Université de Bourgogne 17 et 18 Juin 2015 Ecole

Université de Bourgogne
17 et 18 Juin 2015
Ecole Doctorale Environnements Santé
M2R Signalisation Cellulaire et Moléculaire
Par : Antoine BERGER
Liens entre le nitrate et le monoxyde d’azote dans la réponse
immunitaire de Medicago truncatula
Unité Mixte de Recherche 1347 Agroécologie
Agrosup Dijon – INRA – Université de Bourgogne
Pôle Mécanisme et Gestion des Interactions Plantes-Microorganismes
ERL CNRS 6300
Maitre de stage :
Sylvain Jeandroz
Co-encadrement :
Elise Thalineau
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Sommaire!
Introduction*................................................................................................................................................*3*
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Matériels*et*Méthodes*..............................................................................................................................*5!
1.!Matériels*.........................................................................................................................................................*5!
2.!Méthodes*.........................................................................................................................................................*6!
2.1.!Quantification!des!nitrates!intracellulaires!..................................................................................................!6!
2.2.!Détection!du!NO!par!le!DAF!.................................................................................................................................!6!
2.3.!Quantification!des!S=nitrosothiol!(SNO)!.........................................................................................................!6!
2.4.!Détection!du!peroxyde!d’hydrogène!(H2O2)!.................................................................................................!7!
2.5.!Transformation!des!racines!.................................................................................................................................!7!
2.6.!Test!ELISA!contre!les!protéines!d’A.%euteiches!sur!racines!transformées!........................................!8!
2.7.!Immunodétection!des!protéines!........................................................................................................................!8!
2.8.!Production!de!la!glutamine!synthétase!recombinante!............................................................................!9!
2.9.!Immunoprécipitation!des!protéines!tyrosine=nitrées!..............................................................................!9!
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Résultats*....................................................................................................................................................*10!
1.!Effet*de*la*nutrition*azotée*sur*la*concentration*racinaire*en*nitrate,**la*production*de*NO*
et*la*concentration*en*SNO*.............................................................................................................................*10!
2.!Impact*du*NO*lors*de*l’interaction*plante/pathogène*..................................................................*12!
2.1.!Confirmation!des!transformations!génétiques!permettant!une!altération!de!l’homéostasie!
du!NO!.......................................................................................................................................................................................!12!
2.2.!Effet!de!l’altération!de!l’homéostasie!du!NO!sur!la!résistance!à!A.%euteiches!..............................!14!
2.3.!Effet!de!la!production!de!SNO!sur!le!métabolisme!azoté!.....................................................................!14!
3.!Modifications*postGtraductionnelles*des*protéines*par*tyrosine*nitration*..........................*15!
3.1.!Production!de!H2O2!..................................................................................................................................................................!15!
3.2.!Détection!du!nitro=protéome!...............................................................................................................................................!16!
3.3.!Tyrosine!nitration!de!la!glutamine!synthétase!............................................................................................................!17!
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Discussion*.................................................................................................................................................*19*
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Perspectives.*............................................................................................................................................*23*
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Références*bibliographiques*.............................................................................................................*23!
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Abréviations :*
APF, aminophenyle fluorescéine CaMV, virus de la mosaïque du choux-fleur ; Ctl, contrôle ;
DAF, diamino fluoresceine ; FAA, formes actives de l’azote ; FAO, formes actives de l’oxygène ;
GFP, green fluorescent protein ; GS, glutamine synthétase ; GS1, GS isoforme 1 ; GS2, GS
isoforme 2 ; GSH, glutathion ; GSNO, nitrosogluthation ; GSNOR, GSNO réductase ; GSSG,
gluthation oxide ; Hmp, Hémoblogine ; HRP, Horse radish peroxidase ; kDa, kiloDalton ; LB,
Luria Broth ; N∅, milieu sans nitrate ; NH3, ammoniac ; NH4
-, ammonuim ; NiR, nitrite réductase ;
NNED, N-(1-naphtyl)-ethlendiaminedihydrochloride ; NO, monoxyde d’azote ; NO2
- , nitrite ; NO3 -
: nitrate ; NPS, milieu complet azote, phosphate, soufre ; NR, nitrate réductase ; nsHb :
Hémoglobine non symbiotique ; O2.-, anion superoxyde ; ONOO-, peroxynitrite ; SNAP, S-nitroso
acetylpenicillamine

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Introduction!
