Protocole avec Annexes 1 et 2 - Collège Lionel

101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant
Automne 2016
Lab 6
ANALYSE GÉNÉTIQUE
DE
LA CAPACITÉ DE GOÛTER L’AMER.
1. OBJECTIFS
1.1 Effectuer une analyse d’ADN dans le but d’établir une relation entre les génotypes et les phénotypes d’un
caractère héréditaire : la capacité de goûter une substance amère, le PTC.
1.2 Analyser cette relation pour déterminer le type de dominance, complète ou incomplète, existant entre les
allèles goûteur et non goûteur de PTC.
1.3 Se familiariser avec des techniques modernes de biologie moléculaire : amplification en chaîne par
polymérase ou ACP (couramment appelée PCR, de l’anglais) et électrophorèse sur gel d’agarose.
1.4 Analyser des résultats en tenant compte des variables non contrôlées et inévitables dans une
expérimentation sur du vivant.
PRÉPARATION AU LABO
Semaine 1:
 Lire le protocole et compléter l’Annexe 2 à l’aide de la section «Détermination du génotype» (p.6-7).
Semaine 2:
 Formuler une hypothèse répondant à la question expérimentale (p.2). Référence : «Génome gourmand» [1] .
 Identifier les génotypes attendus à la Fig.7 intitulée «Électrophorèse : résultats attendus», p.5.
2. INTRODUCTION
2.1 LE GOÛT, C’EST D’ABORD UNE AFFAIRE DE GÈNE. Aimez-vous le brocoli? Le PTC?
Un peu d’histoire. Au début des années 1930, Arthur Fox, un chimiste à l’emploi de la Cie DuPont synthétise
une poudre de phénylthiocarbamide (PTC). Alors qu’il en transfère dans une bouteille, des poussières
s’échappent dans l’air et des collègues se plaignent de leur goût amer. Pourtant Fox n’en goûte rien. Quelques
années plus tard, des généticiens démontrent que la capacité de goûter le PTC est un caractère héréditaire et
qu’en Amérique environ 75% des gens sont goûteurs et 25% non goûteurs [2].
PTC et brocoli. Chez les mammifères, on connaît environ 30 gènes codant pour des
récepteurs protéiniques du goût amer sur la langue. Ont-ils joué un rôle évolutif en
permettant de reconnaître des molécules dangereuses souvent associées au goût amer
(ex : strychnine)? Pourtant, certains aliments sains et anti-cancer contiennent beaucoup
d’isothiocyanates dont la saveur amère se rapproche de celle du PTC (ex : les crucifères :
chou, brocoli, chou de Bruxelles, navet). On a même pu établir un lien chez des enfants
entre leur dédain pour le brocoli et leur capacité à goûter le PTC. Évidemment, rendus au
cégep, tous adorent le brocoli! Mais qu’en est-il du PTC?
Sarrau
Lampe
UV
Rappel
Produit
toxique
Sécurité au laboratoire
Le port du sarrau est obligatoire.
L’exposition aux UV est dommageable pour la peau et les yeux. Utiliser avec verre
protecteur.
Comme toujours, il est interdit de manger ou de boire au laboratoire.
L’ADN est coloré avec un produit potentiellement cancérigène. Tout objet entrant en
contact avec ce produit sera manipulé avec des gants et suivant un protocole très précis.
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Un gène pour le PTC. Un gène pour le récepteur de PTC a été identifié en 2003 et nommé TAS2R38. Il mesure
1002 pb (paires de bases). Il existerait 7 allèles dans le monde (allèles = formes différentes d’un gène), mais
seuls 2 d’entre eux sont répandus en Amérique : un allèle goûteur et un allèle non goûteur qui diffèrent par 3
mutations aux positions 145, 785 et 886. Dans ce labo, seule la mutation 145 sera utilisée pour distinguer les
allèles goûteur avec un C et non-goûteur avec un G (Fig.1).
