Mémoire en vue de l`obtention d`un diplôme de MAGISTER en

‫كـلـيــة عـلـــوم الـطـبيـــــــعة والـحـيـــــــاة‬
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie (SNV)
‫قـســـــــم الـبـيـــــــولـــوجـيــــــا‬
Département de Biologie
Mémoire en vue de l’obtention d'un diplôme de
MAGISTER en Biologie
Option : Microbiologie Fondamentale et Appliquée
Présenté par :
Soutenu le : 01/06/2015
Président
: Mr KIHAL Mebrouk
Rapporteur : Mr HEDDADJI Miloud
Examinateur :
Mr
GUESSAS Bettache
Examinateur : Mr MAMI Anas
Professeur (Université d’Oran1)
Professeur (Université d’Oran1)
Professeur (Université d’Oran1)
MCA (C. U Ain Temouchent)
Année Universitaire : 2014-2015
Youssef
Avant tout nous remercions "ALLAH" l’Omniscient et l’Omnipotent qui nous a
donné le courage, la volonté et la force pour accomplir ce travail.
Nous exprimons nos sincères remerciements au Professeur KIHAL Mebrouk,
directeur du laboratoire de microbiomogie appliquée (LMA) de nous avoirs honoré de
précider ce jury. Qu’il trouve ici notre gratitude et notre respect.
Nous remercions tout particulièrement le Professeur HEDDADJI Miloud pour
l’honneur qu’il nous a fait en proposant ce sujet et en encadrant ce mémoire. Merci pour
vos conseils scientifiques judicieux et votre suivi permanent durant la période de la
réalisation de ce travail malgré vos occupations professionnelles.
Nos remerciements sont adressés également aux membres du Jury, Professeur
GUESSAS Bettache et Docteur MAMI Anas pour bien vouloir évaluer et examiner ce
travail.
Les mots nous manquent pour exprimer toute notre gratitude et nos sentiments de
respect à Madame BENLAHCEN Kheira. Merci pour votre modesité, gentillesse et votre
soutient inestimable depuis notre inoubliable première rencontre, nous vous serons
reconnaissants pour le reste de notre vie.
Un grand merci à nos collegues du laboratoire de microbiologie appliquée :
Alla Eddine, Hadjer, Khadidja, Nabila, Aicha et Sofien, avec lesquels nous avons
partagé des moments de joie mémorable. Merci nos chers collegues pour votre
généosité et vos encouragements pendant les moments délicats que nous avons vécus
durant la réalisation de ce projet.
Nous n’oublions évidemment pas de remercier toutes les personnes auxquelles
revient le mérite de notre formation, particulièrement Mr LAMRI Mahmoud
Mr GUETOUACHE Mourad et Mr SELLOUM Mounir.
Nos remerciements vont aussi à Mr CHAOUI Ridha, directeur de qualité à la laitière
"Hodna" de la Wilaya de M’sila pour sa contribution appréciable à ce projet.
Finalement, nous remercions tous ceux ou celles qui ont contribué de
près ou de loin à la réalisation de ce travail.
A vous tous, un grand Merci.
Liste des abréviations
Acronymes
PBS : Tampon phosphate
ADN : Acide désoxyribonucléique
PCR : Plymerase chain reaction
ARN : Acide ribonucléique
pH : Potentiel d'hydrogène
ATP : Adénosine triphosphate
rpm : Rotation par minute
BAL : Bactéries lactiques
Sig : Niveau de signification
C : Cytosine
ssp : Sous-espèce
DDR : DNA-DNA reassociation
TGI : Tractus gastro-intestinale
EPS : Exopolysaccharides
TPY : Peptone tryptone levure
FAO : Food and agriculture organization
UFC : Unité formant colonie
FDA : Food and drug administration
UHT : Ultra haute température
G : Guanine
V /V : Volume / volume
GRAS : Generally recognised as safe
Gr : Grossissement
HCl : Chlorure d’hydrogène
H2O2 : Péroxyde d’hydrogène
Hsp : Heat shock protein
INRA : Institut national de la recherche
agronomique
j : Jour
LMA : Laboratoire de microbiologie
appliquée
M : Mole/litre
Noms des genres
B. : Bifidobacterium
E. : Escherichia
L. : Listeria
Lb. : Lactobacillus
Lc. : Lactococcus
Ln. : Leuconostoc
S. : Staphylococcus
Sc. / St. : Streptococcus
Mb : Million de bases
ml : Millilitre
µg : Microgramme
µl : Microlitre
µmax : Vitesse spécifique maximale de
croissance.
MRS : De Man, Rogosa et Sharpe
OMS : Organisation mondiale de la santé
O2 : Oxygène
Pb : Paire de bases
Unités de mesure
°D : Degré dornic
°C : Degré Celsius
% : Pourcentage
g : Gramme
m : Mètre
h : Heure
s : Facteur de sédimentation
Liste des figures
Figure 1: Étapes essentielles de transformation du lait en fromage..................................................................... 5
Figure 2: Diagramme général de fabrication des yaourts et des laits fermentés .............................................. 6
Figure 3: Diagramme simplifié de la production du yaourt .................................................................................. 7
Figure 4: Schéma des compartiments de l’appareil digestif de l’homme et leurs microflores. .................. 9
Figure 5: Implantation du microbiote intestinal. ..................................................................................................... 10
Figure 6: Vue générale sur la microflore du colon humain. ................................................................................ 12
Figure 7: Présentation des effets bénéfiques des probiotiques sur la santé humaine .................................. 16
Figure 8: Formation d'acétate et de lactate à partir de glucose par la voie des bifidobactéries................ 25
Figure 9: Métabolisme général des bifidobactéries................................................................................................ 33
Figure 10: Arbre phylogénétique des bifidobactéries............................................................................................ 37
Figure 11: Protocole d’isolement des bifidobactéries à partir du lait fermenté. ........................................... 39
Figure 12: Dispositif utilisé pour la mesure de l’acidité titrable. ...................................................................... 45
Figure 13: Protocole de de détermination de l’effet du pH gastrique simulé ................................................ 47
Figure 14: Aspect macroscopique des souches de Bifidobacterium sur milieu MRS. ................................ 51
Figure 15: Aspect macroscopique des souches de Bifidobacterium ................................................................. 52
Figure 16: Test de production du gaz à partir du glucose. ................................................................................... 53
Figure 17: Test de citrate perméase sur milieu KMK. .......................................................................................... 54
Figure 18: Mise en évidence de l'uréase. ................................................................................................................... 54
Figure 19: Mise en évidence de la production de l'indole. .................................................................................. 55
Figure 20: Test de la gélatinase. ................................................................................................................................... 55
Figure 21: Profil fermentaire de la souche BN. ........................................................................................................ 57
Figure 22: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en présence de l'oxygène.. 58
Figure 23: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en absence de l'oxygène. .. 59
Figure 24: Cinétique de croissance des souches incubées en 43°C. ................................................................. 60
Figure 25: Cinétique de croissance des souches incubées en 37°C. ................................................................. 60
Figure 26: Viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours de stockage à 4°C. ........ 61
Figure 27: Variation du pH du lait fermenté par les souches pendant le stockage à 4°C. ......................... 62
Figure 28: Viabilité des souches pendant 21 jours d’entreposage en présence de d’arôme banane. .... 63
Figure 29: Viabilité des souches pendant 21 jours d’entreposage en présence de d’arôme vanille. .... 64
Figure 30: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN dans le lait écrémé. ............. 65
Figure 31: Cinétique d'acidification et variation de pH produites par dans le lait écrémé. ....................... 66
Figure 32: Activité protéolytique des souches dans milieu MRS à 2% de lait écrémé .............................. 67
Figure 33: Activité lipolytique des souches sur milieu agar au tween 80....................................................... 68
Figure 34: Résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN aux pH acides (2 et 3). ............................... 70
Figure 35: Résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN à 0,5% de sels biliaires. ............................ 71
Figure 36: Activité inhibitrice des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN sur Staphylococcus aureus........ 72
Figure 37: Activité inhibitrice des surnageants natifs des souches R1, R2 et L1 sur Escherichia coli. ... 73
Figure 38: Antibiogramme de la souche L2 .............................................................................................................. 74
Liste des tableaux
Tableau 1 : Exemples de produits laitiers fermentés et leurs pays d’origine ..................................... 3
Tableau 2 : Composition recommandée et optionnelle des ferments du yaourt. .............................. 5
Tableau 3 : Certaines descriptions et définitions des probiotiques ..........................................................13
Tableau 4 : Critères de sélection utilisés pour le screening des probiotiques. .............................. 14
Tableau 5 : Profile fermentaire des différentes espèces de Bifidobacterium. ................................. 27
Tableau 6 : Les espèces du genre Bifidobacterium et leur écologie. ................................................ 28
Tableau 7 : Exemples de bactériocines synthétisées par les souches de bifidobactéries ............ 34
Tableau 8 : Les antibiotiques utilisés pour évaluer l’antibiorésistance des souches. .................. 50
Tableau 9 : Aspects macroscopique et microscopique des souches de bifidobactéries. ............. 52
Tableau 10 : Mise en évidence des activités enzymatiques des souches de bifidobactéries. .... 53
Tableau 11 : La fermentation des sucres par les souches de Bifidobacterium. .............................. 57
Tableau 12: Activité protéolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN………………….68
Tableau 13 : Activité lipolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN. ...................................... 69
Tableau 14 : Activité inhibitrice des souches R1, R2, L1, L2 BB12 et BN .......................................... 71
Tableau 15 : Résultats de l’évaluation de l’antibiorésistance des souches. .................................... 73
Résumé :
Notre étude a pour but d’évaluer les principales aptitudes technologiques et probiotiques
de certaines souches indigènes de bifidobactéries, dont quatre souches (L1, L2, R1 et R2) ont
été étudiées d’une part, sur le plan de leur tolérance à l’oxygène, la cinétique de croissance à
43 °C, la viabilité pendant 21 jours d’entreposage à 4 °C, le comportement envers les arômes
utilisées en industrie laitière , la cinétique de croissance et d’acidification dans le lait et
l’activité protéolytique et lipolytique (propriétés technologiques) ; et d’une autre part, sur le
plan de leur résistance aux conditions gastro-intestinales (pH acide et sels biliaires) et
l’activité antibactérienne envers quelques souches pathogènes. Finalement, les souches ont été
soumises à un antibiogramme afin de déterminer leur comportement envers les différents
types d’antibiotiques (propriétés probiotiques).
Deux souches utilisées en industrie laitière, dont l’une (BN) isolée à partir du lait
fermenté probiotique produit et commercialisé en Algérie (Danone Activia) et l’autre,
Bifidobacterium animalis ssp. lactis (BB12) fournie par la laitière « Hodna » de la Wilaya de
M’sila, ont servi une référence de comparaison des caractères étudiés.
Les résultats des tests d’identification des souches indigènes ont révélé leur appartenance
à deux espèces de bifidobactéries dont, B. longum représentée par les souches L1 et L2 et
B. breve représentée par R1 et R2. Bien que la souche industrielle BN a été classée au sein de
l’espèce B. animalis.
Les résultats de l’évaluation des aptitudes technologiques indiquent que les souches
indigènes présentent des capacités très intéressantes exprimées par le pouvoir de se croitre en
présence de l’oxygène, une vitesse de croissance en 43°C dépassant celles inscrites par les
souches industrielles, une viabilité pendant l’entreposage frigorifique très proche de celle
enregistrée par les souches industrielles, une bonne viabilité lors de l’exposition aux arômes
artificiels, une vitesse de croissance dans le lait meilleure que celles des souches industrielles,
cependant, des faibles activités protéolytique et lipolytique ont été constatées.
Encore, de très bonnes aptitudes probiotiques ont été enregistrées pour l’ensemble des
souches indigènes caractérisées par une notable résistance aux conditions gastro-intestinales,
une bonne activité antibactérienne envers les pathogènes. Finalement les souches étudiées ont
montré une résistance envers certains antibiotiques dont les souches du genre Bifidobacterium
sont connues par leur résistance naturelle à ces antibiotiques.
Mots clefs : souches indigènes, bifidobactéries, aptitudes technologiques, aptitudes
probiotiques.
Abstract:
Our study aims to evaluate the main technological and probiotic abilities of some
indigenous bifidobacteria strains. Four strains (L1, L2, R1 and R2) were studied on the one
hand, in terms of their tolerance to oxygen, kinetics of growth at 43 ° C, viability during 21
days of storage at 4 °C, behavior towards aromas used in the dairy industry, growth kinetics
and acidification in milk and proteolytic and lipolytic activities (technological properties); and
secondly, in terms of their resistance to gastrointestinal conditions (acidic pH and bile salts)
and antibacterial activity against pathogenic strains. Finally, strains were subjected to
susceptibility test to determinate their comportment towards different types of antibiotics
(probiotic properties).
Two strains used in the dairy industry, one (BN) isolated from probiotic fermented milk
produced and sold in Algeria (Danone Activia) and the other Bifidobacterium animalis ssp.
lactis (BB12) provided by "Hodna" dairy company in the province of M'sila, served a
comparison reference of the studied characters.
The results of the indigenous strains identification tests revealed that they belong to two
bifidobacteria species, including B. longum represented by L1 and L2 strains, B. breve
represented by the R1 and R2 strains. While the industrial strain BN was ranked within
B. animalis.
The results of technological abilities evaluation indicate that indigenous strains have very
interesting capacities expressed by the ability to grow in presence of oxygen, a growth rate in
43 °C in over than those registered by industrial strains, viability during cold storage very
close to that obtained by industrial strains, good viability when exposed to artificial aromas, a
growth rate in the milk better than those observed for the industrial strains, however, low
proteolytic and lipolytic activities were noted.
Furthermore, very good probiotic abilities were recorded for all indigenous strains
characterized by a notable resistance to gastrointestinal conditions, good antibacterial activity
against pathogenic strains, finally tested strains showed a resistance to certain antibiotics
including Bifidobacterium strains are known for their natural resistance to these antibiotics.
Key words: indigenous strains, bifidobacteria, technological abilities, probiotic
abilities.
