Chap 5 – Méthodes de séparation
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Transformation chimique et séparation Licence Biologie Humaine-Technologie de la Santé 8h de cours (Sylvestre Toumieux) 7h de TD (Gwladys Pourceau) Chap 1 Méthodes Chromatographique: principe et fonctionnement Chap 2 Chromatographie planaire Chap 3 HPLC (et GC) Chap 4 Chromatographie ionique Chap 5 Méthodes de séparation par centrifugation /osmometrie [email protected] – [email protected] Introduction Problématique : Comment extraire différentes molécules au sein d’un mélange homogène Lait Sang Comment identifier, qualifier, quantifier Sel de mer Il faut séparer Introduction Introduction Séparation en fonction de l’état physique Solide Gazeux Liquide Chromatographie Chromatographie Tamisage Filtration Distillation Centrifugation Centrifugation Flottaison Décantation Décantation Cristallisation Osmométrie Dialyse Sublimation Evaporation Chap 1 Méthodes Chromatographique: principe et fonctionnement Tswett sépare les pigments végétaux colorés sur une colonne carbonate de calcium pulvérulent (CaCO3) les pigments étaient entraînés avec de l'éther de pétrole (mélange pentanes et d’hexanes). - formation de bandes de couleur différente (vert, orange, jaune..). - Technique appelée chromatographie (écriture des couleurs). 1930, Edgar Lederer purifie par la méthode de Tswett la lutéine du jaune d’œuf. 1940, Martin et Synge théorie de la chromatographie Nobel en 1952 1952 mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). 1968 mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC en anglais. 1979 première séparation chirale par HPLC. Mikhaïl Tswett Botaniste Russe 1872-1919 Université Lille1 – ATEM Chimie 4 Définitions La chromatographie: Technique où les constituants d’un mélange se séparent en fonction des vitesses auxquelles ils sont entrainés. On parle d’affinité d’un analyte entre une phase stationnaire et une phase mobile. Le résultat est un chromatogramme, Chromatogramme: C’est 1 diagramme qui restitue la concentration en fonction du temps pour un ou plusieurs analytes. Phase stationnaire: C’est la phase immobilisée (CaCO3 par ex) qui, conjointement à la phase mobile permet la séparation. Elle peut être solide ou liquide. Phase mobile: C’est la phase en mouvement qui, conjointement à la phase stationnaire, permet la séparation. Elle peut être liquide ou gazeuse. Est aussi appelé éluant. Le développement: Correspond au passage de la phase mobile sur la phase stationnaire. A pour effet d’entrainer les analytes. Temps de rétention: C’est le temps mis par un analyte pour traverser la phase stationnaire. 5 Principe et but Principe : Repose sur la séparation entre deux phases (jMob et jStat) de différentes substances chimiques (analytes) qui composent un mélange • les substances qui migrent le plus vite ont le moins d’affinité pour la phase stationnaire • les substances qui migrent le moins vite ont le plus d’affinité pour la phase stationnaire Mais aussi • les substances qui migrent le plus ont le plus d’affinité pour la phase mobile • les substances qui migrent le moins ont le moins d’affinité pour la phase mobile 6 Comparaison & Analogie Séparation par chromatographie versus séparation par : Extraction liquide-liquide → 2 phases liquides non-miscibles Cristallisation → 1 phase liquide + 1 phase solide Distillation → 1 phase gazeuse + 1 phase liquide Analogie : piste de ski 7 Différentes Chromatographies Selon la nature physique des phases Phase mobile Phase stationnaire Liquide Liquide Liquide Solide Gazeuse Liquide Gazeuse Solide Chromato de partage 2 phases liquides non-miscibles Les analytes + ou – solubles dans ces 2 phases Quelles sont les interactions mises en jeu Chromatographie De partage D’adsorption De partage D’adsorption Chromato d’adsorption Analyte soluble dans la phase mobile Polarité Solubilité Volatilité Propriété acido-basique Charge (ionique ou neutre) 8 La polarité Les liaisons polaires Une liaison covalente est dite polaire, si la différence d’électronégativités des deux atomes n’est pas nulle. Les molécules polaires Les molécules possèdent souvent plusieurs vecteurs dipôles. Ces vecteurs s’additionnent pour former un dipôle résultant Interaction entre molécules polaires Les molécules polaires s’attirent mutuellement: Augmente quand les charges partielles + et − sont élevées et que la distance entre les atomes est faible. 9 La polarité La géometrie compte aussi!! 10 La polarité Exercice Polaire Polaire Apolaire Apolaire Polaire 11 La polarité Exercice Morphine Héroïne Codéine Quelle est la molécule la plus polaire? 