DU TORINO - TP

Diplôme Universitaire
de Carcinologie Thoracique Intégrée :
Travaux Pratiques
Stratégies diagnostiques
dans le traitement du
cancer du poumon
Coordonnateur : Eric Morel (UP-Sud)
Participants :
Guillaume Bernadat (UP-Sud)
Ludovic Lacroix (IGR)
Isabelle Turbica (UP-Sud)

Organisation de la journée
9:30
– 10:00
Salle EH36
Cancer
du poumon : aspects de biologie moléculaire et diagnostic. Elaboration
d’un
protocole
d’analyse d’un échantillon par PCR. Exposé des cas cliniques.
Ludovic Lacroix
10:00
– 12:00
Salle EH36
Extraction d’ADN à partir des lignées cellulaires HCC827 et H1975 mutées sur le
gène de l’EGFR.
Réalisation des PCR. Préparation des gels de migration.
Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA
12:30
– 13:30
Déjeuner
13:30
– 14:30
Salle EH36
Etude
de la séquence nucléotidique de l’EGFR : manipulation de bases
de
données
et d’un logiciel pour l’élaboration d’amorces de PCR
diagnostique,
permettant
de mettre en évidence des mutations ponctuelles L858R et
la
délétion
E746-A750 du récepteur EGFR
Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA
14:30
– 15:30
Salle EH36 / EH28
Digestion
enzymatique des amplicons et/ou analyse des produits de PCR
par
migration
sur gel de polyacrylamide résolutif. Détermination du seuil
de
sensibilité
de la technique
Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA
15:30
– 16:30
Salle DH90
Initiation
à la biologie structurale et modélisation moléculaire.
Détermination
sur station de travail, de la structure par
radiocristallographie
du
complexe entre l’EGF et la partie extracellulaire de son récepteur
ainsi
que
la localisation des mutations affectant cette dernière, pouvant
être
visualisées
. Afin de mieux comprendre l’impact de certaines de
ces
mutations,
les interactions de petites molécules à visée thérapeutique
(type
erlotinib)
avec les formes naturelle et mutante du récepteur pourront
ensuite
être
simulées à l’aide d’un logiciel d’amarrage moléculaire et comparées.
Guillaume Bernadat
16:30
– 17:30
Analyse des études de cas en corrélation avec les résultats de PCR obtenus en
travaux pratiques.
Ludovic
Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA
29/04/2016 2

Techniques de base

Techniques d’analyse de mutations
(ponctuelle ou petite delins)
Techniques
sans a priori Techniques
ciblées
•Séquençage (direct /Sanger)
•Gold standard
•Seuil 20% Cell.Tum
•« long »
•HRM (criblage)
•Pyroséquençage
•NGS
•Discrimination allélique
•Q-PCR (CAST /Scorpion…)
•PCR allèle spécifique
•Analyse de fragments/restriction
• …
•Variées/variables
•Seuil de 20 à 1%
•rapide
Délétion
de 21bp
Pic EGFR sauvage
Délétion
de 9 bp

Direct sequencing « Gold standard Method» :
A T C G
Laser
•Sanger Sequencing :
based on ddNTPs (dye terminator)
- Amplitaq DNA polymerase : Cycle sequencing
T A G A A T C T ...
dA dT ddC
dA dT dC ddT
dA dT dC dT dT dA ddG
dA dT dC dT dT ddA
dA dT dC dT ddT
....
amorce 5’-
amorce 5’-
amorce 5’-
amorce 5’-
amorce 5’-
A T C T T A G A ...
(-) 3’-
- 3’(+)(+) 5’-
- 5’(-)
T A G A A T C T ...
dA dT ddC
dA dT dC ddT
dA dT dC dT dT dA ddG
dA dT dC dT dT ddA
dA dT dC dT ddT
....
amorce 5’-
amorce 5’-
amorce 5’-
amorce 5’-
amorce 5’-
A T C T T A G A ...
(-) 3’-
- 3’(+)(+) 5’-
- 5’(-)
Analyse de chromatogramme en fin de journée