‫ملخص‪:‬‬
‫دراستىا تهذف إىً تقييم اىنفاءاث اىتنىىىىجيت و اىبزوبيىتينيت األساسيت ىبؼط اىسالالث اىمحييت مه‬
‫‪ bifidobacteria‬حيث تم مه جهت دراست اىخصائص اىبزوبيىتينيت ألربغ سالالث ) ‪(L1, L2, R1, R2‬‬
‫واىمتمثيت في تحمو وجىد األمسجيه‪ ،‬سزػت اىىمى في درجت حزارة ‪ ، 43 °C‬اىحفاظ ػيً اىحيىيت خاله اىتخشيه‬
‫اىبارد‪ ،‬اىتصزف اتجاي اىؼطىر اىصىاػيت‪ ،‬سزػت اىىمى و تنىيه اىحمىظت في اىحييب و أيعا اىىشاغيت اىمحييت‬
‫ىيبزوتيىاث و اىذهىن‪ .‬و مه جهت أخزي‪ ،‬تم أيعا دراست اىخصائص اىبزوبيىتينيت ىيسالالث اىمذمىرة‪ ،‬و اىمتمثيت‬
‫في مقاومت اىظزوف اىمؼىيت )اىحمىظت و األمالح اىصفزاويت(‪ ،‬اىىشاغيت اىمعادة ىبؼط اىسالالث اىممزظت‪،‬‬
‫أخيزا‪ ،‬تم إخعاع اىسالالث اىمذروست إىً اختبار اىمقاومت ىبؼط أوىاع اىمعاداث اىحيىيت‪.‬‬
‫سالىتان مستؼميتان في صىاػت اىحييب و اىمتمثيتان في ‪ BN‬اىمؼشوىت مه اىحييب اىمخمز اىبزوبيىتيني‬
‫اىمصىىع و اىمسىق في اىجشائز )‪ (Danone Activia‬و اىسالىت‬
‫‪Bifidobacterium animalis ssp. lactis‬‬
‫)‪ (BB12‬تم استؼماىهما ممزجغ ىمقاروت اىخصائص اىمذروست‪.‬‬
‫وتائج اىتشخيص أظهزث أن اىسالالث اىمحييت تىتمي إىً وىػيه مه ‪ bifidobacteria‬حيث اىىىع‬
‫‪ B.longum‬و اىممثو باىسالىتيه ‪ L1‬و ‪ L2‬و اىىىع ‪ B. breve‬اىممثو باىسالىتيه ‪ R1‬و ‪ ،R2‬في حيه تم تصىيف‬
‫اىسالىت‪ BN‬في اىىىع ‪. B. animalis‬‬
‫وتائج تقييم اىنفاءاث اىتنىىىىجيت أظهزث امتالك اىسالالث اىمحييت ىقذراث مهمت جذا و اىتً ظهزث مه‬
‫خاله اىقذرة ػيً اىىمى في وجىد األمسجيه‪ ،‬سزػت ومى في درجت حزارة ‪ 43°C‬أمبز مه اىسزػاث اىمسجيت مه‬
‫غزف اىسالالث اىمستؼميت في اىصىاػت‪ ،‬اىحفاظ ػيً حيىيت خاله اىتخشيه اىبارد قزيبت مه تيل اىمسجيت مه‬
‫غزف اىسالالث اىمستؼميت في اىصىاػت‪ ،‬اىمحافظت ػيً حيىيت جيذة خاله اىتؼزض ىيؼطىر اىصىاػيت‪ ،‬سزػت‬
‫ومى في اىحييب أحسه مه تيل اىمسجيت مه غزف اىسالالث اىمستؼميت في اىصىاػت‪ ،‬في اىمقابو تم تسجيو وشاغيت‬
‫ظؼيفت ىتحييو اىبزوتيىاث و اىذهىن‪.‬‬
‫أيعا تم تسجيو مفاءاث بزوبيىتينيت جيذة جذا مه غزف جميغ اىسالالث اىمحييت اىمذروست و اىتي ظهزث‬
‫مه خاله اىمقاومت اىممتاسة ىيظزوف اىمؼىيت‪ ،‬وشاغيت معادة مهمت ظذ اىسالالث اىممزظت‪ .‬في األخيز‬
‫اىسالالث اىمذروست أظهزث مقاومت اتجاي بؼط اىمعاداث اىحيىيت‪ ،‬حيث أن اىسالالث اىمىتميت ىجىس‬
‫‪ Bifidobacterium‬تميل مقاومت غبيؼيت وحى هذي اىمعاداث اىحيىيت‪.‬‬
‫الكلمات المفتاحية‪ :‬اىسالالث اىمحييت‪ ، bifidobacteria ،‬اىخصائص اىتنىىىىجيت‪ ،‬اىخصائص اىبزوبيىتينيت‪.‬‬
Table des matières
INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 1
CHAPITRE I : Etude bibliographique
1. Produits laitiers fermentés ......................................................................................................................... 3
1.1. Lait fermenté ................................................................................................................................ 4
1.1.1. L‘ben ..................................................................................................................................... 4
1.1.2. Raïb ....................................................................................................................................... 4
1.2. Fromage ........................................................................................................................................ 4
1.3. Yaourt ........................................................................................................................................... 5
1.4. Laits fermentés aux bifidobactéries .............................................................................................. 7
2. Ecosystème gastro-intestinal ..................................................................................................................... 8
2.1. Anatomie du système digestif ...................................................................................................... 8
2.2. Description générale du système digestif ..................................................................................... 8
2.3. Implantation du microbiote intestinal ........................................................................................... 9
2.4. Le microbiote intestinal .............................................................................................................. 11
3. Probiotiques ............................................................................................................................................. 12
3.1. Historique de la définition des probiotiques ............................................................................... 12
3.2. Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques ...................................................... 14
3.2.1. Résistance à l'acidité gastrique ............................................................................................ 14
3.2.2. Résistance aux sels biliaires ................................................................................................ 14
3.2.3. Adhésion aux cellules épithéliales....................................................................................... 15
3.2.4. Production de substances antimicrobiennes ........................................................................ 15
3.2.5. Résistance aux antibiotiques................................................................................................ 15
3.2.6. Critères technologiques ....................................................................................................... 15
3.3. Effets bénéfiques des probiotiques sur la santé humaine ........................................................... 16
3.3.1. Soulagement de la constipation ........................................................................................... 17
3.3.2. Amélioration de l'utilisation du lactose par l'organisme ...................................................... 17
3.3.3. Prévention ou le raccourcissement de la durée des diarrhées .............................................. 17
3.3.4. Contrôle des infections intestinales par Helicobacter pylori............................................... 18
3.3.5. Activité antivirale ................................................................................................................ 18
3.3.6. Diminution des allergies alimentaires ................................................................................. 18
3.3.7. Réduction du taux de cholestérol sanguin ........................................................................... 19
3.4. Production et maintenance de la viabilité des bactéries probiotiques ........................................ 19
3.4.1. Emploi des bactéries probiotiques dans les produits laitiers ............................................... 19
3.4.2. Viabilité des bactéries probiotiques..................................................................................... 20
3.5. Défis technologiques associés au développement des cultures probiotiques ............................. 23
3.5.1. Méthodes de production ...................................................................................................... 23
4. Les bifidobactéries................................................................................................................................... 24
4.1. Taxonomie .................................................................................................................................. 24
4.2. Les espèces du genre Bifidobacterium ...................................................................................... 26
4.3. Ecologie des bifidobactéries ....................................................................................................... 29
4.4. Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiquesdes bifidobactéries ........... 30
4.4.1. Morphologie ........................................................................................................................ 30
4.4.2. Physiologies des bifidobactéries.......................................................................................... 30
4.4.3. Biochimie des bifidobactéries ............................................................................................. 32
4.5. Génétique des bifidobactéries .................................................................................................... 34
4.5.1. Le chromosome bactérien.................................................................................................... 34
4.5.2. Les plasmides ...................................................................................................................... 35
4.5.3. Identification génotypique des bifidobactéries .................................................................... 35
CHAPITRE II : Matériel et méthodes
1. Provenance des souches .......................................................................................................................... 38
1.1. Les souches industrielles ............................................................................................................ 38
1.2. Les souches indigènes ................................................................................................................ 38
1.3. Les souches pathogènes.............................................................................................................. 38
2. Milieux de culture .................................................................................................................................... 38
2.1. Milieu de culture pour les bifidobactéries .................................................................................. 38
2.2. Milieux de culture pour les souches pathogènes ........................................................................ 38
3. Isolement et purification des bifidobactéries ......................................................................................... 39
A partir du lait fermenté .................................................................................................................... 39
4. Pré identification des bifidobactéries ..................................................................................................... 40
4.1. Etude macroscopique ................................................................................................................. 40
4.2. Etude microscopique .................................................................................................................. 40
5. Identification du genre............................................................................................................................. 40
5.1. Recherche de la catalase ............................................................................................................. 40
5.2. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose ............................................................. 40
5.3. Recherche de citrate perméase ................................................................................................... 40
5.4. Mise en évidence de l‘uréase...................................................................................................... 40
5.5. Mise en évidence de la production d‘indole ............................................................................... 41
5.6. Protéolyse de la gélatine ............................................................................................................. 41
6. Caractérisation des espèces ..................................................................................................................... 41
7. Conservation des Souches ....................................................................................................................... 41
8. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de bifidobactéries ....................... 42
8.1. Mise en évidence des propriétés technologiques........................................................................ 42
8.1.1. Croissance en présence de l‘oxygène .................................................................................. 42
8.1.2. Croissance en 43°C ............................................................................................................. 43
8.1.3. Viabilité pendant l‘entreposage à 4°C ................................................................................. 43
8.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C .......................................... 44
8.1.5. Influence des arômes sur la viabilité ................................................................................... 44
8.1.6. Cinétique de croissance et d‘acidification dans milieu lait ................................................. 44
8.1.7. Activité protéolytique .......................................................................................................... 45
8.1.8. Activité lipolytique .............................................................................................................. 45
8.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques .............................................................. 46
8.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées....................................................... 46
8.2.3. Mise en évidence de l‘activité antibactérienne .................................................................... 48
8.2.4. Résistance aux antibiotiques................................................................................................ 49
8.2.5. Traitement statistique des résultats ...................................................................................... 50
CHAPITRE III : Résultats et discussion
1. Pré-identification des souches ................................................................................................................ 51
1.1. Aspect macroscopique ................................................................................................................ 51
1.2. Aspect microscopique ................................................................................................................ 51
2. Identification du genre............................................................................................................................. 52
2.1. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose ............................................................. 53
2.2. Mise en évidence des autres enzymes ........................................................................................ 53
3. Caractérisation des espèces ..................................................................................................................... 56
4. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de bifidobactéries ....................... 58
4.1. Mise en évidence des propriétés technologiques........................................................................ 58
4.1.1. Croissance en présence de l‘oxygène .................................................................................. 58
4.1.2. Croissance en 43°C ............................................................................................................. 59
4.1.3. Viabilité pendant l‘entreposage à 4°C ..................................................................................... 61
4.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C .............................................. 62
4.1.5. Influence des arômes sur la viabilité ................................................................................... 63
4.1.6. Cinétique de croissance et d‘acidification dans milieu lait ................................................. 65
4.1.7. Activité protéolytique .......................................................................................................... 67
4.1.8. Activité lipolytique .............................................................................................................. 68
4.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques ............................................................... 69
4.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées....................................................... 69
4.2.2. Activité antibactérienne ....................................................................................................... 71
4.2.3. Résistance aux antibiotiques................................................................................................ 73
DISCUSSION .............................................................................................................................................. 75
1. Isolement et identification des bifidobactéries ...................................................................................... 75
2. Etudes des propriétés téchnologiques des souches de bifidobactéries ................................................ 76
3. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques des bifidobactéries ......................................... 80
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ....................................................................................................... 83
Références bibliographiques ....................................................................................................................... 85
ANNEXES
Introduction
INTRODUCTION
Selon la définition rapportée par la FAO et L‘OMS (2002), les probiotiques sont des
microorganismes vivants qui lorsqu‘ils sont administrés en quantités adéquates, exercent une
action bénéfique sur la santé de l‘hôte qui les ingère.
Parmi les souches connues par leur effet probiotique, les bifidobactéries occupent un
espace très important. Ces bactéries forment le groupe le plus important des bactéries
intestinales pour la santé de l‘homme. Elles s‘installent dans un court temps après la naissance
et deviennent le groupe dominant des bactéries (92%) de la microflore de nouveau-né allaité
au sein.
Parmi les effets bénéfiques des bifidobactéries sur la santé humaine, on note le contrôle
de la flore intestinale, l‘inhibition de la croissance de nombreux pathogènes, la régulation du
transit intestinal, l‘amélioration de l‘intolérance au lactose et des allergies alimentaires
(Isolauri et al., 2000) et la stimulation du système immunitaire ainsi que certaines propriétés
anti-cancérigènes et anti-diarrhéiques (Shah, 2006).
Les produits laitiers fermentés sont connus pour être de bons vecteurs de probiotiques
notamment en raison de leur large consommation. Afin d‘être considérées comme potentiels
probiotiques, les souches sélectionnées doivent montrer une capacité à survivre dans le
produit et surmonter les obstacles rencontrés durant le procédé de fabrication (température de
fermentation, oxygène…) et au cours de l‘entreposage (basse température, oxygène, arômes),
ainsi durant le transit gastro-intestinal (pH bas, bile…), puis avoir de bon pouvoir adhésif à
l‘épithélium intestinal de l‘hôte. La survie des bifidobactéries dans les produits laitiers
fermentés dépend de plusieurs facteurs tels que, les conditions de fermentation,
la
température d‘entreposage et notamment la souche utilisée.