12 La polarité Force Dipôle / Dipôle induit et Interaction polaire / apolaire Les molécules polaires peuvent induire un dipôle sur une molécule apolaire : C’est la polarisation Note : La polarisabilité Capacité à déformer du nuage électronique pour former un dipôle Plus la masse molaire est importante plus la polarisabilité est importante 13 La polarité 14 La polarité et rétention Phase stationnaire polaire (SiO2, Al2O3) Retient + les molécules polaires Phase stationnaire apolaire (C8, C18) Retient + les molécules apolaires la polarité de la phase mobile tR? tR ? la polarité de la phase mobile tR ? tR ? 15 La polarité des solvants La phase mob est + ou - éluante selon la polarité des solvants qui la composent Polarité des solvants Eau Acide acétique Régime isocratique : Même composition de la phase Mobile au cours de la chromatographie Méthanol Éthanol Régime en gradient : Pyridine Variation de la composition de la phase Mobile au cours de la chromatographie Acétate d’éthyle Acétone Dichlorométhane Choix du système d’élution: Chloroforme On peut ajuster la polarité de l’éluant en mélangeant un nombre limité de solvants. Éther éthylique Toluène Tétrachlorure de carbone Cyclohexane Ether de pétrole Hexane Les solvants très polaires (MeOH) augmentent très rapidement la polarité de l’éluant mixte. La polarité des solvants Schéma général Interaction : Phase stat /Phase Mob Collecteur Phase stationnaire Phase mobile Pompe Détecteur Mise en mvt de la Phase mobile Injecteur Tr Quantification Réservoir de solvant, gaz Introduction de l’échantillon Purification Interprétation Qualification 18 Les différents types de séparation Chromatographie d’adsorption L’Adsorption correspond à la fixation d’un gaz, d’un liquide ou d’un solide sur une surface solide. Elle doit être réversible pour pouvoir récupérer le produit. La Désorption est la remise en solution, à l’aide d’un éluant, de la substance par rupture des liaisons précédentes. Interactions impliquées Ioniques : possibilités de former des liaisons ioniques entre les molécules acides ou basiques et l’adsorbant Électrostatiques : molécules polaires présentent un moment dipolaire qui permet des interactions avec la phase S Liaisons hydrogène : les solutés peuvent donner des LH avec la phase S et/ou la phase M Les différents types de séparation Chromatographie d’adsorption Nature des substances adsorbantes Silice (SiO2,nH2O avec n proche de 0) utilisée dans 80% des cas Alumine (Al2O3 neutre, basique, acide) Bentonite (silicate d'aluminium hydraté) Florisil® (silicate de magnésium) Un même adsorbant présente des propriétés adsorbantes variables selon sa teneur en eau. Plus il y a d’eau dans la phase stationnaire, moins elle va retenir les produits par adsorption. Différentes structures Silanols : Silanol libre Silanols liés Pont siloxane Silanol libre hydraté Les différents types de séparation Chromatographie d’adsorption Surface spécifique La surface spécifique d’une phase S représente la surface totale accessible pour un soluté = surface externe des particules (minoritaire) de phase S + surface à l’intérieur des pores de ces particules (majoritaire). + la surface spécifique est grande, + les composés seront retenus. (La présence d’eau diminue la surface spécifique) Les différents types de séparation Chromatographie d’adsorption Surface spécifique : Influence sur la séparation Exemple : séparation d'un mélange d'hydrocarbures aromatiques Silice Sphérosil de 5,6 m A Colonne : longueur 10 cm, diamètre intérieur 4 mm Phase M : hexane sec, débit 0,9 ml.min-1, température ambiante. Surfaces spécifiques A : 470 m2.g-1 B : 590 m2.g-1 C : 900 m2.g-1 B toluène naphtalène biphényle anthracène phénanthrène C Les différents types de séparation Chromatographie de partage Méthode fondée sur les différences de coefficients de partage des solutés à séparer entre les 2 phases liquides Supports Poudre de cellulose Gel de silice (conserve des propriétés adsorbantes) Polymères synthétiques Oxyde de zirconium (ZrO2) Phase stationnaire Phases greffées ie des phases dans lesquelles de véritables liaisons chimiques existent entre la phase stationnaire et le support Les différents types de séparation Chromatographie de partage La surface du gel de silice va être modifiée en fixant des molécules organiques par des liaisons covalentes (grâce à la réactivité des silanols). Types de greffons : Chaînes alkyles (C18, C8, C4), phényls, nitriles, acides Chromatographie en phase normale Phase S = hydrophile Chromatographie en phase inverse Phase S = lipophile Amino Chaînes alkyles de C4 à C30 Nitro Colonnes C18 sont les plus