Diplôme Universitaire de Carcinologie Thoracique Intégrée : Travaux Pratiques Stratégies diagnostiques dans le traitement du cancer du poumon Coordonnateur : Eric Morel (UP-Sud) Participants : Guillaume Bernadat (UP-Sud) Ludovic Lacroix (IGR) Isabelle Turbica (UP-Sud) Organisation de la journée 9:30 – 10:00 Salle EH36 Cancer du poumon : aspects de biologie moléculaire et diagnostic. Elaboration d’un protocole d’analyse d’un échantillon par PCR. Exposé des cas cliniques. Ludovic Lacroix 10:00 – 12:00 Salle EH36 Extraction d’ADN à partir des lignées cellulaires HCC827 et H1975 mutées sur le gène de l’EGFR. Réalisation des PCR. Préparation des gels de migration. Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA 12:30 – 13:30 Déjeuner 13:30 – 14:30 Salle EH36 Etude de la séquence nucléotidique de l’EGFR : manipulation de bases de données et d’un logiciel pour l’élaboration d’amorces de PCR diagnostique, permettant de mettre en évidence des mutations ponctuelles L858R et la délétion E746-A750 du récepteur EGFR Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA 14:30 – 15:30 Salle EH36 / EH28 Digestion enzymatique des amplicons et/ou analyse des produits de PCR par migration sur gel de polyacrylamide résolutif. Détermination du seuil de sensibilité de la technique Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA 15:30 – 16:30 Salle DH90 Initiation à la biologie structurale et modélisation moléculaire. 16:30 – 17:30 Analyse des études de cas en corrélation avec les résultats de PCR obtenus en travaux pratiques. Détermination sur station de travail, de la structure par radiocristallographie du complexe entre l’EGF et la partie extracellulaire de son récepteur ainsi que la localisation des mutations affectant cette dernière, pouvant être visualisées. Afin de mieux comprendre l’impact de certaines de ces mutations, les interactions de petites molécules à visée thérapeutique (type erlotinib) avec les formes naturelle et mutante du récepteur pourront ensuite être simulées à l’aide d’un logiciel d’amarrage moléculaire et comparées. Guillaume Bernadat Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA 29/04/2016 2 Techniques de base Techniques d’analyse de mutations (ponctuelle ou petite delins) Techniques sans a priori Techniques ciblées Pic EGFR sauvage Délétion de 21bp Délétion de 9 bp • Séquençage (direct /Sanger) • Gold standard • Seuil 20% Cell.Tum • « long » • HRM (criblage) • Pyroséquençage • NGS • • • • • Discrimination allélique Q-PCR (CAST /Scorpion…) PCR allèle spécifique Analyse de fragments/restriction … • Variées/variables • Seuil de 20 à 1% • rapide Direct sequencing « Gold standard Method» : (+) 5’- A T C T • Sanger Sequencing : based on ddNTPs (dye terminator) - Amplitaq DNA polymerase : Cycle sequencing T A G A ... - 3’(+) (-) 3’- T A G A A T C T ... - 5’(-) amorce 5’- dA dT ddC amorce 5’- dA dT dC ddT amorce 5’- dA dT dC dT ddT amorce 5’- dA dT dC dT dT ddA amorce 5’- dA dT dC dT dT dA ddG .... A T C G Laser Analyse de chromatogramme en fin de journée Méthodes du TP Analyse de fragments WT PCR 207 pb Del 18bp exon19 190 pb migration Bouin Formol Nb section ( 30µm) 1 2 5 8 L C L C L C L C 1 L C Formol Nb5section 1CTR 2 8 ( 30µm) L C L C L C L LC C L NC 2 207 pb 190 pb L Méthodes du TP Analyse de fragments de restriction 222 pb WT PCR c.2573 G>T 221 pb 175 pb Digestion Sau91 47 