myéloïdes capable d’exercer une activité immunosuppressive. Ces cellules sont
caractérisées chez la souris par l’expression de CD11b et de Gr1 [58]. L’absence d’homologue
humain de Gr1 rend difficile la définition de cette population chez l’homme, néanmoins
certains auteurs supposent qu’elle peut être composée de cellules LIN- HLA-DR- CD33+ ou
CD11B+ CD14- CD33+ [59]. Le GM-CSF produit par les cellules tumorales est un facteur de
croissance important pour l’expansion de cette population [60].
Comme les lymphocytes Treg, les MDSC exercent leur activité immunosuppresive
par de multiples mécanismes. Elles produisent notamment de grandes quantités d’oxyde
nitrique synthase induite (iNOS) et d’arginase [59]. L’oxyde nitrique exerce un rôle proapoptotique direct sur les cellules T tandis que la déplétion de L-arginine engendrée par
l’activité de l’arginase réduit leur capacité proliférative [61]. D’autres mécanismes
d’immunosuppression incluent la production de l’IL-10 et de dérivés réactifs de l’oxygène
[62, 63]. Enfin, les MDSC pourraient favoriser la différenciation de cellules T CD4+ en
lymphocytes T régulateurs [64].
19
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
f) Facteurs immunosuppressifs produits par les cellules tumorales
Les
cellules
malignes
participent
également
à
la
mise
en
place
d’un
microenvironnement tumoral immunosuppressif, en sécrétant divers facteurs tels que le
TGF-β, le vascular endothelial growth factor (VEGF), le GM-CSF, la protéine Indoleaminepyrrole 2,3 dioxygénase (IDO) ou encore les ligands des récepteurs à domaine de mort FasL
et TRAIL [65-68]. Ces molécules peuvent inhiber la réponse immune anti-tumorale par de
nombreux mécanismes, tels que la régulation négative directe des cellules effectrices ou le
recrutement de cellules suppressives comme les Treg ou les MSDC.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Ainsi, le TGF-β induit l’épuisement des cellules T et l’expansion des Treg, le GM-CSF
favorise le recrutement des MSDC, la protéine IDO provoque l’arrêt du cycle cellulaire des
cellules T en réduisant leur accès au tryptophane et FasL ainsi que TRAIL déclenchent
l’apoptose des cellules T effectrices [50, 68-72]. Il est intéressant de noter que de nombreuses
tumeurs sont insensibles au effets de ces molécules, par exemple aux effets du TGF-β, de
FasL et de TRAIL [68, 72, 73].
Les cellules tumorales sécrètent également une grande quantité de vésicules
biologiquement actives, dont des nanovésicules appelées exosomes. Les exosomes sont des
acteurs clés de la communication intercellulaire et leurs propriétés immunosuppressives
exercent
souvent
un
effet
délètere
sur
le
système
immunitaire
au
sein
du
microenvironnement tumoral.
3) Exosomes tumoraux immunosupresseurs
a) Structure et composition des exosomes
Les exosomes sont des nanovésicules extracellulaires entourées d'une bicouche
lipidique analogue à celle des membranes cellulaires. Le nom « exosome » est apparu pour la
première fois en 1981, qualifiant des vésicules issues de différentes lignées cellulaires
tumorales ou non et possédant une activité enzymatique [74]. Les exosomes se distinguent
20
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 3 : Biogenèse des exosomes. (Adapté de Ge et al, 2012). Les exosomes
apparaissent sous forme de vésicules intraluminales (ILV) bourgeonnantes à l’intérieur
des corps multivésiculaires (MVB). Lors de la fusion des MVB avec la membrane
plasmique, les ILV sont libérées dans le milieu extracellulaire et sont alors appelées
exosomes.
Figure 4 : Composition biochimique des exosomes. (Adapté de
Taylor et al, 2011).
des autres microvésicules par leur petite taille (de 30 à 100 nm de diamètre) et par leur
origine endosomale [75]. Ils apparaissent sous forme de vésicules bourgeonnantes à
l’intérieur de corps multivésiculaire dérivés du compartiment endosomal profond. A ce
stade, on les appelle ILV pour « Intra-Luminal Vesicles » [76]. Lors de la fusion des corps
multivésiculaires avec la membrane plasmique, les ILV sont libérées dans le milieu
extracellulaire et sont alors appelés exosomes (Figure 3).
La plupart des cellules eucaryotes sécrètent des exosomes. Ils peuvent être mis en
évidence dans de nombreux liquides biologiques incluant le sang, la salive, l’urine et le lait
maternel. Les exosomes contiennent des lipides, des protéines et des acides nucléiques
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
(Figure 4) [77]. Leur composition protéique varie grandement en fonction du type cellulaire
et de l’état physiologique des cellules productrices [78, 79]. Cependant, tous les exosomes
contiennent des protéines de fusion et de transport membranaire (GTPases, Annexines), des
tétraspannines (dont CD63, fréquemment utilisé comme marqueur des exosomes), des
protéines de choc thermique (Hsp70, Hsp90) et des protéines impliquées dans la biogenèse
des corps multivésiculaires (Alix, TSG101) [80]. Les exosomes sont également enrichis en
lipides associés aux radeaux membranaires et en acides nucléiques, incluant des micros ARN
et autres ARN non codants, des ARN messagers et probablement de l’ADN génomique dans
le cas des exosomes tumoraux [81, 82].
b) Aperçu des fonctions biologiques des exosomes
A l’origine décrits comme des « vésicules déchets » contenant des molécules
indésirables dont la cellule se serait débarrassée, les exosomes sont maintenant considérés
comme des médiateurs de la communication intercellulaire. Ignorés par les macrophages car
reconnus comme composants du soi, et leur contenu protégé des protéases et nucléases, ils
sont capable de délivrer un « message » en provenance de leur cellule d’origine à destination
de cellules voisines et de cellules anatomiquement éloignées par l’intermédiaire des liquides
biologiques [80, 83].
21
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Le rôle des exosomes a été particulièrement étudié dans le système immunitaire,
notamment dans la présentation des antigènes comme l’a montrée une étude tout à fait
décisive de G. Raposo et al. publiée en 1996 [84]. Dans cette étude, les auteurs montrent que
les exosomes produits par les lymphocytes B humains et murins peuvent présenter à un
clone de lymphocyte T CD4+ des peptides antigéniques restreints dans le système HLA de
classe II. Ainsi, les exosomes peuvent transporter des antigènes tumoraux et peuvent induire
une réponse T spécifique en présence de cellules dendritiques n’ayant pas été en contact avec
ces antigènes au préalable [85]. Ils peuvent également transporter des antigènes viraux et
bactériens et favoriser l’inflammation [86-88]. D’autres fonctions ont été attribuées aux
exosomes dans la mort programmée, l’angiogénèse, l’inflammation et la coagulation [80].
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Chez la drosophile, il existe des arguments expérimentaux suggérant une fonction de
vésicules très semblables aux exosomes, les argosomes, dans l’établissement des gradients
morphogénétiques [89].
Dans les contextes pathologiques, les fonctions de communication intercellulaire des
exosomes peuvent être détournées. Ils jouent un rôle dans la dissémination de virus ou de
composants viraux d’une cellule à une autre [90, 91]. Notre équipe a été l’une des premières
à mettre en évidence la présence de microARN du virus Epstein-Barr dans les exosomes [92].
D’autres équipes ont mis en évidence le transfert de ces microARN viraux dans des cellules
non-infectées in vitro avec des indices suggérant que des transferts semblables peuvent se
produire in vivo chez l’homme [93].
Les exosomes sont impliqués dans le développement des cancers à de multiples
niveaux. Ils véhiculent des oncogènes tels que HER2 ou la protéine LMP1 d’EBV [85, 94].
Leurs interactions avec les cellules du stroma permettent la mise en place d’un
microenvironnement propice au développement tumoral, par exemple en reprogrammant
les cellules endothéliales avoisinantes pour qu’elles sécrètent le VEGF qui les stimule d’une
manière autocrine [95]. Les exosomes peuvent également permettre aux cellules tumorales
d’échapper aux traitements notamment en « leurrant » les thérapies ciblées ou en favorisant
l’élimination des agents de chimiothérapie. Ainsi, les exosomes transportant HER2
22
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
détournent l’anticorps monoclonal trastuzumab des cellules tumorales et les cellules de
cancer du sein relarguent des exosomes riches en doxorubicin [96, 97].
Si les exosomes participent directement à la mise en place d’un microenvironnement
procipe au développement tumoral, de plus en plus de preuves tendent à montrer qu’ils
protégeraient activement la tumeur contre l’élimination par le système immunitaire grâce à
une large panoplie de capacités immunosuppressives [98]. Nous allons maintenant nous
intéresser en détail à ces propriétés.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
c) Exosomes tumoraux et immunosuppression
Les exosomes tumoraux exercent une activité suppressive directe sur les cellules T
effectrices en véhiculant FasL et TRAIL, ligands des récepteurs de mort exprimés à la surface
des lymphocytes T activés [99, 100]. Le FasL exosomal est également responsable d’un défaut
de signalisation du TCR chez les patientes atteintes de carcinome ovarien [101]. Les
exosomes tumoraux transportent fréquemment les molécules CD39 et CD73, qui sont des
enzymes catalysant la transformation de l’ATP en AMP (CD39) et de l’AMP en adénoside
(CD73). Ces enzymes sont actives à la surface des exosomes [102]. L’adénosine extracellulaire
exerce un rôle de régulateur négatif de la réponse immunitaire. Les exosomes tumoraux
véhiculant les ligands du récepteur NKG2D interagissent avec les cellules NK, ce qui réduit
l’expression de ce récepteur et limite ainsi les fonctions effectrices de ces cellules [103].
L’activité immunosuppressive des exosomes est également liée à leur capacité de
régulation positive des Treg et des MDSC. Les exosomes issus d’ascites et de sang de
patients atteints de cancer favorisent la conversion et l’expansion de cellules T CD4+ CD25en Treg CD4+ CD25+ FoxP3+ et accroissent leurs capacités fonctionnelles [104, 105]. Ces
propriétés seraient dépendantes du transport du TGF-β par les exosomes [105, 106]. Chez la
souris, les exosomes issus de lignées cellulaires tumorales favorisent la différenciation des
cellules myéloïdes en MDSC CD11b+ Gr1+ [107].
23
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 5 : Famille des galectines. (Adapté de Liu et al, 2005). (A) Les galectines
constituent une famille de lectines caractériser par des domaines de reconnaissance des
carbohydrates (CRD) conservés d’environ 130 acides aminés. A ce jour, 15 galectines ont
été identifiées, dont 10 chez l’homme. Elles peuvent être classées en 3 groupes : prototype
(un seul CRD : galectines-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14 et -15) tandem (deux CRD non
homologues reliés par un peptide « linker » : galectines-4, -6, -8, -9, -12) et chimère (un
CRD relié à un peptide : galectine-3). (B) Les galectines peuvent interagir avec les
glycoconjugués présents à la surface des cellules et former des « lattices »à partir
desquelles peuvent se déclencher des cascades de signalisation. Elles peuvent également
médiées des interactions intercellulaires et cellules/matrice extracellulaire.
Mon équipe d’accueil a mis en évidence l’activité immunosuppressive directe des
exosomes de carcinome nasopharyngé (NPC) sur les lymphocytes Th1 [108]. Cette activité
immunosuppressive est médiée par la galectine-9, fortement exprimée par les cellules de
NPC et retrouvée en grande quantité dans les exosomes issus de ces cellules.
II. La galectine-9, protéine immunomodulatrice
1) Famille des galectines
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
a) Structure et propriétés générales des galectines
Les galectines, ou lectines de type S, constituent une famille composée de quinze
membres chez les vertébrés, dont dix chez l’homme. Elles se distinguent par leur capacité à
se lier spécifiquement aux groupements glucidiques de type β-galactosides grâce à leur
domaine de reconnaissance des carbohydrates ou CRD (« Carbohydrates Recognition
Domain »). Les galectines se différencient essentiellement par leur spécificité de liaison aux
résidus glucidiques ainsi que par leur structure primaire (Figure 5) [109]. Il est possible de les
classer en trois groupes selon celle-ci :
- les galectines prototypes (« proto-type galectins »), constituées d’un seul domaine
CRD capable de se dimériser (galectine-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14, -15).
- les galectines avec répétitions en tandem (« tandem-repeat type galectins »),
composées de deux domaines CRD non homologues reliés par un peptide « linker »
(galectine-4, -6, -8, -9, et -12).
- les galectines de type chimère (« chimera-type galectin »), ne possèdant qu’un seul
domaine CRD en C-terminal relié à un peptide en N-terminal et capable de former
des oligomères (galectine-3).
24
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Table 1 : Spécificité de ligation des galectines. (Adapté de Rabinovich et al, 2009).
Les domaines CRD des galectines sont constitués de 135 à 140 acides aminés formant
un sandwich beta légèrement courbé lui-même constitué de deux feuillets beta antiparallèles.
Le côté concave est formé de six brins beta (S1 à S6) tandis que le côté convexe est formé de
cinq brins beta (F1 à F5). Certains CRD possèdent un brin beta F supplémentaire (exemples :
galectine-3, CRD N-terminal de la galectine-8). Le côté concave forme la cavité (ou « LBG »
pour Ligand Binding Groove) dans laquelle vient se fixer le carbohydrate. Les brins beta sont
reliés par de longues boucles variables, leur nom étant formé par concaténation des noms
des deux brins qu’elles connectent. La figure 6 présente la structure tridimensionnelle de la
galectine-1, galectine « prototype » généralement utilisée comme référence structurelle de la
famille des galectines. Il est intéressant de noter que les structures tridimensionnelles des
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
CRD sont très similaires en dépit d’une identité de séquence protéique de seulement 29%
[110]. Les principales différences structurelles entres les galectines se situent dans les boucles
variables comme le montre l’alignement structurel présenté dans la figure 7.
Les galectines reconnaissent des glycoconjugués, avec comme structure minimale
reconnue le disaccharide N-acetyllactosamine (LacNAc) formé d’un galactose et d’un
N-acetylglucosamine [111]. Le LacNAc peut être retrouvé dans les N-glycans et O-glycans et
plusieurs
unités
(poly-LacNAc)
peuvent
être
présentées
sur
les
glycoprotéines
membranaires. Il existe toutefois des différences significatives de reconnaissance des glycans
entre les différents membres de la famille des galectines, principalement associées au nombre
de branchements N-glycans, au nombre de répétitions LacNAc ou encore aux modifications
des sacharides terminaux tels que la sialylation ou la fucosylation [110]. La table 1 présente
les spécificités de ligation des galectines [112]. Il est possible que les différences structurelles
observées dans les boucles reliant les feuillets beta soient cruciales pour la détermination de
la spécificité des galectines envers leurs ligands [110].
Par définition, la capacité des galectines à lier des radicaux β-galactosides portés par
des oligosaccharides branchés sur des glycoprotéines ou des glycolipides est leur propriété
biologique essentielle. Le caractère divalent ou bivalent des galectines à deux CRD ou des
dimères de galectines au CRD unique est une autre propriété essentielle de laquelle découle
leur capacité de ponter de nombreuses variétés de macromolécules. Cette capacité est à la
25
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 6 : Structure tridimensionnelle de la galectine-1. (Guardia et al, 2011).
La galectine-1 est une galectine « prototype » constituée d’un unique domaine
de liaison des carbohydrates (CRD). Comme la plupart des autres CRD des
galectines, le CRD de la galectine-1 est constituée de deux feuillets beta
antiparallèles légèrement courbés (« S-sheet », brins S1à S6 et « F-sheet », brins
F1 à F5). Le site de liaison des carbohydrates (Ligand Binding Groove, LBG) est
situé dans le côté concave de la protéine (« S-sheet »).
Figure 7 : Alignement structurel des galectines. (Guardia et al, 2011). La
structure de la galectine-1 est utilisée comme référence pour cet alignement. Les
régions bleues correspondent à des faibles valeurs de racine carrée moyenne de
déviation (structure conservée) et les régions rouges à des fortes valeurs de
racine carrée moyenne de déviation (structure variable).
base de leur participation à l’organisation interne de la cellule, à la formation de
nanodomaines membranaires, à la communication intercellulaire et aux interactions
cellules/matrice extracellulaire (Figure 5) [109].
Elle est particulièrement bien illustrée par la formation de « lattices » à la surface des
cellules (Figure 5) [113]. En pontant les oligosaccharides galactosylés appartenant à différents
glycolipides ou glycoprotéines, les galectines peuvent entraîner la formation de véritables
réseaux moléculaires [114]. Dans certains cas, des cascades de signalisation peuvent se mettre
en place à partir de ces « lattices ». Les galectines peuvent aussi interagir directement avec
d’autres molécules sans mettre en jeu de radicaux β-galactosides, notamment lorsqu’elles
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
participent à la régulation de processus biologiques intracellulaires [109].
b) Distribution tissulaire et localisation sub-cellulaire des galectines
La distribution tissulaire des différentes galectines est variable. Certaines d’entre elles
ont une distribution large, telles que les galectines-1, -3, -8 et -9, tandis que d’autres ont une
distribution beaucoup plus restreinte, telle que les galectines-2, -4, et -6 spécifiques du tractus
digestif, la galectine-7 retrouvée dans les tissus épithéliaux stratifiés, la galectine-12 présente
dans les tissus adipeux, la galectine-10 exprimée dans les éosinophiles humains et les Treg et
la galectine-5 restreinte aux érythrocytes et réticulocytes de rat [115-121].
Les galectines présentent certaines propriétés fondamentales propres aux protéines
cytosoliques : elles sont synthétisées par les ribosomes cytosoliques, leur extrémité Nterminale est acétylée et elles ne possèdent pas de peptide «signal» [122]. Elles subissent peu
de modifications post-traductionnelles [122]. Elles ne sont pas localisées exclusivement dans
le cytosol et elles peuvent être associées aux membranes internes ou à la membrane
plasmique, ou encore avoir une localisation nucléaire [123].
Dans la membrane plasmique, certaines galectines comme les galectines-4 et -9
peuvent être associées aux radeaux membranaires ou « rafts », des structures très riches en
glycolipides [124-126]. Il est possible qu’elles contribuent à l’assemblage et à la stabilité de
26
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
ces structures. De plus, leur incorporation dans ces radeaux membranaires est nécessaire
dans certains cas à leur activité de signalisation. Ainsi, la galectine-9 associée aux radeaux
membranaires induit la prolifération des ostéoblastes par la voie de signalisation c-Src/ERK
[126].
En dépit de leur manque de peptide « signal » normalement requis pour la sécrétion,
elles peuvent être libérées dans le milieu extracellulaire en association avec les exosomes.
Cela a été démontré pour la galectine-1 et la galectine-3 dans les cellules dendritiques, pour
la galectine-5 dans les réticulocytes de rat, et dans les cellules de carcinome naso-pharyngé
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
pour la galectine-9 [94, 121, 127, 128].
c) Galectines, système immunitaire et cancer
Les galectines peuvent influencer un grand nombre de processus biologiques tels que
le développement embryonnaire, la néovascularisation et la modulation du système
immunitaire [129]. Nous allons nous intéresser ici tout particulièrement à ce dernier aspect,
en nous attardant sur les galectines -1 et -3 qui sont, avec la galectine-9, les galectines les plus
étudiées. La galectine-9, principal objet de cette thèse, fera l’objet d’une partie spécifique.
La galectine-1 possède des fonctions principalement anti-inflammatoires et
immunosuppressives. Elle abolit les fonctions des neutrophiles, des macrophages
inflammatoires et des mastocytes [130-132]. De plus, elle favorise directement ou
indirectement l’apoptose des thymocytes et des lymphocytes T, inhibe leur fonction de
sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, augmente la production de la cytokine antiinflammatoire IL-10 et d’une manière générale affaiblit les réponses Th1 et Th17 [112, 133137]. La galectine-1 est fortement exprimée par les Treg [54].
La galectine-3 a été particulièrement étudiée dans le contexte de l’inflammation aigüe.
Elle est impliquée dans l’activation et l’adhésion des neutrophiles, la chimio-attraction des
monocytes et macrophages ou encore l’activation des mastocytes [138-140]. Son rôle de
régulation des lymphocytes T est ambiguë. En effet, si la galectine-3 soluble induit l’apoptose
27
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
des lymphocytes T, les cellules T surexprimant la galectine-3 par transfection sont protégées
de l’apoptose induite par plusieurs agents [141, 142]. De plus, le traitement de cellules T par
des oligonucléotides antisens spécifiques de la galectine-3 réduit leur taux de prolifération
[143].
Les galectines-2 et -4 induisent l’exposition des phosphatidylsérines des neutrophiles
et provoquent l’apoptose des cellules T [135, 144, 145]. Cependant, la galectine-4 pourrait être
un activateur des lymphocytes T dans certains cas en favorisant la sécrétion de cytokines
pro-inflammatoires [146]. De la même manière, la galectine-8 aurait un double rôle de
régulation positive et négative des lymphocytes T [147, 148]. La galectine-10 pourrait jouer
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
un rôle dans la spécialisation des cellules myéloïdes [149]. Elle est également exprimée par
les Treg d’une manière strictement intracellulaire et exercerait un rôle important dans la
régulation des fonctions de ces cellules [119].
Les fonctions des galectines peuvent être détournées dans des contextes
pathologiques, notamment dans les tissus tumoraux. Les galectines sont fréquemment
exprimées par les cellules malignes, tout particulièrement la galectine-1, la galectine-3 et la
galectine-8, impliquées dans la plupart des cancers [150]. La galectine-4 est également
exprimée dans de nombreux types de cancer, à l’exception des cancers du sein et du
poumon. A l’inverse, la galectine-7 est exprimée dans ces cancers, ainsi que dans le cancer du
colon et les lymphomes [151]. La galectine-12 est exprimée dans les cancers du sein et les
carcinomes ovariens [152].
Etant données les multiples activités de régulation des galectines, il est difficile de
déterminer leur rôle précis dans les cancers où elles sont exprimées. La galectine-1 régule
négativement la réponse anti-tumorale des cellules T, favorise le processus métastatique et
l’angiogénèse [153-156]. La galectine-3 favorise la transformation tumorale en interagissant
avec l’oncogène K-Ras et protège les cellules tumorales de l’apoptose [157, 158]. Comme la
galectine-1, elle régule négativement la réponse anti-tumorale des cellules T et favorise le
processus métastatique et l’angiogénèse [159-161].
28
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
2) Découverte, structure et distribution de la galectine-9
a) Découverte de la galectine-9
La galectine-9 fut découverte par deux équipes indépendantes selon deux approches
différentes. Elle fut tout d’abord identifiée dans la maladie de Hodgkin, en tant que cible
d’auto-anticorps présents dans le sérum de la moitié des patients [162]. Elle fut décrite un
peu plus tard par l’équipe de Mitsuomi Hirashima comme agent chimio-attractant des
éosinophiles produit par les lymphocytes T [163], ce qui lui valut le nom alternatif
d’ecalectine (ou « eosinophil chemoattractant lectine »). Depuis sa découverte, un large
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
éventail de fonctions lui a été attribuée, comme nous allons le voir dans cette partie. Ces
fonctions sont principalement liées à la régulation du système immunitaire et il est
aujourd’hui évident que la galectine-9 joue un rôle clé dans la modulation des réponses
immunitaires innées et adaptatives.
b) Structure du gène LGALS9 et de la protéine galectine-9
La galectine-9 est codée par le gène LGALS9 situé sur le chromosome 17p et constitué
de onze exons séparés par dix introns. Le gène s’étend sur environ 18,8 Kpb [164] et peut
subir trois épissages différents pouvant générer trois isoformes : longue (L), moyenne (M) et
courte (S). Les ARN messagers de la forme courte sont dépourvus des exons 5 et 6, les
messagers de la forme moyenne sont dépourvus de l’exon 5, et les messagers de la forme
longue contiennent tous les exons [165, 166].
La
protéine
galectine-9
comporte
deux
domaines
de
reconnaissance
des
carbohydrates (CRD) non homologues présentés en tandem et reliés par un peptide de
liaison dont la longueur varie selon les isoformes. Les isoformes L, M et S comptent
respectivement 355, 323 et 311 acides aminés (poids moléculaires 39 kDa, 36 kDa et 35 kDa)
avec des peptides de liaison de 58, 26, et 14 acides aminés respectivement. L’isoforme M
serait prédominante dans l’intestin [167]. Il existe peu d’études fonctionnelles comparatives
des différentes isoformes de la galectine-9, toutefois il a été montré qu’elles possédaient
29
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
A
B
Figure 8 : Spécificités de ligation de la galectine-9. (Adapté de Hirabayashi et al,
2002). Chromatographie d’affinité frontale. Les galectines sont immobilisées dans
des colonnes dans lesquels sont déposés les différents oligosaccharides. Les
différences de concentration avant et après passage par la colonne permettent de
calculer la constante d’affinité (Ka). (A) Ensemble des oligosaccharide testés. (B) Ka
des différents oligosaccharides testés avec la galectine-9.
toutes les trois une activité comparable de chimio-attraction des eosinophiles [168]. De plus,
l’expression transitoire de l’isoforme longue de la galectine-9 dans des cellules de carcinome
de colon augmente l’expression de la protéine d’adhésion pro-métastatique sélectine-E
tandis que l’expression transitoire des isoformes moyenne et courte réduit son niveau
d’expression [169].
La galectine-9 possède une affinité élevée pour les oligosaccharides de type N-glycan
avec branchements (Kd = 0,16 ~ 0,70 µM) et les oligolactosamines avec répétitions possédant
une structure linéaire (Kd = 0,09 ~ 8,3 µM selon le nombre de répétitions, la constante de
dissociation diminuant avec l’augmentation du nombre de répétitions) [111]. Les domaines
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
CRD N-terminal et C-terminal possèdent des spécifités de ligation différentes. Ainsi, le CRD
N-terminal possède une forte affinité pour le pentasaccharide de Forssman (Kd = 0,09 µM) et
l’A-hexasaccharide (Kd = 0,26 µM) au contraire du CRD C-terminal. La figure 8 présente les
spécificités de ligation de la galectine-9 de ces différents oligosaccharides. Les affinités de la
galectine-9 pour les oligosaccharides de type O-glycan sont encore mal connues à ce jour.
Les structures tridimensionnelles des deux CRD de la galectine-9 ont été déterminées
individuellement par cristallographie [170-172]. Le domaine C-terminal a été cristallisé en
présence des oligosaccharides LacNAc, Sialac et BIPA (Figure 9). Comme les autres CRD des
galectines, le CRD C-terminal de la galectine-9 adopte une configuration en sandwich beta
formé de deux feuillets beta antiparallès, eux-mêmes constitués de six (S1 à S6) et cinq (F1 à
F5) brins beta. A noter la présence d’une hélice supplémentaire (H1) située dans la boucle F5S2. Le CRD C-terminal forme un trimère lors de la cristallisation, cependant il est possible
qu’il n’y ait pas de trimérisation en solution. Les auteurs de l’étude suggèrent que la
structure large et peu profonde de la cavité favoriserait la liaison d’oligosaccharides avec
branchements. Le CRD N-terminal a été cristallisé en présence de lactose, du pentasaccharide
de Forssman et dans une seconde étude avec le poly-LacNAc [171, 172]. La structure du CRD
N-terminal est semblable à celle du CRD C-terminal et l’on retrouve également l’hélice H1
(Figure 9). Ce CRD se cristallise sous forme monomèrique.
30
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
A
B
C
Figure 9 : Structures tridimensionnelles des domaines CRD de la
galectine-9. (Nagae et al, 2007 ; Yoshida et al, 2010). (A) Structure
tridimensionnelle du domaine CRD N-terminal en complexe avec le
lactose. (B) Structure tridimensionnelle du domaines CRD C-terminal en
complexe avec les oligosaccharides LacNAc, SiaLac et BIPA. Les structures
des deux domaines sont proches de la structure de la galectine-1, à
l’exception de l’hélice H1 non présente dans la structure de cette dernière.
(C) Structure détaillée du lactose, de LacNAc, SiaLac et BIPA.
La galectine-9 se lie au récepteur TIM-3 par l’intermédiaire de résidus N-glycans [173].
L’expression de ce type de résidus est nécessaire pour l’induction de l’apoptose des cellules
de la lignée Jurkat [174]. L’équipe d’Hirashima a récemment mis en évidence un effet
suppresseur de la galectine-9 sur le développement des lymphocytes Th17 et celui-ci est
indépendant du récepteur TIM-3 mais dépendant de la biosynthèse d’O-glycans [175].
c) Distribution tissulaire et subcellulaire de la galectine-9
La galectine-9 possède une distribution tissulaire large, cependant elle est peu
exprimée en dehors d’un contexte inflammatoire. Elle est principalement produite par les
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
lymphocytes T, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules
épithéliales [163-165, 176-178]. Son expression est induite par plusieurs cytokines
inflammatoires telles que l’IFN-γ ou l’IL-1 β, ou par l’activation antigénique pour les
lymphocytes T [163, 178, 179]. Elle est régulée positivement par l’histone déacétylase 3
(HDAC3) dans les cellules endothéliales [180].
La galectine-9 est fortement exprimée par les cellules malignes de NPC et par les
cellules de Kupffer infiltrant les tissus hépatiques infectés par le VHC, plus particulièrement
dans le contexte d’hépatocarcinomes liés au VHC [124, 176]. Elle est retrouvée dans le sang
des patients atteints par ces maladies [108, 176]. On la retrouve également exprimée dans
d’autres cancers non liés à des virus, tels que le mélanome et le cancer du sein [181, 182].
Comme décrit précèdemment, les galectines ne sont généralement pas réduites à une
seule localisation cellulaire et la galectine-9 ne déroge pas à cette règle. Celle-ci peut avoir
une localisation cytoplasmique ou nucléaire, être associée à la membrane plasmique ou
encore être sécrétée dans le milieu extracellulaire [94, 124, 183]. Comme les autres galectines,
la galectine-9 ne possède pas de séquence signal et n’est pas sécrété par la voie classique
dépendante du réticulum endoplasmique et de l’appareil de Golgi [184]. Mon équipe
d’accueil a mis en évidence sa sécrétion en association avec les exosomes par les cellules
malignes de carcinome nasopharyngé [94].
31
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 10 : Famille des protéines TIM. (Adapté de Freeman et al, 2010).
