Travaux pratiques d`immunologie

Travauxpratiquesd’immunologie
I. Introduction
Cesmanipulationsontpourbutd’étudiercertainestechniquesimmunologiques,decomprendreles
mécanismesmoléculairesmisenjeudanschacune,d’entirerl’intérêtetdepossiblesapplicationset
decomprendrealorslapuissancedecettesciencequiestaujourd’huienpleineexpansion.
A. Fragmentationdesimmunoglobulines
LeclivageoulafragmentationdesIgpermetd’étudierlesdifférentesrégionsd’uneIg.Ladigestion
estobtenueenutilisantdesenzymesprotéolytiquesquicliventl’Igauniveauderégionsbien
distinctes.Onobtientdesfragments:Fabparlapapaïne,(Fab’)2parlapepsineetlefragmentFcpar
lesdeuxenzymes.LapapaïneestcapabledecliverlesIgGdetouteslesespècesanimales.
Parélectrophorèse,onpourraobserverl’effetdesdigestionsenzymatiquessurlatailledes
fragmentsobtenusencomparantavecdel’Ignonfragmentée.
B. ImmunotransfertouImmunoblot(westernblot)
C’estunetechniquedontlebutestderepérerspécifiquementuneprotéineayantpréalablementété
«purifier»enunebandesurungelaprèsélectrophorèse,puistransféréesurunemembranePVDL
(techniquewesternblot).Pourdétectercetteprotéine,onutiliseunanticorpsdit«primaire»quiva
sefixerspécifiquementsurlaprotéineenquestion,icilaSAB(sérumalbuminebovine).Onrévèle
ensuitelecomplexeanticorps‐SABparunanticorpsdit«secondaire»,quiluivareconnaitre
spécifiquementl’anticorpsprimaire.
Danscetteexpérience,onutilisecommeanticorpsprimaire,unanticorpsdelapin:onainjectéla
SABàunlapin,cequiastimulésonsystèmeimmunitairequis’estmisàsynthétiserdesanticorps
dirigéscontredesdéterminantsantigéniques(épitopes)delaSAB.Plusieursimmunisationssont

nécessaires(systèmederappel).Onpourrapréleverensuitelesangdulapin,lelaissercoaguler,et
enrécupérerlesérum.Onestdoncenprésenced’unsérumdelapinanti‐SAB:c’estcequ’onutilise
danscetteexpérience.
L’anticorpssecondaireestobtenuparimmunisationdechèvrecontrel’anticorpsdelapinantiSAB,
selonunprotocolesimilaire.Onycoupleensuitelaphosphatasealcalinequipermettralarévélation.
C. ELISA(EnzymeLinkedImmunoAssay)
Cettetechniqueimmunologiquetrèsutiliséeenmédecine,estutilisépourdétecterletitred’un
anticorpspourunantigènedonnéetdoncd’évaluersonaffinitérelative.Onpeutégalementétudier
leshomologiesetlesinteractionsentredifférentsantigènes.
Onétudiecilaréactivitédusérumpolyclonaldelapinanti‐SABvis‐à‐visdelaSABetdeL’OVA
(Ovalbumine).NotrebutdansceTPestdevoirs’ilestpossiblededoserdelaSABavecunanticorps
anti‐SABetdetesterlaspécificitédel’anticorps,enregardantsicelui‐cireconnaitl’ovalbumine.
II. Matérieletméthode
A. FragmentationdesIg
Lesimmunoglobulinesutiliséessontissusd’unsérumdelapin.Onréaliseunedigestion,à37°C,
pendant30minutesetpendant1h30,pourmontrerl’efficacitédelaréactionenfonctiondutemps.