répandues Nitrile Colonnes C4 utilisées pour analyser des peptides Dialcool ODS : OctaDécylSilane, C18 Colonnes C30 utilisées pour séparer les caroténoïdes Réaction d’un chlorosilane sur les groupements silanols de la silice Les différents types de séparation Chromatographie de partage La phase mobile Pouvoir solvant + inertie chimique vis-à-vis des échantillons à analyser Inerte chimiquement et insoluble vis-à-vis de la phase S Mélange de plusieurs solvants : on adapte la polarité à la séparation à réaliser. Polarité des solvants Eau Méthanol Régime isocratique : Éthanol Même composition de la phase Mobile au cours de la chromatographie Propan-1-ol Isopropanol Acétonitrile DMF Dioxanne THF Régime en gradient : Variation de la composition de la phase Mobile au cours de la chromatographie Les différents types de séparation Chromatographie échangeuse d’ion Utilisation d’une phase S constituée de macromolécules formant un solide poreux et insoluble dans les solvants et ayant la propriété de pouvoir échanger des ions avec la phase M. Résine échangeuse d’anions Résine échangeuse de cations R = solide plus ou moins poreux se présentant sous forme granulée. = produit naturel (dextran, polymère de glucose) ou copolymère de synthèse Copolymères réticulés polystyrène/divinylbenzène styrène divinylbenzène Les différents types de séparation Chromatographie échangeuse d’ion Groupements échangeurs Échangeurs de cations Acide fort Acide faible Acides sulfoniques Amberlite IR-120 Dowex 50w Acides carboxyliques Amberlite IR 50 Échangeurs d’anions Base forte Base faible Ammonium IV Amberlite IRA-400 Dowex 1 Amine tertiaire Amberlite IRA-45 Dowex 3 Les différents types de séparation Chromatographie d’exclusion stérique Gel homogène Fondée sur la rétention sélective des solutés suivant leur taille lors de la pénétration dans les pores de la phase stationnaire remplis de solvant. -phase dispersée (=substance solide constituée de petites particules poreuses très régulières et calibrées) (les molécules vont plus ou moins pénétrer dans les pores du gel selon leur taille) -phase dispersante ou solvant (=pénètre dans les particules et provoque leur gonflement en créant des pores de différentes tailles) : molécule exclue (de grosse taille) : molécules de petite taille Signal du détecteur .. .. . .. : solvant Volume du solvant Solvant Molécules volumineuses exclusion des pores Particules de phase stationnaire Pores remplis de solvant Petites molécules diffusion dans les pores Les Applications 29 Chap 2 - La chromatographie Planaire • Plaque CCM= Chromatographie sur couche mince plaque d’aluminium, verre, plastique de ~5x5cm recouverte de phase stationnaire solide (SiO2 ou Al2O3) • La phase mobile est constituée de solvant organique qui migre par capillarité – Mélange de solvant polaire + apolaire • Très utilisée dans les laboratoires pour – Analyser un mélange – Suivre une réaction (nbr de produit formés, conversion) – Mettre au point des conditions de purification par flash chromato (choix de la phase mob) – Purifier un mélange de composés (plaque préparative) • Se déroule en trois étapes: – Le dépôt – Le développement – La révélation 30 La chromatographie CCM Le dépôt : - Avec un capillaire, on dépose la solution à analyser qui à préalablement été diluée (entièrement soluble) sur la ligne de dépôt. Le développement: - La CCM est placée dans une cuve hermétique qui contient la phase mobile. - Ligne de dépôt > niveau éluant - Mise en mvt de la phase mobile par capillarité - Migration = f(polarité analyte, phase mob, phase stat) - Arrêt du développement à la ligne de front de solvant 31 La chromatographie CCM La révélation : Analyse de la plaque CCM pour détecter la présence/absence et la position des analystes - Visuellement : - Si absorption dans le domaine du visible (400 <λabs< 800nm) - Insuffisances - Fluorescence (irradiation de la plaque à 258 nm) - Plaque enduite d’un substance sensible - On constate un défaut ou une variation d’absorbance - Notion de Gpt Chromophores - Insuffisances - Chimiquement - La dégradation des fonctions chimiques présentent sont visibles à l’œil nu. - Il existe des révélateurs spécifiques à une fonction et d’autres + ou – universel 32 Exercice: Résultats des CCM 3 révélateurs: bleu de molybdène, ninhydrine, rhodamine Bleu de molybdène (zinzade) •phospholipides •taches bleues Ninhydrine •amines + acides aminés •taches violacées Rhodamine •tous les lipides •taches fluorescentes(UV) 33 La chromatographie CCM Mise en œuvre pratique Identification des composés Chaque produit va être identifié par la valeur de son Rf (Rapport