Représentation schématique. Les sites de glycosylations sont positionnés de
manière approximative.
d) Exosomes et galectine-9
La galectine-9 est présente en grande quantité dans les cellules de NPC et dans les
exosomes sécrétés par ces cellules [94, 124]. Ces exosomes porteurs de galectine-9 sont
retrouvés dans le sang de souris xénogreffées par des lignées de NPC et dans le sang de
patients atteints de NPC [108]. L’inclusion de la galectine-9 dans la membrane des exosomes
la protège de la digestion protéique par la trypsine et le traitement des exosomes par le
Triton resensibilise la galectine-9 à cette digestion. Ces exosomes peuvent être capturé par
des billes magnétiques recouvertes de l’anticorps anti-galectine-9 9M1-3, ce qui démontre
qu’au moins une partie de la galectine-9 est exposée à la surface des exosomes. L’élément clé
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
de cette étude est la démonstration que les exosomes vecteurs de galectine-9 peuvent agir en
tant qu’agoniste de TIM-3. En effet, ils peuvent induire l’apoptose de clones CD4+
spécifiques de protéines d’EBV. Cette apoptose peut être inhibée par 9M1-3 et par un
anticorps bloquant de TIM-3.
3) Récepteurs de la galectine-9 et signalisation
a) Récepteur TIM-3
Les protéines TIM (T-cell Immunoglobulin and Mucin-domain containing)
constituent une famille de protéines membranaires de type I composées en N-terminal d’un
domaine extracellulaire homologue des immunoglobulines, d’un domaine de type mucine,
d’un domaine transmembranaire, et d’un domaine intracellulaire en C-terminal (Figure 10).
Les protéines de la famille TIM sont au nombre de huit chez la souris (TIM-1 à -8), trois chez
l’homme (TIM-1, TIM-3 et TIM-4), et sont toutes impliquées dans le fonctionnement du
système immunitaire [185].
Le récepteur TIM-3 a tout d’abord été identifié comme marqueur des lymphocytes
Th1 [186]. Nous savons maintenant qu’il est exprimé par les cellules T CD8+, les Th17, les
Treg et les cellules de l’immunité innées telles que les monocytes, les cellules dendritiques et
les NK [187-191]. Il possède un rôle inhibiteur lorsqu’il est exprimé par les Th1, les Th17 et
32
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 11 : Structure tridimensionnelle du domaine IgV de la protéine
TIM-3 murine. (Adapté de Freeman et al, 2010). Les sites de liaison de la
phosphatidylsérine et de la galectine-9 sont indiqués. Les chaînes latérales
de deux asparagines pouvant être N-glycosylés sont représentées sous
forme spérique.
Figure 12 : Modèles d’interaction entre TIM-3 et la galectine-9. (Adapté de
Freeman et al, 2010). TIM-3 peut interagir avec la phosphatidylsérine (en rouge)
présente à la surface de cellules apoptotiques ou d’exosomes. La galectine-9 peut
lier deux molécules TIM-3, ou bien lier une molécule TIM-3 et un autre récepteur.
les T CD8+ et un rôle stimulateur pour les Treg [173, 187-191]. Il induit la production de
cytokines pro-inflammatoires par les monocytes, les cellules dendritiques et les NK [176,
189].
Son expression peut être dérégulée dans différents contextes pathologiques. Ainsi,
TIM-3 est sous-exprimé dans plusieurs maladies auto-immunes telles que la sclérose en
plaque, la polyarthrite rhumatoïde ou l’hépatite auto-immune [192-194]. Inversement, TIM-3
est souvent surexprimé à la surface des CTL lors d’infections chroniques virales [195-197].
Son expression caractérise une population de lymphocytes au phénotype « épuisé », qui se
traduit par une réponse limitée après activation par les antigènes viraux en termes de
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
production de cytokines et de cytotoxicité. Cette association de TIM-3 à l’état d’épuisement
des CTL est également retrouvée dans le mélanome pour des lymphocytes dirigés contre
l’antigène tumoral NY-ESO-1 [198].
D’autres ligands de TIM-3 ont été décrits, dont la phosphatidylsérine et HMGB1 [199,
200]. L’interaction de TIM-3 avec HMGB1 atténue l’immunogénécité de l’ADN relargué par
les cellules tumorales nécrotiques. Par ailleurs, TIM-3 est fortement exprimé par les cellules
malignes de leucémie aiguë myéloïde et de cancer du poumon [201, 202]. Dans ce deuxième
cas, l’expression de TIM-3 est corrélée avec une agressivité accrue de la tumeur.
Le domaine IgV de la protéine TIM-3 murine a été cristallisé seul, et en complexe avec
la phosphatidylsérine (figure 11) [199, 203]. Ce domaine existe en tant que monomère en
solution. Il présente une structure en sandwich beta composé d’un feuillet beta avant (brins
A’, G, F, C, C’, C’’) et d’un feuillet beta arrière (brins B, E, D). Les brins B et F sont reliés par
un pont disulfure qui stabilise l’ensemble de la structure. Les boucles FG et CC’ forment une
fente qui n’est pas présente habituellement dans la structure canonique des domaines IgV.
La figure 12 présente différents modèles d’interaction envisageables impliquant TIM-3, la
galectine-9 et la phosphatidylsérine présente à la surface de cellules apoptotiques ou
d’exosomes.
33
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
b) Récepteurs alternatifs de la galectine-9
La plupart des fonctions connues de la galectine-9 dépendent de son interaction avec
TIM-3, cependant celle-ci est capable de se lier à d’autres glycoprotéines telles que le CD44 et
la « protein disulfide isomerase » (PDI) [204, 205]. Dans ces deux cas, elle altère les capacités
migratoires des cellules en bloquant leurs interactions avec la matrice extacellulaire, à savoir
liaison du CD44 avec l’acide hyaluronique et liaison de la PDI avec l’intégrine β3. D’autres
données suggèrent qu’elle peut interagir avec les antigènes de Forssman et de ThomsenFriedenreich, des glycolipides préférentiellement exprimés à la surface des cellules malignes
[171, 206]. Par ailleurs, plusieurs études ont mis en évidence des fonctions de la galectine-9
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
indépendantes de TIM-3, sans que le récepteur impliqué dans ces fonctions ne soit identifié
[175, 207, 208].
c) Voies de signalisation induites par la galectine-9
Les voies de signalisation mises en jeu par la galectine-9 sont encore mal connues. De
premiers éléments ont été apportés par l’étude de l’apoptose induite par la galectine-9 dans
les lignées cellulaires de lymphomes T, Jurkat et MOLT-4. Dans ces cellules, la galectine-9
induit l’apoptose d’une manière dépendante du temps d’incubation et de la concentration
[209]. L’apoptose induite est inhibée par le lactose et non le sucrose, suggérant la nécessité de
liaison de la galectine-9 avec des résidus β-galactosides. Dans la lignée MOLT-4, l’apoptose
peut être réduite par un inhibiteur de caspase-1, par un inhibiteur de la calpaïne, par 2-APB
(inhibiteur d’IP3), par BAPTA-AM (chélateur intracellulaire de Ca2+), et non par l’EGTA
(chélateur extracellulaire de Ca2+). Ces données suggèrent que la voie caspase-1/calpaïne et
les flux intracellulaires de calcium sont impliqués dans l’apoptose médiée par la galectine-9
des cellules de la lignée MOLT-4.
Le même groupe de recherche s’est intéressé par la suite plus précisément aux
mécanismes de signalisation mis en jeu dans la lignée Jurkat [174]. Dans ces cellules, la
galectine-9 induit une activation de la caspase-3 et le relargage de facteurs mitochondriaux
(Smac/DIABLO, Cytochrome c). Toutefois, les inhibiteurs de caspases y compris l’inhibiteur
34
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
de caspase-1 n’ont qu’un effet partiel sur l’exposition des phosphatidylsérines et la
fragmentation de l’ADN. Les auteurs observent le relargage du facteur AIF, capable
d’induire l’apoptose d’une manière indépendante des caspases, et suggèrent que la
galectine-9 induit la mort des cellules Jurkat par des mécanismes à la fois caspasedépendants et caspase-indépendants. Ils constatent également un relargage du calcium dans
les Jurkat, avec un effet réduit de BAPTA-AM et de l’inhibiteur de calpaïne par rapport aux
cellules MOLT-4. Le récepteur de la galectine-9 n’est pas identifié dans cette étude, mais les
auteurs écartent les molécules CD7, CD29 et CD45 grâce à l’utilisation de plusieurs sousclones de Jurkat.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Les voies de signalisation induites par la galectine-9 ont également été étudiées dans
les ostéoblastes humains [126, 210]. Dans ces cellules, la galectine-9 active la voie de
signalisation c-Src/ERK en regroupant les radeaux membranaires, ce qui induit la
prolifération et elle induit leur différenciation en recrutant le CD44 et en activant ainsi la voie
Smad. L’implication de la voie ERK dans la signalisation de la galectine-9 a également été
montrée dans les cellules dendritiques [211]. Elle induit la phosphorylation des kinases
« mitogen-activated protein » (MAP) p38 et « extracellular signal-regulated » (ERK1/2) ce qui
entraine la maturation de ces cellules.
La liaison de la galectine-9 au récepteur TIM-3 favorise la phosphorylation par ITK
du résidu Y265 situé sur la portion intracellulaire de TIM-3 [212]. Cette tyrosine est situé
dans un domaine très conservé de fixation au domaine d’homologie Src (SH2) et sa
phosphorylation pourrait permettre le recrutement de protéines contenant le domaine SH2.
Inversement, la liaison de la protéine Bat3 au domaine intracellulaire de TIM-3 protège les
lymphocytes Th1 de l’apoptose induite par la liaison de la galectine-9 [213].
35
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
4) Galectine-9 et système immunitaire
a) Galectine-9 et immunosuppression
La galectine-9 régule négativement les lymphocytes Th1 en induisant leur apoptose
par l’intermédiaire du récepteur TIM-3 [108, 173]. Elle induit également l’apoptose des
lymphocytes T CD8+, [176, 191, 214]. Un troisième aspect de l’immunosuppression médiée
par la galectine-9 est la régulation négative des lymphocytes pro-inflammatoires Th17,
démontrée principalement dans des modèles murins [175, 188, 215-217]. La galectine-9 inhibe
la production d’IL-17, réduit la population Th17 et limite leur différenciation. En outre, la
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
réponse Th17 est exacerbée chez les souris invalidées pour la galectine-9. L’effet inhibiteur
du développement des Th17 est indépendant de TIM-3, tandis que leur apoptose est
dépendante de TIM-3 [175].
Parallèlement à ces fonctions immunosuppressives directes exercées sur les Th1, Th17
et T CD8+, la galectine-9 favorise indirectement l’immunosuppression en régulant
positivement les lymphocytes Treg. Ce rôle a été principalement mis en évidence chez la
souris [175, 188, 218]. Dans ces modèles murins, la galectine-9 exogène favorise l’expansion
de Treg FoxP3+ à partir de lymphocytes T naïfs d’une manière dépendante de l’IL-2 et la
population de Treg est réduite dans les souris invalidées pour la galectine-9. Chez l’homme,
l’expansion des Treg médiée par la galectine-9 a été montrée dans le contexte de l’infection
par HCV, d’une manière dépendante du TGF-β [176]. Ce lien entre TGF-β et galectine-9 pour
l’induction des Treg a récemment été confirmé in vitro [219]. De plus, la galectine-9 est aussi
directement exprimée par les Treg et le blocage de TIM-3 réduit l’activité suppressive qu’ils
exercent sur des lymphocytes T CD4+ CD25- in vitro [220].
b) Galectine-9 et inflammation
La galectine-9 augmente la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les
monocytes humains [176, 187]. La production de TNF- α par ces cellules peut-être abolie en
grande partie par le blocage de TIM-3 [187]. Elle augmente également la sécrétion de
36
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
cytokines pro-inflammatoires par les lymphocytes Th1 et Th2, cependant dans une moindre
mesure et d’une manière indépendante de TIM-3 [207]. Sa surexpression intracellulaire
artificielle active la production de cytokines inflammatoires dans les monocytes [183].
Chez la souris, la galectine-9 induit la maturation des cellules dendritiques et
augmente leur production de TNF-α [187, 190]. Cette production est fortement réduite chez
les souris invalidées pour TIM-3 [187]. La galectine-9 favorise également la maturation des
cellules dendritiques chez l’homme [211].
Les cellules NK activées sont les lymphocytes qui expriment le plus fortement le
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
récepteur TIM-3 [189]. La galectine-9 augmente la production d’IFN-γ par les cellules de la
lignée NK92 et cette production est encore supérieure lorsque les cellules NK92 sont
génétiquement modifiées pour surexprimer TIM-3. Cet effet est également observé en cocultivant les cellules NK92 avec des cellules Raji génétiquement modifiées pour exprimer la
galectine-9. La neutralisation de TIM-3 limite la production d’IFN-γ.
c) Galectine-9 et auto-immunité
Dans les maladies auto-immunes, le système immunitaire réagit de façon aberrante
aux antigènes du soi et l’immunosuppression peut constituer une voie thérapeutique. Le
récepteur TIM-3 ayant été largement décrit comme régulateur négatif de la réponse immune
des Th1, plusieurs équipes se sont intéressées au statut de TIM-3 et au potentiel
thérapeutique de son ciblage dans ce type de maladies [192-194, 221]. TIM-3 est sous-exprimé
à la surface de lymphocytes T issus du liquide céphalo-rachidien de patients atteints de
sclérose en plaque, ce qui a pour effet de limiter son rôle de régulateur négatif de la réponse
immune [192, 221]. Un défaut d’expression de TIM-3 similaire a été rapporté dans l’hépatite
auto-immune et la polyarthrite rhumatoïde [193, 194]. Les lymphocytes T CD4+ issus de
patients atteints de ces maladies sous-expriment TIM-3 et sont plus résistants à l’apoptose
induite par la galectine-9. Cette sous-expression favorise ainsi la persistance des réponses
Th1 et Th17 et par conséquent la persistance de la maladie.
37
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Dans des modèles murins d’allergie, la galectine-9 réduit l’inflammation en limitant
les réponses Th1 et Th17 et en empechant l’interaction des leukocytes avec la matrice
extracellulaire
par
blocage
de
l’interaction
CD44/acide
hyaluronique
[204,
216].
Paradoxalement, elle contribuerait au développement de la pathologie en recrutant les
éosinophiles et en favorisant la réponse Th2 [222]. De plus, l’expression de la galectine-9 est
augmentée dans les cellules épithéliales intestinales de patients atteints d’allergie
alimentaire, et son blocage réduit la sévérité des symptomes allergiques dans un modèle
murin de cette pathologie [223].
Comme nous l’avons vu, la galectine-9 et son récepteur le plus étudié, TIM-3, sont
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
exprimés par un grand nombre de cellules effectrices du système immunitaire. La galectine-9
est principalement produite dans un contexte inflammatoire et renforce l’inflammation en
soutenant la réponse immunitaire innée, puis exerce un rétrocontrôle négatif sur les cellules
de l’immunité adaptative. La voie galectine-9/TIM-3 peut être altérée lors de dérèglements
du système immunitaire, comme dans les maladies auto-immunes et, comme nous allons le
voir maintenant, lors d’infections virales et de cancers associés à ces infections.
5). Rôle de la galectine-9 dans les infections virales et les cancers associés aux virus
a) Virus de l’immunodéficience humaine
Deux groupes de recherche se sont intéressés aux effets directs de la galectine-9 sur
les lymphocytes T CD4+ dans le contexte de l’infection par le VIH [205, 224]. Les auteurs de
la première étude montrent que la galectine-9 favorise la rétention des PDI à la surface
membranaires des lymphocytes Th2 [205]. Les PDI modifient la conformation des protéines
en ouvrant ou fermant les ponts disulfures et leur rétention favorise l’entrée du virus dans
les lymphocytes Th2. Cette rétention facilite également la migration des lymphocytes à
travers la matrice extracellulaire grâce à l’association des PDI avec l’intégrine β3 présente
dans la matrice extracellulaire.
38
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Paradoxalement, les auteurs de la seconde étude mettent en évidence un rôle
protecteur de la galectine-9 pour les lymphocytes T CD4+ lors de l’infection par le VIH [224].
L’interaction de la galectine-9 avec TIM-3 réduit l’expression membranaire de CCR5, CXCR4
et α4β7, corécepteurs nécessaires à l’entrée du virus. De plus, la galectine-9 augmente
l’expression de la protéine p21 dans les lymphocytes T CD4+ activés, ce qui réduit leur
susceptibilité à l’infection. Les auteurs suggèrent que les effets de la galectine-9 dépendent
du stade de l’infection et du type de cellule cible. Les variations de concentration de
galectine-9 dans le microenvironnement infectieux pourraient également être à l’origine des
effets antagonistes ainsi observés. Les auteurs détectent une concentration élevée de
galectine-9 plasmatique chez les patients infectés de manière chronique par le VIH,
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
cependant la source de galectine-9 n’est pas identifiée dans cette étude.
Lors de l’infection chronique par le VIH, le récepteur TIM-3 caractérise une
population de lymphocytes T CD8+ ne proliférant pas et ne produisant pas de cytokines en
réponse à une activation antigénique [195]. Le niveau d’expression de TIM-3 sur ces
lymphocytes est corrélé positivement avec la charge virale du VIH et inversement corrélée
avec la quantité de lymphocytes T CD4+. Le blocage de TIM-3 in vitro restaure partiellement
la prolifération et la capacité de sécrétion de cytokines des cellules T spécifiques du VIH,
ainsi que les capacités cytotoxiques des CTL spécifiques du VIH [225]. Les auteurs de ces
études ne démontrent pas que la galectine-9 joue un rôle dans l’établissement et/ou de
maintien du phénotype d’épuisement des lymphocytes T CD8+ dans le contexte de
l’infection chronique par le VIH.
b) Virus Herpès Simplex de type 1
Le rôle de la galectine-9 et de son interaction avec TIM-3 a été étudié dans un modèle
murin d’infection par le virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1). Dans les lésions oculaires
causées par HSV-1, près de la moitié des lymphocytes expriment le récepteur TIM-3. Le
blocage de TIM-3 par l’anticorps monoclonal antagoniste « 2E2 » augmente la sévérité des
lésions. Inversement, l’injection de galectine-9 recombinante chez les animaux réduit leur
sévérité. L’effet protecteur de la galectine-9 provient de sa capacité à réduire la population de
39
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
lymphocytes Th1 et donc à diminuer la production de cytokines pro-inflammatoires. Il
provient également de sa capacité à favoriser la conversion de lymphocytes T en
lymphocytes Treg et l’expansion de cette population [226].
Dans le même modèle murin, les effets d’un traitement combinant la galectine-9
recombinante en avec le MabT25 ont été analysés. Le MabT25 est un anticorps monoclonal
agoniste de TNFRSF25, membre de la superfamille des récepteurs pour le TNF. Il favorise
l’expansion des Treg. Le traitement simultané par la galectine-9 et le MabT25 limite
grandement la sévérité des lésions oculaires induites par le HSV-1 chez la souris, en
réduisant les dégats tissulaires provoqués par les lymphocytes T CD4+ pro-inflammatoires
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
[227]. Il est toutefois important de noter que la galectine-9 induit l’apoptose des lymphocytes
T CD8+ du ganglion trigeminal dans ce modèle murin. La perte de ces lymphocytes se
traduit par une plus grande fréquence et une plus grande amplitude de la réactivation virale.
Les effets de la galectine-9 dans ce modèle murin d’infection par HSV-1 ne sont donc pas
uniquement positifs [214].
c) Hepatites virales et hépatocarcinomes
Le taux de galectine-9 est élevé dans le sang des patients infectés de manière
chronique par le VHC et plus élevé encore chez les patients dont la maladie a évolué en
hépatocarcinome [176]. La galectine-9 est produite par les macrophages hépatiques, ou
cellules de Kupffer, ainsi que par les monocytes. Cette production est induite par l’IFN-γ. En
retour, la galectine-9 induit la production de cytokines pro-inflammatoires par les PBMC et
les monocytes hépatiques. Elle contribue également à limiter la réponse immunitaire en
favorisant l’expansion des Treg via le TGF-β et en induisant l’apoptose des lymphocytes T
cytotoxiques spécifiques du VHC. Les auteurs ne démontrent pas que l’interaction de la
galectine-9 avec le récepteur TIM-3 est directement responsable de cette apoptose.
L’infection chronique par le VHC est caractérisée par la présence d’une population de
lymphocytes T CD8+ au phénotype épuisé, avec une expression membranaire de récepteurs
inhibiteurs, incluant PD-1 et TIM-3 [196]. Le blocage de PD-1 ou de TIM-3 augmente la
40
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
prolifération des CTL in vitro. Par ailleurs, le blocage de TIM-3 a pour effet d’améliorer la
cytotoxicité des CTL envers des lignées cellulaires hépatiques exprimant des épitopes du
VHC. Le rôle de la galectine-9 dans l’entretien de ce phénotype n’est pas démontré dans cette
étude. TIM-3 est également exprimé par les Treg lors de l’infection chronique par le VHC
[228]. Son expression est corrélée avec l’expression du marqueur de prolifération Ki67 et son
blocage sensibilise les Treg à l’apoptose induite par l’activation du TCR.
Dans un modèle murin d’infection par le VHB, les lymphocytes hépatiques expriment
fortement TIM-3, particulièrement les lymphocytes T CD8+ [197]. Lorsque ceux-ci sont
invalidés pour TIM-3 par shRNA, ils produisent davantage d’ IFN-γ. Le rôle de TIM-3 lors
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
de l’infection chronique par le VHC a été confirmé chez l’homme [229]. L’activation
antigénique ne déclenche pas de prolifération ni de forte production de cytokines des
lymphocytes T CD8+ TIM-3+ des patients étudiés. Le blocage de TIM-3 restore de manière
significative la prolifération et la production de cytokines par ces lymphocytes lorsqu’ils sont
exposés à des peptides antigèniques issus du VHB. Le rôle de la galectine-9 n’est pas évoqué
dans ces deux études.
d) Virus d’Epstein-Barr et carcinome nasopharyngé
La galectine-9 est fortement exprimée par les lymphocytes B immortalisés par le virus
d’Epstein-Barr (EBV) et dans les cellules de carcinome nasopharyngé (NPC) infectées par
l’EBV [124]. La forme indifférenciée du NPC, de loin la plus fréquente, est constamment
associée à l’EBV et le génome du virus est présent dans le noyau des cellules malignes [230,
231]. La plupart des gènes d’EBV sont silencieux dans les cellules de NPC, cependant les
protéines virales LMP1, LMP2, EBNA1 et BARF1, ainsi que les ARN viraux EBERS sont
constamment exprimés et contribuent au phénotype malin [13]. La galectine-9 interagit avec
la protéine LMP1 dans les rafts membranaires et ces deux protéines sont retrouvées dans les
exosomes sécrétées par les cellules de NPC [94]. Comme nous l’avons vu, les exosomes
vecteurs de galectine-9 peuvent agir en tant qu’agoniste de TIM-3 et induire l’apoptose de
cellules Th1 [108].
41
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Les cellules tumorales de NPC expriment des antigènes viraux et leur machinerie de
présentation des antigènes est fonctionnelle, de plus les patients atteints de NPC sont
rarement immunodéficients et produisent une réponse immunitaire contre les protéines
d’EBV [232-235]. Pourtant, les lymphocytes T infiltrant les tumeurs ne parviennent pas à
éliminer les cellules malignes infectées par EBV. L’expression des facteurs « classiques »
d’immunosuppression (TGF-β, IL-10, FasL, B7-H1, iNOS) a été analysée dans le
microenvironnement tumoral des NPC sans résultat convaincant [236]. Il est donc possible
que la galectine-9 joue un rôle immunosuppressif essentiel dans ces tumeurs.
Les résultats décrits au cours de cette partie tendent à démontrer que la galectine-9
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
serait au cœur d’une nouvelle voie de régulation majeure du système immunitaire,
dépendante en grande partie du récepteur TIM-3. Le blocage de ces voies de régulation
constitue aujourd’hui un enjeu crucial en oncologie, comme l’atteste le succès clinique récent
de l’anticorps immunomodulateur ipilimumab.
III. Anticorps monoclonaux immunomodulateurs
1) Historique
A la fin du XIXème siècle, le médecin et microbiologiste Kitasato Shibasaburo décrivit
la présence d’un médiateur réagissant avec les toxines diphtériques et tétaniques dans le
sérum, et proposa la théorie de l’immunité humorale. Ces médiateurs seraient par la suite
baptisés Antikörper, ou anticorps, par l’immunologiste Paul Ehrlich. En 1975, Georges
Köhler et César Milstein publièrent une méthode d’obtention de lymphocytes B fusionnés à
des cellules de myélome, ou « hybridomes », sécrétant des anticorps à la spécificité
prédéfinie [237]. Pendant longtemps, il fut impossible de maintenir des lymphocytes B en
culture prolongée et cela reste techniquement difficile. La fusion des lymphocytes B avec les
cellules cancéreuses de myélome leur permet d’acquérir un potentiel de réplication illimité
dans des conditions de culture ordinaires. La mise au point des hybridomes valut à Köhler et
Milstein le prix Nobel de médecine en 1984. Cette découverte allait révolutionner le monde
42
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 13 : Principe de production des hybridomes. L’animal immunisé est sacrifié et ses
lymphocytes B sont fusionnées avec des cellules de myélome et incubées dans du milieu de
sélection HAT. Les cellules de myélomes et les lymphocytes B non fusionnés vont être
rapidement éliminées. Les hybridomes possèdent les caractéristiques des lymphocytes B
(production d’anticorps) et des cellules cancéreuses (potentiel de réplication illimité). Un
screening est effectué pour sélectionner les clones sécrétant l’anticorps d’intérêt, puis les
clones sélectionnés sont sous-clonés juqu’à l’obtention d’hybridomes monoclonaux,
sécrétant des anticorps monoclonaux.
A
B
Figure 14 : Structure des anticorps. (Adapté de Strand et al, 2007 ; bioatla.com). (A) Les
anticorps se composés de deux chaînes légères et deux chaîns lourdes reliées entre par des
ponts disulfures. Les régions variables octroient aux anticorps leur spécificité via les
régions déterminantes de complémentarités (CDR), tandis que la région constante connecte
l’anticorps aux cellules actrices du système immunitaire. (B) Répartition des domaines
murins (en bleu) et des domaines humains (en rouge) dans les cinq types d’anticorps
monoclonaux les plus courant. Des suffixes spécifiques sont attribués aux anticorps selon
leur origine et leur fonction d’après la nomenclature définie par l’Organisation Mondiale
de la Santé (voir Table 1 ci-dessous).
des anticorps et contribuer d’une façon majeure au développement des thérapies ciblées en
médecine.
2) Aspects techniques de la production d’hybridome
L’animal immunisé est sacrifié et ses cellules productrices d’anticorps sont mises en
présence de cellules de myélome, par exemple la lignée Sp2/0 dérivée du myélome MOPC21
(Figure 13). La fusion des membranes plasmique s’effectue avec du polyéthylène glycol
[238]. Les cellules de myélome utilisées sont défectives pour une enzyme essentielle à leur
survie, généralement l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transférase (HGPRT). Les
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
cellules eukaryotes synthétisent les nucléotides à partir de sucres et d’acides aminés (voie de
synthèse de novo) ou à partir de nucléosides (voie alterne). L’HGPRT est essentielle pour la
synthèse de nucléotides à partir de nucléosides. Une fois la fusion effectuée, les cellules sont
incubées dans un milieu spécifique appelé HAT. Ce milieu contient de l’aminoptérine,
inhibiteur de la voie de néosynthèse des nucléotides, unique voie de synthèse fonctionnelle
pour les cellules de myélome HGPRT-. Les cellules non fusionnées vont rapidement péricliter
dans le milieu HAT. Ce milieu contient en outre d’une part de l’hypoxanthine, qui satisfait
un besoin transitoire en purines avant que la fusion cellulaire ne soit stabilisée et pleinement
efficace, et d’autre part de la thymidine car l’aminoptérine bloque l’action de la thymidylate
synthétase. Les hybridomes sélectionnés sont ensuite cultivés dans du milieu HT dépourvu
d’aminoptérine, puis dans du milieu classique et pourront alors être clonés puis sous-clonés
pour obtenir des hybridomes monoclonaux [239].
3) Structure et ingénierie des anticorps
Les anticorps, ou immunoglobulines, sont des protéines de haut poids moléculaire
(150 kDa environ) constitués de deux chaînes lourdes identiques et de deux chaines légères
identiques (Figure 14). Il existe cinq types de chaines lourdes chez les mammifères : α, δ, ε, γ,
et µ, définissant respectivement les classes d’anticorps IgA, IgD, IgE, IgG et IgM impliqués
dans des processus fonctionnels distincts [240]. De la même manière, il existe deux types de
chaines légères chez les mammifères : κ et λ.
43
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Les immunoglobulines possèdent deux domaines variables de liaison des antigènes
identiques appelés « Fab », et un fragment constant « Fc ». Les Fab octroient aux anticorps
leur spécificité via les régions déterminantes de complémentarités (CDR) à haute variabilité,
tandis que le Fc connecte l’anticorps aux cellules actrices du système immunitaire par
l’intermédiaire des récepteurs Fc présents à la surface des cellules NK, des cellules
dendritiques, des monocytes, des neutrophiles et des éosinophiles [241].
Si la découverte des hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux fut à l’origine
d’avancées rapides dans les domaines de la recherche fondamentale et du diagnostic,
l’origine murine de ces anticorps posa d’importants problèmes pour leur utilisation en
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
thérapeutique. En effet, l’utilisation régulière d’anticorps de souris chez l’humain provoque
presque systématiquement l’apparition d’anticorps humains anti-souris. Cette réaction
immunitaire réduit l’efficacité de l’anticorps murin thérapeutique et peut être à l’origine de
l’apparition d’effets secondaires indésirables du fait de la formation de complexes immuns.
La différence d’espèce implique également des différences de séquence des fragments
constants des anticorps, pouvant être à l’origine d’une affinité réduite des récepteurs Fc
humains pour les fragments Fc des anticorps non-humains. Cette diminution d’affinité peut
avoir pour conséquence une réduction de leurs capacités effectrices pouvant être pourtant
essentielles à leur action thérapeutique, telle que la cytotoxicité dépendante des anticorps
[242].
Les progrès considérables de la biologie moléculaire réalisés dans les années 1980
apportèrent des solutions à ces problèmes en rendant accessible l’ingénierie des anticorps. Il
est maintenant possible de concevoir des anticorps monoclonaux chimériques, humanisés ou
même humains (Figure 14) [243-245]. Les anticorps chimériques sont constitués des
domaines variables des chaines lourdes et légères de l’anticorps d’intérêt, greffés sur une
région humaine constante dite « charpente » (exemple : rituximab). Les anticorps humanisés
sont des anticorps chimériques où seules les régions CDR hypervariables de l’anticorps
d’intérêt ont été greffées sur la « charpente », éliminant ainsi la quasi-totalité de la séquence
non humaine (exemple : bevacizumab). Les anticorps humains sont obtenus à partir de
banques de phages exprimant des régions variables humaines, ou bien par immunisation de
44
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Table 2 : Nomemclature des anticorps monoclonaux. (Organisation Mondiale de la
santé, 2009). Le nom d’un anticorps monoclonal se compose d’un préfixe unique, d’une
syllabe indiquant sa fonction (table de gauche), d’une syllabe indiquant son origine (table
de droite) et du suffixe « mab ». En cas d’anticorps conjugué, le conjugat fait l’objet d’un
second mot séparé.
