Allocation de Recherche Doctorale pour site EdNBISEx

ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
EA 4358 Glyco-MEV, Université de Rouen
Sujet de thèse
Défense naturelle des plantes: Recherche de nouvelles
substances élicitrices des défenses naturelles (SDN) et
caractérisation des réponses moléculaires.
Contacts
Jean Claude Mollet, [email protected]
Les plantes de grandes cultures sont soumises à de nombreux stress biotiques (insectes,
nématodes, mollusques, bactéries, champignons, oomycètes, …) et la mise en compétition avec de
multiples plantes adventices. L’impact sur la production et/ou la valeur ajoutée du produit peut
s’avérer dramatique, ce qui implique inéluctablement des apports de pesticides et/ou herbicides.
Dans l’objectif de réduire les intrants chimiques, la connaissance du fonctionnement de lacellule
végétale et des interactions avec les microorganismes sont indispensables pour mieux appréhender
les stratégies de bioprotection de la plante. Ainsi, un moyen de réduire l’apport des pesticides est, en
anticipant les attaques, de préparer la plante à mettre en place ses propres mécanismes de défense
comme on le ferait en vaccinant. Cette étape peut être réalisée par l’ajout exogène de substances de
défenses naturelles (SDN) ou éliciteurs capables d’induire les défenses des plantes sans modifier
leurs valeurs commerciales (réduction des rendements, de la qualité des produits isolés…).
Ce projet de thèse en relation avec l’axe thématique 2 du GRR VASI : Nouvelles stratégies de lutte
biologique dérivant du projet ALTERAGRO entre dans ce contexte et vise à caractériser de nouvelles
SDN capables d’induire une meilleure résistance des plantes en utilisant des molécules d'origine
naturelle (comme les produits homologués iodus40 ou stilfénia) et ainsi de proposer une alternative
aux pesticides actuels. Un criblage à haut débit par lecteur de plaques à fluorescence (PRIMACEN)
de chimiothèques (2500 composés), a été réalisé sur une suspension cellulaire et consistait à mettre
en évidence suite à l’élicitation une induction des formes réactives de l’oxygène (FRO), impliquées
dans les premières étapes de réactions de défenses. 17 composés ont été retenus car (1) ils étaient
capables d’induire une plus forte production de FRO que des éliciteurs connus (laminarine,
peptidoglycan, stifénia et chitosan) et (2) n’affectaient pas la viabilité cellulaire (Zahid et al., non
publié). Les travaux seront réalisés principalement sur la plante modèle Arabidopsis thaliana dont le
génome a été
séquencé (disposant d’une ressource bioinformatique et de banques de plantes mutantes
considérables), et appartenant à la même famille qu'une plante de grande culture régionale: le colza
ou le chou. Des essais seront tout de même réalisés sur des plantes d'intérêt agronomique (lin en
particulier). 1. Etude macroscopique des effets des SDN sur le phénotype des plantules Les
molécules candidates seront éprouvées sur des plantules d'Arabidopsis en croissance. Les effets
doses-réponses,
cinétiques et réversibles de ces composés seront ensuite étudiés d'une part sur l'aspect qualitatif et
quantitatif de la croissance et du développement (système racinaire et aérien) par rapport aux plantes
non élicitées. Certaines observations fines seront réalisées par microscopie électronique à balayage
(Plateau technique GRR VASI). L'innocuité des molécules sera aussi testée sur les cellules
contenant les cellules spermatiques mâles, les tubes polliniques, afin de s'assurer que celles-ci ne
provoqueront pas des perturbations dans les mécanismes de reproduction sexuée et une éventuelle
diminution dans la production des graines. 2. Etude microscopique des inductions moléculaires après
élicitation
La paroi étant la première zone de contact, la perception de ces molécules élicitrices démarrent dans
ce compartiment extracellulaire. Après production de ROS et transduction du signal, la synthèse de
nouvelles molécules est induite et certaines s'intègrent dans le réseau pariétal existant afin soit de le
renforcer (callose, extensine, lignine), soit de ralentir la progression du microorganisme grâce à leurs
propriétés antimicrobiennes (protéines PR pour « pathogenesis related proteins » comme les
peptides de type défensines, lipid transfer proteins, ou enzymes de type glucanases ou des enzymes
comme la phénylalanine ammonia-lyase impliquée dans la synthèse des lignines). Dans un premier
temps, une détection des marqueurs de défense induits par l’élicitation sera entreprise. Elle
consistera tout d’abord à déterminer sur les SDN retenus si des FRO sont induites sur les plantules
ainsi que les composés pariétaux comme la callose, la lignine et les extensines. Ces différentes
phases de cette étude seront appréhendées par des approches cytochimiques ou immuno
cytochimiques en microscopie confocale à balayage laser (PRMACEN). Les SDN capables d’induire
ces composés seront sélectionnés. Une étude plus fine par microscopie électronique à transmission
(PRIMACEN) permettra d’étudier à l’échelle sub-cellulaire la répartition de ces composés. Sur ces
SDN sélectionnés, des analyses du profil protéique seront effectuées par électrophorèse
bidimentionelle et les spots seront analysés par protéomique afin de déterminer si l'élicitation a induit
la production des protéines PR (pathogenesis related proteins) (plate-forme de Protéomique de
l'IRIB). Une étude sur les différents organes permettra finalement de déterminer si la réponse de la
plante est locale ou systémique. 3. Déterminer l’impact des SDN sur l’amélioration de la résistance
des plantes.
En collaboration avec les partenaires du GRR VASI (Biosol de l'ESITPA et LMSM de l'Université de
Rouen), les SDN seront testées sur différents pathosystèmes comme Aphanomyces euteiches
(Oomycètes)/ pois protéagineux, deux champignons Fusarium oxysporum / Arabidopsis thaliana et
Verticillium dahliae / lin et sur des bactéries pathogènes de la pomme de terre. L’objectif sera de
déterminer si la progression et la colonisation du pathogène sur la plante préalablement traitée avec
une SDN sont réduites par rapport aux plantes témoins.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
Agri TERR ESITPA
EA 4358 Glyco-MEV, Université de Rouen
Sujet de thèse
Rôle des arabinogalactanes protéines dans la protection des
plantes : de leur identification à leur application in situ
Contacts
Karine Laval, [email protected]
Azeddine Driouich, [email protected]
Les cultures de pois, de lin et de colza sont reconnues en Haute Normandie pour présenter un intérêt
agronomique et économique régional considérable. Toutefois, le rendement de ces cultures et la
qualité de leurs produits se trouvent fortement affectés par des maladies occasionées par des
pathogènes du sol et pour lesquels il n'existe aucun moyen de lutte efficace. Ainsi, les trois
pathosystèmes concernés par ce projet sont: Pois (Pisum sativum) / Aphanomyces euteiches ; Lin
(Linum usitatissimum) / Verticilium dahliae ; colza (Brassica napus) / Sclerotinia sclerotirum. Il est
essentiel de développer pour ces cultures régionales des méthodes alternatives de lutte basées sur i)
une meilleure compréhension du potentiel infectieux du sol et ii) des mécanismes cellulaires et
moléculaires régissant l’interaction et la réponse des plantes aux pathogènes. Les travaux
précédemment réalisés dans le cadre du projet Alteragro ont permis de montrer un effet des
arabinogalactane-protéines (AGP) issus des cellules bordantes de pois sur le cycle infectieux d’A.
euteiches (Brevet Européen*) . Il faut noter que les AGP extraits du colza ne présentent pas les
mêmes propriétés sur le développement d’A. euteiches que ceux provenant du pois, suggérant ainsi
une spécificité des AGP pour un pathosystème donné. Afin d’appréhender les effets des AGP dans le
cadre des trois pathosystèmes sélectionnés, nous proposons un travail en deux phases
expérimentales, la première in vitro, la seconde in situ.