DigestionàlaPapaine:LesIgsontplacéesà2mg/mLdansuntampondedigestion(PBS,0,02M
EDTA,0,02cystéine).Onenplace50µldans4tubesEppendorf.Danslestubes1et2,onmetduPBS,
danslestube3et4,onplacedelasolutionenzymatique.Lestubes1,2et3sontincubéspendant30
minutespuislaréactionestarrêtéeavecdel’iodoacétamine.Enfait,celui‐cisertseulementdansle
tube3,maisonenmetdanslestubes1et2pouravoirdessolutionscomportantlesmêmes
composés:ceciévitedesvariationsnonsignificativesdesrésultats.Letube4estincubé1h30,puisla
réactionestaussiarrêtéepardel’iodoacétamine.
DigestionàlaPepsine:Cetteexpériencefutréaliséeparl’autregroupeselonunprotocolesimilaire,
lebutrecherchéétantlemême,c'est‐à‐direunedigestiondel’immunoglobulineparl’enzyme.On
notecependantquel’onréaliselaréactionàpH=4:lapepsinepossèdeuneactivitéoptimaleàpH=
2,cependantàcepH,l’immunoglobulinenesupportepascepH.OntravailledoncàpH=4,pH
supportéparlaprotéineetpermettantuneactivitéenzymatiqueassezimportantepourunecoupure
del’Ig.
Purification:Lessolutionssontensuitedialyséestoutelanuit,à4°C,contreduPBS.Cecipermetune
purificationpartielledel’Immunoglobuline(oudesdifférentsfragmentsdel’Ig).
Onprépareensuitelegeld’acrylamide‐Bisacrylamideutilisépourlamigration.Celui‐cicomporte2
parties,legeldeconcentrationetlegeldeséparation.Legeldeconcentrationpermetunemigration
rapideetuneconcentrationdescomposésdechaquesolutionàl’interfaceentrelesdeuxgels,cequi
permetàtouslescomposésdecommencerleurmigrationdepuislemêmepoint.Legelestsuite
placédanslacuved’électrophorèsecomportantletamponadéquat.

Chaqueéchantillonestmisdansuntampondecharge,appeléLaemmli.Celui‐cipossèdeunedensité
importante,cequifaciliteledépôt,étantdonnéquel’ondéposel’échantillondanslespuitsdugel
immergé.LeBleudebromophénolqu’ilcontientestuncomposédebaspoidsmoléculairequimigre
trèsviteetquipermetdoncdesuivrelefrontdemigration.LeSDS(sodiumdodécylsulfate)confère,
auxmoléculesdelasolution,lamêmecharge,enentourantcelles‐cid’unmanteaunégatif,les
protéinesnemigrentalorsqueselonleurtaille.
Onutilisedeuxtamponsdechargedifférents:untamponréducteur(avecduβmercaptoéthanol)
pourletube2etunnonréducteurpourlestubes1,3et4.Aprèsmélangedutampondechargeet
dessolutions,onplacelestubesà95°Cpendant5minutes,pourunebonnerépartitionduSDS(grâce
àl’agitation),etuneréductiondespontsdisulfuresdesIgparleβmercaptoéthanoldansletube2.
Ondéposeensuiteleséchantillonsdanslespuitsainsiqu’untémoindemasse(TM).
Onréaliseégalementlesdépôtssuivants,selonlemêmeprotocole(tampondechargenonréducteur
+chauffage),surmêmegel:TM,Ig,SérumAlbuminebovine,ovalbumine.Cesdépôtsservirontau
westernblot(expériencedécriteplusloin).Voicil’alluredesdépôtsdugel.
345678TMFigure1:gelSDS‐Page.
1:Igréduitetdigéréàla
papaïne1h30
2:OVA
3:SAB
4:Ignonréduit
TM:témoindemasse
5:Igréduitetdigéréàla
papaïne1h30
6:Igréduitetdigéréàla
papaïnependant30minutes
7:Igréduit
8:Ignonréduit.
21TM
Onsurveillelamigration:quandlebleudebromophénol(situéauniveaudufrontdemigration)
arriveàlalimitedugel,onstoppelamigration.