Table 3 : Anticorps monoclonaux actuellement approuvés en oncologie. (Galluzzi et al,
2012). Ces anticorps ont été approuvés en Europe par l’European Medicines Agency
et/ou aux Etats-Unis par la Food and Drug Administration. Abbréviations : C,
chimérique, H, humain, Hzed, humanisé, M, murin, M-R hybrid, hybride souris-rat.
souris transgéniques exprimant les chaines lourdes et légères humaines (exemple :
ipilimumab). Il existe une nomenclature internationale des anticorps monoclonaux établie
par l’Organisation Mondiale de la Santé dans les années 1990 prenant en compte leur origine
et leur fonction (Table 2).
L’ingénierie des anticorps a également rendu possible la production de variants
d’anticorps tels que les anticorps fragmentaires « single-chain variable fragment » (ScFv)
constitués uniquement des domaines variables, les anticorps bispécifiques (exemple :
catumaxomab, à la fois anti-CD3 et anti-EpCAM), les anticorps fusionnés à des toxines ou
des enzymes, et les anticorps couplés à des ligands radioactifs ou des cytokines [246-248]
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
(Figure 15).
4) Anticorps monoclonaux et cancer
En 1986, l’anticorps monoclonal murin anti-CD3 muromonab (ou OKT3) fut le
premier anticorps à être autorisé par la Food and Drug Administration américaine (FDA)
pour une utilisation clinique, en tant que traitement du rejet de greffe lors de la
transplantation rénale. En oncologie, le premier anticorps autorisé fut le rituximab en 1997
pour le traitement des lymphomes non-hodgkinien réfractaires à la chimiothérapie.
Aujourd’hui, une trentaine d’anticorps monoclonaux sont utilisés en clinique, dont près de la
moitié en oncologie (Table 3).
Le rituximab est un anticorps chimérique souris/humain dirigé contre la molécule
CD20 présente à la surface des lymphocytes B sains et cancéreux. Il induit la mort des
cellules B essentiellement par cytotoxicité dépendante des anticorps (ADCC) et cytotoxicité
dépendante du complément (CDC) [249]. Il existe trois autres anticorps anti-CD20 autorisés
en oncologie : l’ofatumumab, anti-CD20 humain plus efficace que le rituximab pour induire
la cytotoxicité, l’ibritumomab et le tositumomab, tous deux couplés à des isotopes radioactifs
[250]. Deux autres anticorps autorisés en clinique ciblent des antigènes spécifiques des
lymphocytes : l’alemtuzumab (anti-CD52) et le brentuximab vidotin (anti-CD33 couplé au
monométhyl auristatine E, un agent anti-mitotique).
45
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 15 : Amélioration de l’efficacité des anticorps par ingénierie. (Adapté de Carter,
2001). L’ingénierie des anticorps permet d’améliorer leur efficacité par de multiples
méthodes : amélioration des fonctions effectrices par modifications de la séquence ou de la
glycosylation, adressage de molécules cytotoxiques, armement direct par couplage à des
cytokines, toxines ou radionuclides, armement direct par anticorps bispécifiques ou
immunoliposomes.
Le trastuzumab cible le récepteur HER2, un membre de la famille du récepteur du
facteur de croissance épidermique (EGFR). HER2 est surexprimé dans 30% des cancers du
sein ainsi que dans d’autres tumeurs épithéliales, notamment celles des ovaires, de la
prostate, des poumons et de l’appareil digestif [251, 252]. Le trastuzumab inhibe les
mécanismes de signalisation du récepteur HER2 en empêchant son homodimérisation ou son
hétérodimérisation et en empêchant le clivage de son domaine extracellulaire [253]. Il
favorise également l’élimination des cellules tumorales par le système immunitaire en
activant l’ADCC. Un second anticorps anti-HER2, le pertuzumab, a été autorisé en Juin 2012
par la FDA.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Le cetuximab se lie au récepteur EGFR (ou HER1) et empêche son hétérodimérisation
ainsi que la fixation de ses ligands [254, 255]. L’EGFR est surexprimé dans de nombreux
cancers incluant les cancers du colon, de la tête et du coup, des ovaires et des poumons [256].
L’inhibition des mécanismes de signalisation du récepteur EGFR induite par le cetuximab
provoque fréquemment l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des cellules tumorales [254,
255]. Le panitumumab est un anticorps humain anti-EGFR également autorisé en utilisation
clinique et ayant le même mode d’action que le cetuximab [257].
Trois anticorps actuellement utilisés en oncologie agissent directement sur le
microenvironnement tumoral : le bevacizumab, le catumaxomab et l’ipilimumab [258-260].
Le bevacizumab fut le premier inhibiteur d’angiogénèse autorisé en clinique. Il se lie au
Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) circulant et l’empêche de se lier à son
récepteur [258]. Le catumaxomab est un anticorps bispécifique anti-CD3 et anti-EpCAM qui
recrute les lymphocytes T CD3+ au voisinage des cellules tumorales EpCAM+ et favorise de
cette manière la réponse anti-tumorale des CTLs [259].
46
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
5) Anticorps monoclonaux immunomodulateurs
L’ipilimumab est un anticorps immunomodulateur autorisé en 2011 par la FDA et
l’EMA. Cet anticorps brise la tolérance périphérique des lymphocytes T en antagonisant le
récepteur inhibiteur CTLA-4 présent à leur surface, et rétablit ainsi la réponse anti-tumorale
des CTLs. L’autorisation de cet anticorps pour une utilisation clinique révolutionna le
traitement des mélanomes métastatiques, domaine qui n’avait connu aucune évolution
depuis plus d’un demi-siècle et prouva la validité du concept de l’immunomodulation en
médecine oncologique [260].
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
L’étude
du
potentiel
thérapeutique
en
oncologie
de
nouveaux
anticorps
immunomodulateurs est actuellement en cours [261]. Parmi ces nouveaux anticorps, on peut
citer le dacetuzumab, le GC-1008 et le CT-011. Le dacetuzumab est un agoniste du CD40.
L’activation du CD40 augmente la présentation des antigènes par les APC, favorise
l’activation des cellules T et possède un effet cytotoxique direct sur les cellules tumorales
exprimant ce récepteur. Des résultats encourageant ont été obtenu avec le dacetuzumab lors
d’un essai de phase I pour le traitement de lymphomes non-hodgkiniens réfractaires [262]. Il
est actuellement en essai de phase II en combinaison avec une chimiothérapie pour le
traitement des lymphomes B diffus à grandes cellules [261]. Le GC-1008 cible le TGF-β et est
actuellement impliqué dans un essai de phase I pour le carcinome rénal métastatique et dans
un essai de phase II pour le mélanome [261]. Enfin, le CT-011, dirigé contre le récepteur
inhibiteur PD1, est impliqué dans sept essais de phase II [261].
Le développement de nouveaux anticorps immunomodulateurs modulant les voies
de régulation du système immunitaire récemment découvertes, telle que la voie
galectine-9/TIM-3, pourrait s’avérer être un enjeu majeur en oncologie. Aucun anticorps
monoclonal anti-galectine-9 neutralisant performant n’ayant été décrit à ce jour, la première
étape du développement consiste à produire de nouveaux anticorps anti-galectine-9 et à
caractériser leurs propriétés.
47
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
OBJECTIFS DE LA THESE
L’objectif général de ma thèse consiste à produire de nouveaux anticorps
monoclonaux dirigés contre la galectine-9 et à caractériser leur potentiel diagnostic et
thérapeutique.
Cet objectif général peut être décomposé en plusieurs objectifs spécifiques :
1) Production de nouveaux anticorps monoclonaux anti-galectine-9 par immunisation
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
de souris avec la partie C-terminale de la protéine.
2) Caractérisation de ces anticorps en ELISA, western blot et immunohistochimie.
3) Mise au point de tests fonctionnels in vitro des effets de la galectine-9.
4) Utilisation de ces tests pour déterminer le potentiel de neutralisation de la
galectine-9 des nouveaux anticorps.
48
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Article I
BMC INFECTIOUS AGENTS AND CANCER
« A novel monoclonal antibody for detection
of galectin-9 in tissue sections :
application to human tissues infected by oncogenic viruses »
49
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
RESUME DE L’ARTICLE I
Afin de produire de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés contre la galectine-9,
nous avons immunisé plusieurs souris avec la partie C-terminale de la protéine (résidus 191
à 355 de l’isoforme longue). Nous avons obtenu un panel d’hybridomes en fusionnant les
lymphocytes de la souris ayant la plus forte réponse à l’immunisation avec des cellules de la
lignée Sp2/0. Sept anticorps monoclonaux ayant une forte réactivité avec la galectine-9 en
ELISA ont été sélectionnés pour une analyse plus poussée en western blot et
immunohistochimie.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Parmi ces anticorps, cinq réagissent avec l’épitope « TPAIPPMMYPHPA » communs
aux trois isoformes de la galectine-9 (résidus 210 à 222 de l’isoforme longue) et peuvent être
utilisés pour leur détection en western blot. En immunohistochimie, l’anticorps 1G3 permet
la détection de la galectine-9 sur coupes de tissus humains d’une manière très sensible et
spécifique. 1G3 réagit avec la galectine-9 murine mais aucune cross-réactivité n’a été
observée avec les autres membres de la famille des galectines.
En utilisant 1G3 en immunohistochimie, nous confirmons l’expression constante et
intense de la galectine-9 dans les cellules malignes de carcinome nasopharyngé, avec un
marquage à la fois cytoplasmique et nucléaire dans la plupart des échantillons. Elle n’est pas
détecté dans la muqueuse saine proche des foyers tumoraux. Nous confirmons également la
forte expression de la galectine-9 dans les cellules de Kupffer présentes dans les tissus
hépatiques infectés par le virus de l’hépatite C. Pour la première fois, nous mettons en
évidence une expression de la galectine-9 dans les leukocytes infiltrant les tissus hépatiques
infectés par le virus de l’hépatite B. De plus, nous observons une expression de la galectine-9
dans les hépatocytes infectés par ces deux virus, ce qui n’avait pas été démontré jusqu’à
présent.
Ces résultats ont été publiés en 2012 dans le journal BMC Infectious Agents and cancer.
50
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
RESEARCH ARTICLE
Open Access
A novel monoclonal antibody for detection of
galectin-9 in tissue sections: application to human
tissues infected by oncogenic viruses
Clément Barjon1,2, Toshiro Niki3, Benjamin Vérillaud1, Paule Opolon1, Pierre Bedossa4, Mitsuomi Hirashima3,
Stéphanie Blanchin5, Michel Wassef6, Hugo R Rosen7, Anne-Sophie Jimenez1, Ming Wei2 and Pierre Busson1*
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Abstract
Background: Galectin-9 is a mammalian lectin which possesses immunosuppressive properties. Excessive
production of galectin-9 has been reported in two types of human virus-associated diseases chronic hepatitis C and
nasopharyngeal carcinoma associated to the Epstein-Barr virus. The objective of this study was to produce new
monoclonal antibodies targeting galectin-9 in order to improve its detection in clinical samples, especially on tissue
sections analysed by immunohistochemistry.
Methods: Hybridomas were produced through immunization of mice with the recombinant c-terminus part of
galectin-9 (residues 191 to 355 of the long isoform) and semi-solid fusion of spleen cells with Sp2/0 cells.
Monoclonal antibodies were characterized using ELISA, epitope mapping, western blot and immunohistochemistry.
Results: We selected seven hybridomas producing antibodies reacting with our recombinant c-terminus galectin-9
in ELISA. Five of them reacted with the epitope “TPAIPPMMYPHPA” (common to all isoforms, residues 210 to 222 of
the long isoform) and stained all three isoforms of galectin-9 analysed by western blot. One of them, 1G3,
demonstrated very good sensitivity and specificity when used for immunohistochemistry. Using 1G3, we could
confirm the intense and constant expression of galectin-9 by Epstein-Barr virus positive malignant cells from
nasopharyngeal carcinomas. In most samples, specific staining was detected in both cytoplasm and nuclei. Galectin-9
was also detected in liver biopsies from patients infected by the human hepatitis C or B viruses with expression not
only in inflammatory leucocytes and Kupffer cells, but also in hepatocytes. In contrast, galectin-9 was virtually absent in
non-infected liver specimens.
Conclusion: The 1G3 monoclonal antibody will be a powerful tool to assess galectin-9 expression and distribution
especially in diseases related to oncogenic viruses.
Background
Galectin-9 is a β-galactoside binding lectin of mammalian origin which possesses two distinct carbohydrates
domains linked together by a peptide sequence of 14, 26
or 58 aminoacids depending on the isoform, respectively
S, M or L isoform. Galectin-9 holds multiple immunomodulatory properties and an overall predominantly immunosuppressive function. In the context of murine
immunity, galectin-9 has been shown to play a key role
in a regulatory feed-back essential for a physiological
* Correspondence: [email protected]
1
University Paris-Sud 11, CNRS-UMR 8126, Institut de Cancérologie Gustave
Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, 94805 Villejuif cedex, France
Full list of author information is available at the end of the article
termination of the Th1 immune response [1]. CD4+
Th1 lymphocytes produce interferon-gamma which
induces galectin-9 production by various cell types
including fibroblasts and endothelial cells. Conversely,
galectin-9 induces inhibition of CD4+ Th1 lymphocytes, at least in part through stimulation of the Tim-3
receptor. It also induces expansion of regulatory T-cells
in mice [2,3]. Recent studies performed in murine systems have provided novel insights about its immunosuppressive functions in the context of viral infections. In
mice infected by the herpes simplex virus 1 (HSV1),
galectin-9 induces apoptosis of CD4+ Th1 and CD8+
T-lymphocytes [4,5]. Interestingly these immunosuppressive effects have both adverse and beneficial effects
© 2012 Barjon et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative
Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and
reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
regarding the pathological consequences of HSV1 infection. Galectin-9 favors HSV1 reactivation in the trigeminal nerve whereas it limits the extent of corneal lesions
and neovascularisation in murine experimental herpetic
keratitis. Galectin-9 also decreases the intensity of
humoral and cellular immune response to RNA viruses
like the influenza A virus in another murine experimental system [6].
Although recent data obtained in mouse experimental
systems keep bringing new elements concerning the immunosuppressive and regulatory function of galectin-9,
the physiological and pathological role of galectin-9 in
humans remains poorly documented and controversial.
There is evidence that alterations of galectin-9 functions
could contribute to auto-immune diseases. For example,
the Tim-3 receptor on CD4+ Th1 clones from patients
with multiple sclerosis (MS) is defective in its response
to galectin-9 [7,8]. Similar results were reported for
patients with rheumatoid arthritis and recently autoimmune hepatitis [9,10]. Reciprocally, there is evidence
of excessive galectin-9 production in two human diseases associated with oncogenic viruses : nasopharyngeal
carcinomas (NPC) associated with the Epstein-Barr virus
(EBV) and chronic infection by the hepatitis C virus
(HCV) [11,12]. Indeed, recent works have shown the
presence of tumor exosomes carrying galectin-9 in the
blood of NPC patients. In vitro, NPC exosomes have a
direct deleterious effect on several human CD4+ T-cell
clones specific of EBV-antigens [11]. Using an ELISA
test, we have detected unusually high concentrations of
galectin-9 in the blood of patients with chronic hepatitis
C, especially those HCV-related hepatocellular carcinomas [12]. It seems that in this context, galectin-9 is
produced mainly by Kupffer cells. The same report
demonstrates that in vitro recombinant galectin-9
induces expansion of regulatory T cells and apoptosis of
HCV-specific cytotoxic T cells whereas it increases the
production of pro-inflammatory cytokines from mononuclear cells [12]. Thus, galectin-9 may be a key element
in regulating T cell response in the liver and thus in the
establishment of viral persistence.
Despite the growing number of studies being published
on galectin-9, no monoclonal antibody (mab) has yet been
recommended for immunohistochemistry. To our knowledge, in previous publications, immunohistochemistry of
galectin-9 was only based on polyclonal antibodies [13].
Therefore we have produced a collection of novel antigalectin-9 hybridomas and we have selected one of
them – the 1G3 clone - producing a mab highly efficient
for staining of tissue sections. Using this antibody, we
could observe strong staining of malignant epithelial cells
in NPC tissue sections. We could also observe galectin-9
staining of inflammatory leucocytes, Kupffer cells and
hepatocytes in liver biopsies from patients with chronic
Page 2 of 11
viral hepatitisC and B. This antibody is expected to become useful in a wide range of human diseases, especially
those related to oncogenic viruses.
Methods
Production of anti-galectin-9 monoclonal antibodies
The recombinant S and M isoforms of human galectin-9
and the M isoform of murine galectin-9 were produced
in E. coli as GST-fusion proteins. Tag-free proteins were
purified by affinity chromatography on a lactose-agarose
column [17]. The c-terminus galectin-9 (residues 191 to
355 of the galectin-9 long isoform) was produced in E.
coli as a GST-fusion protein. The tag-free protein was
purified by exclusion chromatography. Immunizations
were conducted at PX’Therapeutics (Grenoble, France).
Five BALB/c female mice (eight weeks old) were immunized with the recombinant c-terminus galectin-9.
Immunizations (40 μg of protein) were administered
intraperitoneally at days 0, 22, 37 and 54 with complete
Freund’s adjuvant for the first immunization, then with
incomplete Freund’s adjuvant for subsequent injections.
We performed enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) on mice serum to confirm response to galectin-9
immunization, using the same recombinant galectin-9
c-terminus part which was injected into mice. A rabbit
polyclonal serum raised against the same portion of
galectin-9 was used a positive control. The five immunized mice exhibited a specific and strong immune response against the c-terminus part of galectin-9. Three
days after the last boost, the two best responding mice
were sacrificed and their splenocytes were collected to use
in subsequent liquid or semi-solid fusion with Sp2/0 cells
at a ratio of 5:1 and 2:1 respectively. Hybridomas supernatants were assessed in galectin-9 ELISA. The semi-solid
fusion was successful and a large collection of monoclonal
hybridomas secreting anti-galectin-9 antibodies was
obtained.
Galectin-9 ELISA for assessment of mouse sera and
selection of hybridomas
Wells of microtiter plates (Greiner Bio-One, Courtaboeuf,
France) were coated with 0.05 M carbonate/bicarbonate
buffer (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France)
pH 9.6 containing 50 ng human c-terminus galectin-9
during 1 H at room temperature. After washing with phosphate buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20
(Euromedex, Souffelweyersheim, France), the wells were
saturated with 3% bovine serum albumine (BSA) (SigmaAldrich, St Quentin Fallavier, France) in PBS at room
temperature for 1 H. They were then incubated with
mouse sera or raw hybridoma supernatants in PBS with
1% BSA at room temperature for 2 H. After a washing step
with PBS with 0.1% Tween-20, the anti-galectin-9 antibody
level was determined using horseradish peroxidase-coupled
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
(HRP) goat antibodies to mouse IgG (Sigma-Aldrich, St
Quentin Fallavier, France) and 3,3’,5,5’ Tetramethylbenzidine (TMB) (Thermo Fisher Scientific, Brebieres, France)
as substrate. Microtiter plates were incubated 15 min in
the dark under shaking before stopping the reaction with
1 M H2SO4. Then, OD was read at 405 nm and 620 nm
using a MultiSkan Ex microplate reader (Thermo Fisher
Scientific). Experiments were performed in duplicates.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
ELISA for epitope mapping and oligopeptide competition
A panel of 27 oligopeptides representative of the 168
amino-acids from the c-terminus galectin-9 used for
mice immunisation was produced. Oligopeptides were
13 amino-acids long, with a 7 amino-acids overlap. For
epitope mapping, each peptide was coated in 96-well
plate using 100 ng/well during 16 hours at 4 °C. For
oligopeptide competition, full length galectin-9 (recombinant S isoform produced in E. Coli) was coated in the
same conditions. Wells were saturated in PBS + 0.1%
BSA at room temperature during 2 hours, then incubated with purified mouse monoclonal antibodies during
2 hours at room temperature. For oligopeptide competition, 1G3 was tested in parallel with the mab 9S2-3
which targets the n-terminus of galectin-9 [14]. The antibodies were pre-incubated during 2 H at room temperature
with control oligopeptide (“ITQTVIHTVQSAP”) or target
oligopeptide (“TPAIPPMMYPHPA”) using serial dilutions
ranging from 4 μg/ml to 2 ng/ml. Revelation of bound
monoclonal antibodies was performed using a peroxidaseconjugated secondary antibody as described in the previous
paragraph.
Capture of biotinylated galectins on surface-bound
antibodies
For this assay, we used the following recombinant galectins: the S and M isoforms of human galectin-9, the
murine M isoform of galectin-9 and human galectin-1,
-2, -3, -4, -8 (M isoform) and −10. Preparation of recombinant galectins and their biotinylation have been
already described in previous works [15-17]. 1G3 and
control mouse IgG1 antibody (MOPC21 clone) were
coated in 96-well plates overnight at 4 °C in assay buffer (PBS-Tween, 2% fetal calf serum (FCS), 0.05%
NaN3). Plates were blocked with 5% FCS overnight at
4 °C then washed five times with PBS-Tween. Biotinylated galectins (1 nM) were incubated during 1 H at
37 °C in antibody-coated wells; then plates were
washed five times with PBS-Tween. Revelation of captured biotynilated galectins was done by addition of
SA-HRP for 1 H at 37 °C. After washing, TMB substrate was added during 2.5 min at room temperature.
Reaction was stopped with 1 M phosphoric acid and
OD was read at 405 nm and 620 nm. Experiments
were performed in duplicates.
Page 3 of 11
Cell lines
BL2 and REMB1 cells were grown in RPMI 1640
medium (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented
with 10% FCS. BL2 is an EBV-negative B-cell line
derived from a Burkitt’s Lymphoma. REMB1 is a lymphoblastoid cell line (LCL) resulting from in vitro EBVtransformation of B lymphocytes from a normal donor.
HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with
10% FCS. C15 is an EBV-positive NPC xenograft which
was propagated by subcutaneous passages into nude
mice [11]. C666-1 cells which are EBV-positive NPC
cells were grown in vitro in RPMI 1640 medium supplemented with 25 mM HEPES and 7.5% FCS, in plastic
flasks coated with collagen I (Biocoat; Becton-Dickinson,
Franklin Lakes, NJ) [11].
Western blot
Cell pellets were solubilized in RIPA buffer (150 mM
NaCl, 25 mM Tris–HCl pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.5% sodium deoxycholate, 0.5% NP40, 0.1% SDS) supplemented with the complete protease inhibitor cocktail (Roche
Applied Science, Neuilly-sur-Seine, France) and sonicated on ice. Extracts were clarified by centrifugation for
15 minutes at 16 000 g at 4 °C. Protein concentration
was assayed by the Bradford method using BioRad protein assay (BioRad, Marnes-la-coquette, France). Cell
protein extracts were separated on 12% polyacrylamide
gels in standard conditions. Gels were blotted on PVDF
membranes (Immobilon-P; Millipore, Molsheim, France)
then blocked during one hour with TBS containing 3%
non-fat milk powder and 4% glycine. Membranes were
incubated overnight with mouse monoclonal antibodies
at the concentration of 2 μg/ml in blocking solution.
Specific protein bands were visualized using goat antimouse HRP–conjugated secondary antibodies and
revealed by chemiluminescence using Immobilon Western kit (Millipore, Molsheim, France).
Clinical specimens
Thirteen samples from head and neck carcinomas were
selected from a retrospective collection of biopsies collected for diagnosis purpose at Lariboisière hospital
(Paris, France). This set of biopsies included ten nasopharyngeal carcinomas and three carcinomas of the
oropharynx and oral cavity. Nine liver samples were
selected from a retrospective collection obtained following partial or complete hepatectomy at Beaujon
hospital (Paris, France). This set of surgical samples
included three specimens infected by HCV, three specimens infected by the hepatitis B virus (HBV) and
three specimens of uninfected patients having undergone partial hepatectomy for benign tumors. All these
samples were obtained and processed according to
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
guidelines of Lariboisière and Beaujon hospitals institutional review boards.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Immunohistochemistry
Biopsies from head and neck carcinomas and surgical
liver samples were initially fixed in paraformaldehyde 4%
and paraffin-embedded. Prior to galectin-9 staining, tissue sections were dewaxed with xylene and ethanol and
rehydrated. Antigens were unmasked using a pH 6.0 citrate solution at 98 °C during 30 min. After adequate
washing steps, sections were incubated 10 min with 3%
H2O2, washed again and saturated with blocking serum
(Biogenex, MM France, Francheville, France) for 1 hour.
Sections were then incubated with mouse monoclonal
antibodies diluted at 2 μg/ml in blocking serum for 1
hour at room temperature. Visualization was achieved
by exposing sections to a goat anti-mouse HRP 1:50
(Southern Biotech, Clinisciences, Nanterre, France) during 30 min at room temperature then adding DAB substrate. The slides were counterstained with Mayer’s
hematoxylin diluted at 1:2 during 1 min at room
temperature.
Results
Preparation and selection of hybridomas
Five mice were immunized with the recombinant cterminus portion of galectin-9 (residues 191 to 356 of
the long isoform). Their immune response was monitored by serum ELISA on recombinant c-terminus
galectin-9. As a positive control we used a previously
described rabbit polyclonal serum raised against the
same portion of galectin-9 [11]. Splenocytes were collected from the two best responding mice three days
after the last c-terminus galectin-9 injection. Two
fusions were performed, one with subsequent cloning in
classical conditions (liquid medium in microwell plates)
and the other in semi-solid medium. Only the fusion in
semi-solid medium was successful. A panel of thirtynine hybridomas from which culture supernatants were
positive in ELISA screening was obtained. Seven were
selected for their abundant secretion of immunoglobulins and high reactivity with the c-terminus galectin-9 in
ELISA (Figure 1A).
Determination of antibodies epitopes
Monoclonal antibodies produced by the seven selected
hybridomas were subjected to epitope mapping, using a
panel of oligopeptides (P1 to P27) representative of the
168 amino-acids from the c-terminus part of galectin-9.
Five monoclonal antibodies (1G3, 1E12, 2E6, 1F4 and
1D8) were found to recognize the same linear epitope,
with 1G3 consistently having the highest reactivity. The
amino-acid sequence of this preferred epitope is
“TPAIPPMMYPHPA” which corresponds to peptide P4
Page 4 of 11
and covers the end of the linker peptide and the beginning of galectin-9 c-terminus part (Figure 1B). This sequence exists in all three isoforms of galectin-9 (aa 166
to 178 in the S-isoform, aa 178 to 190 in the M-isoform,
aa 210 to 222 in the L-isoform) suggesting that those
antibodies can react with all galectin-9 isoforms. Epitopes of 2E12 and 2D12 antibodies couldn’t be determined in this experiment. Therefore these antibodies
may react with a conformational epitope. To confirm
1G3 specificity toward the P4 peptide, a competitive
ELISA was performed using serial dilution of a control
peptide and P4 peptide. 9S2-3 monoclonal antibody,
which targets the n-terminus part of galectin-9, was used
as control antibody [14]. As shown in Figure 1C, only
the peptide P4 was able to reduce 1G3 binding to
galectin-9 S isoform in a concentration-dependent
manner.
Performance in western blot
Protein extracts were prepared from various cell lines
with or without endogenous expression of galectin-9. In
addition, HeLa cells were short-term transfected with
expression plasmids coding for each galectin-9 isoform
(S, M or L). Protein extracts from each cell category
were analysed by western blot using our anti-galectin-9
monoclonal antibodies. All seven antibodies were able to
detect galectin-9 including 2E12 and 2D12 (data not
shown). However, the strongest specific signals were
consistently obtained using the 1G3 monoclonal antibody (Figure 2). All three isoforms were detected by
1G3 in HeLa cells transfected with the corresponding
plasmids. A low amount of the S- and M-isoforms were
detected in wild-type HeLa cells. All isoforms were
detected in protein extracts from both C15 and C666-1
NPC xenografts. REMB1 cells (LCL) expressed mainly
the M-isoform and a low amount of the L-isoform, while
no S-isoform could be detected in this experiment. No
galectin-9 was detected in BL2 cells (EBV-negative human
B-cells derived from an EBV-negative Burkitt’s lymphoma)
in agreement with one of our previous report [11].
Determination of 1G3 cross-reactivity
Galectin-9 is a member of a large family of proteins which
share some structural properties and conserved aminoacids. Therefore, it was important to verify that the 1G3
antibody did not cross-react with other members of the
galectin family. A capture assay was performed using 1G3
or control mouse IgG bound to ELISA plates to assess
their reactivity with biotynilated human galectin-1, -2, -3,
-4, -8 (M isoform) and galectin-10. The M isoform of
murine galectin-9 was also included in this experiment.
Recombinant human galectin-9 isoforms S and M were
used as positive controls. According to the data shown in
Figure 3, 1G3 captures the S and M isoforms of human
Page 5 of 11
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
Figure 1 Selection of anti-galectin 9 hybridomas and epitope mapping of the corresponding monoclonal antibodies. A) Seven
hybridomas were selected for their performance in ELISA against recombinant c-terminus galectin-9 (2E12, 1E12, 2E6, 1F4, 1G3, 1D8, 2D12). Their
crude supernatants gave about the same reactivity as the undiluted mouse serum sample taken prior to spleen collection (mouse polyclonal).
Other hybridomas such as 1H12 and 2F4 were set aside due to their lower reactivity with c-terminus galectin-9 in ELISA. B) Mapping of the 1G3
epitope (TPAIPPMMYPHPA) contained in the three natural isoforms of galectin-9. This epitope is close to the n-terminus extremity of the
recombinant c-terminus galectin-9 used for mouse immunization. C) Selective inhibition of 1G3 binding to the recombinant S-isoform of human
galectin-9 by the P4 oligopeptide (TPAIPPMMYPHPA). Plates were coated with human galectin-9 S. Subsequent binding of the mabs 1G3 and
9S2-3 were done after pre-incubation with the P4 peptide or a control peptide. The binding of 1G3 to the galectin-9 is selectively inhibited by
the P4 peptide at concentrations above 0.5 μg/ml. In constrast the binding of 9S2-3 is not affected.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
Figure 2 Western blot detection of galectin-9 isoforms using
the 1G3 monoclonal antibody. A low amount of S and M galectin-9
isoforms are present in wild-type HeLa cells. These isoforms are readily
detected following transfection with the appropriate expression
plasmids. The L-isoform is expressed at a lower abundance than the
two other forms. The three endogenous isoforms are detected in the
protein extracts from the C15 and C666-1 NPC xenografts. The EBVpositive B-cell line REMB1 expresses a high amount of the M-isoform
and a very low amount of L-isoform, however no S-isoform could be
detected. In contrast with REMB1 cells, the BL2 cells derived from an
EBV-negative B-cell lymphoma have no detectable galectin-9. The faint
background bands visible after long exposure do not match with any
galectin-9 isoform.
galectin-9 as well as the murine galectine-9. In contrast, it
does not cross-react with other human galectins.