Nous chercherons à déterminer in vitro: 1. L’effet des pathogènes sur les cellules bordantes de la
racine : Existe-t-il un effet des pathogènes sur les cellules bordantes et plus particulièrement sur la
peoduction des AGP dans les trois cas étudiés ? Cet effet se traduit-il uniquement par une
augmentation du nombre de cellules bordantes et/ou est-il lié à une induction de la synthèse des AGP
?
2. L’effet des AGP sur les pathogènes : Existe-t-il un effet des AGP sur le développement des
pathogènes dans les trois cas : Est-il possible d’établir une corrélation entre la composition des AGP,
la plante, et le pathogène qui lui est associé? Existe-t-il un seuil minimal d’AGP permettant le contrôle
du pathogène ?
Afin d’appréhender ces effets dans les trois pathosystèmes étudiés nous proposons d’effectuer in vitro
des tests par couple et des tests croisés visant à analyser l’impact d’un apport en AGP issus d’extraits
racinaires de pois, de colza et de lin sur la viabilité et le développement des agents pathogènes A.
euteiches, V.dahliae et S. sclerotinum. Des gradients de concentration d’AGP issus de racine de pois,
de colza et de lin seront testés sur les trois pathogènes sélectionnés. En outre, pour chacune des
espèces végétales, les AGP seront extraits de plantes sensibles et de plantes partiellement
résistantes à l’agent infectieux. Des contrôles faisant appel à des molécules voisines (AGP d’autres
plantes, pectine, gomme arabique,...) seront étudiés en parallèle. Les résultats obtenus in vitro
permettront de sélectionner les molécules les plus prometteuses et de les tester dans le sol sur les
pathogènes et les pathosystèmes. Parallèlement des approches moléculaires pour la quantification
des pathogènes seront validées. Nous chercherons à tester in situ 1. L’évolution des pathogènes dans
le sol en terme de croissance et d’état physiologique ; Cette évolution sera réalisée en cinétique reliée
avec les symptômes de la maladie observés sur la plante. L’impact du cortège microbien sur le
développement du pathogène.
2. Le devenir des AGP dans le sol et les quantités susceptibles d’induire un effet sur le
développement du pathogène. Ce questionnement se fera en lien avec une étude en cours « Projet
de Maturation SANTéPLANT » financé par l’agence de l’innovation en région Haute Normandie,
réalisée par le Dr. Marc Antoine Cannesan dans le cadre du pathosystème pois/ Aphanomyces
euteiches (responsable. Pr. A. Driouich). Ces travaux seront réalisés en conditions contrôlées grâce à
l’utilisation d’écosystèmes miniaturisés. La construction de serres expérimentales dés fin 2013 devrait
faciliter ces approches
Ces travaux sont particulièrement importants pour identifier des molécules existant en grande
quantité, faciles à produire et qui pourraient être commercialisées en tant que biopesticides. Ce travail
trouvera son aboutissement au travers d’expérimentations réalisées au champ, soit en micro-parcelles
expérimentales, soit par l’analyse de sols infestés (suivi des pathogènes au cours de la rotation).
*Cannesan MA, Vicré-Gibouin M, Gangneux C, Lerouge P, Laval K, Driouich A. Arabinogalactan
proteins for use as an antiparasitic agent. European patent N°11305788.9-2103. University of Rouen.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
EA 1293 ECODIV
Sujet de thèse
Effets des changements de pratiques agronomiques sur
l’habitat et la diversité microbienne du sol – conséquences sur
la disponibilité de l’azote
Contacts
Michael Aubert, [email protected]
La conservation des sols est une nécessité urgente pour notre agriculture, notre environnement et
donc nos sociétés. Celle-ci passe par la restauration de leur biodiversité et des fonctions associées.
Aujourd’hui, de nombreuses études sont menées sur le potentiel des sols en termes de stockage du
carbone, de minéralisation de l'azote ou de biodiversité. Cependant, les approches visant à évaluer la
combinaison de ces 3 services écosystémiques sont peu nombreuses. La réponse agronomique à la
nécessité de conservation des sols commence à prendre forme au travers de la mise en place de
systèmes de culture innovants. Ces derniers modifient les itinéraires culturaux classiques et incluent
des techniques culturales alternatives qui ont des impacts sur les propriétés chimiques, physiques et
biologiques du sol (Beninende et al., 2008). En effet, en réduisant la fréquence ou les doses des
intrants organique et/ou chimique, ces techniques affectent le cycle de la matière organique des sols
et donc ses propriétés biochimiques (Bending et al., 2004). Il est donc important, pour évaluer les
systèmes de culture à bas intrants, d’être en mesure de quantifier leur impact sur (1) la biodiversité
des sols y compris dans sa dimension fonctionnelle, (2) la capacité des sols à fournir des éléments
nutritifs au couvert végétal, (3) la fonction de puits de carbone des sols et la dynamique de ce
dernier.
Les microorganismes du sol, bactéries et champignons, sont les principaux acteurs de la
minéralisation de la matière organique du sol qui est à la base de 2 services écosystémiques majeurs
: le recyclage des nutriments pour la nutrition minérale des couverts végétaux et le stockage du
carbone (Doran and Zeiss 2000). Les microorganismes sont sensibles à différents paramètres
biotiques et abiotiques qui vont influencer les équilibres entre minéralisation et stockage (Monaco et
al., 2008). Parmi ces paramètres, les propriétés biochimiques de l’habitat semblent jouer un rôle
majeur dans le développement des communautés microbiennes (Nsabimana et al., 2004). En effet, le
sol est une matrice hétérogène formée de particules minérales et organiques à l’origine de la
formation de complexes organo-minéraux (Gobat et al. 2004). La composition biochimique de la
matière organique induit une diversité dans la nature et dans l’abondance des complexes organominéraux. Toute modification de ceux-ci peut induire de nouvelles niches écologiques ou en détruire
d’anciennes, impactant à la fois la composition des communautés microbiennes mais aussi la
résultante fonctionnelle de l'activité biologique des sols (Sollins et al. 1996; Bending et al., 2004).
Ainsi, selon Sotres et al. (2005), la mise en place d’indicateurs de la qualité biochimique des sols,
nécessite à la fois la standardisation des méthodes analytiques et la compilation des données
concernant les propriétés biochimiques des sols sous diverses conditions géographiques et
différentes utilisations et modes de gestion des sols. Le travail de thèse vise donc à caractériser une
interface peu prise en compte entre la physico-chimie des sols et la biologie ou l’écologie
microbienne des sols. Il consiste en une caractérisation biochimique de l’habitat afin d’apporter des
éléments de compréhension des interactions matrice sol / vie biologique. Les objectifs de cette thèse
sont de caractériser le rôle biochimique de l’habitat comme facteur écologique déterminant la
structure des communautés microbiennes des sols. Il se décline en 3 volets :
- Détermination des indicateurs de caractérisation de l’habitat
- Modification de l’habitat par les pratiques agronomiques
- Impact des changements des caractéristiques de l’habitat sur le pool d’espèce et sur la
communauté
fonctionnelle.