3 MUTATIONS:
2 Allèles du gène TAS2R38 (1002 pb)
1
Une des 23 paires
de
CHROMOSOMES
145
785
886
CCA
ALLÈLE Goûteur
GCA
ALLÈLE Non Goûteur
1002pb
Fig.1. Différences entre les deux principaux allèles du gène TAS2R38.
On soupçonne que notre sensibilité au PTC soit sous contrôle polygénique, c’est-à-dire que plusieurs paires de
gènes seraient impliquées. Cependant, le gène TAS2R38 serait le principal responsable des variations observées
dans la population [2].
Le goût, pas juste une affaire de gène… La perception des saveurs est très complexe et plusieurs facteurs
interviennent, tels que l’influence de l’odorat, les mécanismes cérébraux, les différences culturelles, ou
simplement le nombre de papilles gustatives qui peut varier d’un individu à l’autre! Le sexe pourrait aussi
intervenir puisque c’est souvent chez les femmes qu’on trouve des «super goûteuses» [3].
2.2 GÉNOTYPE VS PHÉNOTYPE.
Nous venons au monde avec un bagage de gènes donnés, c’est notre génotype [4;p.303]. Les gènes sont reçus
en deux versions, l’une maternelle, l’autre paternelle. Lorsqu’un individu reçoit 2 allèles identiques du gène
TAS2R38, on dit qu’il est «homozygote». Le caractère héréditaire observé, le «phénotype», est bien sûr celui
porté par les allèles : l’individu est goûteur ou non-goûteur. Mais quel sera le phénotype d’un individu
«hétérozygote», c'est-à-dire un individu qui hérite de deux allèles différents?
 Dans un cas de dominance complète, l’hétérozygote présente un phénotype correspondant à celui de
l’allèle dit «dominant». L’allèle qui ne se manifeste pas est dit «récessif».
 S’il s’agit d’un cas de dominance incomplète, l’hétérozygote présente un phénotype intermédiaire entre
ceux des homozygotes [4;p.309]; il sera alors semi-goûteur ou «goûteur faible».
2.3 QUESTION EXPÉRIMENTALE.
Puisque nous possédons maintenant les moyens techniques d’analyser notre ADN et nos gènes, nous pouvons
énoncer la question expérimentale suivante : l’interaction entre les deux allèles se rapproche-t-elle d’une
dominance complète ou incomplète? En termes de résultats attendus, la question peut s’énoncer ainsi :
Les élèves hétérozygotes possédant un allèle goûteur et un allèle non-goûteur du gène TAS2R38 auront-ils un
phénotype «goûteur fort» de PTC, «non-goûteur», ou un phénotype intermédiaire «goûteur faible»?
2.4 HYPOTHÈSE … à rédiger après lecture de l’article «Génome gourmand» [1] disponible à l’Annexe 3.
Rédigez une hypothèse et justifiez-la à l’aide de l’article «Génome gourmand» [1]. Indiquer le type de
dominance attendu, le phénotype attendu pour un hétérozygote et citer un passage de l’article à l’appui.
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2.5 DÉMARCHE GÉNÉRALE PROPOSÉE
Au cours de ce labo, nous tenterons de répondre à la question posée en suivant la démarche suivante (Fig.2):
1) D’abord une dégustation de PTC, pour déterminer le phénotype de chacun. Qui est goûteur? Non-goûteur?
Y-a-t-il des «goûteurs faibles»?
2) Ensuite une analyse d’ADN, pour déterminer le génotype de chacun : homozygote ou hétérozygote? (un
seul élève expérimentateur par équipe)
3) Enfin, une analyse croisée des résultats pour déterminer le type de dominance, complète ou incomplète,
selon le phénotype observé chez les hétérozygotes. Les homozygotes, goûteurs et non-goûteurs,
constituent un groupe témoin servant à valider la méthode d’analyse, puisque leur phénotype devra
nécessairement correspondre à leur génotype, en toute logique.
1) DÉTERMINATION DES
PHÉNOTYPES
2) DÉTERMINATION DES
GÉNOTYPES
G
1o EXTRACTION D’ADN
de cellules buccales
Allèle Non-goûteur
?