Performance of 1G3 monoclonal antibody in
immunohistochemistry
The seven mabs were assessed on paraffin-embedded
cell pellets, using BL2 and REMB1 cells as negative and
positive references, respectively. Again the 1G3 antibody
Page 6 of 11
was the most efficient antibody with the best signal/
background ratio. It was selected for subsequent investigation of galectin-9 expression in various tissue specimens.
As shown on Figure 4 and Table 1, galectin-9 expression
was detected in malignant cells from all ten NPC specimens. It was consistently strong and homogeneous
through the malignant cell population. Cytoplasmic staining was constant, coexisting in all but one case with nuclear staining in at least a fraction of the cells. Weaker
scattered staining of stromal leucocytes was detected in
six of ten cases. Tissue sections from three specimens of
squamous cell carcinomas (SCC) of the oropharynx and
oral cavity were also stained with 1G3 (Figure 4 and
Table 1). In one of them, a tonsil SCC containing a strong
lymphoid infiltrate, substantial galectin-9 staining was
seen in malignant cells. In contrast, malignant cells were
completely negative in tissue sections from other SCCs.
For nine of these head and neck carcinoma specimens
(NPC and non-NPC), fragments of non-malignant epithelium could be observed. In two cases, the epithelium was of
the secretory type including one specimen with positive
staining in about one third of the epithelial cells. In the
seven other specimens, the epithelium was of the pluristratified Malpighian type with absence of galectin-9 staining in
all but one case.
Finally, the 1G3 monoclonal antibody was tested on
nine liver tissue samples infected by HCV or HBV or
uninfected (Figure 5 and Table 2). Galectin-9 was consistently detected in sections from infected but not from
uninfected liver specimens. At a low magnification (X10,
Figure 3 Demonstration of the specificity of 1G3 binding to galectin-9 by a capture ELISA assay. 1G3 and irrelevant mouse IgG were
adsorbed on an ELISA plate and then incubated with various types of biotynilated human galectins (hGAL 1,2,3,4,7,8 and hG9 and hG10) or the
M-isoform of murine galectin-mG9. Both human and murine galectin-9 are captured by 1G3 in contrast with other galectins which do not exhibit
significant binding to 1G3.
Page 7 of 11
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
Figure 4 Detection of galectin-9 in tissue sections from nasopharyngeal carcinomas and other head and neck carcinomas. Galectin-9 is
detected by immunohistochemistry using the 1G3 mab. A) Absence of galectin-9 staining on a section of a paraffin-embedded pellet of BL2 cells
(X200). B) Intense albeit heterogenous galectin-9 staining on a section of a paraffin-embedded pellet of REMB1 cells (X100). C) NPC tumor biopsy.
(Table 1, patient #2, undifferentiated non-keratinizing) (X100). Intense galectin-9 staining is seen in the nests of malignant cells which are clearly
separated from the abundant lymphoid stroma. In addition, a weaker staining is seen in a large number of stromal cells. D) NPC tumor biopsy
(Table 1, patient #10, undifferentiated non-keratinizing) (X100). Galectin-9 staining is only seen in spans of epithelial cells which are distinct from
the lymphoid stroma. E) NPC tumor biopsy (Table 1, patient #1, undifferentiated non-keratinizing) (X100). Malignant cells are intermingled with
infiltrating leucocytes. Galectin-9 is detected in both malignant and infiltrating cells. In contrast, it is completely undetectable in the nonmalignant epithelium. F) Oropharynx squamous cell carcinoma (Table 1, patient #13) (X100). Complete absence of galectin-9 staining in
malignant cells.
X50 or X100), galectin-9 was not visible in hepatocytes.
However it was visible in scattered polymorphic cells
suggestive of inflammatory leucocytes and Kupffer cells.
Restricted intense staining of cells with a morphology
typical of Kupffer cells was observed in one case (patient
#2) consistent with our previous report [12]. Scattered
positive cells were also seen in all three specimens
infected by HBV; it was not restricted to Kupffer cells
but was seen in cells of various morphology probably
various types of leucocytes. One additional, unexpected
finding was made at a high magnification (X400). Delicate, punctate staining was visible in a large proportion
of the hepatocytes in all six virus-infected liver samples.
This punctate staining was almost identical for specimens infected by HCV or HBV. However it was not visible in sections from non-infected liver samples.
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
Page 8 of 11
Table 1 Detection of galectin-9 in biopsies from head and neck carcinomas
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Patient
Origin
Gender/
Age
Tumor site/Histological Type
Clinical
stage
Galectin-9 staining
Malignant
cells
Stroma
cells
Adjacent mucosa
(epithelium type)
1
Tunisia
M/48
NPC/UNK*
T4N3bM1
++
+
- (malpighian)
2
Romania
F/34
NPC/UNK
T2bN0M0
++
+
- (malpighian)
3
Cameroon
M/62
NPC/UNK
T4N2M0
++
-
+ (secretory)
4
France
M/63
NPC/UNK
T4N0Mx
++
+
n/a
5
France
M/62
NPC/UNK
T3N2M0
++
+
n/a
6
Portugal
F/84
NPC/UNK
T4N2M0
++
+
n/a
7
Algeria
M/40
NPC/UNK
T4N2M0
++
-
+ (malpighian)
8
Turkey
M/57
NPC/UNK
T1N0M0
++
+
n/a
9
China
F/31
NPC/UNK
T4N0M0
++
-
- (malpighian)
10
France
M/48
NPC/UNK
T1N2M0
++
-
- (secretory)
11
France
M/62
Tonsil/Infiltrating SCC**
T2N1M0
+
+
- (malpighian)
12
France
F/82
Tongue/Differentiated SCC
T2N0M0
-
+
- (malpighian)
13
France
M/64
Pelvi-lingual furrow/Differentiated SCC
T2N1M0
-
+
- (malpighian)
* NPC/UNK : nasopharyngeal carcinoma/undifferentiated non-keratinizing, ** SCC : squamous cell carcinoma, ++ : intense and homogeneous galectin-9 staining,
+ : moderate or scattered galectin-9 staining, - : absence of galectin-9 staining, n/a : not applicable (no segment of non malignant mucosa observed in the tissue
section).
Discussion
Galectin-9 has complex immunomodulatory properties
with action on effector cells of both innate and adaptative immunity. It induces secretion of pro-Th1
(interferon-gamma) and inflammatory cytokines by
monocytes and NK-cells whereas it has an inhibitory effect on NK-cell cytotoxicity [18,19]. On the other hand it
is inhibitory for mature CD4+ Th1 cells whereas it favors
expansion of regulatory T-cells [1,12]. Overall galectin-9
appears to have pro-inflammatory and immunosuppressive functions. This is consistent with its role of
facilitation for various types of viral infections in murine
experimental systems [4,6]. Out of seven monoclonal
antibodies directed to the c-terminus of galectin-9, 1G3
was the best suited for immunohistochemistry. The epitope mapping and competition assay provide evidence
that its target epitope is included in the following aminoacid sequence TPAIPPMMYPHPA (residues 210 to 222
of the long isoform). The ELISA capture assay demonstrates that it cross-reacts with the murine galectin-9.
1G3 also reacts with murine galectin-9 analysed by western blotting (data not shown). This is not surprising because murine galectin-9 contains in its linker domain an
amino-acid sequence which is highly homologous to its
human target (residues 208 to 220 of murine galectin-9
long isoform, “TPGIPPVVYPTPA”). In contrast, 1G3
does not react with human galectin-1, 2, 3, 4, 8 and 10 in
the same assay.
Using 1G3 to analyse clinical specimens, we have confirmed that galectin-9 is abundant in two types of
human tissues infected by oncogenic viruses, nasopharyngeal carcinoma and liver chronically infected by HCV
or HBV. Galectin-9 was detected in malignant cells from
all nasopharyngeal carcinoma specimens. Sporadic staining was also seen in some tumor infiltrating leucocytes.
These finding are consistent with our initial report on
galectin-9 in NPC [20]. However, in contrast with this
initial report, galectin-9 was rarely detected in nonmalignant mucosa. This is probably due to the fact that
the polyclonal antibody used for this previous study was
causing more background staining than the purified 1G3
monoclonal antibody. Galectin-9 nuclear staining was
observed at least in a fraction of the cells in all but one
NPC case. Nuclear distribution of galectin-9 has been
recently reported in a completely different setting, precisely in microglia/macrophages of active lesions of MS
stained with a rabbit polyclonal anti-galectin-9 [13]. In
contrast, in chronic inactive MS lesions, galectin-9 was
entirely localized in the cytoplasm. To our knowledge, a
specific role for nuclear galectin-9 has not been yet
described. Keeping in mind the immunosuppressive
functions of galectin-9, it will be interesting to know
whether relative galectin-9 abundance will be predictive
of NPC tumor response to various therapeutic modalities especially adoptive immunotherapy [21,22].
Staining galectin-9 in liver specimens has resulted in
confirming results and some unexpected findings. First,
we have confirmed that galectin-9 is undetectable or at
very low abundance in non-infected liver parenchyma.
In contrast, it is detectable in HCV-infected liver tissue
Page 9 of 11
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
Figure 5 Detection of galectin-9 in liver tissue sections. A, B) Normal liver tissue next to an adenoma (Table 2, patient #8, X100 and X400
respectively). Complete absence of galectin-9 staining. C, D) HCV-related liver cirrhosis next to a carcinoma (Table 2, patient #2, X100 and X400
respectively). Prominent staining is visible in Kupffer cells which are characterized by a flat triangle shape and their close association with sinusoid
vessels. At high magnification, delicate, punctate staining is visible in a large number of hepatocytes (black arrows). E and F) HBV-related liver
cirrhosis next to a carcinoma. (Table 2, patient #5) Predominant staining in various types of leucocytes often with a round shape. At high
magnification, delicate punctate staining is visible in a large number of hepatocytes (black arrows).
sections. It is noteworthy that it is also detectable in liver
samples infected by HBV. In addition to Kupffer cells, it
seems to be often expressed by various types of inflammatory leucocytes. Surprisingly, it is also detected in a
large proportion of hepatocytes in all infected samples
under the form of small punctuations localized in the
cytoplasm and visible only at high magnification (X400).
This means that although the amount of galectin-9 per cell
is relatively low in hepatocytes, altogether these hepatocytes
probably represent a major source of galectin-9 for the
organisms of HCV- or HBV-infected individuals. These
observations raise a series of questions to be addressed in
future experiments. It will be interesting to know whether
the plasma concentration of galectin-9 is increased for
patients chronically infected by HBV as reported by us for
patients infected by HCV [12]. Another question will be to
determine to what extent the intensity of galectin-9 expression in chronically infected livers correlates with the severity of tissue lesions and the risk of hepatocarcinoma. One
may also wonder whether galectin-9 abundance in tissue
sections correlates with its concentration in peripheral
blood.
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
Page 10 of 11
Table 2 Detection of galectin-9 in liver specimens from infected (HCV, HBV) or non-infected patients
Patient
1
Gender/Age
Medical History
M/54
Viral diagnosis
Histological diagnosis
M/66
Hepatocytes
HCV cirrhosis with
transformed foci
-
++
Chronic HCV infection
Micronodular cirrhosis
associated to a carcinoma
+ + (aspect of Kupffer cells)
++
Alcoholism
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Leucocytes or
related cells
Chronic HCV infection
Alcoholism
2
Galectin-9 staining
3
M/61
Chronic HCV infection
Micronodular cirrhosis
with transformed foci
+
+
4
M/67
Chronic HBV infection
Macronodular cirrhosis
associated to a carcinoma
+
+
5
M/50
Chronic HBV infection
Hepatic fibrosis associated
to a carcinoma
++
++
6
M/30
Chronic HBV infection
Liver tissue with minimal lesions
next to a non-malignant nodule
(focal nodular hyperplasia)
+
++
7
F/32
No infection
Normal liver tissue next to a
non-malignant nodule
(focal nodular hyperplasia)
-
-
8
F/20
No infection
Normal liver tissue next
to an adenoma
-
-
9
F/28
No infection
Normal liver tissue next
to an adenoma
(with steatosis)
-
-
++ : homogeneous galectin-9 staining, + : mild or scattered galectin-9 staining, - : absence of galectin-9 staining.
Conclusion
We report the performances of 1G3 a novel mab useful to
assess not only the abundance and tissue distribution of
galectin-9, but also its cytoplasmic and nuclear distribution. Future aims will be to investigate whether galectin-9
abundance in tissue sections is predictive of responses to
various tumor modalities, especially adoptive immunotherapy. Regarding chronic hepatitis B and C, it will be
useful to detemine whether galectin-9 abundance correlates with disease severity and correlates with the risk of
hepatocarcinoma.
Abbreviations
BSA: Bovine serum albumine; EBV: Epstein-Barr virus; ELISA: Enzyme-linked
immunosorbent assay; FCS: Fetal calf serum; HBV: Hepatitis B virus;
HCV: Hepatitis C virus; HRP: Horseradish peroxydase; HSV1: Herpes simplex
virus 1; LCL: Lymphoblastoid cell line; mab: Monoclonal antibody;
MS: Multiple sclerosis; NPC: Nasopharyngeal carcinoma; PBS: Phosphate
buffered saline; SCC: Squamous cell carcinoma; Tim-3: T cell Ig and Mucin
domain 3; TMB: 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine.
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
Authors’ contributions
CB performed characterization of monoclonal antibodies by ELISA, western
blotting, epitope mapping and competitive ELISA. TN has provided the gal9-CT plasmid construct and the polyclonal gal-9-CT antibody and has
performed biotinylated galectins ELISA. SB has supervised the production of
hybridomas. BV and ASJ have provided tumor cell protein extracts. MWa, PBe
and BV have provided pathological samples for immunohistochemistry. PO
has supervised the procedures of immunohistochemistry. PO, CB and PBu
have analysed and interpreted stained tissue sections. MWe, HR and MH
were involved in the design of the study and preparation of the manuscript.
CB and PBu designed and coordinated the study, and drafted the
manuscript. All authors read and approved the final manuscript.
Acknowledgements
This work was supported by the Eureka grant Oligoclonics (E ! 3942).
Clément Barjon was supported by the « Association Nationale de la
Recherche et la Technologie » (ANRT) and the « Association pour la Recherche
contre le Cancer » (ARC).
Author details
1
University Paris-Sud 11, CNRS-UMR 8126, Institut de Cancérologie Gustave
Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, 94805 Villejuif cedex, France. 2Cellvax, Ecole
Nationale Vétérinaire d’Alfort, 7 avenue du Général de Gaulle, 94704
Maisons-Alfort cedex, France. 3Department of Immunology and
Immunopathology, Faculty of Medicine, Kagawa University, Kagawa
761-0793, Japan. 4Département de Pathologie, INSERM U773, Hôpital
Beaujon, Université Paris-Diderot, 92110 Clichy, France. 5Px’ Therapeutics,
38040 Grenoble cedex 9, France. 6Département de Pathologie, Hôpital
Lariboisière, Université Paris-Diderot, 75475 Paris cedex 10, France.
7
Department of Medicine, Division of Gastroenterology & Hepatology,
University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO, USA.
Received: 27 March 2012 Accepted: 29 June 2012
Published: 17 July 2012
References
1. Zhu C, Anderson AC, Schubart A, Xiong H, Imitola J, Khoury SJ, Zheng XX,
Strom TB, Kuchroo VK: The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T
helper type 1 immunity. Nat Immunol 2005, 6:1245–1252.
2. Oomizu S, Arikawa T, Niki T, Kadowaki T, Ueno M, Nishi N, Yamauchi A,
Hirashima M: Galectin-9 suppresses Th17 cell development in an IL-2dependent but Tim-3-independent manner. Clin Immunol 2012,
143:51–58.
3. Seki M, Oomizu S, Sakata KM, Sakata A, Arikawa T, Watanabe K, Ito K,
Takeshita K, Niki T, Saita N, et al: Galectin-9 suppresses the generation of
Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16
http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16
4.
5.
6.
7.
8.
9.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates
experimental autoimmune arthritis. Clin Immunol 2008, 127:78–88.
Reddy PB, Sehrawat S, Suryawanshi A, Rajasagi NK, Mulik S, Hirashima M,
Rouse BT: Influence of galectin-9/Tim-3 interaction on herpes simplex
virus-1 latency. J Immunol 2011, 187:5745–5755.
Sehrawat S, Suryawanshi A, Hirashima M, Rouse BT: Role of Tim-3/galectin9 inhibitory interaction in viral-induced immunopathology: shifting the
balance toward regulators. J Immunol 2009, 182:3191–3201.
Sharma S, Sundararajan A, Suryawanshi A, Kumar N, Veiga-Parga T, Kuchroo
VK, Thomas PG, Sangster MY, Rouse BT: T cell immunoglobulin and mucin
protein-3 (Tim-3)/Galectin-9 interaction regulates influenza A virusspecific humoral and CD8 T-cell responses. Proc Natl Acad Sci U S A 2011,
108:19001–19006.
Koguchi K, Anderson DE, Yang L, O'Connor KC, Kuchroo VK, Hafler DA:
Dysregulated T cell expression of TIM3 in multiple sclerosis. J Exp Med
2006, 203:1413–1418.
Yang L, Anderson DE, Kuchroo J, Hafler DA: Lack of TIM-3
immunoregulation in multiple sclerosis. J Immunol 2008, 180:4409–4414.
Lee J, Park EJ, Noh JW, Hwang JW, Bae EK, Ahn JK, Koh EM, Cha HS:
Underexpression of TIM-3 and Blunted Galectin-9-Induced Apoptosis of
CD4+ T Cells in Rheumatoid Arthritis. Inflammation 2011, 35(2):633–637.
Liberal R, Grant CR, Holder B, Ma Y, Mieli-Vergani G, Vergani D, Serena
Longhi M: The impaired immune regulation of autoimmune hepatitis is
linked to a defective Galectin-9/Tim-3 pathway. Hepatology 2012,
doi:10.1002/hep.25682 [Epub ahead of print].
Klibi J, Niki T, Riedel A, Pioche-Durieu C, Souquere S, Rubinstein E, Le
Moulec S, Guigay J, Hirashima M, Guemira F, et al: Blood diffusion and Th1suppressive effects of galectin-9-containing exosomes released by
Epstein-Barr virus-infected nasopharyngeal carcinoma cells. Blood 2009,
113:1957–1966.
Mengshol JA, Golden-Mason L, Arikawa T, Smith M, Niki T, McWilliams R,
Randall JA, McMahan R, Zimmerman MA, Rangachari M, et al: A crucial role
for Kupffer cell-derived galectin-9 in regulation of T cell immunity in
hepatitis C infection. PLoS One 2010, 5:e9504.
Stancic M, van Horssen J, Thijssen VL, Gabius HJ, van der Valk P, Hoekstra D,
Baron W: Increased expression of distinct galectins in multiple sclerosis
lesions. Neuropathol Appl Neurobiol 2011, 37:654–671.
Seki M, Sakata KM, Oomizu S, Arikawa T, Sakata A, Ueno M, Nobumoto A,
Niki T, Saita N, Ito K, et al: Beneficial effect of galectin 9 on rheumatoid
arthritis by induction of apoptosis of synovial fibroblasts. Arthritis Rheum
2007, 56:3968–3976.
Niki T, Tsutsui S, Hirose S, Aradono S, Sugimoto Y, Takeshita K, Nishi N,
Hirashima M: Galectin-9 is a high affinity IgE-binding lectin with antiallergic effect by blocking IgE-antigen complex formation. J Biol Chem
2009, 284:32344–32352.
Nishi N, Abe A, Iwaki J, Yoshida H, Itoh A, Shoji H, Kamitori S, Hirabayashi J,
Nakamura T: Functional and structural bases of a cysteine-less mutant as
a long-lasting substitute for galectin-1. Glycobiology 2008, 18:1065–1073.
Nishi N, Itoh A, Fujiyama A, Yoshida N, Araya S, Hirashima M, Shoji H,
Nakamura T: Development of highly stable galectins: truncation of the
linker peptide confers protease-resistance on tandem-repeat type
galectins. FEBS Lett 2005, 579:2058–2064.
Gleason MK, Lenvik TR, McCullar V, Felices M, O'Brien MS, Cooley SA,
Verneris MR, Cichocki F, Holman CJ, Panoskaltsis-Mortari A, et al: Tim-3 is
an inducible human natural killer cell receptor that enhances
interferon gamma production in response to galectin-9. Blood 2012,
119(13):3064–3072.
Ndhlovu LC, Lopez-Verges S, Barbour JD, Jones RB, Jha AR, Long BR,
Schoeffler EC, Fujita T, Nixon DF, Lanier LL: Tim-3 marks human natural
killer cell maturation and suppresses cell-mediated cytotoxicity. Blood
2012, 119(16):3734–3743.
Pioche-Durieu C, Keryer C, Souquere S, Bosq J, Faigle W, Loew D, Hirashima
M, Nishi N, Middeldorp J, Busson P: In nasopharyngeal carcinoma cells,
Epstein-Barr virus LMP1 interacts with galectin 9 in membrane raft
elements resistant to simvastatin. J Virol 2005, 79:13326–13337.
Page 11 of 11
21. Louis CU, Straathof K, Bollard CM, Ennamuri S, Gerken C, Lopez TT, Huls MH,
Sheehan A, Wu MF, Liu H, et al: Adoptive transfer of EBV-specific T cells
results in sustained clinical responses in patients with locoregional
nasopharyngeal carcinoma. J Immunother 2010, 33:983–990.
22. Smith C, Tsang J, Beagley L, Chua D, Lee V, Li V, Moss DJ, Coman
W, Chan KH, Nicholls J, et al: Effective treatment of metastatic
forms of epstein-barr virus-associated nasopharyngeal carcinoma
with a novel adenovirus-based adoptive immunotherapy. Cancer Res
2012, 72:1116–1125.
doi:10.1186/1750-9378-7-16
Cite this article as: Barjon et al.: A novel monoclonal antibody for
detection of galectin-9 in tissue sections: application to human tissues
infected by oncogenic viruses. Infectious Agents and Cancer 2012 7:16.
Submit your next manuscript to BioMed Central
and take full advantage of:
• Convenient online submission
• Thorough peer review
• No space constraints or color figure charges
• Immediate publication on acceptance
• Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar
• Research which is freely available for redistribution
Submit your manuscript at
www.biomedcentral.com/submit
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Article II
(EN PREPARATION)
« Monoclonal antibodies neutralizing human galectin-9 :
comparative assessment using various biological assays »
62
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
RESUME DE L’ARTICLE II
La galectine-9 est une lectine animale principalement exprimée dans un contexte
inflammatoire et possèdant des propriétés à la fois inflammatoires et immunosuppressives.
Elle induit la production de cytokines inflammatoires par les cellules du système
immunitaire inné tandis qu’elle induit l’apoptose des lymphocytes Th1 CD4+ et favorise
l’expansion des lymphocytes Treg. Les propriétés immunomodulatrices de la galectine-9
dépendent en grande partie de son interaction avec le récepteur TIM-3. Cependant, ces deux
molécules interagissent chacune avec d’autres protéines et dans plusieurs contextes la
responsabilité de l’interaction galectine-9/TIM-3 n’a pas été formellement démontrée. En
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
dehors de l’anticorps 9M1-3 utilisé pour la neutralisation de la galectine-9 dans un dispositif
expérimental très précis et difficile à reproduire, il n’existait pas d’anticorps neutralisant de
la galectine-9 performant.
C’est pourquoi nous avons entrepris l’analyse comparative de plusieurs anticorps
monoclonaux anti-galectine-9 dans des tests in vitro ayant pour cible deux lignées de
lymphomes T humains, Jurkat et MOLT-4. L’activité de neutralisation de deux anticorps que
nous avons produits, 1G3 et 2E12, est comparée à celle de 9M1-3 et d’un anticorps
commercial encore jamais utilisé pour des tests de neutralisation, l’ECA-42. L’anticorps 2E12
bloque la fixation de la galectine-9 au récepteur TIM-3 dans un test acellulaire, au contraire
d’1G3. Les anticorps 2E12 et ECA-42 neutralise complètement l’apoptose induite par la
galectine-9 sur cellules Jurkat et MOLT-4, tandis que 9M1-3 neutralise partiellement cette
activité. 1G3 ne possède pas d’activité neutralisante dans ce test. 2E12 neutralise également
l’augmentation de calcium cytosolique induite par la galectine-9 dans les cellules Jurkat.
L’utilisation d’anticorps bloquant anti-TIM-3 ne parvient pas à bloquer ces effets, ce qui
suggère que ceux-ci sont indépendant de TIM-3. Nous avons également caractérisé par
microscopie électronique les effets de la galectine-9 et de son bloquage par 2E12 sur les
cellules Jurkat.
Cet article est actuellement en préparation.
63
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Monoclonal antibodies neutralizing human galectin-9 : comparative
assessment using various biological assays
Clément Barjon1,5, Olivier Dellis2, Toshiro Niki3, Sylvie Souquère4, Gérard Pierron4, AnneSophie Pailhes-Jimenez1, Ming Wei5, Pierre Busson1
1
University Paris-Sud 11, CNRS-UMR 8126, Institut Gustave Roussy, 114 rue Edouard
Vaillant, 94805 Villejuif cedex, France.
2
University Paris-Sud 11, UMR-S Inserm, Batiment 440/443, rue des Adèles, 91405 Orsay,
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
France.
3
Department of Immunology and Immunopathology, Faculty of Medicine, Kagawa
University, Kagawa 761-0793, Japan.
4
CNRS UMR 8122, Institut Gustave Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, 94805 Villejuif cedex,
France.
5
Cellvax, Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, 7 avenue du Général de Gaulle, 94704
Maisons-Alfort cedex, France.
[email protected] ; [email protected] ; [email protected] ;
[email protected] ; [email protected] ; [email protected] ; [email protected] ; [email protected]
* Correspondence : [email protected]
ABSTRACT
Galectin-9 is a mammalian lectin which is mainly expressed in an inflammatory
context which possesses both pro-inflammatory and immunosuppressive properties. It
induces production of inflammatory cytokines by cells of the innate immune system whereas
it induces apoptosis of Th1 CD4+ cells and promotes expansion of T regulatory cells.
Immunomodulatory effects of galectin-9 are mostly dependent on its interaction with the
TIM-3 receptor. However, galectin-9 and TIM-3 both interact with other molecules and for
many cellular targets it is still unclear whether the effects of galectin-9 are dependent on
TIM-3 or another type of receptor. Published data on antibodies neutralizing galectin-9 has
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
remained scarce so far, although they could prove useful to investigate galectin-9/TIM-3
pathway involvement in those cellular targets. Therefore, we undertook to investigate the
neutralizing activity of several anti-galectin-9 mabs, including two recently developped
antibodies. We here report that the novel antibody “2E12” is able to block galectin-9/TIM-3
interaction as well as inhibit galectin-9-induced cytosolic calcium release and apoptosis,
which were both TIM-3 independent effects. On the basis of these observations, the 2E12
antibody is likely to become a powerful tool to study both TIM-3 dependent and TIM-3
independent functions of soluble galectin-9.
INTRODUCTION
Galectin-9 is a mammalian lectin with a selective affinity for the galactosyl residues of
glycoproteins and glycolipids. It has two non-homologous Carbohydrate Recognition
Domains (CRD) of about 130 amino acids each which are connected by a linker peptide. In
humans, galectin-9 exists in three isoforms, long (L), medium (M) and short (S) that differ
only in the length of the linker peptide (58, 26 and 14 amino-acids respectively). Galectin-9
may be localized in the cytosol, in the internal or/and plasma membranes and also in the
nucleus [1-3]. It can be secreted into the extracellular medium following pathways which are
not fully understood. It carries signaling functions both intracellular (in the manner of a
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
membrane receptor) and extracellular (in the manner of a cytokine) [4-6].
Outside an inflammatory context, galectin-9 is weakly expressed in most human
tissues. Its expression increases under the influence of pro-inflammatory cytokines such as
Interferon-γ (IFN-γ) and Interleukin-1 β (IL-1 β) [7, 8]. Cells producing galectin-9 belong to
diverse tissues and systems including the immune system (T cells, macrophages), as well as
endothelial cells, fibroblasts and epithelial cells from various organs [7, 9-13]. Galectin-9
generates both pro-inflammatory and immunosuppressive effects in the extracellular
environment [14, 15]. It induces the production of inflammatory cytokines by monocytes,
dendritic cells, NK cells and to a lesser extent T cells [15-17]. Its immunosuppressive action
results - among others - from its inhibitory effects on CD4 + Th1 and its stimulatory effects on
regulatory T-cells (Treg) [12, 14, 18]. The galectin-9/TIM-3 interaction is suspected to promote
the establishment of the exhausted phenotype of CD8+ T cells in several chronic viral
infections [19-22].
Galectin-9 is expressed at a high level in various types of human tumoral or
pretumoral conditions. We have demonstrated its consistent intense expression in
nasopharyngeal carcinomas (NPC) associated to the Esptein-Barr virus (EBV) [1, 5]. Later on,
we and others have demonstrated its production by Kupffer cells in HCV-associated
carcinomas
[12].
More
recently,
using
a
novel
mab
highly
performant
in
immunohistochemistry, we have shown that it is expressed not only by Kupffer cells but also
by the hepatocytes themselves in both HCV- and HBV-infected liver tissues [3]. Expression
of galectin-9 has also been reported in non virus-associated carcinomas such as melanoma
and breast carcinoma cells [23, 24].
Immunosuppressive and inflammatory effects of galectin-9 depend to a large extent
on the interaction of galectin-9 with the TIM-3 receptor at the surface of target T cells.
However, galectin-9 has other receptors than TIM-3, for example the membrane enzyme
Protein Disulfide Isomerase (PDI) involved in opening / closing protein disulfide bridges
[25]. It can also bind lipid-associated glycans, for exemple the Forssman and the Thomsen–
Friedenreich antigens which are glycolipids preferentially expressed on malignant cells [26,
27]. Conversely, the receptor TIM-3 has other ligands than galectin-9 especially
phosphatidyl-serine (a phospholipid present at the internal face of the plasma membrane
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
switching to the external face in case of apoptosis) and HMGB1 (a DNA-binding protein
released in the extracellular medium in the context of cell necrosis) [28, 29]. For many cellular
targets, including Treg, it is unclear whether the effects of galectin-9 are dependent on TIM-3
or another type of receptor [17].