Le nombre des espèces de bifidobactéries introduites en industrie laitière est très limité
dont les souches d‘origine animale sont les plus utilisées, cela est dû à leur viabilité
satisfaisante durant la fabrication et l‘entreposage du produit en comparaison à celles
d‘origine humaine, mais ces dernières, ont des meilleurs caractères probiotiques (résistance au
pH bas et aux sels biliaires, bon pouvoir adhésif, activité antibactérienne…). De ce point,
notre étude tire son importance, elle sert à rechercher des souches de bifidobactéries indigènes
d‘origine
humaine
présentant
de
bonnes
propriétés
technologiques
caractérisées
essentiellement par une meilleure viabilité au cours de la fabrication et l‘entreposage du
Page 1
Introduction
produit, en plus des propriétés probiotiques (viabilité pendant le transit gastro-intestinale et
activité anti bactérienne envers les souches pathogènes).
Pour atteindre cet objectif, notre travail comporte les étapes suivantes :

Isolement et caractérisation microbiologique et biochimique des bifidobactéries.

Evaluation de leurs propriétés technologiques qui sert à étudier leur
comportement envers les conditions retrouvées dans le produit au cours de la
fabrication et l‘entreposage.

Etude in vitro de certaines propriétés probiotiques de ces souches (résistance au
pH et aux sels biliaires gastriques et même l‘activité anti bactérienne envers les
pathogènes).

Etude statistique servant à comparer les résultats obtenus pour les souches
indigènes avec ceux constatés pour les souches utilisées en industrie laitière.
Page 2
CHAPITRE I
Etude bibliographique
1. Produits laitiers fermentés
Une large gamme de produits laitiers fermentés est commercialisée à travers le monde. Il
existe un grand nombre de laits fermentés provenant de plusieurs pays et qui diffèrent par leur
matière première, leur flore microbienne, leur technologie, leur texture, leur goût et leur durée
de conservation (Leksir, 2012).
Le tableau 1 donne une description de différents types de laits fermentés et leurs pays
d‘origine.
Tableau 1: Exemples de produits laitiers fermentés et leurs pays d‘origine Leksir, (2012).
Nom
Description
Yoghourt/
Yaourt
Produit ferme ou brassé,
arôme caractéristique.
Lait à
l’acidophilus
Kéfir
Produit ferme, brassé ou
liquide, faible arôme.
Boisson brassée,
consistance crémeuse,
arôme et gout
caractéristique (CO2).
Boisson pétillante, acide,
gout rafraîchissant et
arôme caractéristique.
Boisson laitière aigre
diluée avec de l‘eau,
consommée sale, épicée
ou sucrée.
Produit ferme ou brassé,
ou boisson liquide, flaveur
agréable, acide ou
faiblement acide.
Produit ferme ou brassé,
gout et arôme agréable.
Koumis
Lassi
Dahi
Leben
Filmjölk
Villi
Boisson brassée,
visqueuse, saveur
acidulée.
Produit brassé visqueux,
acidulé et gout agréable
Pays présumé
d’origine
Asie, Balkans
Etats-Unis
Caucase
Mongolie
Ferment(s) impliqué(s)
St. thermophilus
Lb. bulgaricus
(+Lb. acidophilus,
Bifidobacterium ssp.)
Lb. acidophilus
Lc. lactis, Lc. cremoris,
Lb. kéfir, Lb. casei, Lb.
acidophilus, Leuconostoc
ssp., levures
Lb. bulgaricus,
Lb. acidophilus, levures
Inde
Lactococcus ssp.,
Lactobacillus ssp.,
Leuconostoc ssp.,levures
Inde
St. thermophilus,
Lb. bulgaricus,
Lc. diacétylactis, Leuconostoc ssp.
Moyen orient
St. thermophilus,
Lb.bulgaricus,
Lb. acidophilus,
Lc. lactis, levures
Lc. lactis, Lc. cremoris,
Lc. diacétylactis,
Ln. cremoris
Lc. lactis, Lc. cremoris,
Lc. diacétylactis, Lc.
dextranicum, moisissure
(Geotrichum candidum)
Suède
Finlande
Page 3
CHAPITRE I
Etude bibliographique
1.1. Lait fermenté
Les laits fermentés sont des produits laitiers transformés par une fermentation
essentiellement lactique qui aboutit à l‘acidification et à la gélification du lait (Béal et Sodini,
2012). Les laits fermentés algériens sont le L‘ben et le Raïb.
1.1.1. L’ben
L'origine de ce produit remonte à des temps immémoriaux, probablement à l'époque où
l'homme a commencé à domestiquer les espèces laitières et à utiliser leurs laits. Sa
fermentation lactique lui donne son arôme naturel et sa saveur inimitable. Sa préparation
artisanale est simple, le lait est abandonné à lui-même jusqu'à sa coagulation. Celle-ci se fait à
température ambiante et dure 24 à 48 h selon la saison. Le barattage qui lui succède dure 30 à
40 minutes. A la fin du barattage, on ajoute généralement un certain volume d'eau (environ 10
% du volume du lait), chaude ou froide, suivant la température ambiante, de façon à ramener
la température de l'ensemble à un niveau convenable au rassemblement des grains de beurre
(Ouadghiri, 2009 ; Benkerroum et Tamime, 2004).
Le L‘ben est produit également à l‘échelle industrielle. C'est un lait pasteurisé fermenté.
L'acidification est provoquée par ensemencement des ferments lactiques mésophiles. Le
lait qui sert à la préparation du L‘ben est reconstitué. Il subit une pasteurisation à 84°C
pendant 30 secondes, puis refroidi à 22°C et ensemencé de levain lactique (Streptococcus
cremoris ; Streptococcus lactis et Streptococcus diacetylactis ; Leuconostoc dextranicum,
Leuconostoc citrovorum et Leuconostoc mesenteroides) (Benkerroum et Tamime, 2004).
1.1.2. Raïb
Le Raïb fait partie des produits laitiers fermentés populaires en Algérie, en plus du
L‘ben (lait écrémé fermenté). Le Raïb a une très ancienne tradition en Algérie; il est fabriqué
à partir du lait cru de vache ou de chèvre. La fermentation du lait, comme de nombreux
procédés traditionnels de fermentation, est spontanée et incontrôlée et pourrait être une
source précieuse
des bactéries
lactiques autochtones (Mechai et Kirane, 2008).
Contrairement au L‘ben, le Raïb ne subit pas une opération de barattage et d‘écrémage, il
s‘agit d‘un lait fermenté entier.
1.2. Fromage
Le but est de transformer le lait en un produit d'utilisation prolongée et de goût différent
grâce à diverses actions microbiennes et enzymatiques (Leroy et De Vuyst, 2004; Hui, 1992).
La coagulation du lait et l'égouttage du caillé obtenu, représentent, en effet, une sorte de
concentration, qui constitue un moyen de conservation auquel il faut ajouter l'acidification
provoquée par la fermentation lactique, qui s‘oppose à l'envahissement du fromage par les
bactéries de putréfaction (Yìldìz, 2010; Keohane et al., 2009 ; Parente et Cogan, 2004).
Ce double principe de dessiccation et d'acidification va se retrouver, plus ou moins
prononcé dans la préparation de tous les fromages (Leroy et De Vuyst, 2004).
Page 4
CHAPITRE I
Etude bibliographique
La transformation du lait en fromage comporte quatre étapes essentielles (voir Figure 1).
Dans le cas d'un fromage frais, la fabrication est terminée après l'égouttage (Yìldìz, 2010;
Parente et Cogan, 2004).
Figure 1: Étapes essentielles de transformation du lait en fromage
(Parente et Cogan, 2004).
1.3. Yaourt
Le yaourt est un lait fermenté obtenu exclusivement par la coagulation du lait sous
l'action de deux bactéries : Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus
(Quiberoni et al., 2010 ; Iyer et al., 2009 ; Codex alimentarius. 2003 ) (Tableau 2).
Ces bactéries doivent être vivantes dans le produit et leur nombre doit dépasser dix
millions par gramme de yaourt à la date limite de conservation (Champagne et al., 2009;
Pfeiler et Klaenhammer, 2007).
Tableau 2: Composition recommandée et optionnelle des ferments du yaourt (Hui, 1992).
Composition standard recommandée par la FDA
Streptococcus salivarius ssp. thermophillus
Lactobacillus delbruckii ssp. bulgaricus
Ferments additionnels du yaourt
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus casei
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus jugurti
Lactobacillus lactis
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium infantis
Les propriétés fermentaires aromatiques et épaississantes des bactéries lactiques du
yaourt confèrent au produit final ses caractéristiques organoleptiques. Les résultats de
recherche ont montré que la production d'acide et la production d'acétaldéhyde de la culture
Page 5
CHAPITRE I
Etude bibliographique
mixte de Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus sont beaucoup plus
importantes que celles des cultures pures, on peut également observer un effet synergique
marqué sur la consistance et la viscosité du produit lorsqu'on emploie des cultures
épaississantes bonnes productrices d‘exopolysaccharides (EPS) (Yìldìz, 2010; Ravin et al.,
2006).
Figure 2: Diagramme général de fabrication des yaourts et des laits fermentés
(Béal et Sodini, 2012).
Les deux principaux types de yaourt sont le yaourt brassé et le yaourt ferme.
Les figures 2 et 3 montrent les différentes étapes de production des yaourts et laits
fermentés et des deux types de yaourt respectivement.
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
Figure 3: Diagramme simplifié de la production du yaourt (Yìldìz, 2010).
1.4. Laits fermentés aux bifidobactéries
Ce sont des laits fermentés à l‘aide de bifidobactéries associées à diverses bactéries. Il
existe plusieurs types des laits fermentés aux bifidobactéries :
-Type levain yaourt + Bifidobacterium + Lactobacillus acidophilus
-Type levain yaourt + Bifidobacterium, soit d‘origine humaine, soit d‘origine animale.
Les laits fermentés avec Bifidobacterium d‘origine animale, essentiellement
Bifidobacterium animalis, sont les plus répandus. Leur technologie est celle du yaourt à la
condition de choisir des souches capables de résister en milieu acide (pH 4,2 à 4,5) et en
anaérobiose relative (Hadadji, 2007)
Page 7
CHAPITRE I
Etude bibliographique
2. Ecosystème gastro-intestinal
2.1. Anatomie du système digestif
Les éléments constitutifs du tube digestif sont les suivants :
L‘œsophage qui se termine par le cardia
L‘estomac, qui inclut l'antre et le canal du pylore
Les intestins :
L‘intestin grêle (6-8 m), comprenant :
- Le duodénum
- Le jéjunum
- L‘iléon qui rejoint le cæcum à la jonction iléo-cæcale
Le gros intestin ou côlon (1,5 m), constitué de 3 parties :
Le cæcum.
L'appendice est un organe rudimentaire, reliquat de l'évolution, attaché au cæcum.
Le côlon qui comprend :
- Le côlon ascendant
- Le côlon transversal
- Le côlon descendant et sigmoïde
- Le rectum qui se termine par l'anus.
2.2. Description générale du système digestif
Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux microorganismes
exogènes. Sa muqueuse étant estimée à 200-300 m2, il représente la plus grande surface du
corps en contact avec l‘environnement. L‘écosystème gastro-intestinal est généré par une
alliance stable entre 1) l‘épithélium gastro-intestinal, 2) le système immunitaire et 3) une
importante flore microbienne. Si l‘un des trois composants de l‘écosystème est défaillant, des
pathologies peuvent survenir. Les interactions entre les microorganismes et l‘hôte peuvent
être de trois types : symbiose, commensalisme ou pathogénicité. L‘hôte est protégé contre la
microflore intestinale pathogène par les barrières chimiques et physiques formées par
l‘épithélium gastro-intestinal (Amrouche, 2005 ; Bäckhed et al. , 2004).
La figure 4 montre les principaux compartiments constituant le tractus gastro-intestinal
de l‘homme.
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
Œsophage: mucus, péristaltisme. Seuls les
microorganismes provenant des aliments ou de la
cavité
orale sont présents.
Estomac: pH acide (pH<2), O2, enzymes, mucus.
Microflore : 104 UFC/g : Candida albicans ,
Helicobacter
pylori, Lactobacillus, Streptococcus.
Duodénum: sécrétions pancréatiques et biliaires,
mucus,
faible O2. Microflore : 103-104 UFC/g :
Bacteroides,
Candida albicans , Lactobacillus, Streptococcus.
Jéjunum: sécrétions pancréatiques et biliaires,
mucus,
péristaltisme. Microflore : 105-107 UFC/g
:Bacteroides,
Candida albicans , Lactobacillus, Streptococcus.
Iléon: Anaérobiose, sels biliaires, enzymes.
Microflore:
107-108 UFC/g : Bacteroides, Clostridium,
Enterobacteriacea , Enterococcus, Lactobacillus,
Veillonella .
Colon: Anaérobiose, motricité, enzymes bactériennes, acides gras volatiles, ammoniaque,… Microflore : 10 101011 UFC/g: Bacteroides, Bacillus, Bifidobacterium, Clostridium, Enterococcus, Eubacterium, Fusobacterium
, Peptostreptococcus ,Ruminococcus , Streptococcus
Figure 4: Schéma simplifié décrivant les compartiments de l‘appareil digestif de l‘homme et
leurs microflores. D'après (Ouwehand and Vesterlund, 2003).
2.3. Implantation du microbiote intestinal
Tout contact entre le corps humain et un microorganisme qu‘il vienne d‘un aliment, de
l‘environnement, d‘un autre humain ou d‘animaux, peut en principe conduire à la
colonisation. Le fœtus des mammifères évolue in utero dans un environnement stérile et la
colonisation microbienne débute durant le processus de la naissance. En l‘absence des
mécanismes immunitaires sophistiqués de l‘adulte, le tube digestif du nouveau-né est un
environnement particulièrement permissif où les niveaux de population atteignent rapidement
1011 bactéries par gramme de selles. La colonisation suit néanmoins un schéma relativement
organisé, sous la dépendance de facteurs exogènes (exposition aux microorganismes d‘origine
maternelle (fécale, vaginale et cutanée) et environnementale, mais aussi l‘alimentation et
parfois l‘antibiothérapie) et endogènes (Bruno 2012).
Page 9
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Quelques études indiquent que le lait maternel pourrait être le vecteur de
microorganismes de la mère vers l‘enfant. Ainsi, même collecté aseptiquement, le lait de
femme n‘est pas stérile (Warner, 2003).