2o AMPLIFICATION :
Ciblage et multiplication
de fragment du gène
C
Allèle Goûteur
3o DIGESTION :
Coupure des allèles goûteurs
pour les différencier des nongoûteurs
C
DÉGUSTATION de
PTC
+
4o ÉLECTROPHORÈSE : séparation par bandes selon leur grosseur
Homozygote
Goûteur
2X
C
+
Homozygote Hétérozygote
Non-goûteur
G
2X
G
C
+
G
C
Goûteurs
forts?
Goûteursfaibles?
NonGoûteurs?
3) ANALYSE GÉNOTYPES VS PHÉNOTYPES
Y-a-t-il une forte corrélation entre les génotypes et les phénotypes observés?
La relation entre les allèles du gène TAS2R38 est-elle un exemple de
dominance complète ou de dominance incomplète?
Fig.2. Résumé de la démarche générale proposée.
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2.6 DÉMARCHE DÉTAILLÉE DE L’ANALYSE D’ADN (Consulter la «Vue d’ensemble», Annexe 1)
I. EXTRACTION D’ADN.
 Des cellules buccales sont d’abord recueillies par rinçage vigoureux avec une solution saline.
 L’ADN est ensuite extrait des cellules par ébullition en présence d’une résine; celle-ci sert à éliminer les cations
bivalents (ex : Ca++) nuisibles à l’enzyme «ADN polymérase» utilisée à la prochaine étape.
II. AMPLIFICATION DE L’ADN PAR ACP. (Consulter Campbell Biologie, fig. 20.8).
 Objectifs. L’amplification en chaîne par polymérase (ACP) nous permet d’atteindre 2 objectifs :
1o Cibler une région précise de l’ADN : ici la région de la mutation 145 du gène PTC.
2o Faire de multiples copies (ou «réplicons») de cette région pour pouvoir l’analyser.
Chez un homozygote, toutes les copies obtenues seront identiques;
Chez un hétérozygote, on aura 2 types de copies qui diffèrent par une seule lettre, C ou G
 Étapes. L’ACP s’effectue dans un thermocycleur (petit four à
température programmable) en 3 étapes (Fig.3):
1o Dénaturation à 94oC : à cette température, l’agitation moléculaire
l’emporte sur les liaisons H de l’ADN et les brins d’ADN se séparent.
2o Hybridation à 68oC; l’agitation diminue et les brins d’ADN tendent
à se lier, mais les amorces, plus concentrées, prennent de vitesse l’ADN
chromosomique. Elles se fixent au début et à la fin de la région ciblée
grâce à la complémentarité des bases azotées. Pour cibler la région de
la mutation 145, nous utilisons une «amorce-début» de 44pb,
complémentaire à la région 101-144 du gène, et une «amorce-fin» de
24pb, complémentaire à la région 297-320 (Fig.4)
3o Élongation à 72oC; à partir des amorces, l’enzyme ADN polymérase
Taq ajoute les nucléotides complémentaires. Cet enzyme est extrait de
la bactérie Thermophilus aquaticus vivant dans des eaux thermales et
il est activé à la température de 72oC.
1o Dénaturation
94oC
2o Hybridation
68oC
Amorce début
Amorce fin
72oC
3o Élongation
Chacune de ces 3 opérations ne dure que 30 secondes mais elles sont
répétées plusieurs fois, de telle sorte qu’au bout de 30 cycles on
Polymérase
obtient 1 073 741 824 réplicons de la région ciblée : la région 101 à 320
Fig.3.
Étapes de l’ACP [5]
du gène PTC, mesurant 220 pb (Fig.4). Attention, un hétérozygote
présentera deux types de réplicons qui diffèrent uniquement à la position 145!
ALLÈLE GOÛTEUR
101
145
Amorce début
144
297
Amorce fin
320
5’ ....CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGC................................................................................................................ 3’
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
3’ CTACTAACGTTTGGTTCGGTTGGA 5’
5’ CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGG 3’
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ...............................................CTACTAACGTTTGGTTCGGTTGGA... 5’
3’ ......................................................................................................................