Frontal) Rf = d/D d : distance parcourue par le produit D : distance parcourue par le solvant ATTENTION: le Rf varie en f(Phase stat, Phase mob, [analyte] 34 La chromatographie CCM Nature de la phase mobile 35 La chromatographie CCM Nature de la phase mobile 36 La chromatographie CCM Application : Suivi d’une réaction Identifiez les composés 1, 2, 3 et 4 sur la CCM en fonction de leur structure. Calculez les Rf de chaque produit. Pourquoi la tache 4 ne quitte pas la ligne de dépôt? La phase mobile est constituée de 50% de cyclohexane et 50% d’acétate d’éthyle. Il est possible de modifier ces proportions en 60/40 ou 40/60. Représentez soigneusement l’allure des CCM dans ces deux cas. 37 La purification par CCM préparative But : Purifier un mélange (100-200mg) par la même méthode que la CCM Différence/CCM: Taille de la plaque CCM :25x25cm tps d’élution ~1h pas de révélation chimique Procédé: Identique à la CCM (dépôt et développement) les produits sont révélés par UV puis récupérés par grattage et filtration 38 39 Chap 3 - Chromatographie Liquide HPLC HPLC : High Performance Liquid Chromatography 40 Chromatographie Liquide HPLC Généralités Basée sur le partage de l’analyte entre la phase liquide mobile et la phase stationnaire liquide Attention : les deux phases sont liquides et non-miscibles Séparation = f(solubilité) entre les deux phases Attention : la solubilité varie en fct de [], polarité, charge, interaction Electrostat Très fortes pressions (> 100 bars) Coeff de partage K = [A]phase stat/ [A]Phase mob 41 Schéma général Interaction : Phase stat /Phase Mob Collecteur Phase stationnaire Phase mobile Pompe Détecteur Mise en mvt de la Phase mobile Injecteur Tr Quantification Réservoir de solvant Introduction de l’échantillon Purification Interprétation Qualification 42 Chromatographie Liquide HPLC HPLC : High Performance Liquid Chromatography http://chem.uft.uni-bremen.de/Chromatography F – Instrumentation en HPLC et GC 1 - HPLC Solvants Chromatographie Liquide HPLC Mise en mouvement de la phase mobile Doit avoir: - Un débit reproductible de 0,1 à 10 mL/min - Stabilité du débit si gradient de solvant (variation de la composition de la Pmob - Absence de pulsations - Solvants qualités HPLC Précaution : Dégazage du solvant Pourquoi? Comment? Chromatographie Liquide HPLC Mise en mouvement de la phase mobile : Système de double piston 46 Chromatographie Liquide HPLC Mise en mouvement de la phase mobile : Système cardioïque 2 pistons en oppositions Technique de l’ingénieur - Chromatographie en phase liquide Débit régulier sans pulsation 47 Chromatographie Liquide HPLC Injection Permet l’introduction de l’échantillon Doit être précis (volume), reproductible et fiable (fuite) Remplissage de la boucle: La phase mob circule de la pompe vers la colonne (2-3), L’échantillon est injecté (5) dans la boucle (5-20 L). Le surplus de solvant est évacué dans l’effluent (4). Injection de l’échantillon On bascule l’injecteur puis le solvant issu de la pompe traverse la boucle (1-4) et entraîne l’échantillon dans la colonne. Rinçage de la boucle Chromatographie Liquide HPLC La colonne Précolonne Colonne Colonne de protection pour éviter « d’encrasser » la colonne où a lieu la séparation (elle retient les composés indésirables) Tube droit en acier inoxydable ou en verre de diamètre et de longueur variable (5 à 30 cm). Capillaire (rare) ou remplie Université Lille 1 ATEM Chromatographie Liquide HPLC La phase stationnaire Plusieurs types : Silice, Alumine, greffée (normal ou inverse) Chromato d’adsorption -Polaire (trop) -Hydrophile -Acide Chromato de partage Phase Normale ou Inverse 50 http://web.uconn.edu/rusling/StuartLC3.pdf Chromatographie Liquide HPLC Les phases stationnaires 51 Chromatographie Liquide HPLC Exemple de séparation HPLC 52 Technique de l’ingénieur - Chromatographie en phase liquide Chromatographie Liquide HPLC Les phases mobiles Attention à la miscibilité 53 Chromatographie Liquide HPLC Les phases mobiles Agilent technology Amélioration de la séparation Temps d’analyse optimisé 54 Chromatographie Liquide HPLC Les détecteurs Seuil de détection - limite de [] à laquelle le détecteur est sensible - pg/ml au g/ml Linéarité - Limite min et max où signal = f[concentration] - Linéaire si signal= 2 x bruit de fond Faible bruit de fond - lié au faible bruit de fond et linéarité Reproductibilité – stabilité - dérive f(tps), f(T°)… Temps de réponse - Tps nécessaire pour passer de 10% à 90% - + c’est court + le signal est fidèle 55 Chromatographie Liquide HPLC Les détecteurs La détection est basée sur un différentiel de signal entre: - un