Pour survivre aux attaques des microorganismes pathogènes présents dans leur
environnement, les plantes ont développé un système immunitaire évolué et efficace. Ce système
est composé d’éléments constitutifs, tels que des barrières physiques externes (cuticule et parois) et
chimiques (composés anti-microbiens), mais également d’une réponse immunitaire induite. De
manière générale, cette dernière est basée sur la reconnaissance des pathogènes ou de molécules
produites par ceux-ci, générant des voies de signalisation qui peuvent conduire à la résistance via un
renforcement des barrières physiques, la production de molécules comme les formes actives de
l’oxygène (FAO), la transcription de gènes de défense qui codent des protéines à action
antimicrobienne (protéines PR), ou des enzymes impliquées dans la synthèse d’antibiotiques
(phytoalexines) ou des phénomènes de mort cellulaire (réponse hypersensible), limitant la
progression du pathogène (Garcia-Brugger et al., 2006).
L’issue de l’interaction (résistance quantitative ou qualitative) dépend donc de la
reconnaissance du pathogène mais également d’effets environnementaux. En effet, de nombreux
éléments bibliographiques montrent un lien entre la disponibilité en nutriment, et la mise en place
de la réponse immunitaire ; les plantes soumises à une carence ou à un excès d’un élément nutritif
montrent ainsi des degrés de résistance ou de susceptibilité variés (Dordas, 2008).
L’azote est un des éléments nutritifs majeurs pour la plante. Chez de nombreuses plantes, la
source majeure d’azote est le nitrate (NO3
-) (Gojon et al., 2011), qui après son import par des
transporteurs NRT, est réduit de manière enzymatique en nitrite (NO2
-) puis en ammonium (NH4 +).
Ce dernier est ensuite pris en charge par la glutamine synthétase (GS) afin de catalyser la synthèse
de la glutamine nécessaire à la formation des autres acides aminés impliqués notamment dans la
croissance des plantes mais également dans la formation de protéines impliquées dans la réponse
immunitaire. Les effets de la nutrition azotée sur la résistance semblent dépendre du pathosystème,
par exemple un apport plus important en nitrate favoriserait l’infection par Magnaporthe grisea
chez le riz (Long et al., 2000) alors que l’inverse est observé entre la pomme de terre et le
pathogène Phytophthora infestans (Ros et al., 2008). Au niveau moléculaire, il a notamment été
montré que la disponibilité en azote influence l’expression des protéines de défenses ou la
production de FAO en fonction du pathogène (Fagard et al., 2014). Un lien existe donc entre la
nutrition azotée et la réponse immunitaire.
Le monoxyde d’azote (NO), gaz hydrophobe hautement diffusible, est un acteur clé dans la
transduction du signal issu de la reconnaissance du pathogène qui participe au déclenchement de la
réponse immunitaire (Stamler et al., 1992 ; Koen et al., 2013). Dans ce cadre, les effets du NO sont

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nombreux, il peut notamment activer des gènes codant pour des protéines impliquées dans la
défense, participer à l’induction de la réponse hypersensible ou plus directement modifier des
protéines par différents types de modifications post-traductionnelles (tyrosine nitration, métal-
nitrosylation, S-nitrosylation) (Besson-Bard et al., 2008).
Le NO est l’un des produits issu du métabolisme de l’azote. Sa biosynthèse peut être
catalysée à partir des nitrites par la Nitrate Réductase (NR) (Rockel et al., 2002). Inversement, il a
été montré que le NO pouvait réguler, par rétrocontrôle, l’expression d’un gène codant pour un
transporteur de nitrate et l’activité NR (Frungillo et al., 2014). Par cette voie de régulation, le NO
module donc l’assimilation du nitrate et par conséquent le métabolisme azoté lui-même (Figure 1).
Ces données laissent penser que le NO pourrait constituer un lien entre la nutrition azotée
par les nitrates et la réponse immunitaire et permettrait ainsi expliquer en partie les effets de la
nutrition sur les défenses.