Ce travail nécessite des expérimentations menées sur le terrain (approche in situ) et des
expérimentations au laboratoire en conditions contrôlées (approche ex situ)
Résultats attendus : Aspects fondamentaux : Mieux comprendre la dynamique de la matière
organique endogène du sol face aux nouveaux enjeux de stockage du carbone, de cycle de l'azote et
de maintien de la biodiversité. Déterminer des indicateurs permettant de caractériser cette matière
organique en relation avec le compartiment microbien des sols. Contribuer à la compréhension des
relations entre les caractéristiques biochimique de l’habitat et les communautés microbiennes des
sols en utilisant des outils technologiques récents. Apporter des éléments de réflexion pour la
hiérarchisation des facteurs écologiques controllant les communautés microbiennes et de leur
fonctionnement. Aspects finalisés : Comprendre l’impact des pratiques agronomiques, non seulement
sur le compartiment biologique du sol ou la composante physico-chimique, mais sur leur interface,
représentée par les propriétés biochimiques des sols. Fournir des indicateurs biochimiques de qualité
des sols (Miralles et al., 2007). Fournir des indicateurs susceptibles de prédire l’impact de la
conversion des pratiques agricoles sur l’efficience des services écosystémiques (fertilité minérale des
sols, stockage du carbone) et ainsi contribuer à l’élaboration d’outils d’aide à la décision
agronomique.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
Laboratoire de Communication et Différenciation Neuronale et
Neuroendocrine, DC2N, Inserm U982, Equipe 3 "Astrocyte et
Niche Vasculaire"
Sujet de thèse
Nouvelle signature structurelle et fonctionnelle des récepteurs
chimiotactiques « professionnels »? Application potentielle au
traitement des tumeurs cérébrales
Contacts
Hélène Castel, helene.castel@ univ-rouen.fr
La super famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est la plus large famille des
protéines transmembranaires du génome humain. Des altérations fonctionnelles de ces récepteurs
participent à de nombreuses pathologies telles que l’inflammation et les maladies auto-immunes, les
maladies cardiovasculaires, les dysfonctionnements endocrines, un grand nombre de processus
neurophysiopathologiques, mais aussi le cancer, ce qui explique qu’environ 50% des thérapies
actuelles ciblent les RCPG. L’analyse des arbres phylogénétiques de RCPG de la classe A chez
différentes espèces, indique que les récepteurs somatostatinergiques dont le récepteur du peptide
urotensine II (UII) nommé UT, des chimiokines professionnelles incluant le récepteur CXCR4 ainsi
que les récepteurs purinergiques, sont phylogénétiquement liés. En effet, Chabbert et coll. (UMR
CNRS 6214 - INSERM U771, Angers, France) avec qui notre équipe collabore, ont proposé que ces
récepteurs ont une origine commune résultant d’une délétion dans le deuxième domaine
transmembranaire (TM2) apparue tôt au cours de l’évolution (Chabbert et al. 2012).
Une hypothèse récente suggère que l’élément clef du chimiotactisme réside dans la capacité des
récepteurs à recruter un nombre supérieur de protéines G à l’avant des cellules en migration (Xu et
al., 2005), suggérant que les récepteurs chimiotactiques se définissent par un mécanisme
d’activation particulier. Nous émettons l’hypothèse selon laquelle ces récepteurs qui auraient une
origine commune, résultent d’une délétion évolutive d’un acide aminé dans le TM2, à l’origine d’une
structure en coude « typique » au niveau d’une proline. Notre hypothèse est que ce coude est
responsable d’un mécanisme d’activation particulier, spécifique des récepteurs chimiotactiques.
Les chimiokines, les agonistes purinergiques, mais aussi les neuropeptides vasoactifs tels que
l’UII (Lecointre et al., 2009), sont des acteurs majeurs de la régulation de la croissance et des
propriétés métastasiques des tumeurs malignes, et affectent la néo-angiogenèse et l’invasion des
tumeurs cérébrales gliales. Le projet de thèse consistera dans un premier temps à réaliser des
insertions/délétions/mutations du TM2 de récepteurs présentant un coude proline, i.e. les récepteurs
humains du SDF-1, le CXCR4 et de l’urotensine II; l’UT, ou d’un récepteur avec un renflement au
niveau de la proline, le récepteur du peptide kiss, le KISS1R. Les mutants seront fusionnés aux
épitopes HA et c-myc et des lignées stables de cellules HEK et/ou NIH3T3 transfectées par les
ADNc codant ces récepteurs seront établies. Nous étudierons l'expression des récepteurs par PCR,
Western blot et FACS, nous caractériserons leur translocation correcte à la membrane plasmique
(Elisa, Immunocytochimie), et nous utiliserons la méthode de transfert d’énergie par fluorescence
(FRET-HTRF) pour réaliser des études de liaison afin de comparer les affinités des agonistes et
antagonistes des récepteurs sauvages et mutants. Dans un deuxième temps, sur le panel de
récepteurs mutants caractérisés, il s’agira de mettre en évidence le rôle de la distorsion du TM2
dans l'activation des récepteurs (couplages aux protéines G par la méthodologie BRET, voies de
signalisation, ainsi que processus d’oligomérisation de récepteurs). Par Western blot et FACS, la
cinétique et l'amplitude de l'activation des effecteurs de la voie PI3K tels que AKT, ERK, et/ou
Rho/Rac seront analysées. La conséquence sur la morphologie cellulaire et la polymérisation de Factine sera évaluée en utilisant le vidéomicroscope confocal (SP5, plate-forme d’imagerie de HauteNormandie, PRIMACEN). Le rôle de ces différents récepteurs sera évalué sur la migration cellulaire
grâce au test de la chambre de Boyden et au test de recouvrement d’une zone lésée. Enfin, dans un
troisième temps, nous envisageons de réaliser des xénogreffes hétérotopiques des lignées NIH3T3
exprimant de manière stable les récepteurs humains, sauvages ou mutés, dans des souris Nude,
afin d’étudier la cinétique de croissance tumorale, les processus nécrotiques/apoptotiques,
l’architecture néovasculaire et les processus métastasiques éventuels.
Dans le cadre des collaborations établies avec les Dr I. Milazzo (COBRA, IRCOF, Université de
Rouen, France) et M. Chabbert, il sera aussi recherché la structure des ligands peptidiques liés aux
récepteurs sauvages et mutés afin de modéliser la structure active de ces récepteurs. En comparant
avec les données expérimentales, nous allons accéder à des changements conformationnels
nécessaires pour l'activation. Ce projet contribuera à la conception de ligands spécifiques des
récepteurs chimiotactiques, cibles thérapeutiques de choix dans les tumeurs particulièrement
invasives et vascularisées, telles que les tumeurs cérébrales.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
Laboratoire "Endothélium Microvasculaire et Lésions
Cérébrales Néonatales"
Sujet de thèse
Effet d’une exposition anténatale au sulfate de magnésium sur
le développement du réseau neurovasculaire : Impact potentiel
sur des vasculopathies
Contacts
Bruno Gonzalez, [email protected]
Situation du projet
Dans les pays industrialisés, les lésions cérébrales du nouveau-né constituent la première cause de
handicaps moteurs, de déficits cognitifs et de troubles psychologiques ultérieurs. Les outils
permettant d’établir un diagnostic ou un pronostic manquent et il n’existe à ce jour aucun traitement
préventif utilisé en routine. Le sulfate de magnésium est utilisé en pratique clinique pour son action
tocolytique chez la femme enceinte. Une récente étude clinique internationale impliquant le CHU de
Rouen, Service de Pédiatrie Néonatale du Pr S Marret, membre du laboratoire NeoVasc, a
démontré que le sulfate de magnésium réduit le risque de lésions cérébrales (Doyle et coll., BJOG,
2011). Toutefois, à ce jour le(s) mode(s) d’action du sulfate de magnésium reste(nt) inconnu(s). De
plus, les protocoles cliniques et les doses de sulfate de magnésium administrées à la femme
enceinte varient énormément d’un pays à un autre et certaines études nord-américaines rapportent
de possibles effets secondaires notamment sous forme de vasculopathies.