signal de phase mobile pur: La référence (arbitrairement 0) - un signal de phase mobile contenant un produit : valeur X 56 Chromatographie Liquide HPLC Les détecteurs spectrométriques Détecteur qui dépend des propriétés d’absorption de l’analyte A = Absorbance (sans unité) e = Coefficient d’extinction molaire L/mol/cm C = Concentration (mol/L) l= longueur du trajet optique (cm) Cdt : l’analyte absorbe en UV 57 Chromatographie Liquide HPLC Les détecteurs spectrométriques mono-faisceaux Effluent Colonne 58 Chromatographie Liquide HPLC Les détecteurs spectrométriques à barrette de diode (DAD Diod Array Detector) Effluent Colonne 59 Chromatographie Liquide HPLC Le détecteur par mesure de l’indice de réfraction : le réfractomètre Mesure en continu la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile et l’effluent de la colonne. Chromatographie Liquide HPLC Détecteur Evaporatif à Diffusion de Lumière (DEDL) ELSD : Evaporative Light Scaterring Detection 61 Chromatographie Liquide HPLC Autres détecteurs Détecteur électrochimique - Fonction du potentiel red/ox du soluté - Basée sur la ddp entre phase mob et phase mob+ produit Détecteur par conductimétrie Mesure la conductivité électrique due à la présence d'un soluté dans la phase mobile (de façon absolue ou différentielle). Chromatographie Liquide HPLC Autres détecteurs Polarimètre Mesure l'activité optique des substances possédant un ou des centres d'asymétrie. Spectrométrie de masse Mesure la masse molaire des analytes en g/mol La Chromatographie ionique Généralités Utilisé pour les molécules complexes et chargées - Polysaccharides - Oligonucléotides - Oligopeptides - Protéines La phase stationnaire (appelée ici résine) est ionisée et de signe opposée aux ions à analyser Phase stat ionisée + → Analyse d’anion Ce sont les résines basiques ex: groupements ammoniums – N+R3 CI- Phase stat ionisée - → Analyse de cation Ce sont les résines acides Ex: groupements acides sulfoniques - SO3- CI+ La phase mobile est liquide. C’est une solution aqueuse ionique tamponnée: c’est un électrolyte 64 La Chromatographie ionique Principe de séparation Equilibre dynamique entre le contre-ion de l’électrolyte et l’ion à analyser Exemple : Chromatographie ionique basique – échangeuse d’anion Contre ion Résine basique 65 La Chromatographie ionique Principe de séparation La rétention dépend : la molarité du tampon [CI] (CAD la qtt de charge disponible) du pH (Variation de la charge) du type d’ionisation des l’analytes (cationique/neutre/anionique) Si la concentration de contre-ions est importante, les analytes sont moins retenus Si la concentration de contre-ions est faible, analytes se fixent sur la résine. Elution avec gradient de [CI] La Chromatographie ionique Principe de séparation La rétention dépend : la molarité du tampon [CI] (CAD la qtt de charge disponible) du pH (Variation de la charge) du type d’ionisation des l’analytes (cationique/neutre/anionique) Note cas des analytes multichargés Ex: Acide aminé pI= point isoélectrique - pH pour lequel l’analyte est neutre Si pH> pi analyte anionique Si pH< pi analyte cationique 67 La Chromatographie ionique Les Résines 68 La Chromatographie ionique Les Résines 69 La Chromatographie ionique Les détecteurs Détecteur de conductivité 2 électrodes en sortie de colonne mesurent la conductivité de la phase mobile - Détecte les ions Beaucoup de charges liées à la présence de l’électrolyte Détecte difficilement les acides faibles car peu dissociés et faiblement concentrés Rôle du suppresseur pour éliminer la conductance lié à l’électrolyte Dialyse de Donnan La Chromatographie ionique Le détecteur anionique Détecteur de conductivité A - est un analyte anionique Na+ le Contre ion HCO3- est issu de l’électrolyte Utilisation d’une membrane perméable aux ions H + (issus de H2SO4) et Na + Pour l’électrolyte : Faiblement dissocier: faible conductivité Pour l’analyte : Fortement dissocier: forte conductivité www.lisa.univ-paris12.fr/~desboeufs/cours_chimie_ana_B.pdf La Chromatographie ionique Le détecteur cationique M+ est un analyte cationique Cl- est le Contre Ion H+ est issu de l’électrolyte Utilisation d’une membrane perméable aux ions Cl- et OH- (issus de H2O) Pour l’électrolyte : Neutre : absence de conductivité Pour l’analyte : Fortement dissocier: forte conductivité www.lisa.univ-paris12.fr/~desboeufs/cours_chimie_ana_B.pdf Chromatographie Gazeuse GC CPG : chromatographie en phase gazeuse GC : gas chromatography 73 Chromatographie Gazeuse GC Généralités La phase mobile est gazeuse. C’est un gaz inerte H2, N2, He - Appelé aussi « gaz vecteur » L’analyte est