pb 47 pb 88 pb 222 pb 87 pb migration Formol Nb section ( 30µm) Nb 1 section 2 (Nb 30µm) section L C L C ( 30µm) Bouin Bouin Formol Formol Bouin Formol Nb section 5 1 82 5 8 1CTR 28 5CTR 8 1 2 51 82 5 ( 30µm) L 1C L 2C LL5CC LL8CC LL1CC L L2CCL LC5C L LNC8C L LCTR C C L NC L C L C L C L C221L pb C L C L C L C L C N 175 pb 86 pb L Plan expérimental Organisation des manipulations Extraction d’ADN > Caco-2 - Lignée Control –EGFR WT (Colorectal adenocarcinoma) > HCC827 • H.sapiens, lung, adenocarcinoma, 39yrs, female, Caucasian … • EGFR NM_005228; c.2236_2250del15. p.Glu746_Ala750del > NCI-H1975 • H.sapiens, lung, adenocarcinoma, female… • EGFR NM_005228; c.2573T>G; p.Leu858Arg (p.L858R) (et c.2369C>T; p.Thr790Met ou p.T790M) PCR (Exon 19 et Exon 21) Digestion avec des enzymes de restriction (pour exon 21) Dépôt sur Gel (QIA-Xcel) Analyse des résultats 29/04/2016 9 EXTRACTION Lyse des cellules et extraction de l’ADN total Utilisation du kit d’extraction d’ADN total: Extract-N-Amp™ Tissue PCR kit (SIGMA) > > > > > > 100µL Extraction Solution 25µL Tissue Preparation Solution (proteinase K) Vortexer 1min Incubation 20 min à température ambiante Incubation 3 min, 95°C 100µL Neutralizing solution 29/04/2016 10 PCR Lignée Exon amplifié Dilution de l’échantillon Caco-2 (WT) Exon19 207pb 1 Exon 21 222 pb 1 Exon 19 195pb 1 Exon 19 1/2 Exon 19 1/10 Exon 21 222pb 1 Exon 19 207pb 1 Exon 21 222 pb 1 HCC -827 H-1975 Limite de sensibilité? 29/04/2016 11 Préparation des tubes PCR Réactifs > Les réactions de PCR sont réalisées en micro tubes DNAse et RNAse free. > Les amorces sont en solution mère à une concentration de 100 mM puis diluées pour l’expérimentation à 10 mM. > La polymérase permettant l’élongation des brins est fournie dans l’Extract-N-Amp™ Tissue PCR kit: « JumpStart Taq antibody » Mix Constituants par tube H2O Volume (µL) 4.4 Echantillon 4 Amorce FW 0.8 Amorce Rev 0.8 Polymérase 10 Total 20 Pre-mix pour n tubes Volume (µL) Amorce FW 0.8x(n+1) Amorce Rev 0.8x(n+1) Polymérase 10x(n+1) Ajouter 11.6 µL/tube 29/04/2016 12 Programme de la PCR > Thermocycleur: > Programme: Etapes Température (°C) Dénaturation 94 Dénaturation 95 Hybridation 60 Elongation 72 Elongation finale 72 Conservation 10 29/04/2016 Durée 3 min 30 sec 45 sec 1 min 10 min infini X40 cycles 13 Digestion Taille des fragments générés par la digestion des amplicons « exon21 » Fragment non muté: 47pb + 175pb Mutation L858R: 47pb + 88pb + 87pb Mix digestion 29/04/2016 Constituants par tube Volume (µL) Amplicon 10 H2O 7 Enzyme Sau96I 1 Tampon 10x 2 Total 20 Pre-mix pour n tubes Volume (µL) Enzyme Sau96I 1x(n+1) Tampon 10x 2x(n+1) Ajouter 3 µL/tube 14 Migration •Automate d’électrophorèse capillaire QIAxcel Advanced •Prélèvement de 0.1µL d’échantillon dans les capillaires •Migration de l’ADN dans un gel contenant un intercalant (bromure d’éthidium) •Détection de fragments entre 5000 et 15 pb Résolution entre 3 et 5 pb pour les fragments<500pb Etude de la séquence nucléotidique de l’EGFR Interrogation de bases de données Base de données protéiques: ExPASy – UniProtKB N° d’accession: P00533 Base de données nucléotidiques: NCBI N° d’accession: NM_005228.3 (RefSeq) molécule de mRNA Base de données nucléotidiques: Refseq NG_007726.3 molécule d’AND www.ensembl.org Prédiction de la taille des amplicons: utilisation du logiciel A Plasmid Editor 29/04/2016 17