Objectifs :
Compte-tenu de ces éléments, les objectifs de ce projet de thèse sont :
1/ Caractériser le(s) mode(s) d’action associé(s) aux effets neuroprotecteurs du sulfate de
magnésium dans un environnement lésionel
2/ Rechercher d’éventuels effets secondaires délétères notamment sur le réseau microvasculaire
cérébral
Descriptif détaillé
Objectif 1. Les lésions cérébrales du nouveau-né sont caractérisées par une dégénérescence
nerveuse de natures nécrotique et apoptotique. Cette partie du projet de thèse vise à déterminer si
le sulfate de magnésium a un impact sur l’un ou l’autre voire les deux types de mort. Pratiquement,
l’effet de faibles et de fortes doses de sulfate de magnésium sera testé sur un modèle de tranches
de cortex de rongeurs nouveau-nés cultivées dans un environnement normal ou pathologique
(excitotoxique). Ce modèle d’étude a été préalablement validé au laboratoire NeoVasc (Desfeux et
coll., Cereb Cortex, 2010). Concernant l’apoptose, quatre paramètres seront quantifiés : le clivage
de la caspase-3 et l’expression du gène pro-apoptotique Bax par la technique de western blot, la
visualisation de la caspase-3 par imagerie confocale et la mesure de l’activité de la caspase-3.
Concernant la nécrose, trois paramètres seront quantifiés : l’activité lactate déshydrogénase (un
marqueur de perméabilisation membranaire), la visualisation de la mortalité nécrotique par un
marquage à la 7-amino-actinomycine D et l’œdème cellulaire.
Objectif 2. Des travaux récents obtenus chez l’Homme par le Pr R. Mittendorf suggèrent que le
sulfate de magnésium, aux doses utilisées aux USA, induirait des effets secondaires en altérant
l’angiogenèse cérébrale (Mittendorf et Dammann, J Perinatol, 2006). Cette partie du projet va donc
consister à rechercher, par la technique de vidéomicroscopie, l’effet du sulfate de magnésium sur
l’angiogenèse corticale. En pratique, les études seront menées in vivo (après traitement de souris
gestantes aux doses utilisées en clinique) et ex vivo sur des tranches de néocortex de rongeurs
nouveau-nés. Ces tranches seront maintenues en survie sous un microscope inversé équipé d’une
chambre d’incubation dont l’atmosphère est contrôlée et traitées par différentes doses de sulfate de
magnésium. Les microvaisseaux seront visualisés à l’aide de la sonde fluorescente isolectine B4FITC et des images seront acquises toutes les 30 minutes à l’aide d’une caméra numérique. Les
données seront traitées à l’aide du logiciel Metamorph et donneront accès aux distances
parcourues, trajectoires et vitesses d’élongation des microvaisseaux.
L’ensemble du projet de thèse sera réalisé chez le rongeur en utilisant des approches in vitro, ex vivo
et in vivo. Il s’inscrit dans un protocole plus vaste incluant notamment un versant clinique. Un
partenariat international avec le Pr R. Mittendorf (Chicago, USA) est envisagé. A terme, ce projet de
thèse contribuera à clarifier le message délivré aux cliniciens quant à l’usage du sulfate de
magnésium en obstétrique et/ou en pédiatrie néonatale.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
Inserm UMR 1079, Génétique du cancer et des maladies
neuropsychiatriques
Sujet de thèse
Bases génétiques et fonctionnelles de la maladie d’Alzheimer
du sujet jeune
Contacts
Dominique Camion, [email protected]
La maladie d'Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus fréquente, avce plus de
800.000 personnes atteintes en France. Bien que le risque de développer la maladie soit fortement lié
à l'âge, dans une minorité de cas la MA touche le sujet jeune, avec un début inférieur à 65 ans. Dans
ces cas, on peut observer une transmission autosomique dominante de la maladie, majoritairement
liée à des mutations des gènes APP, PSEN1 et PSEN2 ainsi qu'à des duplications du gène APP. A ce
jour, près de 11% des formes familiales jeunes de MA restent encore inexpliquées. Dans ce cadre, en
collaboration avec le Centre National de Référence Maladie d’Alzheimer Jeunes basé au CHU de
Rouen, notre projet vise à identifier les gènes responsables des formes autosomiques dominantes à
début précoce de MA sans mutation dans les gènes connus par séquençage d’exome. De grandes
quantités de données sont générées par ce type d’études ; il convient donc d’établir des stratégies
d’analyse afin (i) de filtrer les variants nucléotidiques polymorphiques des variants rares
potentiellement causaux et (ii) de sélectionner, au sein des variants rares, les mutations causales pour
la MA. Dans ce cadre, nous avons d'ores et déjà développé un logiciel d'analyse des variants issus
des données de séquençage d'exome, en collaboration avec le laboratoire d'informatique LITIS, basé
à Mont Saint Aignan. Ce logiciel, EVA (Exome Variation Analyzer), permet de séparer les variants
polymorphiques des variants rares. Concernant la deuxième partie de l'analyse, qui consiste à mettre
en évidence les mutations causales au sein des variants rares, plusieurs stratégies peuvent être
appliquées. Une première stratégie, basée sur la récurrence, vise à comparer les exomes réalisés sur
plusieurs individus présentant une forme jeune à transmission mendélienne de MA, à la recherche
d’un gène muté commun à ces individus. Cette stratégie a déjà été utilisée avec succès au sein de
notre laboratoire ; elle nous a permis d’identifier un nouveau gène responsable de formes jeunes de
MA par séquençage d’exome dans 14 familles Alzheimer. Une deuxième stratégie consistera en
l’étude de cas isolés : on recherchera des mutations de novo par séquençage de trios, composés d’un
individu atteint et de ses deux parents sains. Troisièmement, des familles compatibles avec une
transmission récessive seront analysées au moyen d’une stratégie adaptée. Les gènes ainsi identifiés
seront ensuite validés d’un point de vue fonctionnel. Différentes études seront réalisées, incluant
l’analyse de l’ARNm des patients et le développement de tests fonctionnels adaptés, dans des
modèles cellulaires et des organismes modèles tels que la drosophile. Enfin les voies biologiques
impliquant ces gènes seront caractérisées. Ce projet, centré sur l’étude des variants rares nécessitera
le développement de stratégies et de méthodes d’analyse innovantes et requiert donc de fortes
compétences en biologie moléculaire et en bioinformatique.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
INSERM U918
Sujet de thèse
Séquençage exomique d’une série de lymphomes diffus à
grandes cellules de phénotype B (LDGCB) réfractaires à
l’immunochimiothérapie
et
analyse
intégrées
des
caractéristiques génomiques et transcriptomiques.