ALLÈLE NON-GOÛTEUR
145
5’ ....CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGG.............................................................................................................. 3’
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
3’ CTACTAACGTTTGGTTCGGTTGGA 5’
5’ CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGG 3’
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ..............................................CTACTAACGTTTGGTTCGGTTGGA.... 5’
3’ ......................................................................................................................
Fig.4. Régions ciblées sur le gène PTC par l’amorce début et l’amorce fin.
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 Astuce de l’amorce-début.
145
ALLÈLE Goûteur
Normalement, les nucléotides d’une
Gène
143
101
amorce sont identiques à ceux du gène. Ici, 5’ ....CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGCC................ 3’
l’amorce-début diffère à la position #43 :
Amorce début
5’ CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGGCC 3’
elle contient un G au lieu d’un A! Cette
«erreur» vise à introduire le doublet GG 3’ ......................................................................................................................................... 5’
devant la mutation 145. Ainsi, les réplicons
145
obtenus par ACP contiendront en ALLÈLE Non-Goûteur
143
Gène
positions 143-146 les séquences GGCC 5’ ....CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGGC............... 3’
pour l’allèle goûteur ou GGGC pour le nonAmorce début
5’ CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGGGC 3’
goûteur (Fig.5). Ces deux séquences sont
essentielles au bon déroulement de la 3’ ......................................................................................................................................... 5’
Fig.5. Différence entre l’amorce-début et le gène en position 143.
prochaine étape.
III. DIGESTION DE L’ADN.
Objectif : couper l’allèle goûteur de manière à pouvoir le distinguer de l’allèle non-goûteur.
Les réplicons sont incubés en présence de l’enzyme de restriction HaeIII (extrait de la bactérie Haemophilus
aegypticus). Cet enzyme coupe l’ADN par hydrolyse au milieu d’une séquence GGCC. Cette séquence se trouve
aux positions 143-146 de l’allèle goûteur! Ce dernier est alors coupé en 2 fragments de 44pb et 176pb (Fig. 6).
Par contre, l’allèle non101
320
goûteur présente la séquence
5’ ..................................GG145
CC…….................................................... 3’
GGGC et ne peut être coupé
3’ ……………………………………………………………………… ……..5’
par l’enzyme.
réplicon de 220 PB de l’allèle goûteur
Fig.6. Hydrolyse enzymatique de l’allèle goûteur.
NB. En guise de groupe
5’ CC……..................................................... 3’
5’
…………………….…GG
3’
témoin, des réplicons ne
3’ ……………………….….. 5’ + 3’ ………………………………………………. 5’
seront pas traités avec
fragment de 176 PB
fragment de 44 PB
l’enzyme.
Fig.6. Digestion enzymatique de l’allèle goûteur.
IV. ÉLECTROPHORÈSE. (Campbell Biologie, fig. 20.9)
Objectif : séparer et visualiser les deux types d’allèles.
 Les fragments d’ADN sont placés dans un gel d’agarose et soumis à un courant électrique. Puisque l’ADN porte
des charges négatives (-), les fragments sont entraînés vers l’électrode positive (+) et ce, à différentes vitesses,
les plus petits se déplaçant plus rapidement à travers le gel. Une fois la migration terminée, un colorant
fluorescent sous UV permet de visualiser les bandes d’ADN (Fig. 7).
 La position des fragments est évaluée à
l’aide d’un marqueur comportant des brins
de dimension connue; la bande de 500pb est
plus brillante et sert de repère. L’allèle nongoûteur n’est pas coupé et ne présente
qu’une seule bande de 220pb, alors que
l’allèle goûteur est coupé et présente 2
bandes distinctes de 176pb et 44pb.
 Sur la fig.7, quels sont les génotypes des
individus 1-2-3 : hétérozygote, homozygote
goûteur ou homozygote non-goûteur?