Les bactéries qu‘il contient peuvent être transmises à l‘enfant via l‘allaitement. Deux
équipes de chercheurs ont étudié l‘influence de l‘allaitement maternel dans la mise en place
de la flore microbienne intestinale du nouveau-né (Perez et al., 2007).
Elles ont montré que des bactéries ayant pour origine l‘intestin de la mère transitent par
le lait.
La mère transmet donc des éléments qui vont contribuer à la colonisation de l‘intestin de
son enfant et auront un impact sur la mise en place de son immunité. Les bactéries anaérobies
qui dominent le microbiote intestinal de l‘adulte font parties des premiers microbes rencontrés
lors d‘une naissance par voie basse. Elles ne se développeront cependant en dominance dans
l‘intestin que lorsque les aérobies strictes et les anaérobies facultatives auront consommé
l‘oxygène présent. Ce premier relais d‘espèces s‘opère durant les heures qui suivent la
naissance. Des relations antagonistes gouvernent ensuite progressivement le relais d‘espèces
en dominance conduisant vers l‘âge de deux ans à un microbiote stable sur le plan fonctionnel
(figure 5).
Figure 5: Implantation du microbiote intestinal. D‘après (Wilson, 2008).
Page 10
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Les bactéries anaérobies strictes dominent les bactéries anaérobies facultatives dans le
côlon distal et les selles par un facteur 1000 environ. L‘hygiène qui entoure la naissance et
les premiers moments de la vie conditionne fortement la dynamique de colonisation. Il
apparaît aujourd‘hui clairement que la colonisation par des espèces commensales habituelles
comme E. coli est retardée dans des pays industrialisés par rapport au passé (de quelques jours
à 6 mois) et par rapport au pays en voie de développement, apparemment du fait des
conditions d‘hygiène appliquées aujourd‘hui (Adlerberth et al., 2006 ; Nowrouzian et al.,
2003).
D'autres facteurs peuvent jouer un rôle dans la mise en place de la microflore intestinale
comme le génotype et le lieu de naissance de l'hôte (Bruno, 2012).
2.4. Le microbiote intestinal
Selon la définition de Isolauri et al. (2002), la flore intestinale normale est une collection
complexe et en équilibre de microorganismes qui habitent normalement le tractus gastrointestinal et remplissant un rôle dans la nutrition, la physiologie et le contrôle du système
immunitaire de l‘hôte
Après une colonisation complète, la microflore intestinale est considérée comme un
organe acquis après la naissance (Bruno, 2012). Il est constitué d‘une grande diversité
d‘espèces microbiennes assurant différentes fonctions pour l‘hôte. La microflore du tractus
gastro-intestinal a été estimée à près de 1013-1014 cellules microbiennes représentant 400 à
600 espèces et sous espèces (Bäckhed et al., 2004).
Cette microflore représente environ 10 fois le nombre total de cellules du corps humain.
La prévalence des bactéries dans le tractus gastro-intestinal dépend des conditions régnant
dans le compartiment du tractus. Deux catégories de bactéries ont été identifiées : les bactéries
autochtones ou indigènes se trouvant dans des niches particulières, et les bactéries allochtones
ou transitoires (comme les probiotiques) rencontrées dans d‘autres habitats du tractus
(Bäckhed et al., 2004).
La majorité des bactéries pathogènes sont allochtones et vivent normalement en
harmonie avec l‘hôte, excepté lorsque l‘équilibre du système est rompu. Du point de vue
microbiologique, comme le montre la figure 4, l‘environnement gastro-intestinal comprend
trois régions principales qui offrent des conditions très différentes pour la survie des différents
microorganismes. Dans le premier compartiment, l‘estomac, la prolifération microbienne est
fortement réduite par la présence d‘oxygène apporté par la déglutition (29% de la teneur en
oxygène de l‘air) ainsi que par la présence d‘une forte acidité. De ce fait, l‘estomac héberge
sélectivement les microorganismes acidotolérants et anaérobies facultatifs comme les
lactobacilles, streptocoques, levures, etc. Dans le deuxième compartiment qui est le petit
intestin, la microflore est constituée essentiellement de bactéries anaérobies facultatives tels
que les lactobacilles, les streptocoques et les entérobactéries, et anaérobies strictes notamment
les bifidobactéries, les bactéroides et les clostridies. La teneur en oxygène du petit intestin est
de 4.6%. Dans le dernier compartiment qui est le côlon, le transit digestif est plus lent et la
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
flore microbienne est plus abondante, représentant 35 à 50% du volume du contenu du colon
humain (Cummings et al., 1989)
La microflore du colon est très complexe et dominée par les bactéries anaérobies strictes
(Bacteroides spp., Clostridium spp., Bifidobacterium spp., Atopobium spp...). Tandis que
les bactéries anaérobies facultatives sont moins nombreuses et représentées par les
lactobacilles, les entérocoques, les streptocoques et les Enterobacteriaceae. Les levures (ex.
Candida albicans) sont assez faiblement représentées. La charge microbienne dans les
différents compartiments a été estimée à environ : 104, 103-4, 105-7, 107-8 et 1010-11 (ufc)/g dans
l‘estomac, le duodénum, le jéjunum, l‘iléon et le colon respectivement (Ouwehand and
Vesterlund, 2003).
Les principaux composants de la flore du colon ainsi que leurs effets sur l‘hôte sont
présentés dans la figure 6.
Figure 6: Vue générale sur la microflore du colon humain.
D‘après (Gibson and Roberfroid, 1995).
3. Probiotiques
3.1. Historique de la définition des probiotiques
Le terme probiotique a bénéficié de plusieurs définitions qui ont évolué dans le temps en
fonction des connaissances scientifiques et des avancées technologiques. La notion de
probiotiques a été développée principalement grâce aux travaux de Metchnikoff ayant suggéré
que l‘ingestion de bactéries lactiques vivantes accroît la longévité en réduisant dans le tube
digestif la population de bactéries putréfiantes ou produisant des toxines. Une des premières
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
définitions des probiotiques comme « facteurs promoteurs de croissance produits par des
microorganismes » a été proposé par Lilly et Stillwell en 1965. Depuis ce temps, la définition
du terme probiotique a été modifiée à plusieurs reprises (Ait-Belgnaoui et al., 2005;
Lamoureux, 2000).
En 1989, Roy Fuller a mis l‘accent sur la demande de viabilité des probiotiques et
introduisit l‘idée qu‘ils avaient un effet bénéfique sur l‘hôte (Guarner et al., 2008). La FAO et
l‘OMS (2002), ont établi récemment des lignes directrices pour l‘utilisation du terme
« probiotiques » dans les aliments et formulent la définition suivante : « les probiotiques sont
des microorganismes vivants qui lorsqu‘ils sont administrés en quantités adéquates, exercent
une action bénéfique sur la santé de l‘hôte qui les ingère».
Tableau 3: Certaines descriptions et définitions des probiotiques citées au cours des années
(Vasiljevic et Shah, 2008).
Année Description
Probiotics are common in vegetable food as vitamins, aromatic
1953
Source
Kollath
1954
substances, enzymes and possibly other substances connected with vital
processes
Probiotics are opposite of antibiotic
1955
Deleterious effect of antibiotics can be prevented by probiotics therapy
Kolb
1956
A Substance secreted by one microorganism which stimulates the
growth of another
Tissue extracts which stimulate microbial growth
Lilly and
Stillwell
Sperti
1973
Compounds that build resistance to infection in the host but do not
inhibit the growth of microorganisms in vitro
Fujii and Cook
1974
Organisms and substances that contribute to intestinal microbial balance
Parker
1992
Live microbial feed supplement which beneficially effects the host
animal by improving microbial balance
Viable mono- or mixed of live microorganisms which applied to
animals or man have a beneficial effect on the host by improving the
proprieties of the indigenous microflora
Fuller
1971
1992
Vergin
Havenaar and
Huis int'veld
1996
Live microbial culture or cultured dairy product which beneficially
influences the health and nutrition of the host
Salminen
1996
Live microorganisms which, upon ingestion exerts benefits beyond
inherent basic nutrition
Microbial cell preparations or components of microbial cells that have a
beneficial effect on the health and well-being of the host
Schaafsma
1999
2001
2002
A preparation of or a product containing viable, defined microorganisms
in sufficient number which alter the microflora ( by implantation or
colonization) in a compartment of the host and by that exert beneficial
health effect in this host
Live microorganisms that when administrated in adequate amount
confer health benefit on the host
Salminen,
Ouwehand,
Benno and Lee
Scherezenmeir
and de Vrese
FAW/WHO
Page 13
CHAPITRE I
Etude bibliographique
3.2. Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques
Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l‘espèce ou la souche
microbienne. Il est nécessaire de connaître le genre et l‘espèce de la souche utilisée car les
effets probiotiques sont spécifiques à la souche microbienne.
La non pathogénicité (innocuité) des souches est un critère très important, les souches
ayant le statut GRAS (Generally Regarded As Safe) sont d'ailleurs à favoriser. Toutefois, le
critère de viabilité ou de survie demeure essentiel dans la sélection des probiotiques qui
doivent parvenir vivantes au site de leur action, à savoir l‘intestin, et donc résister aux
différents mécanismes de défense de l‘hôte. Les bactéries étant administrées par voie orale, il
faut qu‘elles franchissent les obstacles majeurs du transit digestif : le pH acide, les sels
biliaires, les enzymes pancréatiques…etc (Millette et al., 2008; Lamoureux, 2000; Percival,
1997).
Le tableau 4 rapporte les critères les plus utilisé pour la sélection des probiotiques.
Tableau 4: Critères de sélection utilisés pour le screening des probiotiques
(Nousiainen et al., 2004).
Critères
Résistance à l'acidité gastrique
Résistance aux sels biliaires
Production d'acide (à partir de glucose et
lactose)
Adhésion au mucus et/ ou aux cellules
épithéliales humaines
Production de substances antimicrobiennes
Résistance à la chaleur
Bonnes propriétés technologiques
But cherché
Survie pendant le passage par l'estomac et duodénum
Survie pendant le passage par l'intestin grêle
Production (de barrière acide) efficace dans l'intestin
Colonisation efficace, réduction des sites d'adhésion des
pathogènes à la surface
Inhibition du développement des germes pathogènes
Survie pendant le processus de transformation
Stabilité, croissance sur une large échelle, survie dans le
produit, résistance aux bactériophages
3.2.1. Résistance à l'acidité gastrique
La survie des bactéries dans le suc gastrique dépend de leur capacité à tolérer les bas pH.
Le temps de passage peut être d‘une heure à quatre heures selon l'individu et son régime. Par
conséquent, quelques auteurs proposent que les souches probiotiques doivent résister à un pH
de 2.5 dans un milieu de culture pendant quatre heures (Ammor et Mayo, 2007).
3.2.2. Résistance aux sels biliaires
Dans l'intestin grêle, la tolérance aux sels biliaires est un facteur important qui contribue
à la survie des probiotiques. Les bactéries qui survivent aux conditions acides de l'estomac
doivent alors faire face à l‘action détergente des sels biliaires libérés dans le duodénum après
ingestion des repas gras.
Page 14
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Les bactéries peuvent réduire l‘effet émulsifiant des sels biliaires en les hydrolysant avec des
hydrolases, de ce fait diminuant leur solubilité (Gu et al., 2008; Ammor et Mayo, 2007 ).
3.2.3. Adhésion aux cellules épithéliales
La capacité d‘adhésion à l'épithélium intestinale est un critère de sélection recommandé
pour le choix des probiotiques, car c'est une condition pour la colonisation des entrailles.
L'adhérence constitue le premier mécanisme de défense contre l‘invasion des bactéries
pathogènes. (Reyes-Gavilan et al., 2011; Palomares et al., 2007).
3.2.4. Production de substances antimicrobiennes
Les bactéries lactiques synthétisent des molécules à action bactéricide (ou
bactériostatique) comme les acides organiques, le peroxyde d‘hydrogène, le dioxyde de
carbone, le diacétyle et les bactériocines. Ces mécanismes antimicrobiens ont été exploités
pour améliorer la préservation des aliments (Labioui et al., 2005; Titiek et al., 1996 ).
3.2.5. Résistance aux antibiotiques
Les bactéries lactiques sont naturellement résistantes à beaucoup d‘antibiotiques grâce à
leur structure et physiologie. Les travaux de Temmerman et al. (2003) ont montré que 68.4%
des probiotiques isolés ont une résistance à un antibiotique ou plus. Des souches de
Lactobacillus ont été trouvées résistantes à la kanamycine (81%), à la tétracycline (29.5%), à
l‘érythromycine (12%) et au chloramphénicol (8.5%). 38% des isolats de Enterococcus
faecium ont été trouvés résistants à la vancomycine.
Dans la plus part des cas la résistance n‘est pas transmissible, cependant, il est possible
que le plasmide codant pour la résistance aux antibiotiques soit transféré à d‘autre espèces et
genres. C'est une raison significative pour choisir des souches manquantes du potentiel de
transfert de résistance (Denohue, 2004).
Les autorités européennes ont récemment conclu que quelques bactéries utilisées pour la
production d‘aliment pourraient poser un risque à la santé humaine et animale en raison
d'héberger des souches avec les gènes de résistance transmissibles. Par conséquent, avant de
lancer une culture probiotique, il est important de vérifier que les souches bactériennes
impliquées ne comportent pas de gènes transmissibles de résistance aux antibiotiques (Ammor
et Mayo, 2007).
3.2.6. Critères technologiques
Plusieurs aspects technologiques doivent être pris en compte dans la sélection des
probiotiques tels que :
3.2.6.1. Viabilité et stabilité des microorganismes
Pour exercer leur effet bénéfique sur la santé, les probiotiques doivent survivre en grand
nombre au procédé de fabrication, et à la période d‘entreposage au froid qui s‘ensuit.