Contacts
Fabrice Jardin, [email protected]
Les lymphomes diffus à grandes cellules de phénotype B (LDGCB) représentent environ un tiers des
lymphomes non-Hodgkiniens (LNH). Ces tumeurs ont en commun une présentation clinique agressive
mais sont très hétérogènes sur le plan moléculaire. Les bases de cette hétérogénéité ont été
récemment décrites par l’analyse des profils d’expression géniques (GEP) qui individualisent deux
principaux sous-types : (i) le sous-type « Germinal centre B-cell like » (GCB). Il est caractérisé par un
profil d’expression proche de celui des cellules normales lymphoïdes du centre germinatif (ii) le sous
type « Activated B- Cell like » (ABC). Plus récemment des techniques de séquençage haut-débits
(Next generation sequencing, NGS) ont permis d’identifier des gènes mutés de manière récurrente.
Ces mutations ciblent des gènes impliqués dans des mécanismes fondamentaux de la biologie du
lymphocyte B. Certaines d’entre-elles peuvent être observées de manière préférentielle dans l’un ou
l’autre des sous-types moléculaires. Nous avons récemment réalisé dans le cadre du protocole
GHEDI (Deciphering the genetic heterogeneity of DLBCL at the rituximab era, projet INCA-DHOS
recherche translationnelle, investigateur principal F Jardin) l’analyse d’une cohorte de LDGCB inclus
dans les essais clinique du GELA par CGH (Agilent 180K) et GEP (affymetrix U133 +2) et identifier
des régions minimales délétées ou amplifiés comprenant 400 gènes candidats. Notre projet a pour
objectif de proposer pour la première fois une analyse moléculaire intégrée d’une cohorte de LDGCB
inclus
dans
les
essais
thérapeutiques.
Deux
approches
sont
proposées
:
(i) séquençage exomique d’une cohorte de patients considérés comme réfractaire primaire ou en
rechute précoce après le traitement usuel par immunochimiothérapie. 10 à 20 échantillons tumoraux
(et 10 à 20 ADN provenant de tissus normaux matchés) seront analysés.
(ii) séquençage ciblé sur une cohorte de 250 patients d’un nombre restreint de gènes candidats
préalablement
identifiés
par
l’analyse
intégrée
CGH/transcriptome.
Ce projet nécessitera le développement d'outils informatiques innovants capable d'intégrer 3 types de
données de biologie moléculaire haut débit: élaboration / validation des algorithmes, mise en place et
valorisation d'une interface, validation biologiques des gènes/voies oncogéniques identifiés in silico.
Cette approche doit permettre l'identification de nouveaux gènes d’intérêt et de nouvelles voies
oncogéniques dans les LDGCB, de poser les bases rationnelles pour de nouvelles thérapies ciblées
et d'identifier de nouveaux biomarqueurs à valeur pronostique ou théranostique.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
Inserm UMR U 644
Sujet de thèse
Mise en évidence du rôle direct de la protection endothéliale
dans la modulation de la sévérité de l’insuffisance cardiaque
Contacts
Vincent Richard, [email protected]
Le projet vise à mieux comprendre les mécanismes de l’insuffisance cardiaque (IC), et à en identifier
de nouveaux traitements. Nous avons mis en avant le rôle délétère dans l’IC de la diminution des
influences vasodilatatrices d’origine endothéliale (‘dysfonction endothéliale’), qui constitue ainsi une
cible thérapeutique importante dans cette pathologie. Cependant, à ce jour, le lien entre dysfonction
endothéliale et aggravation de l’IC n’a jamais été montré directement.
Notre groupe a découvert une nouvelle approche de protection endothéliale, basée sur l’inhibition de
la protéine tyrosine phosphatase 1B (PTP1B). Ainsi, dans des modèles expérimentaux d’IC,
l’inhibition pharmacologique (ou la déficience génétique) de PTP1B réduit la dysfonction
endothéliale, mais également améliore l’IC, et constitue ainsi un nouveau traitement potentiel de
cette maladie. Cependant, le rôle exact de la PTP1B endothéliale dans cette amélioration de l’IC est
inconnu. Pour cette raison, nous avons développé une lignée de souris (CreLox) déficiente pour la
PTP1B spécifiquement au niveau de l’endothélium.
Le présent projet vise à évaluer les conséquences dans l’IC de cette inactivation de PTP1B limitée à
l’endothélium.
Il sera réalisé dans un modèle d’IC systolique (post-infarctus), puis dans un modèle d’IC diastolique
secondaire à une obésité/insulino résistance. Nous évaluerons l’impact sur l’endothélium par des
techniques d’artères isolées perfusées, et sur la perfusion et la fonction cardiaques par IRM,
échocardiographie et cathétérisme cardiaque. L’expression de gènes régulant la fonction, le
remodelage, l’inflammation etc., et le niveau de phosphorylation des cibles de la PTP1B seront
également mesurés (PCR quantitative et western blot).
Si ces expérimentations démontrent en parallèle une prévention de la fonction endothéliale et une
amélioration de l’IC, elles constitueront la première preuve directe du caractère aggravant de la
dysfonction endothéliale dans l’IC.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
EA 3222 LEMA
Aquatiques)
Sujet de thèse
Etude du potentiel prédictif de biomarqueurs moléculaires de
perturbation endocrinienne chez le crustacé estuarien
Eurytemora affinis
Contacts
Céline Boulangé-lecomte, [email protected]
(Laboratoire
d’Ecotoxicologie
–Milieux
La directive EC 1107/2009 encadrant la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques
prévoit de vérifier a priori, pour chaque substance considérée, les dangers associés à son utilisation
et en particulier si elle représente une menace pour (1) la santé des populations humaines (effets
cancérigène, mutagène, reprotoxique), (2) la santé environnementale (persistance de la substance),
(3) la santé des populations animales non cibles dans l’environnement, notamment par le biais de
mécanismes de perturbation endocrinienne (PE). A l’heure actuelle, les tests in vitro utilisés sont
principalement des tests d’affinité aux récepteurs aux androgènes, estrogènes et aromatase ; des
tests in vivo (e.g. dosage de la vitellogénine) sont actuellement en cours de développement chez le
rongeur, le poisson et les amphibiens. En revanche, bien qu’ils représentent 95% des espèces
animales et jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement des écosystèmes aquatiques, peu ou pas
de d’outils sont actuellement disponibles chez les invertébrés.
Dans ce contexte, le présent projet vise à développer des outils moléculaires pour l’évaluation du
potentiel PE des composés phytosanitaires chez un crustacé. L’organisme modèle qui a été choisi
pour sa pertinence écotoxicologique est le copépode estuarien Eurytemora affinis. La stratégie
adoptée repose une approche ouverte par criblage basée sur l’expression différentielle du
transcriptome (pyroséquençage) et du protéome (2D-DIGE) avant et après exposition des individus à
des PE modèles. Parallèlement, les effets toxiques des composés seront analysés par la mesure des
performances reproductives des individus i.e. durée des stades de développement et nombre de
sacs ovigères produits par femelles. La mise en relation des variations d’expression et des effets
chroniques sur la reproduction permettra d’évaluer le potentiel prédictif des biomarqueurs
moléculaires sélectionnés. Enfin, l’ensemble de ces résultats sera comparé aux données issues des
tests in vitro actuellement utilisés pour la caractérisation des propriétés PE des produits
phytosanitaires afin d’en évaluer la pertinence. Les substances qui ont été sélectionnées sont des
pesticides présentant des propriétés soit anti-androgéniques soit juvénoïdes ; elles seront utilisées
seules ou en mélanges binaires afin de rendre compte de la complexité de l’évaluation du risque
associé à l’utilisation de produits chimiques en agriculture relative aux interactions toxiques. Ce
travail comporte également un volet sociologique développé en collaboration entre le LEMA, le
CETAPS et DySoLa : il s’agira de reconstituer les controverses scientifiques et institutionnelles à
l’œuvre dans la définition de la « menace de Perturbation Endocrinienne ». Le corpus de données
sera constitué de documents d’acteurs (liste des institutions à établir : IGE, AESN, DIREN,
IFREMER, ANSES etc.) et d’entretiens semi-directifs. Il s’agira de reconstruire la diversité des points
de vue, les lignes argumentaires développées, l’histoire des questions de recherche et des
techniques d’expertise, ainsi que les jeux d’acteurs à l’œuvre.