Although it is now obvious that extracellular galectin-9 has major functions in cell
communications, especially in the immune system, published data on antibodies
neutralizing galectin-9 has remained scarce. In a previous publication, we have reported
neutralizing activity for a monoclonal antibody (mab) called 9M1-3 [30]. However, this
activity was observed in an assay based on very specific cell targets, namely EBV-specific
CD4 T cell clones expanded in the presence of recombinant EBV proteins. In addition, the
neutralizing activity of 9M1-3 had not been assessed comparatively to other galectin-9
specific antibodies. Therefore, we undertook to investigate the neutralizing activity of several
anti-galectin-9 mabs, including 9M1-3 as a positive control and two recently developped
antibodies, in several types of in vitro assays.
We here report that two mabs, including one of our novel antibodies, “2E12”, were
able to prevent galectin-9 binding to TIM-3 in a cell-free assay. Additionally, they were able
to inhibit galectin-9-induced cell death in two human T cell lines, as well as
galectin-9-induced cytosolic calcium release in Jurkat cells in the case of 2E12. Both effects
were not inhibited using TIM-3 blocking antibodies, suggesting that they were TIM-3
independent. On the basis of these observations, the 2E12 antibody is likely to become a
powerful tool to study both TIM-3 dependent and TIM-3 independent functions of soluble
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
galectin-9.
MATERIAL AND METHODS
Blocking of galectin-9/TIM-3 interaction
Soluble mouse TIM-3 (mTIM3-fc) was coated in 96-wells plates at 1 µg/ml.
Biotinylated galectin-9 was added (30 ng/ml) with or without anti-galectin-9 monoclonal
antibodies (range of 0.01 µg/ml to 10 µg/ml) : 9M1-3 from GalPharma (Kagawa, Japan) ;
ECA-42 from MBL (Nagoya, Japan) ; 1G3 and 2E12 which were developped in our
laboratory. Rabbit polyclonal anti-galectin-9 antibody (poly-9CT) and lactose (20 mM) were
used as positive control of galectin-9/TIM-3 interaction blocking. Irrelevant mouse and rabbit
immunoglobulins were used as negative control. Detection of biotinylated galectin-9 binding
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
to mTIM3-fc was performed using streptavidin coupled to horseradish-peroxydase. Assay
was carried out at room temperature, in duplicate.
Cell lines
Jurkat and MOLT-4 cells obtained from American Type Culture Collection
(Manassas, VA, USA) were grown in RPMI 1640 medium (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, USA)
supplemented with 10% foetal calf serum (FCS) at 37°C in a 5% CO2 humidified atmosphere.
For experiments carried out in serum free medium, Hybridoma-SFM also from Gibco was
used in place of RPMI 1640.
Flow cytometry analysis
For apoptosis assays, Jurkat cells (1 x 105 cells in a 96-wells plate) were treated with
recombinant human galectin-9 (short isoform) at 30 nM (1 µg/ml) during 6H in serum free
medium. MOLT-4 cells were treated in the same conditions during 24H in FCSsupplemented medium. Galectin-9 was preincubated with or without anti-galectin-9 (9M1-3,
ECA-42, 1G3 and 2E12) or anti-TIM-3 (2E2 from Biolegend (San Diego, USA) and 344823
from R&D systems (Minneapolis, USA) monoclonal antibodies (10 µg/ml) during 30 min at
37°C. Lactose (5 mM) and irrelevant mouse immunoglobulin were used as positive and
negative control of galectin-9 neutralisation, respectively. Treated cells were washed with
PBS supplemented with lactose then resuspended in Annexin V buffer. Annexin V-APC was
added to the solution then the mixture was incubated 15 min in the dark at room
temperature. Propidium iodide was added just before the analysis. Experiments shown are
representatives of at least three experiments.
For staining of surface membrane-bound galectin-9, Jurkat cells were incubated with
primary anti-galectin-9 antibodies (poly-9CT, 9M1-3, ECA-42, 1G3 and 2E12 ; 5 µg/ml) or
mouse irrelevant immunoglobulin for 1H at 4°C, then washed in ice-cold PBS and incubated
30 min at 4°C with donkey anti-rabbit antibody or goat anti-mouse antibody both coupled to
phycoerythrin (PE). Analysis were performed with C6 flow cytometer from Accuri.
Calcium mobilisation analysis
The intracellular Ca2+ concentration of Jurkat cells was recorded by a fluorimetric
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
ratio technique. The fluorescent indicator Indo-1 was loaded by incubating the cells at room
temperature with 4 µM Indo-1-AM (Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, USA). Cells were
resuspended in Hepes Buffer Saline (HBS) medium without CaCl2, then treated with
galectin-9 (30 nM or 60 nM) with or without preincubation with 2E12 anti-galectin-9
antibody (2E12, 5 µg/ml or 10 µg/ml) or anti-TIM-3 antibodies (2E2 and 344823, 10 µg/ml). To
determine the implication of Store-Operated Calcium Entry (SOCE) channels, cells were with
2-APB, an IP3 receptor inhibitor. Intracellular Ca2+ concentrations were calculated following
the method already described by Dellis and collaborators [31].
Electron microscopy analysis
Jurkat cells were treated with 60 nM galectin-9 (short isoform) during 3H with or
without preincubation with 2E12 antibody (10 µg/ml), lactose (5 mM) or irrelevant mouse
immunoglobulin. After treatment, cells were washed in PBS supplemented with lactose and
pellets were fixed with 1.6% glutaraldehyde (Taab Lab Equip Ttd, Reading, UK) for 1H at
4°C. For visualization of cells ultrastructure, fixed pellets were rinsed for 1H in ice-cold
phosphate buffer, post-fixed with 2% aqueous osmium tetroxide (Pelanne Instruments,
Toulouse, France) and dehydrated in increasing concentrations of ethanol prior to Epon
embedding. Ultrathin sections were cut with a Reichert Ultramicrotome III (Reichert, Depew,
NY) and counterstained with uranyl acetate and lead citrate before being observed with a
Tecnai Spirit transmission electron microscope (FEI, Hillsboro, OR, USA). For detection of
galectin-9
and
2E12
antibody,
cells
were
embedded
in
Lowicryl
K4M.
Their
immunolocalization were performed using 1G3 anti-galectin-9 antibody and/or a secondary
mouse antibody coupled to gold (BBInternational, UK).
RESULTS
Blocking of galectin-9/TIM-3 interaction with novel monoclonal anti-galectin-9 antibodies
The neutralizing potential of the anti-gal-9 antibodies was first assayed in a cell-free
assay. This test was based on the interaction of the biotinylated recombinant short isoform of
human galectin-9 with recombinant murine TIM-3 coated in 96-wells plates. Galectin-9
binding to TIM-3 was not blocked by the 1G3 antibody and only partially by 9M1. In
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
contrast, it was blocked almost completely by 2E12 (Figure 1). Poly-9CT and 2E12 blocking
were dose-dependent and could be observed with a concentration as low as 10 ng/ml.
Inhibition of galectin-9-induced cell death in T lymphocytes cell lines
The human leukemic T-cell lines Jurkat and MOLT-4 have already been described as
useful target cells to assess the pro-apoptotic activity of extracellular galectin-9 [32, 33].
However, in classical culture condition, they are only sensitive to very high concentrations of
galectin-9, which are not appropriate to assess the neutralizing power of antibodies.
Recently, it was shown that melanoma cells are more sensitive to apoptosis induced by
galectin-9 in serum free culture medium [34]. Authors of this study suggested that this loss
of sensitivity may be due to serum elements binding to galectin-9, or shielding galectin-9
receptors on cells. We hypothesized that using serum-free medium could also make
lymphoid target cells more sensitive to low concentrations of galectin-9. Indeed, we were
able to observe cell death in 30% of Jurkat cells treated for 6h with 60 nM galectin-9 (S) using
serum-free medium (data not shown). In the experiment shown in figure 2, a concentration
of 30 nM of galectin-9 was used to better underscore differences of neutralization between
antibodies. Cell death was assessed using Annexin-V/IP staining (Figure 2).
Preincubation of galectin-9 with 2E12 and ECA-42 completely abolished galectin-9induced cell death, while it was only inhibited at 50% by preincubation with 9M1-3 (Figure
2). ECA-42 is commercially available but its capacity to inhibit galectin-9 functions had not
been demonstrated. 1G3 did not inhibit galectin-9-induced cell death (data not shown).
Lactose inhibited galectin-9-induced cell death, providing a confirmation that interaction of
galectin-9 with carbohydrates residues is important for its pro-apoptotic function. TIM-3 is
expressed at the plasma membrane of Jurkat cells (data not shown). To determine if TIM-3 is
involved in galectin-9-induced cell death in this experiment, we preincubated Jurkat cells
with two different anti-TIM-3 antibodies, including the monoclonal antibody 2E2 which is
widely used to block TIM-3 interaction with its ligands [15]. Galectin-9-induced cell death
was not inhibited by TIM-3 antagonists, suggesting that binding of galectin-9 to TIM-3 is not
required to induce apoptosis in Jurkat cells.
The same experiment was performed using MOLT-4 cells, which appeared to be more
sensitive to galectin-9, thus normal RPMI medium supplemented with FCS could be used.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
However, galectin-9 induced death in a greater fraction of MOLT-4 cells when they were
incubated in serum-free medium (data not shown). As with Jurkat cells, galectin-9-induced
cell death was inhibited by lactose, ECA-42 and 2E12, slightly inhibited by 9M1-3, and not
inhibited by 1G3 and TIM-3 antagonists (Figure 3).
Jurkat cells express galectin-9 which can be detected at the surface of their plasma
membrane (Figure 4). Poly-9CT was used as positive control. Strong staining was observed
with ECA-42, very weak staining was observed with 2E12, and 9M1-3 did not stain Jurkat
cells. Interestingly, the ability of ECA-42, 9M1-3 and 2E12 antibodies to stain membranous
galectin-9 does not correlate with their neutralizing potential.
Inhibition of galectin-9-induced intracellular calcium release
Using the free calcium probe Indo-1, intracytosolic calcium release was assessed in
Jurkat cells treated by recombinant galectin-9. Experiments were performed in serum free
medium unlike previous studies [32, 33], which allowed us to use lower concentrations of
galectin-9. Maximum intracellular calcium release was reached with 60 nM galectin-9, and an
effect of galectin-9 could be observed with a dose as low as 6 nM (data not shown). Calcium
release was rapid, occuring within 30 seconds after galectin-9 addition (Figure 5). It was
inhibited by pre-treatment with 2-APB, an IP3 inhibitor. Preincubation of galectin-9 with
2E12 drastically reduced the intracytosolic calcium release in a dose-dependent manner.
TIM-3 antagonists had no effect on it (Figure 5).
Electron microscopy characterization of galectin-9/2E12 interactions
Jurkat cells were treated with galectin-9 with or without pre-incubation with 2E12,
then harvested for electron microscopy analysis (Figure 6). Untreated Jurkat cells (Figure 6A)
exhibited normal, round shape with large nuclei and small-sized cytoplasm. In contrast with
untreated cells, no isolated cells could be observed when treated with galectin-9 (Figure 6B
and 6C). All of them were clustered with their membranes jointed side by side by dense
junctional strings suggesting the presence of large quantities of protein in the intermembranous space (Figure 6B). Large vesicles were present in the cytoplasm of some cells.
Moreover, most cells exhibited long and very dense intracellular strings reminiscent of the
intermembrane material (Figure 6C). When using 2E12 to counteract galectin-9 effects, dense
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
junctional strings were no longer observed and cells were overall more isolated, resembling
untreated ones (Figure 6D). However, dense globular structures were observed at the surface
and inside the cells (Figure 6E and 6F). Cells treated with galectin-9 and lactose were
structuraly identical to untreated cells and did not exhibit such globular structures (data not
shown).
Considering these results, we wanted to determine if galectin-9 and 2E12 were
present in these dense linear or globular structures (Figure 7). Galectin-9 was localized using
1G3 antibody and a secondary antibody directed against mouse immunoglobulin and
coupled to gold [3]. 2E12 was localized using the same secondary antibody. High quantity of
galectin-9 was indeed present in dense junction between cells (Figure 7A and 7B) and in
intracellular dense strings (Figure 7C and 7D), as well as in globular structures when cells
were treated with both galectin-9 and 2E12 (Figure 7E and 7F). 2E12 antibody was also
present in cell membrane globular structures (Figure 7G) and intracellular globular
structures (Figure 7H).
DISCUSSION
Two monoclonal antibodies appear to have a high neutralizing power against
recombinant galectin-9 in various in vitro assays : ECA-42 and 2E12. In contrast with ECA-42,
2E12 does not react with galectin-9 at the cell surface. Both reagents will be useful for basic
and applied therapeutic research. Regarding basic research, these mabs will help elucidate
TIM-3-dependent and -independent functions of extracellular galectin-9. For applied
therapeutic research, they will be useful to evaluate the benefit of neutralising galectin-9 in
preclinical tumor or virus models.
First reports describing galectin-9 have been published in 1997 [35, 36]. A major
thrust have been given to the investigations about galectin-9 functions when it was identified
as one specific ligand of the Tim-3 receptor in 2005 [14]. Since this publication, a wide range
of TIM-3 functions have been unveiled in various types of immune effector cells, in vitro as
well as in vivo. As mentioned in the introduction, stimulation of TIM-3 induces the
production of inflammatory cytokines by monocytes, dendritic cells, NK cells and to a lesser
extent T cells whereas it has inhibitory effects on CD4 + Th1 cells and stimulatory effects on
Treg [12, 14-18]. In addition, antibody cross-linking of TIM-3 on NK cells suppress their
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
toxicity [37]. TIM-3 is also involved in the induction of the exhausted phenotype of CD8+ T
cells in various pathological conditions [19, 22]. In mice bearing syngenic tumors, systemic
administration of an antibody against murine TIM-3 increases T cell IFN-γ-mediated
immunity against tumors. This confirms the overall immunosuppressive function of TIM-3
at the systemic level [38]. One recently discovered immunosuppressive action of TIM-3
occurs at the level of tumor infiltrating dendritic cells : TIM-3 capture of HMGB1 inhibits the
efficacy of DNA vaccination and reduces the immunogenicity of nucleic acids released from
dying tumor cells [39]. Beyond the frontiers of the immune system, TIM-3 seems to have
important functions in tissue homeostasy and tumor development. It is consistently
expressed on acute myeloid leukemia stem cells [40]. It is expressed by lung carcinoma cells
and its high level of expression is indicative of a higher risk of bad outcome, suggesting a
function in tumor cell proliferation or survival [41].
Currently, it is difficult to appreciate the contribution of galectin-9 to these various
functions of TIM-3. Operationally, one can distinguish several types of galectin-9 interactions
with target cells. There are experimental settings where target cells are responsive to
galectin-9 in complete absence of TIM-3 expression. This has been formally proven for
murine Th1 and Th2 cells but - to our knowledge - not for any type of human cells [17].
There are situations where cells respond to galectin-9 through combined stimulation of
TIM-3 and probably other galectin-9 membrane receptors. This is probably the case for
various types of immune cells although it is difficult to demonstrate [17]. There are also
situations where galectin-9 probably competes with other TIM-3 ligands (HMGB1 and
phosphatidyl-serine) or at least modulate their action. TIM-3 includes an amino-terminal
immunoglobulin variable domain followed by a mucin domain, a transmembrane domain
and a cytoplasmic tail. Galectin-9 binds to TIM-3 through the amino-linked carbohydrates of
the mucin domain whereas HMGB1 and phosphatidyl serine bind to TIM-3 through a metal
ion-dependent ligand-binding site in the FG loop of the immunoglobulin variable domain
[28]. Therefore, both types of ligands are suspected to induce distinct signaling events.
Whether galectin-9 binding to TIM-3 can modulate intracellular signals triggered by HMGB1
or phosphatidyl-serine remains to be investigated. It is obvious that in all these situations,
antibodies neutralizing human galectin-9 will be of major help.
There are probably several mode of transport for extracellular galectin-9, including
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
association to exosomes [30]. One key issue in our future investigations will be to determine
whether or not 2E12 can neutralizes exosomes carrying galectin-9 as it does for recombinant
galectin-9. Exosomes produced by malignant cells can promote tumor progression and
counteract anti-tumor immune response and their removal could become a interesting new
therapeutic pathway [42]. Indeed, therapeutic devices designed for selective retention of
exosomes from patients blood are already being developped [43].
A novel therapeutic strategy against virus and tumors has recently emerged which
aims to neutralize the inhibiting factors of the immune response, in other words to break
tolerance towards viral or tumor antigens. The benefit of this new strategy has been
remarkably illustrated by the recent success of ipilumab for the treatment of metastatic
melanoma [44]. This humanized antibody does not act directly on tumor cells but protects T
cells from the suppressive effects of tumor cells and thus restores an effective antitumor
response. Ipilumab neutralizes the CTLA-4 system but there is a rationale to target other
systems inhibiting anti-tumor responses based on receptors such as PD1, LAG3 and TIM-3.
One of our next aim is to use our mab 2E12 in preclinical murine models to assess its ability
to antagonize the immunosuppressive effects of galectin-9 in vivo. If these experiments are
successful, they will provide a basis for the production of a humanized monoclonal antibody
against galectin-9 and its use in clinical trials.
BIBLIOGRAPHY
1.
2.
3.
4.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Pioche-Durieu C, Keryer C, Souquere S, Bosq J, Faigle W, Loew D, Hirashima M,
Nishi N, Middeldorp J, Busson P: In nasopharyngeal carcinoma cells, Epstein-Barr
virus LMP1 interacts with galectin 9 in membrane raft elements resistant to
simvastatin. J Virol 2005, 79:13326-13337.
Keryer-Bibens C, Pioche-Durieu C, Villemant C, Souquere S, Nishi N, Hirashima M,
Middeldorp J, Busson P: Exosomes released by EBV-infected nasopharyngeal
carcinoma cells convey the viral latent membrane protein 1 and the
immunomodulatory protein galectin 9. BMC Cancer 2006, 6:283.
Barjon C, Niki T, Verillaud B, Opolon P, Bedossa P, Hirashima M, Blanchin S,
Wassef M, Rosen HR, Jimenez AS, et al: A novel monoclonal antibody for
detection of galectin-9 in tissue sections: application to human tissues infected by
oncogenic viruses. Infect Agent Cancer 2012, 7:16.
Tanikawa R, Okada Y, Tanikawa T, Nakano K, Hirashima M, Yamauchi A,
Hosokawa R, Tanaka Y: Interaction of Galectin-9 with Lipid Rafts Induces
Osteoblast Proliferation Through the c-Src/ERK Signaling Pathway. J Bone
Miner Res 2007.
Klibi J, Niki T, Riedel A, Pioche-Durieu C, Souquere S, Rubinstein E, Moulec SL,
Guigay J, Hirashima M, Guemira F, et al: Blood diffusion and Th1-suppressive
effects of galectin-9-containing exosomes released by Epstein-Barr virus-infected
nasopharyngeal carcinoma cells. Blood 2009, 113:1957-1966.
Jayaraman P, Sada-Ovalle I, Beladi S, Anderson AC, Dardalhon V, Hotta C, Kuchroo
VK, Behar SM: Tim3 binding to galectin-9 stimulates antimicrobial immunity.
The Journal of experimental medicine 2010, 207:2343-2354.
Imaizumi T, Kumagai M, Sasaki N, Kurotaki H, Mori F, Seki M, Nishi N, Fujimoto
K, Tanji K, Shibata T, et al: Interferon-gamma stimulates the expression of
galectin-9 in cultured human endothelial cells. J Leukoc Biol 2002, 72:486-491.
Yoshida H, Imaizumi T, Kumagai M, Kimura K, Satoh C, Hanada N, Fujimoto K,
Nishi N, Tanji K, Matsumiya T, et al: Interleukin-1beta stimulates galectin-9
expression in human astrocytes. Neuroreport 2001, 12:3755-3758.
Matsumoto R, Matsumoto H, Seki M, Hata M, Asano Y, Kanegasaki S, Stevens RL,
Hirashima M: Human ecalectin, a variant of human galectin-9, is a novel
eosinophil chemoattractant produced by T lymphocytes. J Biol Chem 1998,
273:16976-16984.
Lipkowitz MS, Leal-Pinto E, Rappoport JZ, Najfeld V, Abramson RG: Functional
reconstitution, membrane targeting, genomic structure, and chromosomal
localization of a human urate transporter. J Clin Invest 2001, 107:1103-1115.
Spitzenberger F, Graessler J, Schroeder HE: Molecular and functional
characterization of galectin 9 mRNA isoforms in porcine and human cells and
tissues. Biochimie 2001, 83:851-862.
Mengshol JA, Golden-Mason L, Arikawa T, Smith M, Niki T, McWilliams R, Randall
JA, McMahan R, Zimmerman MA, Rangachari M, et al: A crucial role for Kupffer
cell-derived galectin-9 in regulation of T cell immunity in hepatitis C infection.
PLoS One 2010, 5:e9504.
Asakura H, Kashio Y, Nakamura K, Seki M, Dai S, Shirato Y, Abedin MJ, Yoshida
N, Nishi N, Imaizumi T, et al: Selective eosinophil adhesion to fibroblast via IFNgamma-induced galectin-9. J Immunol 2002, 169:5912-5918.
Zhu C, Anderson AC, Schubart A, Xiong H, Imitola J, Khoury SJ, Zheng XX, Strom
TB, Kuchroo VK: The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type
1 immunity. Nat Immunol 2005, 6:1245-1252.
15.
16.
17.
18.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
Anderson AC, Anderson DE, Bregoli L, Hastings WD, Kassam N, Lei C,
Chandwaskar R, Karman J, Su EW, Hirashima M, et al: Promotion of tissue
inflammation by the immune receptor Tim-3 expressed on innate immune cells.
Science 2007, 318:1141-1143.
Gleason MK, Lenvik TR, McCullar V, Felices M, O'Brien MS, Cooley SA, Verneris
MR, Cichocki F, Holman CJ, Panoskaltsis-Mortari A, et al: Tim-3 is an inducible
human natural killer cell receptor that enhances interferon gamma production in
response to galectin-9. Blood 2012.
Su EW, Bi S, Kane LP: Galectin-9 regulates T helper cell function independently
of Tim-3. Glycobiology 2011, 21:1258-1265.
Seki M, Oomizu S, Sakata KM, Sakata A, Arikawa T, Watanabe K, Ito K, Takeshita
K, Niki T, Saita N, et al: Galectin-9 suppresses the generation of Th17, promotes
the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune
arthritis. Clin Immunol 2008, 127:78-88.
Jones RB, Ndhlovu LC, Barbour JD, Sheth PM, Jha AR, Long BR, Wong JC,
Satkunarajah M, Schweneker M, Chapman JM, et al: Tim-3 expression defines a
novel population of dysfunctional T cells with highly elevated frequencies in
progressive HIV-1 infection. J Exp Med 2008, 205:2763-2779.
Jin HT, Anderson AC, Tan WG, West EE, Ha SJ, Araki K, Freeman GJ, Kuchroo VK,
Ahmed R: Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during
chronic viral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 2010, 107:14733-14738.
McMahan RH, Golden-Mason L, Nishimura MI, McMahon BJ, Kemper M, Allen
TM, Gretch DR, Rosen HR: Tim-3 expression on PD-1+ HCV-specific human
CTLs is associated with viral persistence, and its blockade restores hepatocytedirected in vitro cytotoxicity. J Clin Invest 2010, 120:4546-4557.
Nebbia G, Peppa D, Schurich A, Khanna P, Singh HD, Cheng Y, Rosenberg W,
Dusheiko G, Gilson R, Chinaleong J, et al: Upregulation of the tim-3/galectin-9
pathway of T cell exhaustion in chronic hepatitis B virus infection. PLoS One
2012, 7:e47648.
Kageshita T, Kashio Y, Yamauchi A, Seki M, Abedin MJ, Nishi N, Shoji H,
Nakamura T, Ono T, Hirashima M: Possible role of galectin-9 in cell aggregation
and apoptosis of human melanoma cell lines and its clinical significance. Int J
Cancer 2002, 99:809-816.
Irie A, Yamauchi A, Kontani K, Kihara M, Liu D, Shirato Y, Seki M, Nishi N,
Nakamura T, Yokomise H, Hirashima M: Galectin-9 as a prognostic factor with
antimetastatic potential in breast cancer. Clinical cancer research : an official
journal of the American Association for Cancer Research 2005, 11:2962-2968.
Bi S, Hong PW, Lee B, Baum LG: Galectin-9 binding to cell surface protein
disulfide isomerase regulates the redox environment to enhance T-cell migration
and HIV entry. Proc Natl Acad Sci U S A 2011, 108:10650-10655.
Nagae M, Nishi N, Murata T, Usui T, Nakamura T, Wakatsuki S, Kato R: Crystal
structure of the galectin-9 N-terminal carbohydrate recognition domain from
Mus musculus reveals the basic mechanism of carbohydrate recognition. The
Journal of biological chemistry 2006, 281:35884-35893.
Nagae M, Nishi N, Nakamura-Tsuruta S, Hirabayashi J, Wakatsuki S, Kato R:
Structural analysis of the human galectin-9 N-terminal carbohydrate recognition
domain reveals unexpected properties that differ from the mouse orthologue.
Journal of molecular biology 2008, 375:119-135.
28.
29.
30.
31.
32.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
Tang D, Lotze MT: Tumor immunity times out: TIM-3 and HMGB1. Nature
immunology 2012, 13:808-810.
DeKruyff RH, Bu X, Ballesteros A, Santiago C, Chim YL, Lee HH, Karisola P,
Pichavant M, Kaplan GG, Umetsu DT, et al: T cell/transmembrane, Ig, and mucin3 allelic variants differentially recognize phosphatidylserine and mediate
phagocytosis of apoptotic cells. Journal of immunology 2010, 184:1918-1930.
Klibi J, Niki T, Riedel A, Pioche-Durieu C, Souquere S, Rubinstein E, Le Moulec S,
Guigay J, Hirashima M, Guemira F, et al: Blood diffusion and Th1-suppressive
effects of galectin-9-containing exosomes released by Epstein-Barr virus-infected
nasopharyngeal carcinoma cells. Blood 2009, 113:1957-1966.
Dellis O, Mercier P, Chomienne C: The boron-oxygen core of borinate esters is
responsible for the store-operated calcium entry potentiation ability. BMC
Pharmacol 2011, 11:1.
Kashio Y, Nakamura K, Abedin MJ, Seki M, Nishi N, Yoshida N, Nakamura T,
Hirashima M: Galectin-9 induces apoptosis through the calcium-calpain-caspase-1
pathway. J Immunol 2003, 170:3631-3636.
Lu LH, Nakagawa R, Kashio Y, Ito A, Shoji H, Nishi N, Hirashima M, Yamauchi A,
Nakamura T: Characterization of galectin-9-induced death of Jurkat T cells. J
Biochem 2007, 141:157-172.
Wiersma VR, de Bruyn M, van Ginkel RJ, Sigar E, Hirashima M, Niki T, Nishi N,
Samplonius DF, Helfrich W, Bremer E: The glycan-binding protein galectin-9 has
direct apoptotic activity toward melanoma cells. J Invest Dermatol 2012,
132:2302-2305.
Tureci O, Schmitt H, Fadle N, Pfreundschuh M, Sahin U: Molecular definition of a
novel human galectin which is immunogenic in patients with Hodgkin's disease. J
Biol Chem 1997, 272:6416-6422.
Matsumoto R, Matsumoto H, Seki M, Hata M, Asano Y, Kanegasaki S, Stevens RL,
Hirashima M: Human ecalectin, a variant of human galectin-9, is a novel
eosinophil chemoattractant produced by T lymphocytes. The Journal of biological
chemistry 1998, 273:16976-16984.
Ndhlovu LC, Lopez-Verges S, Barbour JD, Jones RB, Jha AR, Long BR, Schoeffler
EC, Fujita T, Nixon DF, Lanier LL: Tim-3 marks human natural killer cell
maturation and suppresses cell-mediated cytotoxicity. Blood 2012.
Ngiow SF, von Scheidt B, Akiba H, Yagita H, Teng MW, Smyth MJ: Anti-TIM3
antibody promotes T cell IFN-gamma-mediated antitumor immunity and
suppresses established tumors. Cancer research 2011, 71:3540-3551.
Chiba S, Baghdadi M, Akiba H, Yoshiyama H, Kinoshita I, Dosaka-Akita H, Fujioka
Y, Ohba Y, Gorman JV, Colgan JD, et al: Tumor-infiltrating DCs suppress nucleic
acid-mediated innate immune responses through interactions between the
receptor TIM-3 and the alarmin HMGB1. Nature immunology 2012, 13:832-842.
Kikushige Y, Shima T, Takayanagi S, Urata S, Miyamoto T, Iwasaki H, Takenaka K,
Teshima T, Tanaka T, Inagaki Y, Akashi K: TIM-3 is a promising target to
selectively kill acute myeloid leukemia stem cells. Cell stem cell 2010, 7:708-717.
Zhuang X, Zhang X, Xia X, Zhang C, Liang X, Gao L, Ma C: Ectopic expression of
TIM-3 in lung cancers: a potential independent prognostic factor for patients
with NSCLC. American journal of clinical pathology 2012, 137:978-985.
Taylor DD, Gercel-Taylor C: Exosomes/microvesicles: mediators of cancerassociated immunosuppressive microenvironments. Semin Immunopathol 2011,
33:441-454.
43.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
44.
Marleau AM, Chen CS, Joyce JA, Tullis RH: Exosome removal as a therapeutic
adjuvant in cancer. J Transl Med 2012, 10:134.
Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, Weber RW, Sosman JA, Haanen JB, Gonzalez R,
Robert C, Schadendorf D, Hassel JC, et al: Improved survival with ipilimumab in
patients with metastatic melanoma. N Engl J Med 2010, 363:711-723.