Cependant, la stabilité physique et génétique des cellules ainsi que toutes les propriétés
nécessaires pour exercer leurs bienfaits sur la santé doivent également être assurées
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
(Izquierdo, 2009). De plus, ces souches devraient être viables sans se multiplier pour ne pas
provoquer d‘effet indésirable sur le goût ou l‘arôme du produit ni augmenter l‘acidité
(Mattila-Sandholm et al., 2002). Par ailleurs, plusieurs études ont démontré que des cellules
en phase stationnaire de croissance, plus tolérantes aux stress environnementaux que des
cellules en phase exponentielle, devraient être privilégiées pour la confection de produits
contenant des probiotiques en grand nombre (Heller, 2001).
3.2.6.2. Propriété acidifiante
La fonction acidifiante est la plus recherchée des bactéries lactiques qui a pour effet une
production importante d‘acide lactique conduisant à une acidification rapide et durable, les
conséquences d‘ordre physicochimique et microbiologique sont récapitulées d‘après
Surta et al., 1998 : coagulation du lait, la synérèse du caillé et la solubilisation du calcium
micellaire, elle participe aux qualités organoleptiques des produits laitiers fermentés et inhibe
la croissance de microorganismes nuisibles.
3.3. Effets bénéfiques des probiotiques sur la santé humaine
Les probiotiques ont pour but d‘aider la flore microbienne naturelle de l‘intestin. De
plusieurs avantages pour la santé sont fournis par l'ingestion des aliments contenant des
cultures probiotiques (Da Cruz et al., 2010). Il est important de mentionner que les effets de
la promotion de la santé dépendent de la souche présente dans la formulation du produit, et
qu'il n'y a pas une souche probiotique en mesure de fournir tous les avantages (Shah, 2007).
Figure 7: Présentation des effets bénéfiques de la consommation des probiotiques sur la santé
humaine (Saarela et al., 2000).
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
Les principaux effets bénéfiques sur la santé de l'hôte sont les suivants :
3.3.1. Soulagement de la constipation
Les lactobacilles peuvent avoir des effets sur la constipation (selles difficiles, dureté
excessive des selles, transit intestinal lent) et permettent de réduire l‘utilisation de laxatifs,
qui ont l‘inconvénient majeur d‘éliminer différentes substances essentielles à l‘organisme
comme les acides aminés, les minéraux… (Guarner et al., 2008).
3.3.2. Amélioration de l'utilisation du lactose par l'organisme
L‘un des effets des bactéries lactiques qui a été le plus mis en avant et démontré chez
l‘Homme est celui qui concerne l‘amélioration de l‘intolérance au lactose (De Vrese et al.,
2001). Chez les personnes souffrant d‘intolérance au lactose, un déclin de la production de
β-galactosidase est observé au-delà de la petite enfance.
La deuxième cause d‘intolérance (intolérance secondaire) est représentée par les
maladies comme les résections intestinales, les gastro-entérites, la maladie céliaque ou les
gastrectomies.
Plusieurs études ont montré que la β-galactosidase des bactéries lactiques participait à la
digestion du lactose dans l‘intestin. En principe, le remplacement du lait par du yaourt
conduit à une meilleure absorption et une meilleure tolérance chez les sujets présentant une
intolérance au lactose (primaire et secondaire). Streptococcus thermophilus et Lactobacillus
delbrueckii ssp. bulgaricus améliorent la digestion du lactose et réduisent les symptômes liés
à l‘intolérance au lactose (douleurs abdominales, ballonnements). Plusieurs travaux
explicatifs ont montré que la lactase de bactéries lactiques participe à la digestion du
lactose du yaourt (90%) chez les sujets déficients en lactase (Guarner et al., 2008).
3.3.3. Prévention ou raccourcissement de la durée des diarrhées
Des études cliniques ont démontré que la diarrhée du voyageur, diarrhée aux
rotavirus, diarrhée associée aux antibiotiques comme celle causée par Clostridium difficile,
peuvent être contrecarrées avec succès par l‘utilisation de probiotiques tels que :
L. rhamnosus, B. bifidum, S. thermophilus, L. acidophilus, L. bulgaricus (Wang et al., 2004) .
Les mécanismes potentiellement impliqués incluent la production d‘acide lactique, de
peroxyde d‘hydrogène, d‘autres substances antimicrobiennes telles que les bactériocines, la
compétition pour des nutriments ou des récepteurs d‘adhésion, des actions anti toxines et la
stimulation du système immunitaire (Gill, 2003).
Plusieurs études randomisées contrôlées sur l‘Homme ont montré l‘efficacité des souches
probiotiques pour prévenir ou atténuer les perturbations digestives liées à la prise
d‘antibiotiques (Cremonini et al., 2002 ; Fooks et Gibson, 2002) et les diarrhées
nosocomiales infantiles dues surtout à des rotavirus (Szymanski et al., 2006).
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
3.3.4. Contrôle des infections intestinales par Helicobacter pylori
L‘infection par Helicobacter pylori favorise les risques d‘ulcère du duodénum et de
l‘estomac et de certains cancers et lymphomes gastriques (Dial et Lichtenberges, 2002).
Wang et al. (2004) ont rapporté que la consommation régulière de yaourt additionné de
L. acidophilus La5 ou de Bifidobacterium lactis BB12 induit une suppression effective de
l‘infection due à Helicobacter pylori. La croissance d‘Helicobacter pylori est inhibée par
la production de quantités importantes d‘acide lactique (Zubillaga et al., 2001) et par la
production de bactériocines notamment la lacticine produite par Lactococcus lactis et qui
exerce une activité antimicrobienne contre plusieurs souches d‘Helicobacter pylori.
3.3.5. Activité antivirale
Les probiotiques, comme une partie de la microflore intestinale, sont signalé es à
promouvoir la défense de l‘hôte et à moduler le système immunitaire (Clancy, 2003; Cross,
2002).
Parmi elles, les genres Lactobacillus sp. et Bifidobacterium sp, sont indiqués pour
stimuler l‘immunité systémique à médiation cellulaire (TH1) et sont aujourd‘hui largement
utilisés dans les thérapies probiotiques (Clancy, 2003;Cross, 2002). Ils ont plusieurs
avantages à l‘hôte, y compris le potentiel de stimuler l‘activité antivirale (Kidd, 2003 ; Kaila
et al., 1995).
Les avantages des probiotiques ont été démontrés chez les patients présentant de diarrhée
associée aux rotavirus et au VIH (Goossens et al., 2003; Rosenfeldt et al., 2002; Rolfe, 2000).
Les mécanismes par lesquels elles sont à combattre les infections sont suggérés
d‘inclure l‘exclusion des agents pathogènes par le biais de la concurrence pour la fixation et
la stimulation des défenses immunitaires de la cellule hôte (Isolauri, 2003).
3.3.6. Diminution des allergies alimentaires
L‘allergie alimentaire du nourrisson se traduit souvent par de l‘eczéma atopique. Les
traitements curatif et préventif de cette pathologie par des BAL ont été évalués lors d‘une
étude clinique sur 27 enfants nourris au sein et souffrant d‘eczéma atopique (Arvola et al.,
2000).
Il a été notamment observé qu‘après deux mois de traitement avec une formule
supplémentée en L. rhamnosus GG et B. lactis BB12, il y a eu une amélioration plus rapide
de l‘état atopique en comparaison avec le groupe placebo. Un effet préventif de L. rhamnosus
GG a aussi été observé chez des enfants à risque nés de parents atopiques (Kalliomaki et al.,
2001).
Les mécanismes ainsi que les processus régulateurs de l‘allergie sont loin d‘être tous
connus.
Plusieurs mécanismes touchant à l‘immunité ou à l‘état de la muqueuse ont été suggérés
pour expliquer l‘effet protecteur des BAL. Celles-ci pourraient, en diminuant la perméabilité
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
intestinale très augmentée en période de réactivité allergique, participer à la diminution du
passage des protéines alimentaires (Rautava et al., 2002).
3.3.7. Réduction du taux de cholestérol sanguin
Des tests in vitro ont montré une réduction du taux de cholestérol dans un milieu de
culture avec certains Lactobacillus (Zhang et al., 2008). Plusieurs hypothèses ont été émises
pour expliquer ce fait, comme l‘assimilation du cholestérol par les bactéries ou l‘hydrolyse
des sels biliaires conjugués.
Les acides biliaires, synthétisés par le foie à partir du cholestérol, sont "recyclés" et
utilisés en moyenne trois fois pendant un même repas. L‘hydrolyse des sels biliaires
conjugués (les acides biliaires doivent être conjugués à la taurine et à la glycine pour être
solubles) rend nécessaire la synthèse de sels biliaires supplémentaires, ce qui conduirait à une
réduction du cholestérol (Liong et Shah, 2005).
Bien que la déconjugaison des sels biliaires puisse avoir des effets bénéfiques sur l‘hôte,
comme la diminution des niveaux de cholestérol, une déconjugaison excessive ou une
déshydroxylation des acides biliaires par certains microorganismes semble avoir plusieurs
effets néfastes sur l‘hôte. Les bactéries les plus fréquemment désignées comme probiotiques,
telles que les souches des genres Lactobacillus et Bifidobacterium, sont incapables de
déshydroxyler les sels biliaires déconjugués.
Une autre explication évoque une diminution du taux de cholestérol qui serait
uniquement due à la co-précipitation du cholestérol avec les sels biliaires déconjugués,
phénomène qui ne peut pas se produire in vivo car le pH est plus élevé que dans un milieu de
culture acidifié par les BAL.
Des études ont été réalisées sur des humains pour tester l‘influence de la consommation
des produits laitiers fermentés sur le taux de cholestérol sanguin, mais les résultats n‘ont
jamais été confluents (Pereira et Gibson, 2002).
3.4. Production et maintenance de la viabilité des bactéries probiotiques dans les
produits laitiers
3.4.1. Emploi des bactéries probiotiques dans les produits laitiers
Les produits laitiers probiotiques appartiennent à la catégorie des produits laitiers
fonctionnels qui ont montré une croissance impressionnante au cours de la dernière décennie)
(Menrad, 2003). Ainsi, le nombre des produits disponibles et la connaissance du
consommateur du concept probiotique a évolué, et, en conséquence, la recherche sur ces
produits a également augmenté.
Plus de 600 produits alimentaires probiotiques sont commercialisés par l‘industrie laitière
depuis 2006 comprenant : les crèmes glacées, les fromages, le beurre, les laits en poudre, les
desserts glacés et la mayonnaise (Sveje, 2007). Cependant, les exemples les plus connus des
produits laitiers probiotiques sont le lait fermenté et les yaourts, qui sont généralement
consommés après quelques jours ou semaines de leur fabrication (Nagpal et al., 2007).
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
Le
yaourt a longtemps été reconnu comme un produit avec de nombreuses
caractéristiques appréciées par les consommateurs, ce qui en fait un choix évident en tant que
porteur de souches probiotiques.
Au cours de ces dernières années, la popularité de bio-yaourts, contenant des ferments
S.thermophilus, Lb. bulgaricus, Lb. acidophilus et des espèces de Bifidobacterium a
augmenté de manière significative (Farnworth, 2008).
3.4.2. Viabilité des bactéries probiotiques
Afin d'obtenir les effets souhaités, les bactéries probiotiques doivent être capables de se
croître dans le lait et de survivre à un taux suffisamment élevé (Tamime, 2005).
Dans la littérature scientifique, des concentrations minimale de 106 et 107 UFC/g dans le
produit fini sont considérées comme des quantités thérapeutiques de cultures probiotiques
dans les aliments transformés (Talwalkar et al., 2004), atteignant 108 et 109 UFC/g, fournies
par une consommation quotidienne de 100 g ou 100 ml de lait fermenté, d'où un bénéfice
pour la santé de l'Homme (Jayamanne et Adams, 2006).
Ces chiffres élevés ont été proposés pour compenser les pertes possibles des
microorganismes probiotiques pendant la durée de conservation de l‘aliment probiotique,
lors du transit dans les conditions acides de l'estomac, et de résister aux sels biliaires dans
l'intestin grêle (Tamime, 2005).
Au Japon, l‘association des laits fermentés et les boissons lactées a mis au point un
chiffre standard, qui recommande la présence d‘un minimum de 107 UFC/ml de bactéries
lactiques viables dans les produits laitiers (Tamime, 2005).
3.4.2.1. Effet du procédé technologique sur la viabilité des bactéries probiotiques
La viabilité de bactéries probiotiques dans les produits laitiers au cours du procédé
technologique dépend des souches utilisées, l'interaction entre les espèces présentes, la
production de peroxyde d'hydrogène par le métabolisme bactérien, les composants de la
matrice alimentaire et l'acidité finale du produit (Farnworth, 2008).
La viabilité dépend également de la disponibilité des éléments nutritifs, les activateurs et
inhibiteurs de croissance, la concentration des sucres, l'oxygène dissous et de l'oxygène
perméable à travers l‘emballage (en particulier pour les espèces Bifidobacterium), le niveau
d'inoculation et le temps de fermentation (Oliveira et Damin, 2003).
Les principaux facteurs qui affectent la viabilité des probiotiques sont :
La composition du milieu de fermentation
Les bactéries probiotiques sont utilisées dans la fermentation du lait dans une mesure
limitée en raison du ralentissement de leur croissance dans le lait.
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
En général, les bactéries probiotiques se développent mieux dans les milieux
synthétiques riches à savoir, peptone tryptone levure (TPY) et le bouillon De Man, Rogosa
et Sharpe (MRS), que dans le lait.
Toutefois, ces milieux sont complexes et coûteux pour la propagation à grande échelle
des bactéries probiotiques et peuvent également conférer une flaveur avant l'incorporation.
Pour la fabrication d'un produit de qualité, tant en termes de texture et de viabilité de
bactéries probiotiques, un milieu à base de lait est habituellement nécessaire en raison de la
présence de la caséine (Shah, 2007).
L'oxygène
Au cours de la production de yaourt, l'oxygène peut facilement envahir et se dissoudre
dans le lait. L'oxygène peut également pénétrer dans le produit à travers les matériaux
d'emballage pendant le stockage (Dave et Shah, 1998).