Ce travail s’appuie sur le projet CREOLE (2012-2015) financé par l’ANSES dans le cadre du
programme national de recherche en « environnement-santé-travail ». Il s’inscrit dans la tâche 4 du
projet FESEL intitulée « Approche multimarqueurs de réponse aux stress d’espèces du continuum
Estuaire de Seine – Littoral ».
Il débutera par une étude bibliographique et par l’optimisation des méthodes de stabulation des
copépodes en laboratoire (3 mois). L’exposition des organismes en conditions contrôlées sera
ensuite réalisée (3 mois). Suivront les analyses transcriptomique (12 mois) et protéomique (réalisée
en collaboration avec le laboratoire CART, Université de Liège), l’étude des performances
reproductives (3 mois) et la comparaison des résultats obtenus (3 mois). L’analyse sociologique des
controverses et des jeux d’acteurs correspond à un volume de travail équivalent à 6 mois, et sera
concentrée sur la période des 24 premiers mois (lié à l’exploration bibliographique). Les 6 derniers
mois seront consacrés à la rédaction du manuscrit de thèse ainsi qu’à la valorisation du travail
(rédaction d’articles scientifiques).
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
Sujet de thèse
Contacts
UMR CNRS 6143
Caractérisation
et
modélisation
du
fonctionnement
hydrodynamique et des propriétés de transport d'un aquifère
karstifié et multicouche soumis à des variations tidales.
Nicolas Massei, [email protected]
Le système karstique du Hannetot, situé en bord de Seine à 70 km de Rouen, vers le Havre, est
typique des hydrosystèmes karstiques de la Seine-aval. Sa taille réduite et sa configuration
géomorphologique le positionneraient comme un bassin élémentaire à l'échelle régionale. Ses
caractéristiques ont valu à ce système de figurer parmi les sites du Service d'Observation Karst de
l'INSU (réseau national de suivi et d'observation des milieux karstiques). Il comprend i) un bassin
versant superficiel de plateau d'environ 8 km2, drainé par une perte (perte du Bébec) qui constitue le
point majoritaire d'engouffrement des eaux de surface, ii) une source karstique en pied de plateau,
dans la vallée de Seine, constituant l'exutoire principal del'aquifère et en connexion hydraulique avec
la perte du Bébec, iii) un forage en aval de la source, tubé dans les alluvions de la Seine et crépiné
dans la Craie fissurée/karstique sous alluvions. De précédents travaux ont montré que pour ce type
de système, les variations de niveau d'eau à la source, située en pied de plateau en bordure de
Seine, une influence tidale pouvait être détectée, quoique de faible amplitude. Ces travaux ont
également montré que cette influence tidale affectait la qualité des eaux à la source en pied de
plateau et au forage AEP en plaine alluviale en aval de la source, en agissant comme facteur limitant
ou en favorisant l'amplitude du gradient hydraulique établi dans l'aquifère de la Craie depuis les
plateaux vers la vallée de Seine. Les graves de fond des alluvions a priori très transmissives et
situées quelques mètres au-dessous de la crépine du forage AEP, pourraient jouer un rôle important
dans le transfert de l'onde de pression tidale depuis la Seine vers le forage et donc dans la
dynamique hydrologique de tout le système karstique, puisqu'une influence tidale est identifiée
jusqu'à la source vers l'amont. La dynamique hydrologique du remplissage alluvionnaire est encore
assez mal connue de même que les interactions entre les différentes masses d'eau à leurs
interfaces; leur caractérisation revêt donc une importance particulière dans un tel contexte. Dans
cette thèse, l'objectif est de caractériser les interactions entre les différentes entités hydrogéologiques
et hydrologiques : nappe de la Craie partiellement drainée par le karst, nappe temporaire des
formations superficielles, nappe du remplissage alluvionnaire multicouche, Seine soumise aux
variations tidales. Le travail sera principalement focalisé sur la caractérisation hydrogéologique et
hydrodynamique de l'interface entre Craie fissurée/karstifiée, remplissage alluvionnaire et Seine. Le
travail nécessitera: 1- de parfaire la compréhension des relations entre amont et aval du système
(resp. systèmes perte-source etperte-forage), en terme de flux hydrique, d'éléments dissous et
particulaires. Des campagnes de traçage seront mises en oeuvre en fonction des conditions
hydrologiques pour évaluer les degrés de nonstationnarité et non-linéarité de la relation
perte/source/forage (traçage/multitraçage en régimes permanent et transitoire, essai de pompage de
longue durée dans la partie aval). Les séries temporelles (pluie, débit/niveau d'eau, conductivité
électrique, turbidité) issues des mesures aux différents points de l'ensemble du système seront
analysées par différentes approches méthodologiques. 2- la caractérisation des propriétés
hydrodynamiques des entités hydrogéologiques par leur réponse hydraulique aux perturbations
tidales; 3- la mise en oeuvre d'outils hydrogéophysiques pour la caractérisation de la géométrie et
des propriétés hydrauliques des réservoirs hydrogéologiques (approches spatiale et temporelle).
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
EA 1293 ECODIV (Etude et Compréhension de la Biodiversité)
Sujet de thèse
Rôle de la trame verte et bleue de la région Haute Normandie
dans le maintien des connectivités écologiques et la survie des
populations animales et végétales.
Contacts
Aurélie Husté, [email protected]
La qualité d’un environnement a une influence majeure sur la présence des espèces animales et
végétales. Également, les connexions entre les habitats ont un rôle déterminant sur la dynamique
spatio-temporelle des individus, via les processus de dispersion, et donc a posteriori sur la survie
des espèces. Les activités anthropiques sont aujourd’hui des facteurs déterminants pour
comprendre l’organisation et la dynamique de la biodiversité dans la plupart des écosystèmes. Ainsi,
cette biodiversité dépend souvent de la volonté que l’Homme peut avoir de la préserver ou de la
promouvoir par des aménagements ou le contrôle des pollutions. Dans ce contexte, la Trame Verte
et Bleue (TVB) est une mesure phare du Grenelle de l’Environnement et apparaît comme
indispensable puisqu’elle a pour vocation de favoriser les connectivités écologiques. Ainsi, la TVB
devrait dans les années à venir faire l’objet de plans de gestion orientés vers de la conservation, de
la restauration, des aménagements et même de la création d’habitats. Néanmoins, de tels plans ne
peuvent être définis sans une connaissance préalable des espèces animales et végétales en
présence d’une part et de la « santé » de ces espèces d’autre part. Également, les habitats avec un
potentiel écologique certain et les connexions existantes ou possibles doivent être identifiés afin
d’éviter un échec de la TVB.