1D : ____________________
(-)
3 GÉNOTYPES POSSIBLES
1N
220 pb
176 pb
1D
2N
2D
3N
MARQUEUR
3D
220 pb
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
176 pb
100 pb
44 pb
44 pb
N : contrôle (réplicons Non Digérés)
D : réplicons digérés
(+)
Fig 7. Électrophorèse : résultats attendus
2D : ____________________
3D : ____________________
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3. PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL.
3.1 DÉTERMINATION DU PHÉNOTYPE
Goûteur fort? Non-goûteur? Goûteur faible? Il est parfois difficile d’évaluer objectivement le goût de chacun. Cette
partie du protocole comporte une bonne part de subjectivité et on devra en tenir compte dans l’analyse des
résultats. Par exemple, si on distingue des goûteurs forts et des goûteurs faibles, est-ce vraiment relié à une
dominance incomplète ou simplement dû à divers facteurs influençant la perception des saveurs?
Chaque équipe se voit attribuer un numéro. Dans chaque équipe il y a un élève «A» et un élève «B». Seul l’élève
«A» déterminera aussi son génotype à partir de sa salive. On inscrira donc au tableau des résultats les numéros 1A,
1B, 2A, 2B, etc.
1) Goûter une languette contrôle (sans PTC) en l’humectant bien au milieu de la langue pendant 10 secondes.
2) Goûter de la même manière une languette imbibée de PTC. Y-a-t-il une différence? Si un goût amer est perçu,
est-il «fort» ou «faible»?
3) Inscrire au Tableau 1 (voir «résultats») les numéros de chacun des élèves dans un des 3 groupes : goûteur fort,
goûteur faible ou non-goûteur.
3.2 DÉTERMINATION DU GÉNOTYPE
JOUR 1 : EXTRACTION et AMPLIFICATION DE L’ADN
I.
EXTRACTION D’ADN DE CELLULES BUCCALES
1) Se rincer vigoureusement la bouche avec 10 ml de saline pendant 1 minute. Rejeter dans le même petit
contenant («shooter»).
2) Transférer 1000 μl dans un microtube de 1,5 ml. Refermer et écrire le # d’équipe sur le couvercle.
3) Centrifuger à vitesse maximale pendant 2 minutes.
4) Après la centrifugation, observer un culot au fond du microtube et rejeter délicatement le surnageant par une
simple inversion au-dessus d’un évier. NB : un peu de liquide (0,1 ml) doit rester dans le microtube avec le culot.
De manière à doubler l’extraction d’ADN, répéter les étapes 2 à 4 en réutilisant le même microtube.
Pendant la 2e centrifugation, pipeter 100 μl de résine Chelex dans un microtube de 0,5 ml Important : juste
avant de prélever la résine, bien la suspendre en aspirant-rejetant plusieurs fois. Réserver pour l’étape #6.
5) Resuspendre le culot en aspirant et rejetant délicatement (4-5 fois) avec une micropipette de 30 μl.
6) Transférer 30 μl de suspension dans le microtube contenant la résine. Fermer et identifier. Mélanger au Vortex.
7) Porter à ébullition pendant 10 min. (thermocycleur à 99oC)
8) Agiter vigoureusement pendant 5 secondes.
9) Centrifuger à vitesse maximale pendant 90 secondes pour faire précipiter la résine au fond du microtube.
10) Transférer 30 μl de surnageant (sans culot ni résine) dans un nouveau microtube de 1,5 ml.
Identifier et conserver sur glace. C’est l’extrait d’ADN.
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II. AMPLIFICATION DE L’ADN PAR ACP (Amplification en Chaîne par Polymérase)
1) Dans un tube ACP de 0,2ml contenant une pastille «Ready-to-go» incluant des nucléotides (A, T, C et G) et la
polymérase Taq, ajouter :
1o  22,5 μl de la solution d’amorces et attendre quelques secondes pour dissoudre la pastille.
2o  2,5 μl de votre extrait d’ADN. Garder sur glace en attendant que tous les élèves soient prêts pour la
prochaine étape.