L‘oxygène affecte les cultures probiotiques de deux façons :
Premièrement, il est directement toxique pour les cellules ; certaines cultures
probiotiques sont sensibles à l'oxygène et meurent en sa présence.
Deuxièmement, dans la présence d'oxygène, certaines cultures, notamment
Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, produisent le peroxyde. Une inhibition synergique de cultures
probiotiques à cause du peroxyde d'hydrogène et d'acide a été rapportée (Lankaputhra et Shah,
1996)
Les additifs
D‘après le comité FAO–OMS, un additif alimentaire est défini comme une substance
dotée ou non d‘une valeur nutritionnelle, ajoutée intentionnellement à un aliment dans un but
technologique, sanitaire, organoleptique ou nutritionnel. Son emploi doit améliorer les
qualités du produit fini sans présenter de danger pour la santé, aux doses utilisées. Il peut être
d‘origine naturelle, ou artificielle : produits de transformation de substances naturelles
(amidons transformés comme agents de texture etc.) ou encore être un arôme de synthèse.
L‘additif porte la mention« E » (pour « Europe »), suivie d‘un numéro d‘identification. Sa
présence et la dose doivent être précisées sur l‘emballage (Bourrier, 2006).
Les additifs alimentaires sont indispensables dans l'industrie laitière. Cependant, les
effets des additifs sur la croissance des bactéries lactiques probiotiques n‘ont pas été
largement étudiés (Bouchefra, 2012).
3.4.2.2. Méthodes d’améliorations de la viabilité des microorganismes probiotiques
Sélection des souches
Il est important que la viabilité de la souche et la stabilité des caractéristiques
souhaitables soient maintenues pendant la production commerciale, ainsi que dans le produit
fini (Talwalker et Kailasapathy, 2004; Godward et al., 2000).
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
La viabilité et le taux de survie lors du passage dans l'estomac sont nécessaires pour
permettre aux probiotiques vivants des produits laitiers fermentés d‘exercer un rôle
biologique dans l'intestin humain. Ainsi, la sélection de souches appropriées sur la base de
leur tolérance à l‘acidité et aux sels biliaires contribuerait à améliorer la viabilité de ces
souches bactériennes probiotiques (Takahashi et al., 2004).
Taux d'inoculation
Les microorganismes probiotiques croissent mal dans le lait, un volume élevé de
l'inoculum (5-10 ml/ 100 ml lait) est nécessaire, par rapport à un petit inoculum (1 ml/ 100
ml de lait) dans le cas des cultures starter du yaourt, ce qui peut entraîner une suracidification du produit et cela se traduit éventuellement par la faible survie des bactéries
probiotiques. Le pH final à la fin de la fermentation est le facteur crucial pour la survie des
microorganismes probiotiques. A ce stade un pH inférieur à 4,4 entraîne une diminution
substantielle des bactéries probiotiques. Par conséquent, le niveau d'inoculum doit être
soigneusement réglé et contrôlé (Tamime, 2005).
L'utilisation des pièges à oxygène
La teneur en oxygène et le potentiel d'oxydoréduction sont des facteurs importants pour
la viabilité pendant le stockage à froid. L'acide ascorbique (vitamine C) agit comme un
capteur d'oxygène et est autorisé comme additif alimentaire. En outre, le lait et les produits
laitiers offrent seulement 10-15% des besoins quotidiens en vitamine C. Ainsi, la fortification
du yaourt avec de l'acide ascorbique pourrait augmenter sa valeur nutritive (Dave et Shah,
1997a).
St. thermophilus est aérobie, et leur nombre devrait rester faible en présence d'acide
ascorbique. La viabilité de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (étant des microaérophiles) devrait
s'améliorer avec une concentration plus importante en acide ascorbique. Bien que l'ajout
d'acide ascorbique contribue à améliorer la survie de Lb. acidophilus, l'effet du piégeage
d'oxygène est insuffisant pour améliorer la viabilité des bifidobactéries anaérobies (Tamime,
2005).
L'ajout de la Cystéine
La cystéine est un acide aminé contenant du soufre, fournit l'azote aminé comme facteur
de croissance tout en réduisant le potentiel d'oxydoréduction. La cystéine à 250 mg L-1
semble à améliorer la survie de Lb. acidophilus et Bifidobacterium spp. Il convient de noter
que la faible concentration en cystéine (50 mg L-1) améliore la croissance de
St. thermophilus (Dave et Shah, 1997b).
Une légère baisse du potentiel d'oxydoréduction est bénéfique pour la survie de
St. thermophilus, mais lorsque la concentration en cystéine est supérieure à 50 mg L-1, la
dépression du potentiel d'oxydoréduction affecte la croissance bactérienne.
La croissance de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus serait améliorée grâce à de faibles
niveaux de cystéine, mais elle serait inhibée à des niveaux plus élevés (Tamime, 2005).
Page 22
CHAPITRE I
Etude bibliographique
3.5. Défis technologiques associés au développement des cultures probiotiques
La production et la commercialisation des probiotiques à l‘échelle industrielle exposent
les microorganismes à des conditions défavorables qui peuvent tuer une grande partie des
bactéries.
Des nouvelles technologies de séchage, notamment de lyophilisation (freeze drying),
exposent les microorganismes à des conditions plus douces et permettent de conserver la
viabilité des probiotiques. Si les baisses de viabilité sont inacceptables lors de la fermentation,
la lyophilisation, ou la production de cultures concentrées dans des billes de gel d‘alginate
ou de carraghénane est une alternative au processus traditionnel (Macouzet et Champagne,
2007).
3.5.1. Méthodes de production
3.5.1.1. Lyophilisation
La lyophilisation est une méthode pratique pour la préservation et la conservation à long
terme des bactéries probiotiques. Elle consiste à retirer de l'eau de la suspension de cellules
congelées par sublimation sous pression réduite. La sublimation est le processus par lequel
l'eau est éliminée directement à partir de la glace, sans passer par l'état liquide (Malik, 1990).
La lyophilisation est bien adaptée pour la conservation de matériel biologique sensible,
car le gel ralentit ou arrête la plupart des réactions chimiques. Ce processus se déroule sous
vide et en l'absence d'oxygène qui font qu'il est impossible que les réactions d'oxydation se
produisent.
Pour surmonter l'inactivation au cours du séchage et une mauvaise stabilité pendant le
stockage les cryoprotecteurs comme le glycérol, la cystéine ou le sucrose sont ajoutés en
période de lyophilisation des lactobacilles. La lyophilisation est considérée comme l'étalon-or
des méthodes de séchage où la viabilité, la saveur et l‘arôme sont préservés à long terme
durant le stockage, la commercialisation et la consommation (Farnworth, 2008).
3.5.1.2. Microencapsulation
La microencapsulation est un processus par lequel les cellules microbiennes sont
enfermées dans une couche protectrice. L‘encapsulation réduit la perte de la viabilité des
cellules, en séparant les cellules bactériennes de l'environnement défavorable. La couche de
protection permet de réduire la perte de cellules et de blessures en bloquant les composants
actifs tels que l'humidité, l'oxygène atmosphérique et les acides (Sultana et al., 2000).
Il a été constaté que les bactéries lactiques probiotiques utilisées dans les applications
alimentaires enfermées dans des microcapsules de graisse solide conservent toute leur activité
biologique (Krasaekoopt et al., 2003).
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CHAPITRE I
Etude bibliographique
3.5.1.3. L’ajout des prébiotiques
Les probiotiques et les prébiotiques sont des ingrédients qui peuvent être consommés
séparément. Toutefois, lorsqu‘on prépare des aliments fonctionnels avec un mélange de
bactéries probiotiques et de composés prébiotiques, ces produits sont nommés symbiotiques.
Les symbiotiques ont été conçus pour avoir un effet dans le système gastro-intestinal.
Toutefois, on leur découvre de plus en plus de bénéfices secondaires. En effet, une croissance
accrue de probiotiques s‘observe parfois dans les laits fermentés ainsi qu‘une plus grande
stabilité lors de l‘entreposage (Macouzet et Champagne, 2007).
4. Les bifidobactéries
4.1. Taxonomie
Les bifidobactéries ont été découvertes pour la première fois dans les fèces infantiles
nourris au lait maternel par Tissier (1900), qui a isolé une bactérie avec une forme étrange et
caractéristique de Y et l'a appelée Bacillus bifidus. Cette bactérie était anaérobie, Gram
positive et n'a pas développé de gaz pendant sa croissance. Depuis leur première description,
la classification de ces bactéries n'a cessé d'être révisée passant du genre Bacillus, à celui de
Bacteroïdes (Castellani et Chalmers, 1919), Lactobacillus (Hollande ,1920), Bifidobacterium
(Orla-Jensen ,1924), Bacterium (Lehmann et Neumann, 1927), Tissieria (Pribram, 1929),
Nocardia (Vuillemin, 1931), Actimomyces (Nannizzi, 1934), Actinobacterium (Puntoni,
1937) et Corynebacterium (Olsen, 1949).
En raison des similitudes entre les bifidobactéries et les bactéries du genre Lactobacillus,
ils ont été inclus dans ce genre comme classifier dans la 7e édition du manuel de Bergey de la
bactériologie déterminative (Breed et al., 1957).
Dehnert (1957) a décrit l'existence des biotypes multiples des bifidobactéries et a proposé
un arrangement pour la différenciation entre les souches basées sur leurs modèles de
fermentation d'hydrate de carbone.
Durant la même année Cummins et ses collaborateurs ont examiné la composition de la
paroi cellulaire de plusieurs souches de bifidobactéries et ont conclu que ces bactéries sont
différentes de toutes les bactéries Gram positifs précédemment examinées (Cummins et al.,
1957)
La classification taxonomique des bifidobactéries était donc à revoir et le sujet a été
relancé de nouveau à l‘investigation.
En 1963, Reuter a effectué des tests biochimiques et sérologiques sur des souches de
bifidobactéries isolées des fèces d'enfants et d‘adultes et a proposé l'arrangement suivant pour
l'identification de ces bactéries: des bactéries aux formes bacillaires ,anaérobie , Gram positif,
ressemblaient à des lactobacilles, excepté la variabilité morphologique, elles fermentent le
glucose en produisant de l'acide acétique et de l'acide lactique d'un rapport 2:1 et fermentent
11 sucres additionnel des sucres déjà étudiés. Sur cette base il conclut que ces bactéries
Page 24
CHAPITRE I
Etude bibliographique
devraient être classées dans la tribu Lactobacilleae, famille Lactobacillaceae dans le genre
Bifidobacterium.
Scardovi et Trovatelli (1965) et De Vries et al. (1967) ont découvert une nouvelle voie de
fermentation des hexoses chez les bifidobactéries, qui ne se trouve pas dans aucune des
espèces du genre Lactobacillus. L'enzyme principale de cette voie est une fructose-6phosphate phosphoketolase qui clive le fructose-6-phosphate en érythrose-4-phosphate et en
acétyle phosphate (figure 8).
Figure 8: Formation d'acétate et de lactate à partir de glucose par la voie des bifidobactéries.
D'après Scardovi et Trovatelli,(1965).
1 : hexokinase et glucose-6-phosphateisomérase
2 : fructose-6-phosphate phosphoketolase,
3 : transaldolase,
4 : transketolase,
5 : ribose-5-phosphate isomérase,
6 : ribulose-5-phosphate-3-epimerase,
7 : xylulose-5-phosphoketolase,
8 : acétate kinase,
9 : Les mêmes enzymes appliqués dans la
voie homofermentative
Page 25
CHAPITRE I
Etude bibliographique
En 1970, Scardovi et ces collaborateurs ont commencés a appliqué intensivement le
procédé d'hybridation ADN-ADN afin d'évaluer la validité des espèces de bifidobactéries
précédemment décrite et pour identifier de nouveaux groupes de séquences ADN
homologique parmi les souches qu'ils isolaient dans des diverses niches écologiques. Cette
technique d‘identification est une avance significative en bactériologie déterminative et a aidé
à résoudre une grande partie de la confusion précédemment rencontré quand a la
différenciation d'espèce de Bifidobacterium qui a été faite principalement sur le profil
fermentaire d'hydrate de carbone.
Dans la 8e édition du manuel de Bergey du déterminatif de la bactériologie (Rogosa,
1974), les bifidobactéries ont été classifiées dans le genre Bifidobacterium en utilisant le
même nom proposé par Orla-Jensen. Le genre a comporté huit espèces; il a été inclus dans la
famille des Actinomycetaceae d'ordre Actinomycetales.
Une autre correction à la classification a été apportée après l'introduction de
l'électrophorèse des protéines cellulaires solubles sur le gel de polyacrylamide comme critère
d'identification d'espèce (Biavati et al., 1982).
La nouvelle description d'espèce et les remises en ordre apportées à la classification
précédente ont contribué à l'identification de 24 espèces rapportées dans la première édition
du manuel de Bergey de la bactériologie systématique (Scardovi, 1986).
Stackebrand et al. (1997), par l'analyse de ARNr16s, ont proposé une structure
hiérarchique rassemblant le genre Bifidobacterium avec le genre Gardnerella dans une seule
famille Bifidobacteriaceae dans l‘ordre de Bifidobacteriales.
De nos jours cette famille comporte 6 genres: Aeriscardovia, Alloscardovia,
Bifidobacterium, Gardnerella, Parascardovia et Scardovia (Euzéby, 2007).
4.2. Les espèces du genre Bifidobacterium
L‘évolution des techniques utilisées à des fins taxonomiques y compris l‘hybridation
ADN-ADN, a permis jusqu‘à 1992 l‘identification de 29 espèces. La plupart de ces espèces se
distinguent d‘un point de vue physiologique par leur profil fermentaire aux différents sucres
(tableau 5) (Scardovi., 1986).
Page 26
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Tableau 5: Profile fermentaire des différentes espèces de Bifidobacterium (Scardovi, 1986).
