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APPORT DU LABORATOIRE DANS L’ANALYSE DU LCR PR M. MAHMOUD Introduction Inflammation des méninges Méningite bactérienne aigue communautaire Grave : 10% de décès , 30% de séquelles Urgence diagnostic et thérapeutique Toute suspicion de méningite : Ponction lombaire Introduction Ponction lombaire : ◦ Affirmer le diagnostic de méningite ◦ Orienter la thérapeutique : cytologie , coloration de Gram ◦ Culture et identification ◦ Antibiogramme Sensibilité de la souche incriminée Réévaluation d’une antibiothérapie probabiliste ◦ Intérêt épidémiologique Indications : Tableau clinique typique : Syndrome méningé Tableau clinique atypique : méningite décapitée , Nourrisson et Nné . ◦ Diagnostic au laboratoire est capital ◦ Bonne coordination entre microbiologiste et clinicien ◦ Importance des renseignements cliniques Tout syndrome méningé nécessite une PL Diagnostic au Laboratoire ◦ PL ◦ Hémocultures ◦ Biochimie du LCR ◦ NFS ◦ CRP ◦ Procalcitonine Diagnostic au laboratoire 1. Prélèvement du LCR ◦ Asepsie rigoureuse ◦ Entre L4 et L5 ◦ LCR recueilli dans 3 tubes stériles : biochimie, microbiologie, cytologie ◦ 2 à 5ml LCR chez l’adulte ◦ Correctement étiqueté, renseignements cliniques ◦ Acheminement rapide au laboratoire Analyse du LCR : Macroscopie 2. Aspect macroscopique ◦ Normal : clair, eau de roche ◦ Hémorragique : Epreuve des 3 tubes hémorragie méningée Traumatique ◦ Xanthochromique ◦ Trouble : hyperleucocytose du LCR >200GB Analyse du LCR : Etude cytologique 3. Etude cytologique : ◦ Numération sur cellule de Malassez ou Nageotte ◦ Réalisée rapidement : Polynucléaires lysés à 30% en 1h et à 50% en 2H à température ambiante ◦ But : Déterminer le nombre de leucocytes et d’hématies /mm³ ◦ Méningite : >5éléments/ mm³ : Adulte >20éléments/ mm³ : NNé Analyse du LCR :Etude cytologique : ◦ Méningite purulente >500éléments/ mm³ à prédominance PNN ◦ 99% des patients > 100 éléments ◦ 87 % des patients > 1000 éléments Analyse du LCR :Etude cytologique : Corrélation entre le nombre de PNN et l’inoculum bactérien ◦ 2/3 des LCR avec cellularité importante ont un inoculum bactérien > 10³ CFU/ml ◦ Inversement lorsque l’inoculum bactérien < 103 les PNN sont rarement vus à l’examen direct. ◦ Présence des faux négatifs avec des inoculum bactériens élevés sans PNN dans le LCR Etude cytologique : Cas particuliers Méningites à Méningocoque : ◦ Cytologie lymphocytaire lorsque la PL est réalisée précocement ◦ A peu près 10% le nombre de M B à méningocoque avec prédominance lymphocytaire ◦ 10% des MB à méningocoque ont un LCR normal si la PL est réalisée très précocement Méningites décapitées : ◦ la formule cytologique d’une MB traitée précocement devient panachée voire lymphocytaire Analyse du LCR : Examen direct 4. Examen direct : Coloration de Gram Rapide, simple et fiable L’ efficacité de l’examen direct dépend de : ◦ ◦ ◦ ◦ Inoculum Bactérien Agent bactérien Traitement antibiotique précoce Compétence de l’examinateur Analyse du LCR : Examen direct. Inoculum Bactérien : ◦ Inoculum inférieur à 10³ bactéries/ml: sensibilité de la coloration de Gram est de 25% ◦ Inoculum compris entre 10³ et 10 5 : sensibilité de 60% ◦ Il est admis qu’un inoculum d’au moins 10 5 bactéries/ml est nécessaire pour être visible par la coloration de Gram avec une sensibilité de 97% Analyse du LCR : Examen direct : Varie en fonction de l’agent bactérien isolé : ◦ Elevée et proche de 100% chez le pneumocoque ◦ Inférieur à 