gazeux ou volatilisé (analyte thermostable et volatil) La phase mobile ne participe pas à l'échange Chromatographie gaz-solide →chromatographie d’adsorption Chromatographie gaz-liquide → chromatographie de partage On a toujours : Coeff de partage K = [A]phase stat/ [A]Phase mob 74 Chromatographie Gazeuse GC Généralités Si la phase stationnaire est apolaire : interactions liées à la dispersion de l’analyte gazeuse et donc à la T°eb: Analytes apolaires sont les + retenus et Tr= f(T°eb) ex: 1- hexane (69°c) 2- heptane (98°c) 3- octane (126°c) Si même point d’ébullition les analytes polaires ont un Tr + faible 1- propanol (T°eb= 98°c) 2- heptane (T°eb= 98°c) Si la phase stationnaire est polaire: Interaction dipôle-dipôle (+ forces de dispersion) Analytes polaires sont les + retenus Tr= f(polarité) La T°eb à moins d’influence Si même T°eb les solutés peu polaires sont les – retenus heptane (1) propanol (2) point d’eb 98°C 75 Schéma général Interaction : Phase stat /Phase Mob x Collecteur Phase stationnaire Phase mobile Pompe Détecteur Réservoir de gaz Mise en mvt de la Phase mobile Injecteur Tr Quantification Introduction de l’échantillon x Purification Interprétation Qualification 76 Schéma général 77 Chromatographie Gazeuse GC Les colonnes, le four Technique de l’ingénieur PE 1485 Enceinte où est située la colonne - Précision : T° ajustée a 0,1°C - Rapidité: 150°/min - isolation : Stabilité thermique - T° homogène : chaleur tournante - Amplitude : 30-450°C - Mode de travail : isotherme ou en gradient de T° Colonnes remplies : 3 à 5 m x 1 à 4 mm de Ø interne tube en acier inoxydable ou verre pyrex Colonnes capillaires 15 à 100 m x 0.1 à 0.35 mm Ø interne silice fondue revêtue de polyimide à l’ext PS = déposé sur la paroi interne de la paroi sous forme de film liquide 78 Chromatographie Gazeuse GC L’Injection Objectif: Introduction et vaporisation rapide de l’échantillon Très faible volume introduit (~µL) à travers une pastille d’élastomère (= septum) Soit échantillon déjà gazeux (analyse gaz atmosphère) Soit échantillon liquide Analyse d’un gaz - Produit déjà volatil - Boucle + vanne 6 voie pour la reproductibilité Technique de l’ingénieur PE 1485 79 Chromatographie Gazeuse GC L’Injection Analyse d’un liquide - Mélange dilué - Solvants volatils - Injection directe → volatilisation instantanée - T°injecteur > T°colonne - Gaz vecteur chauffé - Septum étanche - seringue Technique de l’ingénieur PE 1485 80 Chromatographie Gazeuse GC L’Injection Injection sur une colonne capillaire Faible capacité→Pb: saturation de la colonne Injecteur split/splitless (fractionnement/sans fractionnement) Gaz vecteur = 104 mL/min Purge septum = 3 mL/min Split = 100mL/min Injection dans la colonne = 1mL/min 81 Chromatographie Gazeuse GC Les phases stationnaires - stable thermiquement - tension de vapeur faible - pas d’associations irréversibles avec l’un des solutés Phase stationnaire solide (adsorption) ou liquide (partage) Imprégnées ou greffées sur un support solide type SIO2 ou polymère Classement en fonction de la polarité et de la température max d’utilisation: -polyethers de glycols, T°max=225°C (polaire) Polyéthers de glycol (polyéthylèneglycol : PEG) HO-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-OH -silicones ou polysiloxanes, T°max=375°C 50% cyanopropyl-50% méthylpolysiloxane (polaire) 50% trifluoropropyl-50% méthylpolysiloxane (polarité intermédiaire) 50% méthyl-50% phénylpolysiloxane (polarité intermédiaire) 5% méthylphénylpolysiloxane (légèrement polaire) polydiméthylsiloxane (apolaire) -squalane (hydrocarbure saturé) (apolaire) T°max=120°C squalane n polysiloxanes R R R R Si O Si O Si R R R R n R = CH 3, C6H5, C 3H6CN, C 3H 6CF3 Chromatographie Gazeuse GC Les phases stationnaires Colonnes Choix fonction de la polarité des substances à séparer. Molécules Exemples Phases stationnaires non-polaires liaisons C-H et C-C hydrocarbures normaux (n-alcanes) poly(méthylsiloxane) polaires liaisons C-Cl, -Br, -F liaisons C-N, -O, -P, -S alcools, éthers, thiols, amines, acides carboxyliques, esters et cétones polarisables liaisons C-H et C=C et acétyléniques poly(méthylphénylsiloxane) poly(cyanopropylméthylsiloxane) PEG poly(cyanopropylsiloxane) alcènes aromatiques poly(cyanopropylphénylsiloxane) Chromatographie Gazeuse GC Les détecteurs Seuil de détection - limite de [] à laquelle le détecteur est sensible - pg/ml au g/ml Linéarité - Limite min et max où signal = f[concentration] - Linéaire si signal= 2 x bruit de fond Faible bruit de fond - lié au faible bruit de fond et linéarité Reproductibilité – stabilité - dérive f(tps), f(T°)… Temps de