Sucres
Espèces
B. bifidum
B. longum
B. longum ssp.
infantis
B. breve
B. adolescentis
B. angulatum
B. catenulatum
B. pseudocatenulatum
B. dentium
B. pseudolongum ssp.
globosum
B. pseudolongum
ssp. pseudolongum
B. cuniculli
B. choerinum
B. animalis
B. thermophilum
B. boum
B. magnum
B. pullorum
B. longum ssp. suis
B. minimum
B. subtile
B. coryneforme
B. asteroides
B. indicum
Xyl
Man
Fruc
Gal
Sucr
Sali
Inul
Malt
Mlb
Treh
V
V
V
+
+
+
V
+
+
+
+
-
+
+
-
-
-
V
+
+
+
+
V
+
V
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
V
V
V
+
-
+
+
+
+
+
+
+
V
V
V
+
-
V
V
+
V
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
-
-
+
V
+
+
+
+
+
+
+
-
V
+
V
+
V
+
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
V
V
V
+
V
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
V
+
+
V
+
V
+
V
+
+
+
-
- : négatif
+ : positif
v : variable
Xyl: Xylose Man : Mannitol Fruc : Fructose Gal : Galactose Sucr: Sucrose Treh: Trehalose Mlb:
Melobiose Malt: Maltose Inul: Inulin Sali: Salicin
Depuis, 1994 trois nouvelles espèces ont été ajoutées à la liste, il s‘agit de
Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium donticolens et Bifidobacterium inopinatum, ce qui fait
de 32 espèces (Kaufmann et al., 1997).
Aujourd‘hui le genre Bifidobacterium compris 48 espèces (tableau 6) (Tsuchida et al.,
2014 ).
Les espèces les plus récemment décrites sont : B. mongoliense, B. stercoris, B. bombi et
B.bohemicum, B. actinocoloniiforme (Killer et al., 2011 ; Kim et al., 2010; Killer et al., 2009 ;
Watanabe et al., 2009).
Page 27
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Tableau 6: Les espèces du genre Bifidobacterium et leur écologie.
Ecology
B. actinocoloniiforme
B. adolescentis
B. angulatum
Digestive tract content of Bombus lucorum
Faeces of human adults;bovine rumen; sewage
Sewage; faeces of human adult
B. animalis
ssp. animalis
Faeces of rats and guinea pigs
ssp. lactis
B. asteroides
Meile et al. (1997);
Masco et al. (2004)
Scardovi & Trovatelli
(1969)
Bottacini et al. (2014)
Killer et al. (2011)
Orla-Jensen (1924)
B. choerinum
B. coryneforme
Intestine of Apis mellifera ssp. caucasica,
ligustica, and mellifera
Tamarind faeces
Digestive tract content of Bombus lucorum
Faeces of human adults,infants, and suckling
calves; human vagina
Digestive tract of bumblebees
Bovine rumen; faeces of piglets
Faeces of infants and suckling calves
Marmoset faeces
Faeces of infants and human adults; human
vagina; sewage
Faeces of piglets; sewage
Intestine of Apis mellifera ssp.mellifera
B. crudilactis
Raw milk cheese
Killer et al. (2009)
Scardovi et al. (1979b)
Reuter (1963)
Bottacini et al. (2014)
Scardovi & Crociani
(1974)
Scardovi et al. (1979b)
Scardovi & Trovatelli
(1969)
Biavati et al. (1982)
Bottacini et al. (2014)
B. cuniculi
Faeces of rabbits
Scardovi et al. (1979b)
B. dentium
Human dental caries and oral cavity, faeces of
human adults; human vagina; abscesses and
appendices
Human faeces
Chicken caecum
Intestine of Apis cerana and A. dorsata
Scardovi & Crociani
(1974)
B. biavatii
B. bohemicum
B. bifidum
B. bombi
B. boum
B. breve
B. callitrichos
B. catenulatum
Species
Faeces of chickens and rabbits, fermented milk
and sewage
References
Killer et al. (2011)
Reuter (1963)
Scardovi & Crociani
(1974)
Scardovi & Trovatelli
(1974)
Masco et al.(2004)
B. gallicum
B. gallinarum
B. indicum
B. kashiwanohense
Infant faeces
B. longum
ssp.longum
Faeces of human adults, infants, and suckling
calves, human vagina,sewage
ssp.infantis
ssp.suis
Faeces of infants and suckling calves, human
vagina
Faeces of piglets
B. magnum
B. merycicum
Faeces of rabbits
Bovine rumen
B. minimum
B. mongoliense
B. moukalabense
B. pseudocatenulatum
B. pseudolongum
ssp. pseudolongum
Sewage, pig caecum
ermented milk (airag)
Gorilla faeces
Faeces of infants and suckling calves, sewage
Faeces of bulls, calves, chickens, dogs, guinea
pigs, pigs and rats
Lauer (1990)
Watabe et al. (1983)
Scardovi & Trovatelli
(1969)
Bottacini et al. (2014)
Reuter (1963);
Mattarelli et al. (2008)
Reuter (1963);
Mattarelli et al. (2008)
Matteuzzi et al.(1971);
Mattarelli et al. (2008)
Scardovi & Zani (1974)
Biavati & Mattarelli
(1991)
Biavati et al. (1982)
Watanabe et al. (2009)
Bottacini et al. (2014)
Scardovi et al. (1979b)
Mitsuoka (1969)
Yaeshima et al. (1992
Page 28
CHAPITRE I
Etude bibliographique
ssp. globosum
Faeces of lambs, piglets,rabbits, rats and suckling
calves, bovine rumen, sewage
B. psychraerophilum
B. pullorum
B. reuteri
B. ruminantium
Pig caecum (content and epithelium)
Faeces of chickens
Marmoset faeces
Bovine rumen
B. saeculare
B. sanguini
B. scardovii
B. stellenboschense
B. stercoris
B. subtile
B. thermacidophilum
ssp thermacidophilum
ssp. porcinum
B. thermophilum
Faeces of rabbit
Tamarind faeces
Human blood
Tamarind faeces
Human faeces
Sewage, human carious lesions
Waste water, pig faeces
Piglet faeces
B. tsurumiense
Faeces of chickens, pigs, and suckling calves;
bovine rumen; sewage
Hamster dental plaque
Scardovi et al. (1969)
Biavati et al. (1982)
Yaeshima et al. (1992)
Simpson et al. (2004)
Trovatelli et al. (1974)
Bottacini et al. (2014)
Biavati &
Mattarelli(1991)
Biavati et al. (1991)
Bottacini et al. (2014)
Hoyles et al. (2002)
Bottacini et al. (2014)
Kim et al. (2010)
Biavati et al. (1982)
Dong et al. (2000)
Zhu et al. (2003)
Mitsuoka (1969)
Okamoto et al. (2008)
4.3. Ecologie des bifidobactéries
Les bifidobactéries ont été isolées à partir de trois niches écologiques: l' organisme
humain, l'organisme animal et l'environnement.
Chez les humains, les bifidobactéries se retrouvent majoritairement dans l' intestin
(la partie distale de l'iléon et le colon). Cependant, ces microorganismes ont été identifiés
dans le vagin et la cavité buccale.
La composition de la flore dominante chez l'humain change au cours des
différents stades de vie. Chez un jeune enfant nourri au lait maternel, la flore
intestinale est composée de 85-99 % de bifidobactéries et les principales espèces retrouvées
sont Bifidobacterium infantis et Bifidobacterium bifidum (Rasic et Kurmann, 1983).
La flore des enfants sevrés représente une transition entre la flore infantile et la flore
adulte. Plusieurs espèces telles que les bactéroïdes, et les clostridies apparaissent dans la
flore fécale. Les bifidobactéries deviennent moins prédominantes (Rasic et Kurmann, 1983).
La flore adulte devient plus complexe et la flore dominante est composée de
bactéroïdes. Bien que les bifidobactéries ne soient plus prédominantes, elles demeurent
un des groupes les plus importants de la flore intestinale.
Les espèces de bifidobactéries les plus retrouvées chez l'adulte sont Bifidobacterium
adolescentis et Bifidobacterium longum (Tamime et al., 1995).
Dans le règne animal, la présence des bifidobactéries a été constatée
majoritairement dans le tube digestif des mammifères (Mitsuoka et Kaneuchi, 1977).
Page 29
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Cinq espèces de Bifidobacterium ont été détectées chez la volaille (B. animalis,
B. galinarum, B. pseudolongum, B. pullorum et B. thermophilum) ( Yaeshima et al., 1992 ;
Watabe et al., 1983 Mistuoka et al., 1969).
Scardovi et Trovatelli (1969) et Biavatti et collaborateurs (1982) ont identifié trois
espèces de Bifidobacterium, B. asteroides, B. coryneforme et B. indicum chez les abeilles
(Biavati et al., 1982 ; Sardovi et Trovatelli, 1969).
Trois espèces de bifidobactéries ont été isolées à partir des eaux usées: B. minimum,
B.subtile et B. thermacidophilum (Dong et al.,2000 ; Biavati et al., 1982).
4.4. Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques des bifidobactéries
4.4.1. Morphologie
Les bifidobactéries sont en forme de bâtonnet à morphologie variable, généralement un
peu courbées et plissées, parfois ramifiées. Des souches fraichement isolées peuvent avoir des
formes allant d‘uniformes à ramifiées, en forme de Y ou de V voire en forme de spatule.
Cependant, sur des milieux défavorables notamment en cas d‘une déficience en
N-acétylhexosamines (N-acétylglucosamine et N-acétylgalactosamine) qui sont
indispensables pour la synthèse de la paroi cellulaire., les bifidobactéries présentent des
ramifications et un pléomorphisme, bien qu‘elles soient sous forme de bâtonnet dans leur
habitat naturel (Bruno 2012).
La paroi des bifidobactéries a une structure typique des Gram-positive, constituée d‘une
enveloppe fine de peptidoglycanes contenant des polysaccharides, des protéines et des acides
téichoïques (Gomes and Malcata, 1999). La composition en acides aminées des tétra peptides
des peptidoglycanes peut différer entre les espèces, et également entre les souches ; elle peut
ainsi être utilisée pour leur différentiation (Lauer and Kandler, 1983).
4.4.2. Physiologies des bifidobactéries
Température
Les souches de Bifidobacterium implantées chez l‘Homme présentent un optimum
de croissance pour des valeurs de température comprises entre 36 et 38°C, alors que
pour les souches d‘origine animale, ce palier est plus élevé et peut atteindre 46,5°C ( Iuliana
2004).
L‘espèce B. thermacidophilum pousse à une température plus élevée égale 49.5ºC
(Dong et al., 2000). En dessous de 20°C leur croissance n‘est plus détectable, à l‘exception de
l‘éspèce B.psychroaerophilum qui peut croitre à des basses température allant jusqu‘ à 8ºC
((Hadadji et al., 2005 ; Simpson et al., 2003).
Page 30
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Oxygène
Les bifidobactéries sont décrites comme étant strictement anaérobies, bien que certaines
souches tolèrent l‘oxygène (Simpson et al., 2005). La sensibilité à l‘oxygène peut différer
cependant entre les espèces mais également entre les souches d‘une même espèce (Talwalkar
and Kailasapathy, 2003).
Les espèces qui tolèrent l‘oxygène présentent une faible activité catalytique qui
élimine les traces du super oxyde d‘hydrogène formées (H2O2) ou par le fait que le
NADH oxydase de ces souches ne forme pas de H2O2, alors l‘accumulation d‘H2O2
inhibe l‘activité de F6PPK.
Pour les souches extrêmement sensibles à l‘oxygène, n‘accumulent pas l‘H2O2 et
l‘oxygène bloque la multiplication bactérienne par l‘intermédiaire d‘un potentiel d‘oxydoréduction trop élevé (Ventura et al., 2004; Romond et al., 1992; Scardovi, 1986).
pH
Les bifidobactéries ont un optimum de croissance compris entre pH 6,5 et 7 (Hadadji et
al., 2005). Les souches de Bifidobacterium lactis et Bifidobacterium animalis peuvent survire
à pH 3,5, tandis que les bifidobactéries dans un environnement supérieur à pH 8,5 ne
survivent pas (Matsumoto et al. , 2004 ; Biavati et al. , 2000).
La production maximale d‘acide lactique et acétique chez les bifidobactéries exige
un pH optimal initial proche de la neutralité qui varie entre 6-7( Scardovi , 1986 ; Collins et
Hall, 1984).
Effets des sels biliaires
Les bifidobactéries possèdent une enzyme, la cholyglycine hydrolase qui hydrolyse les
sels biliaires (glyco- ou taurocholates) en acides aminés (glycine et taurine) et acides
biliaires (acide cholique et acide chénodéoxycholique) (Tanaka et al. 2000). Les produits
obtenus après déconjugaison des sels biliaires constituent une source de nutriments (les
acides aminés) et d' énergie (fournie par la déshydroxylation des acides biliaires) pour
ces microorganismes.
Sensibilité aux antibiotiques
Les bifidobactéries sont généralement sensibles aux antibiotiques du spectre Gram
positif (macrolides, bacitracine, érythromycine, lincomicine, novobicine et vancomycine )
aussi aux beta-lactamines( pénicilline, ampicicilline, amoxicilline, piperacilline et
ticarcilline) (Ammor et al., 2007 ; Masco et al., 2006 ; Hadadji et al., 2005 ; Delagdo et
al.,2005 ).
La sensibilité des bifidobactéries au tétracycline est variables selon les espèces
(Ammor et al., 2007; Masco et al., 2006 ; Delagdo et al.,2005).
Beaucoup d‘espèces des bifidobactéries sont résistantes aux antibiotiques du spectre
Gram négatif (acide fusidique, acide nalidixique et polymixine) et les aminoglycosides
Page 31
CHAPITRE I
Etude bibliographique
(néomycine, gentamicine, kanamycine et streptomycine) ( Ammor et al., 2007 ;Masco et
al., 2006 ; Moubarek et al., 2005).
Besoins nutritionnels des bifidobactéries
En générale les bifidobactéries sont capables d‘utiliser les sels d‘ammonium
comme seul source d‘azote par contre d‘autres espèces comme B. magnum, B. cuniculi
et B. choerinum exigent la présence d‘azote organique (Hassinen et al., 1951).