Oncoupelegelendeux,laissantpourl’instantdecotélapartiequiservirapourlewesternblot.On
colorelapremièrepartiedugelavecdubleudeCoomassie.Celui‐cisefixedefaçonaspécifiquesur
touteslesprotéines.C’estuncolorantsouventutilisépourcegenredemanipulations.Onrincelegel
àl’eaudistillépuisonpasseaumicroondepourenleverlesurplusdecolorantetalorsrévélerles
différentesbandessurlegel.
B. ImmunotransfertouImmunoblot(westernblot)
Lapremièrepartiedecetteexpérienceestl’électrophorèseexpliquéedansleparagrapheprécédent.
Ondoit,avantdecommencerletransfert,apprêterlegel,lamembraneainsiquelesfiltresutilisés.
OnplacelegeldansdutampondetransfertsanséthanolpourenleverleSDS.Lamembraneest
placéedansl’éthanol,puisdansletampondetransfertcontenantdel’éthanol.Lesfiltresduhauts

sontplacésdansletampondetransfertsanséthanol,etlesfiltresdubasdansletampondetransfert
avecdel’éthanol.LePlateauanodiqueestluilargementhumidifiédansdutampondetransfert
contenantdel’éthanol.Toutlesconstituantsnécessaireauwesternblotsontéquilibrésdansla
solutiondetransfert(avecousanséthanol)pourpermettreunbontransfert(pasdechangement
brusqued’environnementlorsdutransfertdugelàlamembrane).
Pôlenégatif
Sensde FiltresGel
migrationMembranePVUL
PôlepositifTampondetransfert+éthanol 
Schémadu«sandwich»demigration
Lesprotéinesvontmigreretseretrouverencontactavecl’éthanolauniveaudelamembrane.Ceci
valesfaireprécipitersurlamembrane.L’éthanolestainsirépartidansledispositifpourévitertoute
précipitationavantlamembrane.
Aprèsmigration,onrécupèrelamembrane(onfaitunemarquedistinctivepourrepérerlecôtéoù
sontlesprotéines)puisonvasaturerlessitesdefixationnonspécifiquesdesprotéines(charges
résiduellesparexemple)avecdesprotéinesdelait(ontrempedansdulait).Sionmettait
directementl’Ig,celle‐cipourraits’adsorberàlamembraneendessitesnonspécifiquesn’importeoù
surlamembrane.Lesprotéinesdelaitvontsaturerlamembraneetlessitesdefixationnon
spécifique.Parceprocédé,lesIgnesefixeront(enthéorie)quedemanièrespécifiqueauxépitopes
qu’ellesreconnaitront.OnlaveensuitelesurplusdelaitavecduPBS.
Onvaensuiteréaliserl’immunodétection:Onincubependant1heureavecl’anticorps«primaire»
(lapin)dirigécontrelaSAB.Onafixationspécifiquedesanticorpssurlesprotéines(normalementsur
laSAB).
Remarque:dansunsoucid’économie,carlesanticorpssontdesmoléculestrèscoûteuses,onutilise
quetrèspeud’anticorps:onplace1mLd’unesolutionà1/200surduParafilm,quel’onrecouvre
aveclamembrane(ilfautfaireattentionausensdelamembrane:eneffetlesprotéinesnesontque
d’uncôtédelamembrane).
OnlaveensuiteavecduPBS,Tween0,1%.LeTweenestundétergentquivapermettreunemeilleure
évacuationdesanticorpsnonfixésendessitesspécifiques(l’interactionesttrèsforte,letweenne
peutpasdéplacerlesanticorpsfixésspécifiquement).OnlaveauPBSpouréliminerletween.
Onincubeavecl’anticorpssecondaire(chèvreantilapin)dirigécontrel’immunoglobulinedelapin
antiSAB,flanquéd’uneactivitéenzymatiquephosphatasealcaline.Celui‐cisefixespécifiquementsur
sacible.OnpourraensuiterinceravecduPBS,TweenetduPBScommeprécédemmentpour
éliminerl’excèsd’anticorps.