50% pour Listeria monocytogenes ◦ A peu près 90% pour Haemophilus influenzae ◦ 76% pour Neisseria meningitidis Analyse du LCR : Examen direct • Antibiothérapie : ◦ Nombreuses études ont montré que la sensibilité de cette technique varie entre 60 et 97% pour une spécificité qui approche les 100% en l’absence de traitement antibiotique ◦ L’ efficacité de l’examen direct dépend de la charge bactérienne présente dans l’échantillon, qui peut être réduite si prise d’antibiotique ◦ En cas de traitement précoce: sensibilité comprise entre 40 et 60% Analyse du LCR : Examen direct La sensibilité de la coloration de Gram est largement élevé en concentrant le LCR par cytocentrifugation (cytospin) L’examen direct ne peut pas signer le diagnostic Confrontation : Microbiologiste / Clinicien Analyse du LCR : Culture 5. Culture Examen de référence pour le diagnostic de méningite bactérienne La culture affirme le diagnostic Identifie l’agent étiologique Étudie la sensibilité aux antibiotiques Malgré délai de résultat de 48H Culture négative : ◦ Prise d’antibiotiques ◦ Délai d’acheminement du prélèvement au laboratoire incompatible avec la survie du germe ◦ Inoculum bactérien très faible Analyse du LCR : Culture Les milieux ensemencés sont sélectionnés pour permettre la croissance des germes les plus fréquemment isolés dans les méningites communautaires. ◦ Gélose au sang+gélose au chocolat avec polyvitex avec incubation à 37°c sous 5à10% de CO2 ◦ A peu près 68% de culture positive Analyse du LCR : Culture Les milieux d’enrichissement : ◦ Utilisés parfois pour permettre la croissance des germes à croissance difficile ◦ En pratique courante, ils ne sont pas ensemencés systématiquement car peu d’intérêt ◦ Culture positive sur milieu d’enrichissement considéré comme contamination Analyse du LCR :Etude de la sensibilité aux antibiotiques Culture positive=> identification du germe => réalisation de l’antibiogramme indispensable Recommandations du CA SFM Catégorisation clinique: Sensible, intermédiaire, résistant Evolution de la résistance bactérienne aux antibiotiques impose la réalisation d’un antibiogramme L’émergence et la fréquence croissante d’isolement de souches de PSDP nécessite la réalisation de CMI Détection des souches PSDP Détection des souches PSDP ◦ Antibiogramme : Un disque d’oxacilline à 1µg sur GS. La souche est PSDP si le diamètre d’inhibition est < 19mm Confirmation de l’antibiogramme par CMI (E test) Une souche est PSDP si la 0,06µg/ml<CMI<2µg/ml La souche est résistante si CMI>2µg/ml Analyse du LCR : Antigènes solubles Peuvent être un important outil diagnostic Agglutination au latex la plus utilisée. Simple d’éxécution Simple d’interprétation Rapide Résultats non modifiables par une antibiothérapie préalable Consiste à rechercher les Ag bactériens dans le LCR Germes : Hib, MNO, PNO, E. coli K1, Strepto B Analyse du LCR :Antigenes solubles Faux positifs Faux négatifs Manque de sensibilité pour certains sérogroupes du MNO : B Difficulté de lecture car réponse non spécifique si > 1 mn. En dehors du PNO et de L’ Hib les réponses sont très variables en fonction des kits. Problème de spécificité : communauté antigénique pour le MNO B avec E coli K1 Analyse du LCR :Antigènes solubles Majorité des études > 10 ans Variabilité des résultats : Sensibilité 50 à 100% ◦ Raisons : Utilisations de kits différents Populations étudiées variables : Adultes , enfants . Contexte épidémique Recherche d’un germe ciblée ◦ Ces différentes variabilités