140
mouse Ig
120
rabbit Ig
% of binding
100
poly-9CT
80
9M1-3
60
40
1G3
20
2E12
0
0,00
0,01
0,10
1,00
10,00
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Antibody concentration (µg/ml)
Figure 1 : Blocking of galectin-9/TIM-3 interaction. Murine soluble TIM-3 was immobilized in 96-wells plate and the
binding of biotinylated human galectin-9 was dectected using streptavidin-HRP. Binding of galectin-9 was almost completely
abolished by poly-9CT and 2E12 in a dose-dependent manner, whereas it was only partially reduced by 9M1-3 and not altered
by 1G3.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Annexin V-APC
PI
gal-9 + ECA-42
gal-9 + 2E12
Annexin V-APC
gal-9 + lactose
Annexin V-APC
gal-9 + 2E2 (anti-TIM-3)
PI
Annexin V-APC
PI
PI
gal-9 + 9M1-3
Annexin V-APC
PI
Annexin V-APC
gal-9 + control Ig
PI
gal-9
PI
PI
untreated
Annexin V-APC
Annexin V-APC
Figure 2 : Inhibition of galectin-9-induced cell death of Jurkat cells. Jurkat cells were treated during 6H with human
recombinant galectin-9 with or without pre-incubation with various galectin-9 inhibitors or control reagents. During treatment,
cells were incubated in serum-free medium. Cell death was inhibited with lactose, ECA-42 or 2E12 and only partially inhibited
with 9M1-3. TIM-3 antagonists had no effect on galectin-9-induced cell death.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Annexin V-APC
PI
gal-9 + ECA-42
gal-9 + 2E12
Annexin V-APC
gal-9 + lactose
Annexin V-APC
gal-9 + 2E2 (anti-TIM-3)
PI
Annexin V-APC
PI
PI
gal-9 + 9M1-3
Annexin V-APC
PI
Annexin V-APC
gal-9 + control Ig
PI
gal-9
PI
PI
untreated
Annexin V-APC
Annexin V-APC
Figure 3 : Inhibition of galectin-9-induced cell death of MOLT-4 cells. MOLT-4 cells were treated during 24Hwith human
recombinant galectin-9 with or without pre-incubation with various galectin-9 inhibitors or control reagents. Unlike Jurkat cells,
MOLT-4 cells were sensitive to galectin-9-induced cell death even in the presence of FCS. As with Jurkat cells, death was
inhibited with lactose, ECA-42 or 2E12 and only partially inhibited with 9M1-3. TIM-3 antagonists had no effect.
9M1-3
cell count
cell count
poly-9CT
PE
PE
cell count
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
2E12
cell count
ECA-42
PE
PE
Figure 4 : Detection of membrane-bound galectin-9 in Jurkat cells. Jurkat cells were stained with anti-galectin-9 primary
antibodies and revealed with secondary antibodies coupled to PE. Staining were observed with poly-9CT and ECA-42, but not
with 9M1-3. A weak staining could be observed with 2E12.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
Figure 5 : Inhibition of galectin-9-induced intracellular calcium release in Jurkat cells. Intracellular calcium
concentration was measured with Indo-1 probe. Galectin-9 induced high intracellular calcium increase within 30 seconds of
treatment, in a dose-dependent manner. This increase was strongly diminished by pre-incubating galectin-9 with 2E12
antibody, also in a dose-dependent manner.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
A
B
C
D
E
F
Figure 6 : Electron microscopy analysis of galectin-9 and galectin-9/2E12 interaction with Jurkat cells. Jurkat
cells were treated with galectin-9 with or without pre-incubation with 2E12. (A) Untreated Jurkat cells. (B, C)
Galectin-9 treated Jurkat cells. Cells are clustered and their membrane junctions are dense (panel B, frame). Long
dense strings are present in their cytoplasm alongside large vesicles (panel C, black arrow). (D, E, F) Jurkat cells
treated with galectin-9 pre-incubated with 2E12. Cells structure resemble that of untreated cells (panel D), with the
exception of dense globular structure which could be observed at cell membrane (panel E, black arrow) and inside
the cytoplasm (panel F, black arrow).
A
B
(cell 2)
(cell 1)
(cell 2)
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
(cell 1)
C
D
E
F
G
H
Figure 7 : Immunolocalization of galectin-9 and 2E12 in Jurkat cells. Cells were treated with galectin-9 with or
without pre-incubation with 2E12. Immunolocalizations of galectin-9 and 2E12 were performed with anti-galectin-9
1G3 antibody and/or a secondary antibody coupled to gold. (A) Ultrastructure of galectin-9-treated cells with dense
membrane junction and (B) galectin-9 immunolocalization. (C) Ultrastucture of galectin-9-treated cells showing
intracellular dense strings and (D) galectin-9 immunolocalization. (E,) Ultrastructure of galectin-9/2E12 treated cells
showing membrane-associated dense globular structure and (F) galectin-9 immunolocalization. (G,H)
Immunolocalization of 2E12 in galectin-9/2E12 treated cells.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
DISCUSSION
87
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
DISCUSSION
Au cours de ma thèse, j’ai développé et caractérisé de nouveaux anticorps
monoclonaux dirigés contre la galectine-9. L’un d’entre eux, l’anticorps 1G3, s’est révélé être
un outil performant pour l’étude de la distribution tissulaire de la galectine-9 dans différents
contextes d’infections virales et de cancers associés. A l’aide d’un second anticorps, 2E12,
nous sommes parvenus à neutraliser l’effet pro-apoptotique de la galectine-9 sur des lignées
humaines de lymphocytes T. Les résultats obtenus lors de ces expériences soulèvent de
nouvelles questions sur la biologie de galectine-9. Dans les lignes qui suivent, je me propose
d’exposer quelles sont ces problématiques et de discuter comment elles pourraient être
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
résolues.
1) Production et caractérisation des anticorps 1G3 et 2E12
En immunisant des souris avec l’extrémité C-terminale de la galectine-9, nous avons
produit une collection d’anticorps monoclonaux ayant une forte réactivité en ELISA pour
celle-ci. Plus particulièrement, l’anticorps 1G3 apparait comme un outil intéressant pour la
détection de la galectine-9 sur coupes de tissu. L’anticorps 2E12, quant à lui, neutralise l’effet
pro-apoptotique de la galectine-9 sur des cellules de lymphomes T humains.
Nous avons choisi d’immuniser les animaux avec l’extrémité C-terminale en
considérant l’expérience de nos collaborateurs japonais. Ils avaient déjà obtenu un anticorps
polyclonal de lapin capable de réagir avec la galectine-9 membranaire à la surface des
cellules en utilisant cette extrémité. De plus, l’anticorps 9M1-3, capable d’immunocapturer
les exosomes de galectine-9, est également dirigé contre un épitope situé dans la partie Cterminale de la galectine-9. Notre espoir initial était de développer un anticorps monoclonal
réagissant à la fois contre la galectine-9 présente à la membrane des cellules cellulaire et
contre la galectine-9 intégrée dans la membrane des exosomes. Nous avons donc testé les
sérums des souris immunisés puis les surnageants des clones obtenus sur cellules gal-9 +/- à
chaque étape de production des hybridomes. Bien que les anticorps sériques des souris
88
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
immunisées réagissaient avec la galectine-9 membranaire, nous ne sommes finalement pas
parvenus à identifier d’hybridomes sécrétant des anticorps ayant conservé cette propriété.
Nous avons souhaité déterminer les épitopes reconnus par nos anticorps en
effectuant une cartographie des épitopes. Cette expérience nous a permis de déterminer que
l’anticorps 1G3 reconnait un épitope linéaire (TPAIPPMMYPHPA) situé partiellement en Cterminal du domaine linker et en N-terminal du domaine CRD C-terminal de la galectine-9.
Nous avons confirmé ce résultat en utilisant le peptide dans une expérience d’ELISA de
compétition. Une analyse par « alanine-scanning » pourrait permettre de déterminer quels
sont les acides aminés cruciaux pour la reconnaissance du peptide par 1G3. Une telle analyse
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
consiste à remplacer successivement chacun des acides aminés du peptide par une alanine et
à tester ensuite l’altération de réactivité de l’anticorps. Nous avons également entrepris une
étude structurale du complexe 1G3/galectine-9 C-terminale en collaboration avec Enrico
Stura (CEA de Saclay), toutefois ces expériences n’ont pas abouti à l’heure actuelle. L’échec
de la cartographie des épitopes pour l’anticorps 2E12 laisse à penser que cet anticorps
pourrait reconnaître un épitope conformationnel, cependant nous n’avons pas réalisé
d’expériences complémentaires pour le prouver et cette question reste donc en suspens.
Il pourrait s’avérer intéressant de produire de nouveaux anticorps monoclonaux
dirigés cette fois-ci contre l’extrémité N-terminale de la galectine-9, ou bien contre des
peptides portant des acides aminés critiques pour la reconnaissance des oligosaccharides par
les domaines CRD de la protéine. Les arginines 65 (CRD N-terminal) et 221 (CRD Cterminal),
impliquées
respectivement
dans
la
reconnaissance
du
lactose
et
des
oligosaccharides sialylés, pourraient s’avérer intéressant à cibler [170].
2) Détection de la galectine-9 dans les tissus humains infectés par des virus oncogènes
La galectine-9 est une protéine immunomodulatrice aux propriétés complexes
agissant sur les cellules de l’imunité innée et de l’immunité adaptative. Sa surexpression a
été décrite dans le contexte du NPC ainsi que dans celui de l’infection par le VHC et des
hépatocarcinomes associés. En utilisant l’anticorps 1G3 dans des expériences
89
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
d’immunohistologie sur coupes de tissus de patients, nous avons précisé la distribution de la
galectine-9 dans ces deux contextes ainsi que dans celui de l’infection par le VHB. Dans le
NPC, elle est fortement exprimée par les cellules tumorales et on retrouve parfois son
expression dans les leucocytes infiltrants. Elle n’est pratiquement pas détectable dans la
muqueuse saine avoisinant la tumeur. L’anticorps 1G3 s’est révélé être un outil
d’immunohistochimie plus sensible et plus spécifique que l’anticorps polyclonal utilisé
auparavant par notre équipe pour l’étude du NPC [124].
Dans les tissus infectés par le VHC, nous avons confirmé la forte expression de la
galectine-9 par les cellules de Kupffer et nous avons mis évidence son expression dans les
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
hépatocytes, ce qui était inattendu. L’expression de la galectine-9 par les hépatocytes infectés
par le VHC a été confirmée dans une publication très récente [263]. Concernant les tissus
infectés par le VHB, la galectine-9 est fortement exprimée par les leucocytes infiltrant et
détectable dans les hépatocytes. Les hépatocytes pourraient représenter une source non
négligeable de galectine-9 dans ces deux pathologies. L’implication de la galectine-9 dans
l’infection par le VHB n’avait pas été mise en évidence jusqu’à présent et depuis la
publication de ces résultats, deux nouvelles études ont confirmé le lien entre galectine-9 et
l’infection par le VHB [264, 265].
Nous avons observé un marquage nucléaire de la galectine-9 dans une fraction des
cellules malignes de NPC dans neuf cas examinés sur dix. La quantité de cellules présentant
un marquage de ce type est variable d’un patient à l’autre. A notre connaissance, il n’existe
pas d’étude fonctionnelle de la galectine-9 nucléaire. Seule une étude récente s’est intéressée
à
la
distribution
intracellulaire
de
la
galectine-9
avec
comme
modèle
les
microglia/macrophages présents dans les lésions de sclérose en plaques [266]. Les auteurs
démontrent que la galectine-9 est exclusivement nucléaire dans les lésions actives alors
qu’elle est majoritairement cytoplasmique dans les lésions inactives. Ces données suggèrent
un rôle spécifique de la galectine-9 nucléaire, à l’image de la galectine-3 nucléaire qui
favorise l’apoptose de cellules issues d’une lignée de cancer de prostate [158]. L’étude de la
localisation intracellulaire de la galectine-9 selon le stade de la maladie ou selon la réponse
de la tumeur à différents traitements pourrait apporter un éclairage sur cet aspect. Plus
90
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
généralement, il serait intéressant de vérifier s’il existe une corrélation entre la quantité de
galectine-9 détectée dans les tissus infectés et l’amplitude de la réponse aux traitements,
notamment la réponse aux immunothérapies pour les patients atteints de NPC étant donné
les propriétés immunosuppressives de la galectine-9.
En conditions physiologiques, lors de la réponse immunitaire de l’hôte contre les
pathogènes, celle-ci doit être régulée présicément pour limiter les dégats des tissus infectés.
La galectine-9 joue alors un rôle dans l’atténuation et la terminaison de cette réaction. Mais
lors de certaines affections virales chroniques ou lors de maladies tumorales, l’action
immunosuppressive de la galectine-9 peut être mise en jeu de façon inappropriée. Cette
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
action s’opère de plusieurs manières. La galectine-9 induit l’apoptose des lymphocytes Th1,
Th17 et T CD8+, favorise la production de cytokines immunosuppressives et l’expansion des
Treg [108, 173, 175, 176, 188, 191, 214-220].
Un autre aspect de cette régulation négative pourrait être lié au phénotype
d’épuisement des lymphocytes CD8+. La population de lymphocytes CD8+ épuisés se
caractérise par une forte expression de récepteurs inhibiteurs, notamment PD-1 et/ou TIM-3
chez les patients infectés chroniquement par le VIH, le VHC et le VHB [195, 196, 225, 264,
265]. La neutralisation de TIM-3 rétablit partiellement ou largement, selon les études, les
capacités cytotoxiques des lymphocytes CD8+. Cependant, cette neutralisation est effectuée à
l’aide d’un anticorps bloquant anti-TIM-3 ou d’un compétiteur soluble de TIM-3.
L’implication directe de la galectine-9 n’est donc jamais formellement démontrée dans ces
publications. L’utilisation de l’anticorps neutralisant 2E12 dans ces expériences pourrait
aider à déterminer si la galectine-9 est bien le ligand de TIM-3 impliqué dans la mise en place
et/ou l’entretien du phénotype d’épuisement des CD8+ lorsque ces infections virales
deviennent chroniques.
3) Neutralisation de l’apoptose induite par la galectine-9 sur lignées T humaines
La galectine-9 induit l’apoptose des cellules de lymphomes T humaines Jurkat et
MOLT-4. Cet effet était déjà connu, cependant l’utilisation de milieu de culture dépourvu de
91
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
sérum de veau fœtal nous a permis d’utiliser des concentrations inférieures aux
concentrations décrites dans ces publications [209]. Il est possible que des éléments présents
dans le sérum se fixent à la galectine-9 ou bien protègent ses récepteurs [267]. Il est
intéressant de noter que les cellules MOLT-4 paraissent plus sensibles à l’apoptose induite
par la galectine-9 que les cellules Jurkat, cependant nous n’avons pas pu déterminer la raison
de cette susceptibilité accrue.
L’anticorps 2E12 bloque l’interaction de galectine-9 avec TIM-3 dans un test
acellulaire. 9M1-3 est également capable de bloquer cette interaction mais dans une moindre
mesure, tandis qu’1G3 est incapable de la bloquer. Nous n’avons pas encore réalisé cette
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
expérience pour ECA-42. Parallèlement, les anticorps 2E12 et ECA-42 nous ont permis de
neutraliser complètement l’effet pro-apoptotique de la galectine-9 sur les deux lignées Jurkat
et MOLT-4. 9M1-3 ne neutralise que partiellement cet effet, tandis qu’1G3 n’a aucun effet
neutralisant. Bien que ces résultats semblent correspondre aux capacités de blocage de
l’interaction galectine-9/TIM-3 par les anticorps, nous avons constaté que l’utilisation de
deux anticorps bloquant de TIM-3 n’ont aucun effet sur l’apoptose induite par la galectine-9.
L’effet pro-apoptotique de la galectine-9 serait donc indépendant de TIM-3 dans ce modèle.
Nous souhaiterions confirmer ce résultat en vérifiant l’effet de la galectine-9 sur des cellules
Jurkat invalidées pour TIM-3.
Nous avons confirmé l’augmentation de calcium cytosolique induite par la
galectine-9 dans les cellules Jurkat et nous avons montré la probable indépendance de TIM-3
dans ce mécanisme. Cette expérience pourrait être répétée avec les cellules Jurkat invalidées
pour TIM-3 et également avec la lignée MOLT-4. Enfin, nous avons caractérisé par
microscopie électronique l’effet de la galectine-9 sur les cellules Jurkat et l’impact de la
neutralisation par 2E12 de cet effet. La galectine-9 semble s’accumuler dans la membrane
plasmique aux zones de contact des cellules et favoriser la formation de cordons denses entre
celles-ci. Il semble que ces cordons puissent être internalisés. Le pré-traitement par 2E12
empêche la formation de ces cordons et l’on peut observer l’apparition de structures denses
globulaires contenant à la fois la galectine-9 et 2E12. Ces structures seraient, elles aussi,
internalisées par les cellules. Il serait intéressant de caractériser l’ultrastructure des cellules
92
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
MOLT-4 après traitement par la galectine-9 étant donné que celles-ci sont plus sensibles à
son effet pro-apoptotique.
4) Effets des exosomes porteurs de galectine-9
Les travaux réalisés précédemment dans l’équipe ont démontré que la galectine-9 est
sécrétée par les cellules de NPC en association avec les exosomes et que ceux-ci sont
détectables dans le sang de patients atteints de NPC [108]. Etant donné que la galectine-9 est
présente dans le sang de patients infectés par le VIH et le VHC, il serait intéressant de
déterminer si elle est associée aux exosomes dans ces contextes infectieux [176, 224]. A notre
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
connaissance, seule l’étude de notre équipe sur les exosomes de NPC s’est intéressée aux
effects directs de la galectine-9 lorsqu’elle est associée aux exosomes. Pour mémoire, la
galectine-9 véhiculée par les exosomes de NPC peut interagir avec TIM-3 et ainsi induire la
mort de clones CD4+ spécifiques de protéines d’EBV. Il nous semble primordial
d’approfondir l’étude des exosomes porteurs de galectine-9, car il est possible qu’en
conditions physiologiques la majorité de la galectine-9 soluble soit intégrée à la membrane
des exosomes.
Pour l’étude des exosomes vecteurs de galectine-9, nous avons développé deux
lignées cellulaires à partir de la lignée de lymphome de Burkitt BL2 : une lignée exprimant
de façon stable la galectine-9 (BL2-gal9) et une lignée contrôle exprimant de façon stable la
GFP (BL2-GFP). Les cellules de cette lignée produisent de grandes quantités d’exosomes.
Lors d’une expérience préliminaire, nous avons purifié des exosomes de BL2-GFP et de
BL2-gal9 puis nous avons comparé leur effet pro-apoptotique sur les cellules Jurkat par
cytométrie de flux grâce à un marquage Annexin-V/IP. Nous n’avons pas pu mettre en
évidence d’effet accru des exosomes galectine-9 par rapport aux exosomes GFP sur la
mortalité des cellules Jurkat au cours de cette expérience. Il est possible que ce test ne soit pas
assez sensible étant donné qu’il nous est difficile de constater un effet de la galectine-9
recombinante à des concentrations inférieures à 1 µg/ml (30 nM) sur les cellules Jurkat.
D’après notre évaluation de la quantité de galectine-9 dans les exosomes de BL2, il faudrait
traiter les cellules avec au moins 200 µg/ml d’exosomes pour retrouver une concentration de
93
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
galectine-9 équivalente. Outre les difficultés techniques que cela représenterait, l’utilisation
d’une telle quantité d’exosome pourrait ne pas être représentative des quantités réelles
d’exosomes circulant in vivo. Ce point est néanmoins discutable car il est envisageable que la
concentration en exosomes soit localement très élevée dans le microenvironnement tumoral.
L’une des pistes possibles pour la mise en évidence d’effets des exosomes porteurs de
galectine-9 serait la mesure de l’augmentation du calcium cytosolique libre dans les cellules
Jurkat, selon le protocole décrit dans les résultats du second article. Lors de cette expérience,
nous avons observé un effet de la galectine-9 à une concentration de 0,2 µg/ml (6 nM). Cette
haute sensibilité pourrait convenir à l’étude des exosomes. Si nous parvenions à mettre
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
évidence un effet des exosomes sur les cellules Jurkat ou dans un autre modèle, nous
pourrions déterminer si nos anticorps sont en mesure de bloquer cet effet. Nous savons déjà
que l’anticorps 1G3 est capable d’immunoprécipiter les exosomes porteurs de galectine-9
issus d’une lignée cellulaire de NPC. La capacité de capture des exosomes par l’anticorps
2E12 reste à déterminer.
Si aucune nouvelle étude de ne s’est intéressée directement aux exosomes vecteurs de
galectine-9, ceux-ci pourraient jouer un rôle dans deux modèles distincts présentés dans
deux publications récentes [189, 268]. Nous avons déjà évoqué la première de ces deux
publications où sont analysés les effets de la galectine-9 recombinante une lignée de cellules
NK. Dans ce modèle, la galectine-9 augmente la production d’IFN-γ par les cellules NK
d’une manière dépendante de TIM-3. Les auteurs obtiennent les mêmes résultats en
substituant la galectine-9 recombinante par des cellules Raji exprimant la galectine-9 de
manière stable (Raji-gal9). Il serait intéressant de déterminer si les exosomes de Raji-gal9
contiennent la galectine-9 et si les effets observés sont dûs à la galectine-9 membranaire, à la
galectine-9 transportée par les exosomes ou bien à ces deux types de présentation de la
galectine-9.
Dans la seconde publication, les auteurs démontrent que les cellules T CD4+
possèdant une expression membranaire de la galectine-9 (gal9+ Th) sont capables de la
sécréter. La co-culture de ces cellules régule négativement les Th17 et positivement les Treg,
94
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
de la même manière que la galectine-9 recombinante. Il serait là aussi intéressant de
caractériser les exosomes provenant des cellules gal9+ Th et de déterminer leur rôle dans la
régulation des Th17 et des Treg.
5) Nouveaux tests in vitro de neutralisation des effets de la galectine-9
Les tests réalisés sur les cellules Jurkat et MOLT-4 pourraient être complétés par de
nouvelles expériences in vitro sur lignées cellulaires et cellules primaires. Les cibles
physiologiques de la galectine-9 sont nombreuses et il est crucial de déterminer si 2E12 est
capable d’inhiber l’ensemble de ses fonctions ou une partie d’entre elles. La mise au point de
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
nouveaux tests pourrait également nous permettre de révéler de nouveaux effets inhibiteurs
d’autres anticorps anti-galectine-9. De plus, les tests s’avèrant assez sensibles pourraient être
adaptés pour l’étude des exosomes vecteurs de galectine-9.
Nous pourrions ainsi déterminer la capacité de nos anticorps à inhiber la production
de cytokines par les monocytes [176, 187] et les cellules NK [189]. Comme nous l’avons vu en
introduction, l’interaction de la galectine-9 avec TIM-3 induit la production de TNF-α, IL-1β
et IFN-γ par les monocytes et la production d’IFN-γ par les cellules NK (lignée NK92). Pour
l’étude des monocytes, nous utiliserions la lignée leucémique monocytaire THP-1 et des
monocytes CD14+ issus de PBMC totaux triés à l’aide de billes magnétiques. Pour l’étude des
cellules NK, nous utiliserions la lignée NK92 citée ci-dessus que nous a transmis l’équipe de
JS Miller. Pour confirmer les résultats obtenus sur lignées T, nous pourrions réaliser de
nouveaux tests de viabilité cellulaire après traitement avec la galectine-9 en prenant pour
cible des lymphocytes T primaires humains issus de PBMC totaux et stimulés par des
anticorps anti-CD3 et anti-CD28.
La stimulation de l’expansion des Treg et potentiellement de leur activité suppressive
est une composante essentielle de l’action immunosuppressive de la galectine-9, mais celle-ci
a surtout été étudiée chez la souris et relativement peu chez l’homme [175, 176]. Cet aspect
pourrait être traité en collaboration avec l’équipe de Nadira Delhem (CNRS UMR 8161,
Institut de Biologie de Lille) qui possède une remarquable expérience dans la manipulation
95
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
des Treg humains. Leur équipe a obtenu des résultats encourageants avec l’anticorps 1G3 en
montrant que celui-ci était capable de réduire l’action suppressive des Treg sur des
lymphocytes T CD4+ CD25- autologues. L’obtention de ces données souligne l’importance de
la mise au point de nouveaux modèles pour la poursuite de la caractérisation des anticorps
que nous avons obtenus.
6) Modèles in vivo de neutralisation des effets de la galectine-9
Nous avons démontré le potentiel neutralisant de l’anticorps 2E12 sur la galectine-9
in vitro. L’étape suivante sur le chemin de l’anticorps thérapeutique serait la démonstration
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
de cette capacité dans un modèle murin in vivo. Un premier modèle simple consisterait à
transposer le test in vitro de viabilité sur les Jurkat en test in vivo. Pour cela nous pourrions
greffer des cellules Jurkat sur des souris immunodéficientes puis traiter ces souris avec de la
galectine-9 recombinante accompagnée ou non de 2E12. La comparaison des croissances
tumorales nous permettrait de déterminer si la galectine-9 recombinante exerce son effet
cytotoxique sur les cellules Jurkat in vivo et si cet effet est contrecarré par 2E12. Nous
utiliserions des cellules Jurkat exprimant la luciférase (Jurkat-Luc) pour faciliter l’évaluation
de la croissance tumorale par imagerie optique externe. La lignée Jurkat-Luc pourrait être
développée rapidement grâce à un système de lentivirus mis au point par notre équipe [269].
Si ce modèle s’avérait donner des résultats satisfaisants, nous pourrions remplacer la
galectine-9 recombinante par des exosomes purifiés issus de cellules BL2-gal9, puis par les
cellules BL2-gal9 et observer l’effet de 2E12 dans ces différents modèles.
Ce premier modèle pourrait nous apporter des informations cruciales sur la
susceptibilité des cellules Jurkat à la galectine-9 et le potentiel de neutralisation de 2E12 dans
un système in vivo. Toutefois, il serait loin de refléter la complexité des interactions entre la
galectine-9, les cellules tumorales, et les cellules immunitaires. Une seconde approche
pourrait être mise en œuvre sur des souris SCID splénectomisée dont le système immunitaire
aurait été reconstitué avec des PBMC humains, selon un protocole bien maitrisé dans
l’équipe de Nadira Delhem. Dans cette approche, la galectine-9 recombinante serait injectée
par voie systémique en étant accompagnée ou non de 2E12. Nous observerions l’effet de la
96
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
galectine-9 et le potentiel de neutralisation de cet effet sur les sous-populations
lymphocytaires humaines des souris. L’injection de galectine-9 pourrait par la suite être
remplacée par une greffe sous-cutanée de cellules malignes de NPC produisant des quantités
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
élevées d’exosomes vecteurs de galectine-9.
97
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
BIBLIOGRAPHIE
98
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Hanahan D, Weinberg RA: The hallmarks of cancer. Cell 2000, 100:57-70.
Sonnenschein C, Soto AM: The death of the cancer cell. Cancer Res 2011, 71:43344337.
Burnet M: Cancer: a biological approach. III. Viruses associated with neoplastic
conditions. IV. Practical applications. Br Med J 1957, 1:841-847.
Stutman O: Tumor development after 3-methylcholanthrene in immunologically
deficient athymic-nude mice. Science 1974, 183:534-536.
Dighe AS, Richards E, Old LJ, Schreiber RD: Enhanced in vivo growth and
resistance to rejection of tumor cells expressing dominant negative IFN gamma
receptors. Immunity 1994, 1:447-456.
Kaplan DH, Shankaran V, Dighe AS, Stockert E, Aguet M, Old LJ, Schreiber RD:
Demonstration of an interferon gamma-dependent tumor surveillance system in
immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95:7556-7561.
van den Broek ME, Kagi D, Ossendorp F, Toes R, Vamvakas S, Lutz WK, Melief CJ,
Zinkernagel RM, Hengartner H: Decreased tumor surveillance in perforin-deficient
mice. J Exp Med 1996, 184:1781-1790.
Shankaran V, Ikeda H, Bruce AT, White JM, Swanson PE, Old LJ, Schreiber RD:
IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape
tumour immunogenicity. Nature 2001, 410:1107-1111.
Disis ML, Calenoff E, McLaughlin G, Murphy AE, Chen W, Groner B, Jeschke M,
Lydon N, McGlynn E, Livingston RB, et al.: Existent T-cell and antibody immunity
to HER-2/neu protein in patients with breast cancer. Cancer Res 1994, 54:16-20.
Tureci O, Mack U, Luxemburger U, Heinen H, Krummenauer F, Sester M, Sester U,
Sybrecht GW, Sahin U: Humoral immune responses of lung cancer patients
against tumor antigen NY-ESO-1. Cancer Lett 2006, 236:64-71.
Abrams SI, Stanziale SF, Lunin SD, Zaremba S, Schlom J: Identification of
overlapping epitopes in mutant ras oncogene peptides that activate CD4+ and
CD8+ T cell responses. Eur J Immunol 1996, 26:435-443.
Kessler JH, Bres-Vloemans SA, van Veelen PA, de Ru A, Huijbers IJ, Camps M,
Mulder A, Offringa R, Drijfhout JW, Leeksma OC, et al: BCR-ABL fusion regions
as a source of multiple leukemia-specific CD8+ T-cell epitopes. Leukemia 2006,
20:1738-1750.
Busson P, Keryer C, Ooka T, Corbex M: EBV-associated nasopharyngeal
carcinomas: from epidemiology to virus-targeting strategies. Trends Microbiol
2004, 12:356-360.
Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD: The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev
Immunol 2004, 22:329-360.
Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ: Cancer immunoediting: integrating immunity's
roles in cancer suppression and promotion. Science 2011, 331:1565-1570.
Pende D, Rivera P, Marcenaro S, Chang CC, Biassoni R, Conte R, Kubin M, Cosman
D, Ferrone S, Moretta L, Moretta A: Major histocompatibility complex class Irelated chain A and UL16-binding protein expression on tumor cell lines of
different histotypes: analysis of tumor susceptibility to NKG2D-dependent
natural killer cell cytotoxicity. Cancer Res 2002, 62:6178-6186.
Langers I, Renoux VM, Thiry M, Delvenne P, Jacobs N: Natural killer cells: role in
local tumor growth and metastasis. Biologics 2012, 6:73-82.
Kepp O, Tesniere A, Zitvogel L, Kroemer G: The immunogenicity of tumor cell
death. Curr Opin Oncol 2009, 21:71-76.
99
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
19.
20.
21.
22.
23.
24.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
Kelly JM, Darcy PK, Markby JL, Godfrey DI, Takeda K, Yagita H, Smyth MJ:
Induction of tumor-specific T cell memory by NK cell-mediated tumor rejection.
Nat Immunol 2002, 3:83-90.
Gerosa F, Baldani-Guerra B, Nisii C, Marchesini V, Carra G, Trinchieri G:
Reciprocal activating interaction between natural killer cells and dendritic cells. J
Exp Med 2002, 195:327-333.
Koebel CM, Vermi W, Swann JB, Zerafa N, Rodig SJ, Old LJ, Smyth MJ, Schreiber
RD: Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state. Nature
2007, 450:903-907.