réponse - Tps nécessaire pour passer de 10% à 90% - + c’est court + le signal est fidèle 84 Chromatographie Gazeuse GC Les détecteurs Détecteur à ionisation de flamme (FID) Technique de l’ingénieur PE 1485 Le soluté est brûlé en sortie de colonne dans une flamme ionisante (combustion H2 dans l’air). Il s’établit alors un courant entre les 2 électrodes dû à l’ionisation de la flamme. Ce courant est constant pour le gaz vecteur seul, par contre si une substance organique arrive dans la flamme, sa combustion modifie l’intensité du courant et cette variation du courant est enregistrée sous forme de pic. Chromatographie Gazeuse GC Les détecteurs Détecteur à conductibilité thermique ou Catharomètre Le changement de composition de la phase mobile lorsqu’un soluté est élué entraîne une variation de la conductivité du gaz vecteur ce qui est noté par le détecteur. Il s’agit en fait d’un pont de Wheatstone : lorsqu’un soluté est élué, la conductivité du gaz vecteur varie provoquant un déséquilibre du pont par suite d’une variation de la résistance de mesure qui se trouve balayée par ce nouveau mélange gazeux. =détecteur universel mais peu sensible Cours Pierre Dubreuil Chromatographie Gazeuse GC Les détecteurs Détecteur à capture d’électrons Une source radioactive (63Ni) émet un rayonnement radioactif β Ces particules ionisent l’azote qui génère alors un électron. N2 + β → N2+ + eSi un molécule « A » ionisable sort de la colonne A + e- → A- La mobilité de l’anion formé étant différente de celle d’un e- Détecteur non universel spécifique des molécules comportant des éléments électronégatifs (X, S, P) Modification du courant de référence SIGNAL Chromatographie Gazeuse GC Les détecteurs Spectrométrie de Masse Mesure la masse molaire des analytes Voir cours Mr Moreau 88 Chap 5 séparation - centrifugation - osmométrie Introduction Séparation en fonction de l’état physique Solide Gazeux Liquide Chromatographie Chromatographie Tamisage Filtration Distillation Centrifugation Centrifugation Flottaison Décantation Décantation Cristallisation Osmométrie Dialyse Sublimation Evaporation Chap 5 Méthodes de séparation (extraction-centrifugation-osmométrie) Séparation par extraction liquide/liquide Problématique : Comment extraire différentes molécules au sein d’un mélange homogène Lait Sang Comment identifier, qualifier, quantifier Sel de mer Il faut séparer Chap 5 – Méthodes de séparation Séparation par extraction liquide/liquide AAAAA Extraction 1 A Extraction 2 AAAAA AAAA n0 Extraction 1 n0 - x x mA= masse du produit A dans la phase 1 m’A= masse du produit A dans la phase 2 V1= volume de la phase 1 V2= Volume de la phase 2 K=[A]2/ [A]1 K= K= x/V2 n0−x /V1 = mA /V MA 2 m′A /V1 MA mA. V1 m′ A . V2 93 Chap 5 – Méthodes de séparation Séparation par fractionnement Différent de l’extraction car pas de produit solide ou liquide dissout dans un solvant Liquide – Liquide Solide - Liquide Filtration, décantation sédimentation, centrifugation 1 - Séparation par filtration Séparation de particule solide en suspension dans un liquide Passage par une membrane/filtre poreuse sous l’effet de la gravité ou de la pression 94 Chap 5 – Méthodes de séparation 1- Séparation par filtration Séparation de particule solide en suspension dans un liquide Passage par une membrane/filtre poreuse sous l’effet de la gravité ou de la pression Différent type de filtre Filtre à membrane Film percé de pores calibrés sélectivité de la taille des particule en Cellulose, téflon Filtre d’épaisseur Retient les particules dans un réseau + ou- dense Sélectivité selon la densité du réseau Papier Filtre ou fibre de verre 95 Chap 5 – Méthodes de séparation 1- Séparation par filtration – type de filtration 96 Chap 5 – Méthodes de séparation 2- Séparation par décantation Sépare : - matières solides en suspension dans un liquide - matières liquides non-miscibles et de densités différentes Différent de l’extraction liquide-liquide où les produits d’intérets sont en solution dans un solvant. 