2) Centrifuger à vitesse maximale pendant 10 secondes, pour bien faire descendre le mélange.
3) Placer dans le thermocycleur et amplifier l’ADN pendant 30 cycles. Conserver à 4oC jusqu’au Jour 2.
JOUR 2 : DIGESTION et ÉLECTROPHORÈSE
III. DIGESTION AVEC L’ENZYME DE RESTRICTION HaeIII
1) Centrifuger 10 secondes le tube ACP puis,
- Transférer 10 μl dans un 1er microtube de 0,5 ml. Identifier «N» (témoin non-digéré) et # d’équipe.
- Transférer à nouveau 10 μl dans un 2e microtube de 0,5 ml; identifier « D » (digéré) et # d’équipe.
2) Ajouter 1 μl d’enzyme HaeIII au microtube «D» seulement; observer une microgoutte sur la paroi du tube.
3) Centrifuger les 2 tubes pour faire descendre les gouttes au fond des tubes (vitesse maximale, 10 secondes).
4) Incuber les 2 tubes à 37oC pendant 30 minutes, dans le thermocycleur. (30 minutes est une durée minimale)
IV. ANALYSE DES FRAGMENTS D’ADN PAR ÉLECTROPHORÈSE.
1) Ajouter 5 μl de colorant de chargement à chacun des tubes «N» et «D». Centrifuger pour mélanger (10 sec.).
2) Technicienne : charger un marqueur d’ADN « 100pb DNA Ladder » dans le puits #1 du gel d’agarose 2%.
3) Charger 15 μl des tubes «N» et «D» dans les puits d’un gel d’agarose 2% (Fig.8). Noter les # des puits (Fig.9).
Le gel contient un colorant potentiellement cancérigène. On portera des gants à la station d’électrophorèse.
4) Faire migrer à 130 V pendant 30-40 minutes ou jusqu’à une migration de 5 cm du colorant de chargement.
5) Observer les résultats aux UV et prendre une photo.
Puits 1 : Marqueur
Puits 2 : échantillon N, équipe 1
Puits 3 : échantillon D, équipe 1
Puits 4 : échantillon N, équipe 2…
Puits
Pipette
Solution tampon
Gel d’agarose
Puits
Gel d’agarose
Échantillon d’ADN
Figure 8 – Coupe transversale d’un gel d’agarose lors
du chargement d’un échantillon d’ADN
Figure 9 – Gel d’agarose vu du dessus avec identification de
l’utilisation des différents puits
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4. RÉSULTATS
4.1 Détermination des phénotypes de tous les élèves
Tableau 1. Répartition de tous les étudiants du groupe selon leur phénotype «goûteur de PTC». (On y écrit le
« code » de chaque étudiant dans la case appropriée; ex : 1A, 3B, etc.)
PHÉNOTYPE (no des élèves)
Goûteur fort
Goûteur faible
Non goûteur
4.2 Détermination du génotype des élèves-expérimentateurs
GÉNOTYPE
(No des élèves)
Tableau 2. Répartition des élèves-expérimentateurs selon leurs génotypes «Goûteur de PTC». (On y écrit le
« code » de chaque étudiant dans la case appropriée; ex : 1A, 3B, etc.)
Homozygote
goûteur
Hétérozygote
Homozygote
non goûteur
4.3 Résultats croisés des phénotypes et des génotypes des élèves-expérimentateurs
Tableau 3. Résultats croisés du phénotype et du génotype des élèves-expérimentateurs. (On y écrit le « code »
de chaque étudiant dans la case appropriée; ex : 1A, 3B, etc.)
GÉNOTYPE
PHÉNOTYPE
Goûteur fort Goûteur faible Non goûteur
Homozygote
goûteur
Hétérozygote
Homozygote
non goûteur
6. MÉDIAGRAPHIE
[1] M. Saint-Hilaire, «Génome gourmand,» Québec Science, pp. 28-30, sept 2007.
[2] S. Wooding, «Phenylthiocarbamide: A 75-Year Adventure in Genetics and Natural Selection,» Genetics, 2015. [En ligne].