L’objectif de cette thèse sera donc d’appréhender la dynamique spatiale et temporelle de
populations d'espèces le long de la TVB en Haute Normandie, constituée par la Seine et ses
alentours, et plus particulièrement entre Les Andelys et l’estuaire. Concernant le volet "trame verte",
ce travail s’appuiera sur des sites ayant déjà fait l’objet d’études par le laboratoire ECODIV et
permettra alors d’ajouter une dimension dynamique (i.e., notion de connexions) aux travaux déjà
réalisés. Notamment, seront retenus les pelouses calcicoles qui sont des sites remarquables en
Haute Normandie de par la flore qu’elles abritent (e.g., Les Andelys, Vironvay, St Adrien, Hénouville,
Le Havre). Le site d’Orival nouvellement considéré dans le projet ESTER pourra être un site pilote
en terme d’expérimentations locales et notamment pour l’étude des dynamiques de (re)colonisation
suite à une action de déforestation pour une restauration d’un coteau calcaire. Concernant le volet
"trame bleue", ce projet se fera en parallèle d’un projet déposé auprès du Ministère de l’écologie, du
développement durable, des transport et du logement et avec comme partenaires financiers
l’Agence de l’Eau Seine Normandie et la CREA (Communauté d’agglomération Rouen-ElbeufAustreberthe) : Rôle des mares dans la connectivité écologique des populations d’Odonates au sein
de la trame verte et bleue de l’Agglomération De Rouen (ROAD). Cette thèse s'appuiera alors sur
les sites des berges de la Seine étudiés dans le projet REBEBAS du GIP Seine Aval (i.e.,
communes de Petitville, Yville sur Seine, Quevillon, Bardouville, St-Etienne-du-Rouvray, Tourville la
Rivière) et sur les données du projet ROAD pour répondre à ses objectifs concernant le volet trame
bleue.
Ce projet a 3 objectifs. Tout d’abord, il s’agira d’identifier les caractéristiques écologiques
importantes des sites choisis (e.g., qualité de l’eau, nature du sol, couvert végétal) favorisant la
présence des modèles biologiques retenus, ceci afin d’identifier les sites ayant un potentiel
écologique certain pour la TVB. Ensuite, il s’agira d’évaluer la dispersion de populations animales et
végétales ciblées entre les sites considérés. Une étude paysagère visant à déterminer les corridors
écologiques aura pour but d’identifier la continuité de la composante verte de la trame. Enfin,
l’ensemble des données acquises seront utilisées pour paramétrer un modèle sur la dynamique de
la biodiversité le long de la TVB considérée. Au delà de l’aspect scientifique, les données acquises
au cours de cette thèse seront couplées à celles du projet ROAD dans le cadre d’une réflexion qui a
été proposée dans ce dernier. Elle consiste à la mise au point d’un indice de « qualité/potentialité »
de la TVB qui aura pour vocation d’être un outil de gestion réutilisable pour d’autres TVB. Son but
sera de permettre un diagnostic d’une trame considérée afin de fournir une aide à la décision sur les
éléments à préserver ou à améliorer.
Concernant les modèles biologiques, 2 espèces animales et 2 espèces végétales seront
considérées, avec pour chacun des règnes une espèce commune et une espèce à forte valeur
patrimoniale. Pour les populations animales, les Odonates seront choisis pour plusieurs raisons.
D’abord, la plupart des individus utilisent à la fois les milieux aquatiques et les milieux terrestres au
cours de leur cycle de vie. Ceci permettra donc de travailler à l’échelle de la TVB. Ensuite, la plupart
sont sensibles aux perturbations humaines et notamment à des pollutions de natures différentes.
Ceci nous permettra alors d’évaluer l’effet des conditions du site et de l’environnement aux
alentours. Enfin, c’est le modèle biologique qui a été retenu pour le projet ROAD. Ceci nous
permettra alors une réelle synergie entre les 2 projets et une plus grande couverture de la TVB à
l’échelle de la région. Les méthodes envisagées pour mener à bien cette thèse sont les suivantes :
1) quantification des déplacements effectués par les populations le long de la TVB à l’aide de
méthodes de Capture-Marquage-Recapture (CMR) ;
2) quantification des flux de gènes (ou dispersion efficace) entre les populations grâce au
génotypage des individus ;
3) analyse fine du paysage dans la région étudiée à l’aide de l’outil SIG et de photographies
aériennes ;
4) les données acquises feront l’objet d’analyses statistiques et seront utilisées comme paramètres
lors de la modélisation du fonctionnement de la TVB étudiée.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
UMR 6143 Morphodynamique continentale et côtière
Sujet de thèse
Acquisition de tolérance de communautés périphytiques sous
pression anthropique: impacts génétiques et fonctionnels pour
les communautés
Contacts
Thierry Berthe, [email protected]
La Directive Cadre Européenne sur l'Eau (Directive 2000/60/CE) a concrétisé une réelle prise de
conscience de la vulnérabilité des milieux aquatiques soumis à une pression anthropique.
Cependant, les descripteurs biologiques proposés par cette directive ne rendent pas forcement
compte du risque toxique associé aux contaminations chimiques (Geizinger et al, 2009). Dans le
contexte actuel de contamination diffuse à faibles doses (micropolluants), il est en effet difficile de
mettre en évidence des effets biologiques et de faire le lien entre ces effets et la présence de
contaminants dans le milieu. Pour établir un lien entre contamination chimique et réponse
biologique, les communautés constituent un niveau d'organisation biologique particulièrement
intéressant. Mesurée à l'échelle d'une communauté, une réponse biologique intègre en effet les
différents niveaux de sensibilité des organismes qui la composent ainsi que les interactions existant
entre ces organismes. L'approche PICT (Pollution-Induced Community Tolerance) propose
d'exploiter ce type de réponse biologique, en mettant en évidence une acquisition de tolérance par
des communautés exposées à des contaminants (Blanck, 2002).
Des études récentes réalisées à Irstea ont permis la mise en évidence d'effets PICT (acquisition de
tolérance) pour la composante hétérotrophe de biofilms exposés en microcosmes à des métaux
typiques des milieux urbains (Fechner et al., 2011b; Fechner et al., 2010a) ou agricoles (Tlili et al.,
2010; Tlili et al., 2008). Ces résultats sont particulièrement intéressants du fait des concentrations
d'exposition testées dans les microcosmes, choisies pour être réalistes d'un point de vue
expérimental : ils confirment ainsi la grande sensibilité des mesures de tolérance ainsi que des
techniques d'empreinte génétique pour mettre en évidence un impact métallique à l'échelle d'une
communauté. Des mesures réalisées in situ, sur des biofilms naturels prélevés sur l'axe Seine dans
un gradient de contamination urbaine multi-métallique, ont ensuite permis de mettre en évidence
une augmentation de la tolérance aux métaux pour des biofilms prélevés en aval de l'agglomération
parisienne, par comparaison avec des biofilms prélevés en amont. Ces résultats sont tout à fait
prometteurs quant à l'utilisation de la tolérance comme un marqueur sensible d'une contamination
multi-métallique (Fechner et al., 2011a; Fechner et al., 2011c).