L’activitéenzymatiquedelaphosphatasealcalineestensuiterévéléeparunesolutioncommerciale
derévélation(trèscouteuseaussi,onenutilisedonclemoinspossible).Théoriquement,desbandes
decouleurapparaitrontauxendroitsdefixationdesanticorpssecondaires.Pouréviterune

colorationexcessivequiempêcheraitunebonnelecturedesrésultats,onstoppelaréactionavecde
l’eaudistillée.
C. ELISA
L’antigèneestadsorbésurlesparoisdespuitsd’uneplaquede96puits.OnplacelaSABoul’OVA
dansdutamponCarbonate‐bicarbonate,cequivapermettrel’adhésion:àpHalcalin,laSAB(ou
l’OVA)vasefixeraufonddespuits.L’antigènenonfixéestéliminéparrinçage.Ci‐dessous,la
répartitiondesantigènesdanslaplaquedemicrotitration.
Onmetlesantigènesàuneconcentrationde100µg/mL.
1234567891011
ASAB SABSABSAB SAB SAB SAB SAB SAB SABSAB
BOVA OVAOVAOVA OVA OVA OVA OVA OVA OVAOVA
CSAB SABSABSAB SAB SAB SAB SAB SAB SABSAB
DOVA OVAOVAOVA OVA OVA OVA OVA OVA OVAOVA
ESAB SABSABSAB SAB SAB SAB
FSAB SABSABSAB SAB SAB SAB
Onsatureensuiteleplastiqueavecdulait:lesprotéinesdelaitvonts’yfixerdefaçonnonspécifique
etlesanticorpsajoutésparlasuitenesefixerontquedemanièrespécifiquesurlaSAB.Onrince
l’excèsdelait.
Onajouteensuiteunesolutiond’anticorpsprimaires(sérumanti‐SAB)àtestée,àdifférentes
concentration,cequivapermettrededéterminerletitredel’anticorps.Lesdifférentes
concentrationssonteffectuéesparunesériededilutionencascade.L’excèsestensuiteéliminépar
lavage.
Ci‐dessous,l’alluredelaplaquedemicrotitrationaveclesconcentrationsdesérumdelapinpour
chaquepuits(enµg/mL).PourleslignesAetBonutilisedusérumdelapinimmunisécontrelaSAB.
PourleslignesDetE,onutilisedusérumdelapinnonimmunisécontrelaSAB.Cecipermetde
comparerlaréponseELISAavecles2typesdesérumetdedéduirel’actiondesanticorpscontenus
danslesérumdelapinimmunisé(estcequecesontvraimentlesanticorpsquiagissent?).Onpeut
établirunevaleurtémoingrâceauxlignesCetD.
DansleslignesEetF,onplacedifférentesconcentrationsdeSABoud’OVA:lebutestdevoirs’ilya
compétitionentrelaprotéineensolutionetcellefixerauplastique.PourlaligneE,onmetdelaSAB
etpourlaligneFonmetdel’OVA.LesconcentrationsindiquéesàlaligneEsontcelledel’antigène
fixéaufond(SAB);cellesindiquéeàlaligneFsontcelledelaprotéineensolution(SABouOVA).
1234567891011
A1,00000,50000,25000,12500,0625 0,0313 0,0156 0,0078 0,00390,00200
B1,00000,50000,25000,12500,0625 0,0313 0,0156 0,0078 0,00390,00200
C1,00000,50000,25000,12500,0625 0,0313 0,0156 0,0078 0,00390,00200
D1,00000,50000,25000,12500,0625 0,0313 0,0156 0,0078 0,00390,00200
E1/20001/20001/20001/2000 1/2000 1/2000 1/2000    
F15,62531,2562,51252505000  