URL: http://www.genetics.org/content/172/4/2015.full . [Accès le 02 10 2015].
[3] «People differ in their taste sensitivity,» Taste Science Lab, 2015. [En ligne].
URL: http://www.tastescience.com/abouttaste3.html . [Accès le 02 10 2015].
[4] J. Reece et coll, Campbell Biologie, 4e éd., Montréal: ERPI, 2012, 1458 p.
[5] «La PCR?,» Réseau Lyonnais d'Ingénierie Éducative, 2015. [En ligne].
URL: http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm . [Accès le 02 10 2015].
Ce laboratoire a été mis au point à partir du protocole suivant:
CAROLINA Cie, Page consultée le 02/10/2015, Using a Single-Nucleotide Polymorphism to predict Bitter-Tasting Ability,
[En ligne], URL: http://bioinformatics.dnalc.org/ptc/animation/index.html
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ANNEXE 1. Vue d’ensemble de la méthode utilisée pour l’analyse de l’ADN.
I. EXTRACTION D’ADN
Gène TAS2R38 (1002pb) – 2 allèles chez Homo sapiens
145
1
785
GCA
101
ALLÈLE Non Goûteur
Fragments amplifiés = 220 pb
ou «réplicons»
AMORCE DÉBUT
144
297
145
CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGGCC ................
AMORCE FIN
320
ALLÈLE Goûteur............. GATGATTGCAAACCAAGCCAACCT
CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGGGC .............ALLÈLE
III. DIGESTION
Les 2 gènes allèles
diffèrent par 3
mutations,
seule la 145 est ciblée
dans ce labo
320
101
II. AMPLIFICATION
1002
ALLÈLE Goûteur
CCA
Une des 23 paires de
chromosomes d’un
hétérozygote
886
Non Goûteur........ GATGATTGCAAACCAAGCCAACCT
Digestion HaeIII : GG↔CC : allèle goûteur
coupé en 2 fragments de 44pb et 176pb
IV. ÉLECTROPHORÈSE
ALLÈLE Goûteur
(coupé)
130 V
(--) départ
départ
ALLÈLE Non Goûteur
(non coupé)
FRAGMENT 220 pb
FRAGMENT 176 pb
FRAGMENT 44 pb
(+)
Une seule
bande
est visible
Deux bandes
sont visibles
Combien de bandes
seront visibles chez
un hétérozygote?
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Collège Lionel-Groulx
101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant
Automne 2016
NOM : ____________________________________ Groupe : ______
ANNEXE 2. Schématisation des 3ères étapes de l’analyse d’ADN.
JOUR 1
I. EXTRACTION D’ADN
1.RINCER
La ______
__ ml de _____ /
__ min
2.TRANSFÉRER
____ μL
4.REJETER
Le __________
GARDER ___ ml
3.CENTRIFUGER
Vitesse maximale
__ min
puis
RÉPÉTER
les étapes
# _____
Pendant la 2e
centrifugation
AJOUTER
___ μl de
Chelex
5.RESUSPENDRE
Pipette de ___ μL
6.__________
____ μL
7.CHAUFFER
__OC x __ min
VORTEX
9.___________
8. VORTEX
_ sec
10.__________
__ μL
Vitesse ________
__ sec
CONSERVER
Sur _____
L’extrait d’___
II. AMPLIFICATION DE L’ADN
1. «Ready-to-go»
AJOUTER :
1o _______________
2o _______________
2.__________________
3. AMPLIFIER ____ cycles
Vitesse ________
__ sec
GARDER SUR _________ et attendre
le groupe pour la prochaine étape
JOUR 2
III. DIGESTION AVEC HaeIII
1.___________
Vitesse ________
__ sec
Puis TRANSFÉRER
__ μL (2 fois)
2.AJOUTER
__ μL de ______
3.___________
Vitesse ________
__ sec
4. ___________
37oC X ___ min
Tube « __ »
Tube « __ »
Garder jusqu’à l’étape 3
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