Des travaux précédents réalisés dans l’équipe ont permis de mettre en évidence un effet de la
carence en nitrate sur la résistance de Medicago truncatula face au champignon pathogène
Aphanomyces euteiches (Thalineau et al., en préparation). L’objectif de mon projet consiste à
analyser l’interaction entre le nitrate et le NO dans le cadre de la réponse immunitaire chez
M. truncatula suite à l’infection, et ainsi à mieux comprendre l’impact du NO dans les relations
nutrition/défense.
Différentes approches ont été développées pour répondre à cet objectif. Nous avons tout
d’abord étudié, en présence ou non du pathogène, l’effet de la disponibilité en nitrate sur la
production des formes actives de l’azote (FAA). Pour étudier le rôle du NO dans la réponse
immunitaire, il nous est apparu ensuite nécessaire de développer un système permettant de moduler
l’homéostasie du NO grâce à l’utilisation de trois types de racines transformées. Une construction
RNAi ciblant les ARNm codant NR1 et NR2 (RNAi ::MtNR1/2), les deux isoformes de la nitrate
réductase (NR) a été réalisée. Celle-ci provoque donc potentiellement une diminution de la
concentration intracellulaire en NO puisque cette enzyme est impliquée dans sa biosynthèse. Les
deux autres constructions consistent en une surexpression sous contrôle d’un promoteur constitutif
fort (CaMV 35S) du gène codant pour la GSNO Réductase (35S ::GSNOR) et du gène codant pour
une hémoglobine bactérienne (35S ::Hmp). Les deux protéines codées par ces gènes participent à la
dégradation du NO et provoqueraient donc également une diminution de l’accumulation de NO.
Ces différentes réactions permettent donc de réguler la concentration de NO présent dans la plante.
Enfin, nous nous sommes intéressés aux effets de NO sur les protéines par l’étude du phénomène de
tyrosine nitration. Cette modification post-traductionnelle qui consiste en l’addition d’un
groupement NO2 sur les résidus tyrosine des protéines, est induite par le peroxynitrite (ONOO-)

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formé à partir du NO et de l’anion superoxide (O2.-) (Abello et al., 2009). Cette modification joue
un rôle important lors des interactions entre plantes et pathogènes en modifiant à la fois des
protéines impliquées dans la réponse immunitaire et des protéines impliquées dans le métabolisme
azoté (Cecconi et al., 2009 ; Melo et al., 2011, Szuba et al., 2015).
Matériels!et!Méthodes!
1. Matériels!
Les graines des génotypes A17 (résistant à A. euteiches) et F83005.5 (sensible à
A. euteiches et appelé F83 par la suite) de M. truncatula sont scarifiées dans de l’acide sulfurique
pendant 6 minutes puis mises à germer sur un milieu bacto-agar (0,7%) pendant 48h dont 24h en
chambre froide à l’obscurité et 24h en phytotron (photopériode de 16h/8h et thermopériode
22°C/19°C, intensité lumineuse 380 µmol.m2.s-1). Les plantules sont par la suite transférées sur un
milieu complet dit NPS (3 mM MgSO4 ; 0,8 mM KNO3 ; 0,84 mM KCl ; 1,3 mM KH2PO4 ; 1,25
mM Ca(NO3)2 ; pH 5.5) ou un milieu carencé en azote dit N∅ (3 mM MgSO4 ; 1,66 mM KCl ; 1,3
mM KH2PO4 ; 1,25 mM CaCl2 ; pH 5.5). L’inoculation des plantes par A. euteiches se fait au niveau
des racines avec une solution de zoospores à environ 5.105 zoospores/ml.
La culture d’A. euteiches est maintenue par des repiquages successifs hebdomadaires sur un
milieu Corn Meal Agar (Sigma, 1% CMA + 1% agar). L’obtention des zoospores, est réalisée à
partir d’explants prélevés directement sur ce milieu et repiqués dans un milieu peptone glucose
(20 g/l bactopeptone ; 5 g/l glucose) pendant 24h. Le mycélium obtenu est alors carencé par 3
lavages successifs avec de l’eau commerciale de Volvic stérile et un dernier lavage avec 30 ml
Figure 1 : Production et dégradation du NO, et liens
avec le métabolisme azoté et la réponse immunitaire
d’après Frungillo et al., 2014.