Hanahan D, Weinberg RA: Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011,
144:646-674.
Sanda MG, Restifo NP, Walsh JC, Kawakami Y, Nelson WG, Pardoll DM, Simons
JW: Molecular characterization of defective antigen processing in human
prostate cancer. J Natl Cancer Inst 1995, 87:280-285.
Korkolopoulou P, Kaklamanis L, Pezzella F, Harris AL, Gatter KC: Loss of antigenpresenting molecules (MHC class I and TAP-1) in lung cancer. Br J Cancer 1996,
73:148-153.
Meissner M, Reichert TE, Kunkel M, Gooding W, Whiteside TL, Ferrone S, Seliger
B: Defects in the human leukocyte antigen class I antigen processing machinery
in head and neck squamous cell carcinoma: association with clinical outcome.
Clin Cancer Res 2005, 11:2552-2560.
Nie Y, Yang G, Song Y, Zhao X, So C, Liao J, Wang LD, Yang CS: DNA
hypermethylation is a mechanism for loss of expression of the HLA class I genes
in human esophageal squamous cell carcinomas. Carcinogenesis 2001, 22:16151623.
Maleno I, Cabrera CM, Cabrera T, Paco L, Lopez-Nevot MA, Collado A, Ferron A,
Garrido F: Distribution of HLA class I altered phenotypes in colorectal
carcinomas: high frequency of HLA haplotype loss associated with loss of
heterozygosity in chromosome region 6p21. Immunogenetics 2004, 56:244-253.
Maleno I, Romero JM, Cabrera T, Paco L, Aptsiauri N, Cozar JM, Tallada M, LopezNevot MA, Garrido F: LOH at 6p21.3 region and HLA class I altered phenotypes
in bladder carcinomas. Immunogenetics 2006, 58:503-510.
Rodriguez T, Mendez R, Del Campo A, Jimenez P, Aptsiauri N, Garrido F, RuizCabello F: Distinct mechanisms of loss of IFN-gamma mediated HLA class I
inducibility in two melanoma cell lines. BMC Cancer 2007, 7:34.
Seliger B, Ruiz-Cabello F, Garrido F: IFN inducibility of major histocompatibility
antigens in tumors. Adv Cancer Res 2008, 101:249-276.
Bicknell DC, Rowan A, Bodmer WF: Beta 2-microglobulin gene mutations: a study
of established colorectal cell lines and fresh tumors. Proc Natl Acad Sci U S A
1994, 91:4751-4755.
Medema JP, de Jong J, Peltenburg LT, Verdegaal EM, Gorter A, Bres SA, Franken
KL, Hahne M, Albar JP, Melief CJ, Offringa R: Blockade of the granzyme
B/perforin pathway through overexpression of the serine protease inhibitor PI9/SPI-6 constitutes a mechanism for immune escape by tumors. Proc Natl Acad
Sci U S A 2001, 98:11515-11520.
Griffith TS, Chin WA, Jackson GC, Lynch DH, Kubin MZ: Intracellular regulation
of TRAIL-induced apoptosis in human melanoma cells. J Immunol 1998,
161:2833-2840.
Landowski TH, Qu N, Buyuksal I, Painter JS, Dalton WS: Mutations in the Fas
antigen in patients with multiple myeloma. Blood 1997, 90:4266-4270.
100
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
35.
36.
37.
38.
39.
40.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
Peli J, Schroter M, Rudaz C, Hahne M, Meyer C, Reichmann E, Tschopp J:
Oncogenic Ras inhibits Fas ligand-mediated apoptosis by downregulating the
expression of Fas. Embo J 1999, 18:1824-1831.
Cheng J, Zhou T, Liu C, Shapiro JP, Brauer MJ, Kiefer MC, Barr PJ, Mountz JD:
Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule.
Science 1994, 263:1759-1762.
Sheikh MS, Huang Y, Fernandez-Salas EA, El-Deiry WS, Friess H, Amundson S, Yin
J, Meltzer SJ, Holbrook NJ, Fornace AJ, Jr.: The antiapoptotic decoy receptor
TRID/TRAIL-R3 is a p53-regulated DNA damage-inducible gene that is
overexpressed in primary tumors of the gastrointestinal tract. Oncogene 1999,
18:4153-4159.
Wherry EJ: T cell exhaustion. Nat Immunol 2011, 12:492-499.
Dong H, Strome SE, Salomao DR, Tamura H, Hirano F, Flies DB, Roche PC, Lu J,
Zhu G, Tamada K, et al: Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a
potential mechanism of immune evasion. Nat Med 2002, 8:793-800.
Pardoll DM: The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat
Rev Cancer 2012, 12:252-264.
Whiteside TL: What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?
Semin Cancer Biol 2012, 22:327-334.
Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ: Natural and adaptive foxp3+ regulatory T
cells: more of the same or a division of labor? Immunity 2009, 30:626-635.
Woo EY, Chu CS, Goletz TJ, Schlienger K, Yeh H, Coukos G, Rubin SC, Kaiser LR,
June CH: Regulatory CD4(+)CD25(+) T cells in tumors from patients with earlystage non-small cell lung cancer and late-stage ovarian cancer. Cancer Res 2001,
61:4766-4772.
Bates GJ, Fox SB, Han C, Leek RD, Garcia JF, Harris AL, Banham AH:
Quantification of regulatory T cells enables the identification of high-risk breast
cancer patients and those at risk of late relapse. J Clin Oncol 2006, 24:5373-5380.
Sasada T, Kimura M, Yoshida Y, Kanai M, Takabayashi A: CD4+CD25+ regulatory
T cells in patients with gastrointestinal malignancies: possible involvement of
regulatory T cells in disease progression. Cancer 2003, 98:1089-1099.
Hiraoka N, Onozato K, Kosuge T, Hirohashi S: Prevalence of FOXP3+ regulatory T
cells increases during the progression of pancreatic ductal adenocarcinoma and
its premalignant lesions. Clin Cancer Res 2006, 12:5423-5434.
Curiel TJ, Coukos G, Zou L, Alvarez X, Cheng P, Mottram P, Evdemon-Hogan M,
Conejo-Garcia JR, Zhang L, Burow M, et al: Specific recruitment of regulatory T
cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced
survival. Nat Med 2004, 10:942-949.
Perrone G, Ruffini PA, Catalano V, Spino C, Santini D, Muretto P, Spoto C,
Zingaretti C, Sisti V, Alessandroni P, et al: Intratumoural FOXP3-positive
regulatory T cells are associated with adverse prognosis in radically resected
gastric cancer. Eur J Cancer 2008, 44:1875-1882.
Fridman WH, Pages F, Sautes-Fridman C, Galon J: The immune contexture in
human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer 2012, 12:298-306.
Walker MR, Kasprowicz DJ, Gersuk VH, Benard A, Van Landeghen M, Buckner JH,
Ziegler SF: Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by
stimulated human CD4+CD25- T cells. J Clin Invest 2003, 112:1437-1443.
101
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
51.
52.
53.
54.
55.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
Strauss L, Bergmann C, Szczepanski M, Gooding W, Johnson JT, Whiteside TL: A
unique subset of CD4+CD25highFoxp3+ T cells secreting interleukin-10 and
transforming growth factor-beta1 mediates suppression in the tumor
microenvironment. Clin Cancer Res 2007, 13:4345-4354.
Grossman WJ, Verbsky JW, Tollefsen BL, Kemper C, Atkinson JP, Ley TJ:
Differential expression of granzymes A and B in human cytotoxic lymphocyte
subsets and T regulatory cells. Blood 2004, 104:2840-2848.
Ren X, Ye F, Jiang Z, Chu Y, Xiong S, Wang Y: Involvement of cellular death in
TRAIL/DR5-dependent suppression induced by CD4(+)CD25(+) regulatory T
cells. Cell Death Differ 2007, 14:2076-2084.
Garin MI, Chu CC, Golshayan D, Cernuda-Morollon E, Wait R, Lechler RI: Galectin1: a key effector of regulation mediated by CD4+CD25+ T cells. Blood 2007,
109:2058-2065.
Wing K, Onishi Y, Prieto-Martin P, Yamaguchi T, Miyara M, Fehervari Z, Nomura T,
Sakaguchi S: CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science
2008, 322:271-275.
Pandiyan P, Zheng L, Ishihara S, Reed J, Lenardo MJ: CD4+CD25+Foxp3+
regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector
CD4+ T cells. Nat Immunol 2007, 8:1353-1362.
Mandapathil M, Hilldorfer B, Szczepanski MJ, Czystowska M, Szajnik M, Ren J,
Lang S, Jackson EK, Gorelik E, Whiteside TL: Generation and accumulation of
immunosuppressive adenosine by human CD4+CD25highFOXP3+ regulatory T
cells. J Biol Chem 2010, 285:7176-7186.
Bronte V, Wang M, Overwijk WW, Surman DR, Pericle F, Rosenberg SA, Restifo
NP: Apoptotic death of CD8+ T lymphocytes after immunization: induction of a
suppressive population of Mac-1+/Gr-1+ cells. J Immunol 1998, 161:5313-5320.
Gabrilovich DI, Nagaraj S: Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the
immune system. Nat Rev Immunol 2009, 9:162-174.
Bronte V, Chappell DB, Apolloni E, Cabrelle A, Wang M, Hwu P, Restifo NP:
Unopposed production of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by
tumors inhibits CD8+ T cell responses by dysregulating antigen-presenting cell
maturation. J Immunol 1999, 162:5728-5737.
Highfill SL, Rodriguez PC, Zhou Q, Goetz CA, Koehn BH, Veenstra R, Taylor PA,
Panoskaltsis-Mortari A, Serody JS, Munn DH, et al: Bone marrow myeloid-derived
suppressor cells (MDSCs) inhibit graft-versus-host disease (GVHD) via an
arginase-1-dependent mechanism that is up-regulated by interleukin-13. Blood
2010, 116:5738-5747.
Srivastava MK, Sinha P, Clements VK, Rodriguez P, Ostrand-Rosenberg S: Myeloidderived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and
cysteine. Cancer Res 2010, 70:68-77.
Kusmartsev S, Nefedova Y, Yoder D, Gabrilovich DI: Antigen-specific inhibition of
CD8+ T cell response by immature myeloid cells in cancer is mediated by
reactive oxygen species. J Immunol 2004, 172:989-999.
Huang B, Pan PY, Li Q, Sato AI, Levy DE, Bromberg J, Divino CM, Chen SH: Gr1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of
tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host.
Cancer Res 2006, 66:1123-1131.
102
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
65.
66.
67.
68.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
von Rahden BH, Stein HJ, Feith M, Puhringer F, Theisen J, Siewert JR, Sarbia M:
Overexpression of TGF-beta1 in esophageal (Barrett's) adenocarcinoma is
associated with advanced stage of disease and poor prognosis. Mol Carcinog 2006,
45:786-794.
Lob S, Konigsrainer A, Zieker D, Brucher BL, Rammensee HG, Opelz G, Terness P:
IDO1 and IDO2 are expressed in human tumors: levo- but not dextro-1-methyl
tryptophan inhibits tryptophan catabolism. Cancer Immunol Immunother 2009,
58:153-157.
Mueller MM, Fusenig NE: Constitutive expression of G-CSF and GM-CSF in
human skin carcinoma cells with functional consequence for tumor progression.
Int J Cancer 1999, 83:780-789.
Hahne M, Rimoldi D, Schroter M, Romero P, Schreier M, French LE, Schneider P,
Bornand T, Fontana A, Lienard D, et al: Melanoma cell expression of Fas(Apo1/CD95) ligand: implications for tumor immune escape. Science 1996, 274:13631366.
Ranges GE, Figari IS, Espevik T, Palladino MA, Jr.: Inhibition of cytotoxic T cell
development by transforming growth factor beta and reversal by recombinant
tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 1987, 166:991-998.
Serafini P, Borrello I, Bronte V: Myeloid suppressor cells in cancer: recruitment,
phenotype, properties, and mechanisms of immune suppression. Semin Cancer
Biol 2006, 16:53-65.
Frumento G, Rotondo R, Tonetti M, Damonte G, Benatti U, Ferrara GB:
Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural
killer cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxygenase. J Exp Med 2002,
196:459-468.
Shiraki K, Yamanaka T, Inoue H, Kawakita T, Enokimura N, Okano H, Sugimoto K,
Murata K, Nakano T: Expression of TNF-related apoptosis-inducing ligand in
human hepatocellular carcinoma. Int J Oncol 2005, 26:1273-1281.
Gorelik L, Flavell RA: Transforming growth factor-beta in T-cell biology. Nat Rev
Immunol 2002, 2:46-53.
Trams EG, Lauter CJ, Salem N, Jr., Heine U: Exfoliation of membrane ectoenzymes in the form of micro-vesicles. Biochim Biophys Acta 1981, 645:63-70.
Wubbolts R, Leckie RS, Veenhuizen PT, Schwarzmann G, Mobius W,
Hoernschemeyer J, Slot JW, Geuze HJ, Stoorvogel W: Proteomic and biochemical
analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their
function and multivesicular body formation. J Biol Chem 2003, 278:10963-10972.
Denzer K, Kleijmeer MJ, Heijnen HF, Stoorvogel W, Geuze HJ: Exosome: from
internal vesicle of the multivesicular body to intercellular signaling device. J Cell
Sci 2000, 113 Pt 19:3365-3374.
Valadi H, Ekstrom K, Bossios A, Sjostrand M, Lee JJ, Lotvall JO: Exosomemediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic
exchange between cells. Nat Cell Biol 2007, 9:654-659.
Mathivanan S, Simpson RJ: ExoCarta: A compendium of exosomal proteins and
RNA. Proteomics 2009, 9:4997-5000.
Filipazzi P, Burdek M, Villa A, Rivoltini L, Huber V: Recent advances on the role of
tumor exosomes in immunosuppression and disease progression. Semin Cancer
Biol 2012, 22:342-349.
Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, Conrad R: Exosomes: Current knowledge
of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic
potentials. Biochim Biophys Acta 2012, 1820:940-948.
103
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
81.
82.
83.
84.
85.
86.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
Subra C, Laulagnier K, Perret B, Record M: Exosome lipidomics unravels lipid
sorting at the level of multivesicular bodies. Biochimie 2007, 89:205-212.
Balaj L, Lessard R, Dai L, Cho YJ, Pomeroy SL, Breakefield XO, Skog J: Tumour
microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene
sequences. Nat Commun 2011, 2:180.
Chaput N, Thery C: Exosomes: immune properties and potential clinical
implementations. Semin Immunopathol 2010, 33:419-440.
Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, Liejendekker R, Harding CV, Melief CJ,
Geuze HJ: B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. J Exp Med 1996,
183:1161-1172.
Andre F, Schartz NE, Movassagh M, Flament C, Pautier P, Morice P, Pomel C,
Lhomme C, Escudier B, Le Chevalier T, et al: Malignant effusions and
immunogenic tumour-derived exosomes. Lancet 2002, 360:295-305.
Giri PK, Schorey JS: Exosomes derived from M. Bovis BCG infected macrophages
activate antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells in vitro and in vivo. PLoS One
2008, 3:e2461.
Walker JD, Maier CL, Pober JS: Cytomegalovirus-infected human endothelial cells
can stimulate allogeneic CD4+ memory T cells by releasing antigenic exosomes. J
Immunol 2009, 182:1548-1559.
Bhatnagar S, Schorey JS: Exosomes released from infected macrophages contain
Mycobacterium avium glycopeptidolipids and are proinflammatory. J Biol Chem
2007, 282:25779-25789.
Greco V, Hannus M, Eaton S: Argosomes: a potential vehicle for the spread of
morphogens through epithelia. Cell 2001, 106:633-645.
Leblanc P, Alais S, Porto-Carreiro I, Lehmann S, Grassi J, Raposo G, Darlix JL:
Retrovirus infection strongly enhances scrapie infectivity release in cell culture.
Embo J 2006, 25:2674-2685.
Pegtel DM, van de Garde MD, Middeldorp JM: Viral miRNAs exploiting the
endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion.
Biochim Biophys Acta 2011, 1809:715-721.
Gourzones C, Gelin A, Bombik I, Klibi J, Verillaud B, Guigay J, Lang P, Temam S,
Schneider V, Amiel C, et al: Extra-cellular release and blood diffusion of BART
viral micro-RNAs produced by EBV-infected nasopharyngeal carcinoma cells.
Virol J 2010, 7:271.
Pegtel DM, Cosmopoulos K, Thorley-Lawson DA, van Eijndhoven MA, Hopmans
ES, Lindenberg JL, de Gruijl TD, Wurdinger T, Middeldorp JM: Functional delivery
of viral miRNAs via exosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 2010, 107:6328-6333.
Keryer-Bibens C, Pioche-Durieu C, Villemant C, Souquere S, Nishi N, Hirashima M,
Middeldorp J, Busson P: Exosomes released by EBV-infected nasopharyngeal
carcinoma cells convey the viral latent membrane protein 1 and the
immunomodulatory protein galectin 9. BMC Cancer 2006, 6:283.
Al-Nedawi K, Meehan B, Micallef J, Lhotak V, May L, Guha A, Rak J: Intercellular
transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from
tumour cells. Nat Cell Biol 2008, 10:619-624.
Ciravolo V, Huber V, Ghedini GC, Venturelli E, Bianchi F, Campiglio M, Morelli D,
Villa A, Della Mina P, Menard S, et al: Potential role of HER2-overexpressing
exosomes in countering trastuzumab-based therapy. J Cell Physiol 2011, 227:658667.
104
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
97.
98.
99.
100.
101.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
Shedden K, Xie XT, Chandaroy P, Chang YT, Rosania GR: Expulsion of small
molecules in vesicles shed by cancer cells: association with gene expression and
chemosensitivity profiles. Cancer Res 2003, 63:4331-4337.
Taylor DD, Gercel-Taylor C: Exosomes/microvesicles: mediators of cancerassociated immunosuppressive microenvironments. Semin Immunopathol 2011,
33:441-454.
Andreola G, Rivoltini L, Castelli C, Huber V, Perego P, Deho P, Squarcina P,
Accornero P, Lozupone F, Lugini L, et al: Induction of lymphocyte apoptosis by
tumor cell secretion of FasL-bearing microvesicles. J Exp Med 2002, 195:13031316.
Martinez-Lorenzo MJ, Anel A, Alava MA, Pineiro A, Naval J, Lasierra P, Larrad L:
The human melanoma cell line MelJuSo secretes bioactive FasL and
APO2L/TRAIL on the surface of microvesicles. Possible contribution to tumor
counterattack. Exp Cell Res 2004, 295:315-329.
Taylor DD, Gercel-Taylor C, Lyons KS, Stanson J, Whiteside TL: T-cell apoptosis
and suppression of T-cell receptor/CD3-zeta by Fas ligand-containing membrane
vesicles shed from ovarian tumors. Clin Cancer Res 2003, 9:5113-5119.
Clayton A, Al-Taei S, Webber J, Mason MD, Tabi Z: Cancer exosomes express
CD39 and CD73, which suppress T cells through adenosine production. J
Immunol 2011, 187:676-683.
Clayton A, Tabi Z: Exosomes and the MICA-NKG2D system in cancer. Blood
Cells Mol Dis 2005, 34:206-213.
Szajnik M, Czystowska M, Szczepanski MJ, Mandapathil M, Whiteside TL: Tumorderived microvesicles induce, expand and up-regulate biological activities of
human regulatory T cells (Treg). PLoS One 2010, 5:e11469.
Wada J, Onishi H, Suzuki H, Yamasaki A, Nagai S, Morisaki T, Katano M: Surfacebound TGF-beta1 on effusion-derived exosomes participates in maintenance of
number and suppressive function of regulatory T-cells in malignant effusions.
Anticancer Res 2010, 30:3747-3757.
Clayton A, Mitchell JP, Court J, Mason MD, Tabi Z: Human tumor-derived
exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res
2007, 67:7458-7466.
Xiang X, Poliakov A, Liu C, Liu Y, Deng ZB, Wang J, Cheng Z, Shah SV, Wang GJ,
Zhang L, et al: Induction of myeloid-derived suppressor cells by tumor exosomes.
Int J Cancer 2009, 124:2621-2633.
Klibi J, Niki T, Riedel A, Pioche-Durieu C, Souquere S, Rubinstein E, Le Moulec S,
Guigay J, Hirashima M, Guemira F, et al: Blood diffusion and Th1-suppressive
effects of galectin-9-containing exosomes released by Epstein-Barr virus-infected
nasopharyngeal carcinoma cells. Blood 2009, 113:1957-1966.
Leffler H: Galectins structure and function--a synopsis. Results Probl Cell Differ
2001, 33:57-83.
Guardia CM, Gauto DF, Di Lella S, Rabinovich GA, Marti MA, Estrin DA: An
integrated computational analysis of the structure, dynamics, and ligand binding
interactions of the human galectin network. J Chem Inf Model 2011, 51:1918-1930.
Hirabayashi J, Hashidate T, Arata Y, Nishi N, Nakamura T, Hirashima M, Urashima
T, Oka T, Futai M, Muller WE, et al: Oligosaccharide specificity of galectins: a
search by frontal affinity chromatography. Biochim Biophys Acta 2002, 1572:232254.
105
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
Rabinovich GA, Toscano MA: Turning 'sweet' on immunity: galectin-glycan
interactions in immune tolerance and inflammation. Nat Rev Immunol 2009,
9:338-352.
Boscher C, Dennis JW, Nabi IR: Glycosylation, galectins and cellular signaling.
Curr Opin Cell Biol 2011, 23:383-392.
Liu FT, Rabinovich GA: Galectins as modulators of tumour progression. Nat Rev
Cancer 2005, 5:29-41.
Hokama A, Mizoguchi E, Mizoguchi A: Roles of galectins in inflammatory bowel
disease. World J Gastroenterol 2008, 14:5133-5137.
Saussez S, Kiss R: Galectin-7. Cell Mol Life Sci 2006, 63:686-697.
Hotta K, Funahashi T, Matsukawa Y, Takahashi M, Nishizawa H, Kishida K, Matsuda
M, Kuriyama H, Kihara S, Nakamura T, et al: Galectin-12, an Adipose-expressed
Galectin-like Molecule Possessing Apoptosis-inducing Activity. J Biol Chem 2001,
276:34089-34097.
Gitt MA, Wiser MF, Leffler H, Herrmann J, Xia YR, Massa SM, Cooper DN, Lusis
AJ, Barondes SH: Sequence and mapping of galectin-5, a beta-galactoside-binding
lectin, found in rat erythrocytes. J Biol Chem 1995, 270:5032-5038.
Kubach J, Lutter P, Bopp T, Stoll S, Becker C, Huter E, Richter C, Weingarten P,
Warger T, Knop J, et al: Human CD4+CD25+ regulatory T cells: proteome
analysis identifies galectin-10 as a novel marker essential for their anergy and
suppressive function. Blood 2007, 110:1550-1558.
Swaminathan GJ, Leonidas DD, Savage MP, Ackerman SJ, Acharya KR: Selective
recognition of mannose by the human eosinophil Charcot-Leyden crystal protein
(galectin-10): a crystallographic study at 1.8 A resolution. Biochemistry 1999,
38:13837-13843.
Barres C, Blanc L, Bette-Bobillo P, Andre S, Mamoun R, Gabius HJ, Vidal M:
Galectin-5 is bound onto the surface of rat reticulocyte exosomes and modulates
vesicle uptake by macrophages. Blood 2010, 115:696-705.
Leffler H, Carlsson S, Hedlund M, Qian Y, Poirier F: Introduction to galectins.
Glycoconj J 2004, 19:433-440.
Liu FT, Patterson RJ, Wang JL: Intracellular functions of galectins. Biochim
Biophys Acta 2002, 1572:263-273.
Pioche-Durieu C, Keryer C, Souquere S, Bosq J, Faigle W, Loew D, Hirashima M,
Nishi N, Middeldorp J, Busson P: In nasopharyngeal carcinoma cells, Epstein-Barr
virus LMP1 interacts with galectin 9 in membrane raft elements resistant to
simvastatin. J Virol 2005, 79:13326-13337.
Brewer CF, Miceli MC, Baum LG: Clusters, bundles, arrays and lattices: novel
mechanisms for lectin-saccharide-mediated cellular interactions. Curr Opin Struct
Biol 2002, 12:616-623.
Tanikawa R, Tanikawa T, Okada Y, Nakano K, Hirashima M, Yamauchi A,
Hosokawa R, Tanaka Y: Interaction of galectin-9 with lipid rafts induces
osteoblast proliferation through the c-Src/ERK signaling pathway. J Bone Miner
Res 2008, 23:278-286.
Thery C, Boussac M, Veron P, Ricciardi-Castagnoli P, Raposo G, Garin J, Amigorena
S: Proteomic analysis of dendritic cell-derived exosomes: a secreted subcellular
compartment distinct from apoptotic vesicles. J Immunol 2001, 166:7309-7318.
Perone MJ, Larregina AT, Shufesky WJ, Papworth GD, Sullivan ML, Zahorchak AF,
Stolz DB, Baum LG, Watkins SC, Thomson AW, Morelli AE: Transgenic galectin-1
induces maturation of dendritic cells that elicit contrasting responses in naive
and activated T cells. J Immunol 2006, 176:7207-7220.
106
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
129.
130.
131.
132.
133.
134.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
142.
143.
144.
145.
Di Lella S, Sundblad V, Cerliani JP, Guardia CM, Estrin DA, Vasta GR, Rabinovich
GA: When galectins recognize glycans: from biochemistry to physiology and back
again. Biochemistry 2011, 50:7842-7857.
Cooper D, Norling LV, Perretti M: Novel insights into the inhibitory effects of
Galectin-1 on neutrophil recruitment under flow. J Leukoc Biol 2008, 83:14591466.
Barrionuevo P, Beigier-Bompadre M, Ilarregui JM, Toscano MA, Bianco GA, Isturiz
MA, Rabinovich GA: A novel function for galectin-1 at the crossroad of innate
and adaptive immunity: galectin-1 regulates monocyte/macrophage physiology
through a nonapoptotic ERK-dependent pathway. J Immunol 2007, 178:436-445.
Rabinovich GA, Sotomayor CE, Riera CM, Bianco I, Correa SG: Evidence of a role
for galectin-1 in acute inflammation. Eur J Immunol 2000, 30:1331-1339.
Perillo NL, Pace KE, Seilhamer JJ, Baum LG: Apoptosis of T cells mediated by
galectin-1. Nature 1995, 378:736-739.
Perillo NL, Uittenbogaart CH, Nguyen JT, Baum LG: Galectin-1, an endogenous
lectin produced by thymic epithelial cells, induces apoptosis of human
thymocytes. J Exp Med 1997, 185:1851-1858.
Stowell SR, Karmakar S, Arthur CM, Ju T, Rodrigues LC, Riul TB, Dias-Baruffi M,
Miner J, McEver RP, Cummings RD: Galectin-1 induces reversible
phosphatidylserine exposure at the plasma membrane. Mol Biol Cell 2009,
20:1408-1418.
Rabinovich GA, Ariel A, Hershkoviz R, Hirabayashi J, Kasai KI, Lider O: Specific
inhibition of T-cell adhesion to extracellular matrix and proinflammatory
cytokine secretion by human recombinant galectin-1. Immunology 1999, 97:100106.
van der Leij J, van den Berg A, Harms G, Eschbach H, Vos H, Zwiers P, van Weeghel
R, Groen H, Poppema S, Visser L: Strongly enhanced IL-10 production using
stable galectin-1 homodimers. Mol Immunol 2007, 44:506-513.
Kuwabara I, Liu FT: Galectin-3 promotes adhesion of human neutrophils to
laminin. J Immunol 1996, 156:3939-3944.
Sano H, Hsu DK, Yu L, Apgar JR, Kuwabara I, Yamanaka T, Hirashima M, Liu FT:
Human galectin-3 is a novel chemoattractant for monocytes and macrophages. J
Immunol 2000, 165:2156-2164.
Frigeri LG, Zuberi RI, Liu FT: Epsilon BP, a beta-galactoside-binding animal
lectin, recognizes IgE receptor (Fc epsilon RI) and activates mast cells.
Biochemistry 1993, 32:7644-7649.
Stillman BN, Hsu DK, Pang M, Brewer CF, Johnson P, Liu FT, Baum LG: Galectin-3
and galectin-1 bind distinct cell surface glycoprotein receptors to induce T cell
death. J Immunol 2006, 176:778-789.
Yang RY, Hsu DK, Liu FT: Expression of galectin-3 modulates T-cell growth and
apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1996, 93:6737-6742.
Joo HG, Goedegebuure PS, Sadanaga N, Nagoshi M, von Bernstorff W, Eberlein TJ:
Expression and function of galectin-3, a beta-galactoside-binding protein in
activated T lymphocytes. J Leukoc Biol 2001, 69:555-564.
Sturm A, Lensch M, Andre S, Kaltner H, Wiedenmann B, Rosewicz S, Dignass AU,
Gabius HJ: Human galectin-2: novel inducer of T cell apoptosis with distinct
profile of caspase activation. J Immunol 2004, 173:3825-3837.
Paclik D, Danese S, Berndt U, Wiedenmann B, Dignass A, Sturm A: Galectin-4
controls intestinal inflammation by selective regulation of peripheral and
mucosal T cell apoptosis and cell cycle. PLoS One 2008, 3:e2629.
107
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
146.
147.
148.
149.
150.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160.
161.
Hokama A, Mizoguchi E, Sugimoto K, Shimomura Y, Tanaka Y, Yoshida M, Rietdijk
ST, de Jong YP, Snapper SB, Terhorst C, et al: Induced reactivity of intestinal
CD4(+) T cells with an epithelial cell lectin, galectin-4, contributes to
exacerbation of intestinal inflammation. Immunity 2004, 20:681-693.
Tribulatti MV, Mucci J, Cattaneo V, Aguero F, Gilmartin T, Head SR, Campetella O:
Galectin-8 induces apoptosis in the CD4(high)CD8(high) thymocyte
subpopulation. Glycobiology 2007, 17:1404-1412.
Tribulatti MV, Cattaneo V, Hellman U, Mucci J, Campetella O: Galectin-8 provides
costimulatory and proliferative signals to T lymphocytes. J Leukoc Biol 2009,
86:371-380.
Abedin MJ, Kashio Y, Seki M, Nakamura K, Hirashima M: Potential roles of
galectins in myeloid differentiation into three different lineages. J Leukoc Biol
2003, 73:650-656.
Lahm H, Andre S, Hoeflich A, Fischer JR, Sordat B, Kaltner H, Wolf E, Gabius HJ:
Comprehensive galectin fingerprinting in a panel of 61 human tumor cell lines by
RT-PCR and its implications for diagnostic and therapeutic procedures. J Cancer
Res Clin Oncol 2001, 127:375-386.