2 types: a- Séparation par sédimentation b- Séparation pas centrifugation 98 Chap 5 – Méthodes de séparation 2a- Séparation par sédimentation Séparation - matières solides en suspension dans un liquide - matières liquides non-miscibles et de densités différentes S’effectue par action de la gravité Calcule de la vitesse de sédimentation: tps pour la séparation du mélange Il faut faire le bilan des forces: Le poids La poussée d’Archimède Les forces de frottements 99 Chap 5 – Méthodes de séparation 2a- Séparation par sédimentation Pour une particule de masse m et de rayon r dispersée dans un liquide de coefficient de viscosité η (eta) en Pa.s: - Le poids (N): P=mg avec m= ρV ρ = masse volumique de la particule (kg/m3) V=volume (m3) de la particule g= constante gravitationnelle = 9,81ms-2 - La poussée d’Archimède (N): A=m’g avec m’= masse du volume de liquide déplacé = ρ’V ρ’ = masse volumique du liquide (kg/m3) V=volume de la particule (m3) g= constante gravitationnelle = 9,81ms-2 - Les forces de frottements : Loi de Stockes f= 6π η r v avec v = vitesse de sédimentation A f m p 100 Chap 5 – Méthodes de séparation 2a- Séparation par sédimentation Déterminons la vitesse de sédimentation : Lorsque l’accélération est nulle, le mouvement est rectiligne uniforme donc: La vitesse est constante: P-f-A=0 P=f+A donc P-A=6 π η r v (m-m’)g= 6 π η r v On extrait la vitesse de sédimentation : v= V g (ρ− ρ′) (ρV− ρ’V)g = 6πηr 6πηr Si P>A sédimentation Si P~A mauvaise sédimentation – comment faire? 101 Chap 5 – Méthodes de séparation 2b- Séparation par Centrifugation SI P n’est pas suffisamment élevé trop long → remplace par la force centrifuge Pour une particule de masse m et de rayon r dispersée dans un liquide de coefficient de viscosité η (êta) en Pa.s: - La force centrifuge (N): F= m ω2 x avec m= masse de la particule ω= vitesse angulaire (rad.s-1) x= distance entre la particule et l’axe de rotation (m) - La poussée d’Archimède (N): A=m’ ω2 x avec m’= masse du volume de liquide déplacé ω= vitesse angulaire (rad.s-1) x= distance entre la particule et l’axe de rotation (m) - Les forces de frottements : Loi de Stockes f= 6π η r v avec v = vitesse de sédimentation 102 Chap 5 – Méthodes de séparation 2b- Séparation par Centrifugation Déterminons la vitesse de sédimentation : Lorsque l’accélération est nulle, le mouvement est rectiligne uniforme donc: La vitesse est constante: F=A+f F-A=f donc (m-m’) ω2 x = 6 π η r v (m−m’) ω2 x D’où v = 6 π η r Alors: quand ω2 augmente : la vitesse de séparation augmente quand x augmente : la vitesse de séparation augmente 103 Chap 5 – Méthodes de séparation 3- Séparation par Dialyse et osmose La dialyse est une séparation par membrane perméable sélective: ions – molécules Les forces misent en jeu sont les gradients de concentration par diffusion Mise en évidence de la diffusion: Solvant pur Solvant pur Interface Solvant + produit Solution homogène Solvant + produit 104 Chap 5 – Méthodes de séparation 3a- Séparation par Dialyse Mise en application de la dialyse t0 tf V1=V2 1 CA+CB 2 Solvant Membrane sélective de B et perméable au solvant V1=V2 1 2 CA+CB/2 CB/2 Membrane sélective de B et perméable au solvant 105 Chap 5 – Méthodes de séparation 3a- Séparation par Dialyse Si on renouvelle le solvant contenu dans la compartiment 2 tf tf V1=V2 V1=V2 1 2 CA+CB/2 Solvant Membrane sélective de B et perméable au solvant 1 CA+CB/2 2 CB/4 Purification du compartiment par extraction de B Membrane sélective de B et perméable au solvant 106 Chap 5 – Méthodes de séparation 3a-Calcul de concentration et coefficient de dialyse Pour une solution de conc. C0 dialysant contre de l’eau distillée constamment renouvelée (CAD [Conc B] =0 dans le compartiment 2) On a la variation de concentration en fonction du temps tel que: dC = -δ C0 dt δ = coefficient de dialyse. Expression négative car variation négative On intègre: lnC=- δt+lnC0 Donc C= C0 e- δt C/C0 t La variation de concentration est une fonction du tps exponentiellement décroissante Quand t augmente la vitesse de dialyse diminue 107 Chap 5 – Méthodes de séparation 3b- Séparation par osmose Lorsqu’une solution chargée de produit est en contact (via une membrane) avec un solvant pur ou de faible concentration La membrane est hémiperméable ne laisse passer le solvant que dans un sens. Le soluté ne passe pas cette membrane Diffèrent de la dialyse où le solvant et le produit sont capables de traverser la membrane 108 Chap 5 – Méthodes de séparation 3b- Séparation par Osmose h C D Le solvant passe du compartiment de gauche vers celui de droite Le volume de droite augmente donc la concentration à droite diminue La pression de la colonne de liquide à droite augmente (PD>PC) : c’est la pression osmotique Π Calcul de la pression osmotique Π= PC-PD= ρ.h.g ρ=masse volumique de la solution g=9.81m/s-2 h= différence de hauteur de niveau On note aussi Π= CRT C = conc. du soluté R= Cst des GP = 8.31J/mol/K T = Température 109 Chap 5 – Méthodes de séparation 3b- Séparation osmose inverse Si on applique une pression sur la solution la plus concentré→ inversion du phénomène Le solvant va diffuser de la solution la +concentréee vers la – concentrée La concentration à droite Augmente en fct du tps 110