Si l'acquisition de tolérance traduit l'adaptation d'une communauté à une perturbation
environnementale, elle a un coût écologique non négligeable pour la communauté exposée. Elle
peut se traduire par des impacts génétiques (par exemple une baisse de la diversité spécifique)
et/ou fonctionnels (par exemple une modification des activités métaboliques). L'impact fonctionnel
des biofilms est susceptible de se répercuter à l'échelle des écosystèmes aquatiques du fait du rôle
écologique majeur que jouent ces communautés dans les cycles d'éléments nutritifs. Outre les
perturbations potentielles dans le fonctionnement de l'écosystème aquatique étudié, la communauté
ainsi modifiée structurellement et fonctionnellement est généralement plus vulnérable à un stress
ultérieur (Amiard-Triquet et al., 2008; Clements and Rohr, 2009). Nous proposons par ce travail de
poursuivre le développement des connaissances sur l'utilisation de la tolérance comme bioindicateur d'une contamination multi-métallique. Pour cela, nous chercherons à explorer le coût
écologique associé à l'acquisition de tolérance.
Ce travail se déclinera en deux étapes complémentaires :
la mise en évidence d'un éventuel impact génétique par une analyse fine de la diversité
génétique bactérienne des communautés hétérotrophes de biofilms de rivière, et de l’occurrence de
gènes de résistance aux métaux, en lien avec les mesures de tolérance décrites ci-dessus ;
-
la mise en évidence d'un éventuel impact fonctionnel par une analyse du profil métabolique
des communautés hétérotrophes de biofilms de rivière ; ici encore, les mesures seront interprétées
en lien avec les niveaux de tolérance évalués par l'approche PICT.
Le travail de thèse se déroulera en plusieurs étapes :
-
étude de la diversité spécifique par séquençage haut-débit des ADNr 16S,
recherche des gènes de résistance aux métaux traces dans les biofilms de rivière :
optimisation de l'extraction des acides nucléiques, détection et/ou quantification de gènes de
résistance aux métaux traces par approche PCR/qPCR et criblage d’une banque métagénomique ;
obtention des profils fonctionnels par la technique MicroRespTM, optimisation du protocole
sur échantillons de biofilms issus de rivières urbaines (détermination du panel de substrats
carbonés adéquats pour les mesures d'activité respiratoire) ;
expositions de biofilms en microcosmes à 5 métaux (Cd, Cu, Ni, Pb et Zn) : mesures de
tolérance aux métaux par l'approche PICT, de la diversité génétique par séquençage, obtention du
profil fonctionnel, interprétation des données en lien avec la contamination chimique ;
application sur échantillons naturels exposés en milieu urbain : prélèvements sur le terrain
de biofilms, mesures de tolérance aux métaux par l'approche PICT, de la diversité génétique par
séquençage, obtention du profil fonctionnel, interprétation des données en lien avec la
contamination chimique.
ALLOCATION DE RECHERCHE DOCTORALE
FINANCEE PAR LA REGION HAUTE-NORMANDIE
Unité de recherche d’accueil
EA 1293 ECODIV (Etude et Compréhension de la Biodiversité)
Sujet de thèse
Impact des changements de pratiques agronomiques sur les
compartiments microbiens et biochimiques des sols et leurs
interactions.
Contacts
Michaël Aubert, [email protected]
La conservation des sols est une nécessité urgente pour l’agriculture, l’environnement et donc les
sociétés humaines. Celle-ci passe par la gestion (conservation et/ou restauration) de leur diversité
biologique et des fonctions associées. Aujourd’hui, de nombreuses études sont menées sur le
potentiel des sols en termes de stockage du carbone, de minéralisation de l'azote ou de biodiversité.
Cependant, les approches visant à évaluer la combinaison de ces 3 services écosystémiques sont
peu nombreuses.
La réponse agronomique à la nécessité de conservation des sols a pris au travers de la mise en
place de systèmes de culture innovants. Ces derniers modifient les itinéraires culturaux classiques
en incluant des techniques culturales alternatives qui ont des impacts sur les propriétés chimiques,
physiques et biologiques du sol (Beninende et al., 2008). En réduisant la fréquence ou les doses des
intrants organiques et/ou chimiques, ces techniques affectent le cycle de la matière organique des
sols et donc les propriétés biochimiques de ce dernier (Bending et al., 2004). Il est donc important,
pour évaluer les systèmes de culture à bas intrants, d’être en mesure de quantifier leur impact sur
(1) la biodiversité des sols y compris dans sa dimension fonctionnelle, (2) la capacité des sols à
fournir des éléments nutritifs au couvert végétal, (3) la fonction de puits de carbone des sols et la
dynamique de ce dernier.
Les microorganismes du sol, bactéries et champignons, sont les principaux acteurs de la
minéralisation de la matière organique du sol qui est à la base de 2 services écosystémiques
majeurs : le recyclage des nutriments pour la nutrition minérale des couverts végétaux et le stockage
du carbone (Doran and Zeiss 2000). Les microorganismes sont sensibles à différents paramètres
biotiques et abiotiques qui vont influencer les équilibres entre minéralisation et stockage (Monaco et
al., 2008). Parmi ces paramètres, les propriétés biochimiques de l’habitat semblent jouer un rôle
majeur dans le développement des communautés microbiennes (Nsabimana et al., 2004). La
composition biochimique de la matière organique induit une diversité dans la nature et dans
l’abondance des complexes organo-minéraux. Toute modification de ceux-ci peut induire de
nouveaux habitats ou en supprimer d’ancien, impactant à la fois la composition des communautés
microbiennes mais aussi la résultante fonctionnelle de l'activité biologique des sols (Sollins et al.
1996; Bending et al., 2004). Ainsi, selon Sotres et al. (2005), la mise en place d’indicateurs de la
qualité biochimique des sols, nécessite à la fois la standardisation des méthodes analytiques et la
compilation des données concernant les propriétés biochimiques des sols sous diverses conditions
géographiques et différentes utilisations et modes de gestion des sols.
Le travail de thèse visera donc à caractériser une interface peu prise en compte entre la physicochimie des sols et la biologie ou l’écologie microbienne des sols. Il consistera en une caractérisation
biochimique de l’habitat microbien afin d’apporter des éléments de compréhension des interactions
matrice sol / vie biologique. Les objectifs seront de caractériser le rôle biochimique de l’habitat
comme facteur écologique déterminant la structure des communautés microbiennes des sols.
Résultats attendus
Aspects fondamentaux. Mieux comprendre la dynamique de la matière organique endogène du sol
face aux nouveaux enjeux de stockage du carbone, de cycle de l'azote et de maintien de la
biodiversité. Déterminer des indicateurs permettant de caractériser cette matière organique en
relation avec le compartiment microbien des sols. Contribuer à la compréhension des relations entre
les caractéristiques biochimique de l’habitat et les communautés microbiennes des sols en utilisant
des outils technologiques récents. Apporter des éléments de réflexion pour la hiérarchisation des
facteurs écologiques contrôlant les communautés microbiennes et de leur fonctionnement.
Aspects finalisés. Comprendre l’impact des pratiques agronomiques, non seulement sur le
compartiment biologique du sol ou la composante physico-chimique, mais sur leur interface,
représentée par les propriétés biochimiques des sols. Fournir des indicateurs biochimiques de
qualité des sols (Miralles et al., 2007). Fournir des indicateurs susceptibles de prédire l’impact de la
conversion des pratiques agricoles sur l’efficience des services écosystémiques (fertilité minérale
des sols, stockage du carbone) et ainsi contribuer à l’élaboration d’outils d’aide à la décision
agronomique.