Moisan S, Demers M, Mercier J, Magnaldo T, Potworowski EF, St-Pierre Y:
Upregulation of galectin-7 in murine lymphoma cells is associated with
progression toward an aggressive phenotype. Leukemia 2003, 17:751-759.
Yang RY, Hsu DK, Yu L, Ni J, Liu FT: Cell cycle regulation by galectin-12, a new
member of the galectin superfamily. J Biol Chem 2001, 276:20252-20260.
Banh A, Zhang J, Cao H, Bouley DM, Kwok S, Kong C, Giaccia AJ, Koong AC, Le
QT: Tumor galectin-1 mediates tumor growth and metastasis through regulation
of T-cell apoptosis. Cancer Res 2011, 71:4423-4431.
Ito K, Scott SA, Cutler S, Dong LF, Neuzil J, Blanchard H, Ralph SJ:
Thiodigalactoside inhibits murine cancers by concurrently blocking effects of
galectin-1 on immune dysregulation, angiogenesis and protection against
oxidative stress. Angiogenesis 2012, 14:293-307.
Ito K, Ralph SJ: Inhibiting galectin-1 reduces murine lung metastasis with
increased CD4(+) and CD8 (+) T cells and reduced cancer cell adherence. Clin
Exp Metastasis 2012, 29:561-572.
Rubinstein N, Alvarez M, Zwirner NW, Toscano MA, Ilarregui JM, Bravo A, Mordoh
J, Fainboim L, Podhajcer OL, Rabinovich GA: Targeted inhibition of galectin-1
gene expression in tumor cells results in heightened T cell-mediated rejection; A
potential mechanism of tumor-immune privilege. Cancer Cell 2004, 5:241-251.
Elad-Sfadia G, Haklai R, Balan E, Kloog Y: Galectin-3 augments K-Ras activation
and triggers a Ras signal that attenuates ERK but not phosphoinositide 3-kinase
activity. J Biol Chem 2004, 279:34922-34930.
Califice S, Castronovo V, Bracke M, van den Brule F: Dual activities of galectin-3 in
human prostate cancer: tumor suppression of nuclear galectin-3 vs tumor
promotion of cytoplasmic galectin-3. Oncogene 2004, 23:7527-7536.
Peng W, Wang HY, Miyahara Y, Peng G, Wang RF: Tumor-associated galectin-3
modulates the function of tumor-reactive T cells. Cancer Res 2008, 68:7228-7236.
Yu LG: Circulating galectin-3 in the bloodstream: An emerging promoter of
cancer metastasis. World J Gastrointest Oncol 2010, 2:177-180.
Nangia-Makker P, Honjo Y, Sarvis R, Akahani S, Hogan V, Pienta KJ, Raz A:
Galectin-3 induces endothelial cell morphogenesis and angiogenesis. Am J Pathol
2000, 156:899-909.
108
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
162.
163.
164.
165.
166.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
167.
168.
169.
170.
171.
172.
173.
174.
175.
Tureci O, Schmitt H, Fadle N, Pfreundschuh M, Sahin U: Molecular definition of a
novel human galectin which is immunogenic in patients with Hodgkin's disease. J
Biol Chem 1997, 272:6416-6422.
Matsumoto R, Matsumoto H, Seki M, Hata M, Asano Y, Kanegasaki S, Stevens RL,
Hirashima M: Human ecalectin, a variant of human galectin-9, is a novel
eosinophil chemoattractant produced by T lymphocytes. J Biol Chem 1998,
273:16976-16984.
Lipkowitz MS, Leal-Pinto E, Rappoport JZ, Najfeld V, Abramson RG: Functional
reconstitution, membrane targeting, genomic structure, and chromosomal
localization of a human urate transporter. J Clin Invest 2001, 107:1103-1115.
Spitzenberger F, Graessler J, Schroeder HE: Molecular and functional
characterization of galectin 9 mRNA isoforms in porcine and human cells and
tissues. Biochimie 2001, 83:851-862.
Graessler J, Spitzenberger F, Graessler A, Parpart B, Kuhlisch E, Kopprasch S,
Schroeder HE: Genomic structure of galectin-9 gene. Mutation analysis of a
putative human urate channel/transporter. Adv Exp Med Biol 2000, 486:179-183.
Wada J, Ota K, Kumar A, Wallner EI, Kanwar YS: Developmental regulation,
expression, and apoptotic potential of galectin-9, a beta-galactoside binding
lectin. J Clin Invest 1997, 99:2452-2461.
Sato M, Nishi N, Shoji H, Seki M, Hashidate T, Hirabayashi J, Kasai Ki K, Hata Y,
Suzuki S, Hirashima M, Nakamura T: Functional analysis of the carbohydrate
recognition domains and a linker peptide of galectin-9 as to eosinophil
chemoattractant activity. Glycobiology 2002, 12:191-197.
Zhang F, Zheng M, Qu Y, Li J, Ji J, Feng B, Lu A, Li J, Wang M, Liu B: Different
roles of galectin-9 isoforms in modulating E-selectin expression and adhesion
function in LoVo colon carcinoma cells. Mol Biol Rep 2009, 36:823-830.
Yoshida H, Teraoka M, Nishi N, Nakakita S, Nakamura T, Hirashima M, Kamitori S:
X-ray structures of human galectin-9 C-terminal domain in complexes with a
biantennary oligosaccharide and sialyllactose. J Biol Chem 2010, 285:3696936976.
Nagae M, Nishi N, Nakamura-Tsuruta S, Hirabayashi J, Wakatsuki S, Kato R:
Structural analysis of the human galectin-9 N-terminal carbohydrate recognition
domain reveals unexpected properties that differ from the mouse orthologue. J
Mol Biol 2008, 375:119-135.
Nagae M, Nishi N, Murata T, Usui T, Nakamura T, Wakatsuki S, Kato R: Structural
analysis of the recognition mechanism of poly-N-acetyllactosamine by the human
galectin-9 N-terminal carbohydrate recognition domain. Glycobiology 2009,
19:112-117.
Zhu C, Anderson AC, Schubart A, Xiong H, Imitola J, Khoury SJ, Zheng XX, Strom
TB, Kuchroo VK: The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type
1 immunity. Nat Immunol 2005, 6:1245-1252.
Lu LH, Nakagawa R, Kashio Y, Ito A, Shoji H, Nishi N, Hirashima M, Yamauchi A,
Nakamura T: Characterization of galectin-9-induced death of Jurkat T cells. J
Biochem 2007, 141:157-172.
Oomizu S, Arikawa T, Niki T, Kadowaki T, Ueno M, Nishi N, Yamauchi A,
Hirashima M: Galectin-9 suppresses Th17 cell development in an IL-2-dependent
but Tim-3-independent manner. Clin Immunol 2012, 143:51-58.
109
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
176.
177.
178.
179.
180.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
181.
182.
183.
184.
185.
186.
187.
188.
189.
Mengshol JA, Golden-Mason L, Arikawa T, Smith M, Niki T, McWilliams R, Randall
JA, McMahan R, Zimmerman MA, Rangachari M, et al: A crucial role for Kupffer
cell-derived galectin-9 in regulation of T cell immunity in hepatitis C infection.
PLoS One 2010, 5:e9504.
Asakura H, Kashio Y, Nakamura K, Seki M, Dai S, Shirato Y, Abedin MJ, Yoshida
N, Nishi N, Imaizumi T, et al: Selective eosinophil adhesion to fibroblast via IFNgamma-induced galectin-9. J Immunol 2002, 169:5912-5918.
Imaizumi T, Kumagai M, Sasaki N, Kurotaki H, Mori F, Seki M, Nishi N, Fujimoto
K, Tanji K, Shibata T, et al: Interferon-gamma stimulates the expression of
galectin-9 in cultured human endothelial cells. J Leukoc Biol 2002, 72:486-491.
Yoshida H, Imaizumi T, Kumagai M, Kimura K, Satoh C, Hanada N, Fujimoto K,
Nishi N, Tanji K, Matsumiya T, et al: Interleukin-1beta stimulates galectin-9
expression in human astrocytes. Neuroreport 2001, 12:3755-3758.
Alam S, Li H, Margariti A, Martin D, Zampetaki A, Habi O, Cockerill G, Hu Y, Xu
Q, Zeng L: Galectin-9 protein expression in endothelial cells is positively
regulated by histone deacetylase 3. J Biol Chem 2011, 286:44211-44217.
Kageshita T, Kashio Y, Yamauchi A, Seki M, Abedin MJ, Nishi N, Shoji H,
Nakamura T, Ono T, Hirashima M: Possible role of galectin-9 in cell aggregation
and apoptosis of human melanoma cell lines and its clinical significance. Int J
Cancer 2002, 99:809-816.
Irie A, Yamauchi A, Kontani K, Kihara M, Liu D, Shirato Y, Seki M, Nishi N,
Nakamura T, Yokomise H, Hirashima M: Galectin-9 as a prognostic factor with
antimetastatic potential in breast cancer. Clinical cancer research : an official
journal of the American Association for Cancer Research 2005, 11:2962-2968.
Matsuura A, Tsukada J, Mizobe T, Higashi T, Mouri F, Tanikawa R, Yamauchi A,
Hirashima M, Tanaka Y: Intracellular galectin-9 activates inflammatory cytokines
in monocytes. Genes Cells 2009, 14:511-521.
Hughes RC: Secretion of the galectin family of mammalian carbohydrate-binding
proteins. Biochim Biophys Acta 1999, 1473:172-185.
Rodriguez-Manzanet R, DeKruyff R, Kuchroo VK, Umetsu DT: The costimulatory
role of TIM molecules. Immunol Rev 2009, 229:259-270.
Monney L, Sabatos CA, Gaglia JL, Ryu A, Waldner H, Chernova T, Manning S,
Greenfield EA, Coyle AJ, Sobel RA, et al: Th1-specific cell surface protein Tim-3
regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease. Nature
2002, 415:536-541.
Anderson AC, Anderson DE, Bregoli L, Hastings WD, Kassam N, Lei C,
Chandwaskar R, Karman J, Su EW, Hirashima M, et al: Promotion of tissue
inflammation by the immune receptor Tim-3 expressed on innate immune cells.
Science 2007, 318:1141-1143.
Seki M, Oomizu S, Sakata KM, Sakata A, Arikawa T, Watanabe K, Ito K, Takeshita
K, Niki T, Saita N, et al: Galectin-9 suppresses the generation of Th17, promotes
the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune
arthritis. Clin Immunol 2008, 127:78-88.
Gleason MK, Lenvik TR, McCullar V, Felices M, O'Brien MS, Cooley SA, Verneris
MR, Cichocki F, Holman CJ, Panoskaltsis-Mortari A, et al: Tim-3 is an inducible
human natural killer cell receptor that enhances interferon gamma production in
response to galectin-9. Blood 2012.
110
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
190. Nagahara K, Arikawa T, Oomizu S, Kontani K, Nobumoto A, Tateno H, Watanabe K,
Niki T, Katoh S, Miyake M, et al: Galectin-9 increases Tim-3+ dendritic cells and CD8+ T
cells and enhances antitumor immunity via galectin-9-Tim-3 interactions. J Immunol
2008, 181:7660-7669.
191. Wang F, He W, Zhou H, Yuan J, Wu K, Xu L, Chen ZK: The Tim-3 ligand galectin9 negatively regulates CD8+ alloreactive T cell and prolongs survival of skin
graft. Cell Immunol 2007, 250:68-74.
192. Koguchi K, Anderson DE, Yang L, O'Connor KC, Kuchroo VK, Hafler DA:
Dysregulated T cell expression of TIM3 in multiple sclerosis. J Exp Med 2006,
203:1413-1418.
193. Liberal R, Grant CR, Holder BS, Ma Y, Mieli-Vergani G, Vergani D, Longhi MS:
The impaired immune regulation of autoimmune hepatitis is linked to a defective
galectin-9/tim-3 pathway. Hepatology 2012, 56:677-686.
194. Lee J, Park EJ, Noh JW, Hwang JW, Bae EK, Ahn JK, Koh EM, Cha HS:
Underexpression of TIM-3 and blunted galectin-9-induced apoptosis of CD4+ T
cells in rheumatoid arthritis. Inflammation 2012, 35:633-637.
195. Jones RB, Ndhlovu LC, Barbour JD, Sheth PM, Jha AR, Long BR, Wong JC,
Satkunarajah M, Schweneker M, Chapman JM, et al: Tim-3 expression defines a
novel population of dysfunctional T cells with highly elevated frequencies in
progressive HIV-1 infection. J Exp Med 2008, 205:2763-2779.
196. McMahan RH, Golden-Mason L, Nishimura MI, McMahon BJ, Kemper M, Allen
TM, Gretch DR, Rosen HR: Tim-3 expression on PD-1+ HCV-specific human
CTLs is associated with viral persistence, and its blockade restores hepatocytedirected in vitro cytotoxicity. J Clin Invest 2010, 120:4546-4557.
197. Ju Y, Hou N, Zhang XN, Zhao D, Liu Y, Wang JJ, Luan F, Shi W, Zhu FL, Sun WS,
et al: Blockade of Tim-3 pathway ameliorates interferon-gamma production from
hepatic CD8+ T cells in a mouse model of hepatitis B virus infection. Cell Mol
Immunol 2009, 6:35-43.
198. Fourcade J, Sun Z, Benallaoua M, Guillaume P, Luescher IF, Sander C, Kirkwood JM,
Kuchroo V, Zarour HM: Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated
with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp
Med 2010, 207:2175-2186.
199. DeKruyff RH, Bu X, Ballesteros A, Santiago C, Chim YL, Lee HH, Karisola P,
Pichavant M, Kaplan GG, Umetsu DT, et al: T cell/transmembrane, Ig, and mucin3 allelic variants differentially recognize phosphatidylserine and mediate
phagocytosis of apoptotic cells. J Immunol 2010, 184:1918-1930.
200. Chiba S, Baghdadi M, Akiba H, Yoshiyama H, Kinoshita I, Dosaka-Akita H, Fujioka
Y, Ohba Y, Gorman JV, Colgan JD, et al: Tumor-infiltrating DCs suppress nucleic
acid-mediated innate immune responses through interactions between the
receptor TIM-3 and the alarmin HMGB1. Nat Immunol 2012, 13:832-842.
201. Kikushige Y, Shima T, Takayanagi S, Urata S, Miyamoto T, Iwasaki H, Takenaka K,
Teshima T, Tanaka T, Inagaki Y, Akashi K: TIM-3 is a promising target to
selectively kill acute myeloid leukemia stem cells. Cell Stem Cell 2010, 7:708-717.
202. Zhuang X, Zhang X, Xia X, Zhang C, Liang X, Gao L, Zhang X, Ma C: Ectopic
expression of TIM-3 in lung cancers: a potential independent prognostic factor
for patients with NSCLC. Am J Clin Pathol 2012, 137:978-985.
203. Cao E, Zang X, Ramagopal UA, Mukhopadhaya A, Fedorov A, Fedorov E, Zencheck
WD, Lary JW, Cole JL, Deng H, et al: T cell immunoglobulin mucin-3 crystal
structure reveals a galectin-9-independent ligand-binding surface. Immunity 2007,
26:311-321.
111
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
204.
205.
206.
207.
208.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
209.
210.
211.
212.
213.
214.
215.
216.
217.
218.
219.
Katoh S, Ishii N, Nobumoto A, Takeshita K, Dai SY, Shinonaga R, Niki T, Nishi N,
Tominaga A, Yamauchi A, Hirashima M: Galectin-9 inhibits CD44-hyaluronan
interaction and suppresses a murine model of allergic asthma. Am J Respir Crit
Care Med 2007, 176:27-35.
Bi S, Hong PW, Lee B, Baum LG: Galectin-9 binding to cell surface protein
disulfide isomerase regulates the redox environment to enhance T-cell migration
and HIV entry. Proc Natl Acad Sci U S A 2011, 108:10650-10655.
Nagae M, Nishi N, Murata T, Usui T, Nakamura T, Wakatsuki S, Kato R: Crystal
structure of the galectin-9 N-terminal carbohydrate recognition domain from
Mus musculus reveals the basic mechanism of carbohydrate recognition. J Biol
Chem 2006, 281:35884-35893.
Su EW, Bi S, Kane LP: Galectin-9 regulates T helper cell function independently
of Tim-3. Glycobiology 2011, 21:1258-1265.
Vaitaitis GM, Wagner DH, Jr.: Galectin-9 controls CD40 signaling through a Tim3 independent mechanism and redirects the cytokine profile of pathogenic T cells
in autoimmunity. PLoS One 2012, 7:e38708.
Kashio Y, Nakamura K, Abedin MJ, Seki M, Nishi N, Yoshida N, Nakamura T,
Hirashima M: Galectin-9 induces apoptosis through the calcium-calpain-caspase-1
pathway. J Immunol 2003, 170:3631-3636.
Tanikawa R, Tanikawa T, Hirashima M, Yamauchi A, Tanaka Y: Galectin-9 induces
osteoblast differentiation through the CD44/Smad signaling pathway. Biochem
Biophys Res Commun 2010, 394:317-322.
Dai SY, Nakagawa R, Itoh A, Murakami H, Kashio Y, Abe H, Katoh S, Kontani K,
Kihara M, Zhang SL, et al: Galectin-9 induces maturation of human monocytederived dendritic cells. J Immunol 2005, 175:2974-2981.
van de Weyer PS, Muehlfeit M, Klose C, Bonventre JV, Walz G, Kuehn EW: A
highly conserved tyrosine of Tim-3 is phosphorylated upon stimulation by its
ligand galectin-9. Biochem Biophys Res Commun 2006, 351:571-576.
Rangachari M, Zhu C, Sakuishi K, Xiao S, Karman J, Chen A, Angin M, Wakeham A,
Greenfield EA, Sobel RA, et al: Bat3 promotes T cell responses and autoimmunity
by repressing Tim-3-mediated cell death and exhaustion. Nat Med 2012.
Reddy PB, Sehrawat S, Suryawanshi A, Rajasagi NK, Mulik S, Hirashima M, Rouse
BT: Influence of galectin-9/Tim-3 interaction on herpes simplex virus-1 latency. J
Immunol 2011, 187:5745-5755.
Wang F, Xu J, Liao Y, Wang Y, Liu C, Zhu X, Chen ZK, Sun Z: Tim-3 ligand
galectin-9 reduces IL-17 level and accelerates Klebsiella pneumoniae infection.
Cell Immunol 2009, 269:22-28.
Niwa H, Satoh T, Matsushima Y, Hosoya K, Saeki K, Niki T, Hirashima M, Yokozeki
H: Stable form of galectin-9, a Tim-3 ligand, inhibits contact hypersensitivity and
psoriatic reactions: a potent therapeutic tool for Th1- and/or Th17-mediated skin
inflammation. Clin Immunol 2009, 132:184-194.
He W, Fang Z, Wang F, Wu K, Xu Y, Zhou H, Du D, Gao Y, Zhang WN, Niki T, et
al: Galectin-9 significantly prolongs the survival of fully mismatched cardiac
allografts in mice. Transplantation 2009, 88:782-790.
Shim JA, Park S, Lee ES, Niki T, Hirashima M, Sohn S: Galectin-9 ameliorates
herpes simplex virus-induced inflammation through apoptosis. Immunobiology
2012, 217:657-666.
Lv K, Zhang Y, Zhang M, Zhong M, Suo Q: Galectin-9 promotes TGF-beta1dependent induction of regulatory T cells via the TGF-beta/Smad signaling
pathway. Mol Med Report 2012.
112
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
220.
221.
222.
223.
224.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
225.
226.
227.
228.
229.
230.
231.
232.
233.
234.
Wang F, Wan L, Zhang C, Zheng X, Li J, Chen ZK: Tim-3-Galectin-9 pathway
involves the suppression induced by CD4+CD25+ regulatory T cells.
Immunobiology 2009, 214:342-349.
Yang L, Anderson DE, Kuchroo J, Hafler DA: Lack of TIM-3 immunoregulation in
multiple sclerosis. J Immunol 2008, 180:4409-4414.
Sziksz E, Kozma GT, Pallinger E, Komlosi ZI, Adori C, Kovacs L, Szebeni B, Rusai
K, Losonczy G, Szabo A, Vannay A: Galectin-9 in allergic airway inflammation
and hyper-responsiveness in mice. Int Arch Allergy Immunol 2010, 151:308-317.
Chen X, Song CH, Liu ZQ, Feng BS, Zheng PY, Li P, In SH, Tang SG, Yang PC:
Intestinal epithelial cells express galectin-9 in patients with food allergy that
plays a critical role in sustaining allergic status in mouse intestine. Allergy 2011,
66:1038-1046.
Elahi S, Niki T, Hirashima M, Horton H: Galectin-9 binding to Tim-3 renders
activated human CD4+ T cells less susceptible to HIV-1 infection. Blood 2012,
119:4192-4204.
Sakhdari A, Mujib S, Vali B, Yue FY, MacParland S, Clayton K, Jones RB, Liu J, Lee
EY, Benko E, et al: Tim-3 negatively regulates cytotoxicity in exhausted CD8+ T
cells in HIV infection. PLoS One 2012, 7:e40146.
Sehrawat S, Suryawanshi A, Hirashima M, Rouse BT: Role of Tim-3/galectin-9
inhibitory interaction in viral-induced immunopathology: shifting the balance
toward regulators. J Immunol 2009, 182:3191-3201.
Reddy PB, Schreiber TH, Rajasagi NK, Suryawanshi A, Mulik S, Veiga-Parga T, Niki
T, Hirashima M, Podack ER, Rouse BT: TNFRSF25 Agonistic Antibody and
Galectin-9 Combination Therapy Controls Herpes Simplex Virus-Induced
Immunoinflammatory Lesions. J Virol 2012, 86:10606-10620.
Moorman JP, Wang JM, Zhang Y, Ji XJ, Ma CJ, Wu XY, Jia ZS, Wang KS, Yao ZQ:
Tim-3 pathway controls regulatory and effector T cell balance during hepatitis C
virus infection. J Immunol 2012, 189:755-766.
Wu W, Shi Y, Li S, Zhang Y, Liu Y, Wu Y, Chen Z: Blockade of Tim-3 signaling
restores the virus-specific CD8(+) T-cell response in patients with chronic
hepatitis B. Eur J Immunol 2012, 42:1180-1191.
Nicholls JM, Agathanggelou A, Fung K, Zeng X, Niedobitek G: The association of
squamous cell carcinomas of the nasopharynx with Epstein-Barr virus shows
geographical variation reminiscent of Burkitt's lymphoma. J Pathol 1997,
183:164-168.
Chang ET, Adami HO: The enigmatic epidemiology of nasopharyngeal carcinoma.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006, 15:1765-1777.
Khanna R, Busson P, Burrows SR, Raffoux C, Moss DJ, Nicholls JM, Cooper L:
Molecular characterization of antigen-processing function in nasopharyngeal
carcinoma (NPC): evidence for efficient presentation of Epstein-Barr virus
cytotoxic T-cell epitopes by NPC cells. Cancer Res 1998, 58:310-314.
Lee SP, Chan AT, Cheung ST, Thomas WA, CroomCarter D, Dawson CW, Tsai CH,
Leung SF, Johnson PJ, Huang DP: CTL control of EBV in nasopharyngeal
carcinoma (NPC): EBV-specific CTL responses in the blood and tumors of NPC
patients and the antigen-processing function of the tumor cells. J Immunol 2000,
165:573-582.
Chien YC, Chen JY, Liu MY, Yang HI, Hsu MM, Chen CJ, Yang CS: Serologic
markers of Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma in
Taiwanese men. N Engl J Med 2001, 345:1877-1882.
113
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
235.
236.
237.
238.
239.
240.
241.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
242.
243.
244.
245.
246.
247.
248.
249.
250.
251.
252.
253.
254.
Paramita DK, Fatmawati C, Juwana H, van Schaijk FG, Fachiroh J, Haryana SM,
Middeldorp JM: Humoral immune responses to Epstein-Barr virus encoded
tumor associated proteins and their putative extracellular domains in
nasopharyngeal carcinoma patients and regional controls. J Med Virol 2011,
83:665-678.
Gourzones C, Barjon C, Busson P: Host-tumor interactions in nasopharyngeal
carcinomas. Semin Cancer Biol 2012, 22:127-136.
Kohler G, Milstein C: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predefined specificity. Nature 1975, 256:495-497.
Pontecorvo G: Production of mammalian somatic cell hybrids by means of
polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genet 1975, 1:397-400.
de StGroth SF, Scheidegger D: Production of monoclonal antibodies: strategy and
tactics. J Immunol Methods 1980, 35:1-21.
Metzger H: Molecular versatility of antibodies. Immunol Rev 2002, 185:186-205.
Roopenian DC, Akilesh S: FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age. Nat Rev
Immunol 2007, 7:715-725.
Hulett MD, Hogarth PM: Molecular basis of Fc receptor function. Adv Immunol
1994, 57:1-127.
Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT: Chimeric human antibody
molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains.
Proc Natl Acad Sci U S A 1984, 81:6851-6855.
Co MS, Queen C: Humanized antibodies for therapy. Nature 1991, 351:501-502.
Zou YR, Gu H, Rajewsky K: Generation of a mouse strain that produces
immunoglobulin kappa chains with human constant regions. Science 1993,
262:1271-1274.
Huston JS, Levinson D, Mudgett-Hunter M, Tai MS, Novotny J, Margolies MN,
Ridge RJ, Bruccoleri RE, Haber E, Crea R, et al.: Protein engineering of antibody
binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv
analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 1988, 85:58795883.
Seimetz D: Novel monoclonal antibodies for cancer treatment: the trifunctional
antibody catumaxomab (removab). J Cancer 2011, 2:309-316.
Weiner LM, Surana R, Wang S: Monoclonal antibodies: versatile platforms for
cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol 2010, 10:317-327.
Winiarska M, Glodkowska-Mrowka E, Bil J, Golab J: Molecular mechanisms of the
antitumor effects of anti-CD20 antibodies. Front Biosci 2011, 16:277-306.
Teeling JL, French RR, Cragg MS, van den Brakel J, Pluyter M, Huang H, Chan C,
Parren PW, Hack CE, Dechant M, et al: Characterization of new human CD20
monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin
lymphomas. Blood 2004, 104:1793-1800.
Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, Holt JA, Wong SG, Keith DE, Levin WJ, Stuart
SG, Udove J, Ullrich A, et al.: Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human
breast and ovarian cancer. Science 1989, 244:707-712.
Chen JS, Lan K, Hung MC: Strategies to target HER2/neu overexpression for
cancer therapy. Drug Resist Updat 2003, 6:129-136.
Hudis CA: Trastuzumab--mechanism of action and use in clinical practice. N Engl
J Med 2007, 357:39-51.
Patel D, Bassi R, Hooper A, Prewett M, Hicklin DJ, Kang X: Anti-epidermal growth
factor receptor monoclonal antibody cetuximab inhibits EGFR/HER-2
heterodimerization and activation. Int J Oncol 2009, 34:25-32.
114
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
255.
256.
257.
258.
259.
260.
261.
tel-00820984, version 1 - 7 May 2013
262.
263.
264.
265.
266.
267.
268.
269.
Li S, Schmitz KR, Jeffrey PD, Wiltzius JJ, Kussie P, Ferguson KM: Structural basis
for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab. Cancer Cell
2005, 7:301-311.
Zhang Z, Stiegler AL, Boggon TJ, Kobayashi S, Halmos B: EGFR-mutated lung
cancer: a paradigm of molecular oncology. Oncotarget 2010, 1:497-514.
Dubois EA, Cohen AF: Panitumumab. Br J Clin Pharmacol 2009, 68:482-483.
Ferrara N, Hillan KJ, Gerber HP, Novotny W: Discovery and development of
bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov
2004, 3:391-400.
Linke R, Klein A, Seimetz D: Catumaxomab: clinical development and future
directions. MAbs 2010, 2:129-136.
Robert C, Mateus C: [Anti-CTLA-4 monoclonal antibody: a major step in the
treatment of metastatic melanoma]. Med Sci (Paris) 2011, 27:850-858.
Shuptrine CW, Surana R, Weiner LM: Monoclonal antibodies for the treatment of
cancer. Semin Cancer Biol 2012, 22:3-13.
Advani R, Forero-Torres A, Furman RR, Rosenblatt JD, Younes A, Ren H, Harrop K,
Whiting N, Drachman JG: Phase I study of the humanized anti-CD40 monoclonal
antibody dacetuzumab in refractory or recurrent non-Hodgkin's lymphoma. J
Clin Oncol 2009, 27:4371-4377.
Ji XJ, Ma CJ, Wang JM, Wu XY, Niki T, Hirashima M, Moorman JP, Yao ZQ: HCVinfected hepatocytes drive CD4(+) CD25(+) Foxp3(+) regulatory T-cell
development through the Tim-3/Gal-9 Pathway. Eur J Immunol 2012.
Li H, Wu K, Tao K, Chen L, Zheng Q, Lu X, Liu J, Shi L, Liu C, Wang G, Zou W:
Tim-3/galectin-9 signaling pathway mediates T-cell dysfunction and predicts
poor prognosis in patients with hepatitis B virus-associated hepatocellular
carcinoma. Hepatology 2012, 56:1342-1351.
Nebbia G, Peppa D, Schurich A, Khanna P, Singh HD, Cheng Y, Rosenberg W,
Dusheiko G, Gilson R, Chinaleong J, et al: Upregulation of the tim-3/galectin-9
pathway of T cell exhaustion in chronic hepatitis B virus infection. PLoS One
2012, 7:e47648.
Stancic M, van Horssen J, Thijssen VL, Gabius HJ, van der Valk P, Hoekstra D,
Baron W: Increased expression of distinct galectins in multiple sclerosis lesions.
Neuropathol Appl Neurobiol 2011, 37:654-671.
Cederfur C, Salomonsson E, Nilsson J, Halim A, Oberg CT, Larson G, Nilsson UJ,
Leffler H: Different affinity of galectins for human serum glycoproteins: galectin3 binds many protease inhibitors and acute phase proteins. Glycobiology 2008,
18:384-394.
Oomizu S, Arikawa T, Niki T, Kadowaki T, Ueno M, Nishi N, Yamauchi A, Hattori
T, Masaki T, Hirashima M: Cell surface galectin-9 expressing th cells regulate th17
and foxp3(+) treg development by galectin-9 secretion. PLoS One 2012, 7:e48574.
Jimenez AS, Gressette M, Barjon C, Wei M, Gourzones C, Busson P: Rapid
obtention of stable, bioluminescent tumor cell lines using a tCD2-luciferase
chimeric construct. BMC Biotechnol 2011, 11:26.
115