entrainent une controverse concernant l’utilité de ces tests. ◦ Plusieurs études ont été menées afin d’éclaircir les différents points Analyse du LCR : Antigènes solubles Etude qui a pour objectif de comparer les kits : ◦ Ces 3 kits sont performants pour faire le groupage des MNO A , B et C . ◦ Rai GP et al ;pneumococcal antigen detection in cerebrospinal fluid .Microbiological infectious disease .2003;26:261-7 Analyse du LCR : Antigènes solubles Etude 2 : Diagnostic étiologique ◦ 65 patients 15 cultures positives : 10 positives en antigènes solubles 5 pas de tests disponibles 15 positives : 4 MNO 3 Pneumo 2 Coli / Acineto 1 Klebsiella / Pseudomonas aeruginosa / S.A / Strepto B 2 tests faussement positifs pour le MNO. ◦ Surinder K . Indian J Med Microb .2007;25;395-7 Analyse du LCR : Antigènes solubles Etude 3 : Contexte épidémique : ◦ Etude qui a concerné une épidémie à MNO A au Niger en 2003 ◦ 488 patients positifs en PCR ou en culture ◦ Spécificité : 95 % ◦ Sensibilité : 88% Intérêt : ◦ Avoir le sérogroupe rapidement pour la vaccination dans ce contexte . Borel et al . Trop Med Hyg .2006;100;964-9 Analyse du LCR : Antigènes solubles Etude 4 : Etude rétrospective . ◦ ◦ ◦ ◦ 146 patients ayant une MB Age moyen : 16 mois 42% Antibiothérapie avant PL 87% des patients ayant eu une Atb étaient positifs en Ag solubles. ◦ 25 % étaient négatifs en culture Bhisitkul DM .Pediatr Emerg Care 1994;10;67-71 Analyse du LCR : Antigène solubles Etude 4 : ◦ ◦ ◦ ◦ 176 enfants suspect MB Reçu un traitement Antibiotique Culture négative : Ag solubles négatifs Culture positive : Sensibilité de 59% PNO 44 % MNO Nigrovic LE. Pediatric infectious disease.2004 ;23;786-8 Analyse du LCR : Antigènes solubles Etude 5 : ◦ 478 LCR ◦ 7 positifs dont 5 ont des examens directs positifs Perkins MD .Jclin Microbiol 1995;33:148691 Ex direct Culture Ag réalisés Positivité des Ag Fes Négatif Négative 120 5 = 4% Casablanca Négatif Négative 186 11 = 5% Marrakech Négatif Négative 360 18 = 5% Biochimie du LCR Glycorrachie: ◦ Glycorrachie : 2/3 de la glycémie. ◦ Diminution dans les méningites bactériennes Protéinorrachie : ◦ Nné : 1.5g/l ◦ Adultes : 0.45 g/l ◦ Augmentation dans les méningites bactériennes. Chlorurrorachie : ◦ Tx normal : 700 et 750 mg / ml . ◦ Hypochlorrurorachie : méningites tuberculeuses . HEMOCULTURES La phase septicémique précède la méningite. 50% des hémocultures sont positives en l’absence de traitement dans les méningites à MNO. < 5 % si traitement antibiotique. Biologie moleculaire Technique non utilisée en pratique courante. Nécessite certaines précautions et laboratoire spécialisé. Amplification d’un gene précis pour un germe donné. Pcr multiplex : MNO , PNO , HIB ; Bonne spécificité : 90 à 95 %. Conclusions Diagnostic : Faisceau d’arguments Confrontation clinico biologique Aucun test à lui seul ne peut poser le diagnostic Culture : Gold standard 30% des cultures restent négatives Intérêt des techniques de biologie moléculaire. Répartition des cas de méningites de l’enfant entre 2009 et 2012 PNO MNO Hib total 2009 16 30 6 52 2010 41 37 3 81 2011 29 27 0 56 2012 24 35 1 60 total 110 129 10 249 Sérogroupage du Meningo MNO A 2009 -2012 9 MNO B MNO 135 AUTRES TOTAL 105 7 129 8 Resistance du Pneumocoque à la Peni G Nombre de souches isolées du LCR 110 Nombre de souches résistantes à la Péni G 30 Pourcentage 27.3% Etat de résistance du Pneumocoque aux C3G Nombre de souches testées 77 Nombre de souches résistantes (I+R) 5 Pourcentage 6.5%