L‘activité des enzymes comme le glutamate déshydrogénase et le glutamine
synthétase
permet l‘assimilation d‘ammonium. Ces deux enzymes sont isolés et
caractérisé à partir de B.breve , B. pseudolongum et B. bifidum (Ballongue,1993). Aussi
la croissance des bifidobactéries est stimulée par la présence d‘ions, vitamines et par
d‘autres facteurs qui sont métabolisés par l‘hôte ou par les microorganismes du tractus
gastro-intestinale comme la thréonine, extrait de levure, cystéine, dextrine, maltose et
β-glycerolphosphate et les facteurs bifidogènes qui sont des substances qui se trouve
dans le laits maternel ces facteurs incluent N- acetyl glucosamine, fructooligosaccharides, lactoferrine, lactulose, lactitol, oligoholosides et les polyholosides (Modler
et al. , 1994).
4.4.3. Biochimie des bifidobactéries
Métabolisme des carbohydrates
La majorité des bifidobactéries utilisent le lactose, le glucose le sucrose, le galactose
comme source de carbone (Hadadji 2007).
Les hexoses sont dégradés par une voie métabolique particulière, la voie de la fructose6-phosphate phosphoketolase (F6PPK) ou «bifid shunt ». Il existe également une voie
partielle de la glycolyse ainsi qu‘une voie partielle du cycle d‘acide tricarboxylique (cycle de
Krebs ; les gènes codant pour la fumarase, l‘oxoglutarate déshydrogénase et la malate
déshydrogénase étant absents). Des différences existent entre les espèces dans leur capacité à
fermenter d‘autres glucides ou des alcools.
La fermentation de deux moles de glucose produit approximativement trois moles d'acide
acétique, deux moles d'acide lactique et 2,5 moles d'ATP. L'enzyme clé de cette voie
métabolique, la F6PPK, est considérée comme un identifiant taxinomique pour la famille des
Bifidobacteriaceae (Felis and Dellaglio, 2007; Ventura et al., 2004).
Il est important de souligner que l'acide lactique produit par les bifidobactéries est de
type L(+) (Sébald et al., 1965; Rasic et Kurmann,1983). Ce métabolite est caractéristique du
genre. En effet, les lactobacilles produisent des formes D(-) ou DL qui ne sont que très
lentement dégradées par le nourrisson et peuvent par conséquent entraîne des troubles tels
que: acidose, formation de méthémoglobine, voire des perturbations neurologiques. Ces
raisons font que le yaourt traditionnel est déconseillé chez le nouveau-né. Par contre, la forme
L(+) est totalement assimilée et métabolisée. Les laits fermentés avec une souche de
Page 32
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Bifidobacterium apparaissent donc mieux adaptés chez le jeune enfant (Rasic et Kurmann,
1983).
Figure 9: Métabolisme général des bifidobactéries. D‘après Lee et O'Sullivan (2010).
ABC : ATP-binding cassette systems ; GPH : glycoside–pentoside–hexuronide cation symporter family ; MIP :
major intrinsic protein ; MSF : major facilitator superfamily ; PTS : sugar phosphotransferase systems
Métabolisme des vitamines
Les bifidobactéries sont capables de produire des vitamines tels que thiamine (B1),
l‘acide folique (B9) et l‘acide nicotinique (Tamura 1983 ; Deguchi et al., 1985).
Les espèces B. breve et B. infantis excrètent un taux trop élevé de l‘acide
nicotinique et le biotine, de même B. bifidum et B. infantis possèdent une bonne
production des vitamines B1 et B9 (Tamura ,1983).
Production des substances antimicrobiennes
Malgré la grande utilisation des bifidobactéries dans la production des aliments
fonctionnels les études sur leur pouvoir antimicrobien est un peu restreint (Ventura et
al.,2004).
Page 33
CHAPITRE I
Etude bibliographique
L‘activité antimicrobienne du genre Bifidobacterium a été détectée en premier lieu
par Tissier (1900), il a étudié l‘effet antagoniste de B. bifidum contre E. coli. D‘autres
études décrivent l‘activité antagoniste ou l‘activité antimicrobienne spécifique des
bifidobactéries liée à la production des acides lactique et acétique (Bruno and Shah,
2002), ou à la production des bactériocines (Cheikhyoussef et al., 2010 ; Cheikhyoussef
et al. , 2008 ; Cheikhyoussef et al., 2007 ; Abd El-Salam et al ., 2004 ; Bevilacqua et
al., 2003).
Quelques exemples de bactériocines synthétisées par les bifidobactéries sont résumés
dans le tableau suivant :
Tableau 7: Exemples de bactériocines synthétisées par les souches de bifidobactéries et leurs
principales caractéristiques. D‘après Martinez et al. (2013).
Bacteriocin
Species and
strain
Inhibitory spectrum
Reference
Bifidin
B. bifidum
NCDC 1452
B. bifidum
NCFB 1454
Gram-positive and Gram-negative
bacteria
Bacillus cereus, Enterococcus faecalis,
Listeria monocytogenes, Pediococcus
acidolactici, Streptococcus faecalis, etc.
Gram-positive and Gram-negative
bacteria
Staphylococcus aureus, Salmonella
typhimurium, Bacillus cereus, E. coli
Staphylococcus aureus, Salmonella
typhimurium, Bacillus cereus, E. coli
Listeria sp., Lactobacillus acidophilus
Anand et al.
(1984, 1985)
Yildirim and Johnson
(1998);Yildirim et al.
(1999)
Kang et al. (1989)
LAB strains, Staphylococcus, Bacillus,
Streptococcus, Salmonella, Shigella, E. coli.
Streptococcus thermophilusST403,
Clostridium perfringens, Staphylococcus
epidermidis,Bacillus subtilis, Serratia
marcescens, E. coliDH5a.
Cheikhyoussef et al.
(2010)
Bifidocin B
Bifilong
B. longum
Bifilact Bb-46
B. longum
Bb-46
B. lactisBb-12
Bifilact Bb-12
Thermophilicin
B67
Bifidin I
Lantibiotic
(Bisin)
B. thermophilum
RBL67
B. infantis BCRC
14602
B. longum
DJO10A
Saleh and El-Sayed
(2004)
Saleh and El-Sayed
(2004)
Von Ah, (2006)
Lee et al. (2011)
4.5. Génétique des bifidobactéries
4.5.1. Le chromosome bactérien
Le chromosome des bifidobactéries mesure en moyenne 2 Mb. La taille exacte a été
déterminée pour deux espèces: 2,1 Mb pour B.breve CIP6469 (Bourget et al., 1993) et 2,26
Mb pour B. longum NCC2705 (Schell et al., 2002).
Les bifidobactéries ont un pourcentage en base G+C plus élevé que la plupart des
autres espèces bactériennes ,ce taux est en générale supérieur à 55% (Delcenserie et al.,
2002). Cette caractéristique constitue un critère taxonomique dans la différenciation des
bifidobactéries des espèces à Gram positif et surtout du genre Lactobacillus dont le
pourcentage en G+C est inférieur à 50% (Gasser et Mandel, 1968).
Page 34
CHAPITRE I
Etude bibliographique
4.5.2. Les plasmides
Les plasmides ne sont ubiquitaires chez les bifidobactéries et lorsque sont présents soient
de petite taille (1000 à 1500pb), leur présence chez une éspèce donnée est plutôt considérée
comme facteur de caractérisation que d‘identification de cette éspèce (Mattarelli et Biavati
,2014).
La présence des plasmides a été détectée chez huit espèces et sous-espèces de
Bifidobacterium, à savoir B. bifidum, B.breve, B. catenulatum, B. longum ssp. longum
B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum ssp. globosum, B. asteroides et B. indicum (Ventura
et al., 2007) Ils peuvent encoder pour des bactériocines comme bifidocin B chez B. bifidum
(Yildirim et al., 1999).
4.5.3. Identification génotypique des bifidobactéries
a. Au niveau du genre
Analyse de séquence de l'ARNr 16S
Ce gène est très bien conservé, jusqu‘à 99% dans le genre Bifidobacterium (Hadadji,
2007).
La PCR (plymerase chain reaction) peut être utilisée pour amplifier le gène de l'ARNr
16S, en utilisant des amorces dirigées vers des régions universellement conservées aux deux
extrémités du gène. La séquence résultante de l‘amplification par PCR peut être ensuite
comparée à une base de données (Mattarelli et Biavati ,2014).
Teneur en G + C de l'ADN
La teneur en G + C de l'ADN est un caractère taxonomique très important, les
bifidobactéries ont généralement des pourcentages en G+C assez élevés (55 à 67%), toutefois
certaines espèces récemment décrites ont des pourcentages en G+C plus faibles (B.bombi à
50.5%, B. actinocoloniiforme à 52.7%, B. bohemicum à 51.2% , B. tsurumiense à 53%)
(Mattarelli et Biavati ,2014).
b. Au niveau de l’espèce
Réassociation ADN-ADN
La DDR (DNA-DNA reassociation) a été appliqués à des bifidobactéries pour la
première fois par Scardovi et al. (1970). Lorsque le pourcentage d'homologie est supérieure à
70% entre les souches isolées et la souche de référence, ainsi que les critères phénotypiques
sont d'accord avec la définition des espèces, ces souches peuvent être regroupées dans la
même espèce, mais cette technique doit être associée avec au moins une autre téchnique
génétique pour classer une souche étudiée dans une espèce donnée (Mattarelli et Biavati
,2014).
Page 35
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Séquençage du génome entier
Le génome des bifidobactéries varie entre 1,9 et 2,9 Mb de taille et joue un rôle
taxonomique très important. Parmi les 48 espèces du genre Bifidobacterium actuellement
reconnues, 05 espèces sont totalement séquencée au niveau du génome (B. adolescentis, B.
longum ssp. longum, B. longum ssp. infantis, B. dentium, et B. animalis ssp. lactis)
(Mattarelli et Biavati, 2014).
Analyse de séquence de l'ARNr 16S
L‘analyse du gène codant pour l‘ARN ribosomal 16S est un moyen utile pour identifier
des relations phylogéniques entre les espèces (Mangin et al., 1999). En se basant sur l‘analyse
de ce gène ; les bifidobactéries sont classées en six principaux groupes : B. boum, B.
asteroides, B. adolescentis, B. pullorum, B. longum et B. pseudolongum (Bottacini et al.,
2014).
Les espèces du genre Bifidobacterium montrent en général plus de 90% de similarité des
séquences d'ARNr 16S, les espèces très proches peuvent montrer plus de 99% de similarité.
Page 36
CHAPITRE I
Etude bibliographique
Figure 10: Arbre phylogénétique des bifidobactéries obtenue par l‘analyse du gène codant
pour L‘ARN ribosomal 16S (Bottacini et al., 2014).
Etude du gène codant pour la protéine Hsp60
Pour étudier la taxonomie du genre Bifidobacterium Jian et al, 2001 ont déterminés la
séquence partielle du gène codant pour la protéine de choc thermique de 60 KDa (Hsp60) de
30 espèces de Bifidobactéries. Il a été démontré un degré similitude de séquence très élevé
dans une même espèce (99,4 à 100%), et 85% entre les différentes espèces du même genre.
La classification basée sur le gène codant pour la protéine Hsp60 semble être la meilleure car
le dendrogramme obtenu est mieux corrélé avec le contenu en G+C (Delcenserie et al.,
2002).
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CHAPITRE II
Matériel et méthodes
Cette étude a été réalisée dans le Laboratoire de Microbiologie Appliquée
(LMA), Département de Biologie, Faculté des Sciences de la Nature
et de la Vie, Université d‘Oran1 Ahmed Benbella
1. Provenance des souches
1.1. Les souches industrielles
La souche BN, isolée à partir du lait fermenté probiotique (Danone Activia), contenant
des bifidobactéries, produit et commercialisé en Algérie.
La souche Bifidobacterium animalis ssp. lactis (BB12), fournie par la laitière " Hodna" de
la Wilaya de M'sila, Algérie.
1.2. Les souches indigènes
Les souches L1, L2, R1 et R2 proviennent de la collection du laboratoire de microbiologie
appliquée (LMA), université d‘Oran1 Ahmed Benbella, où elles ont été isolées à partir des
selles de bébés en bonne santé, ne recevant pas de traitement antibiotique, nourris
exclusivement au sein.
1.3. Les souches pathogènes
La souche Escherichia coli ATCC 25922 provient du laboratoire de microbiologie de
département de biologie université se M'sila, Algérie.
Les souches Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Listeria innocua ATCC 33090
appartiennent à la collection du laboratoire de microbiologie appliquée université d'Oran1
Ahmed Benbella, Algérie.
2. Milieux de culture
2.1. Milieu de culture pour les bifidobactéries
L'isolement des bifidobactéries est une étape minutieuse, il nécessite des conditions assez
spécifiques, qui mettent en jeu des systèmes d‘anaérobiose comme les anaerocults ou les gaspacks et des milieux très riches additionnés d‘un agent réducteur la cystéine-chlorhydrique
(Scardovi, 1986).
L‘isolement des bifidobactéries à partir du lait fermenté (Danone Activia) a été réalisé
sur le milieu MRS (De Man et al., 1960) additionné de 0,05 % cystéine-chlorhydrique et un
agent sélectif l‘acide nalidixique 2mg/l (annexe).
2.2. Milieux de culture pour les souches pathogènes
La culture des souches pathogènes est réalisée sur la gélose nutritive et pour les
interactions nous avons utilisé le milieu Mueller- Hinton (Mueller et Hinton, 1941) (annexe).
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CHAPITRE II
Matériel et méthodes
3. Isolement et purification des bifidobactéries
A partir du lait fermenté
L‘isolement à partir du lait fermenté a été réalisé sur milieu MRS additionné de 0.05%
cystéine chlorhydrique et de 2mg/l d‘acide nalidixique. Nous avons pris un gramme du lait
fermenté, mis dans un tube contenant 9ml de solution saline (0.9% de NaCl et 0.2% de
cystéine chlorhydrique). Après homogénéisation de la suspension pendant 2 min , 0,1ml des
différents dilutions (10-4, 10-5, 10-6) ont été ensemencés sur milieu MRS additionné de 0.05%
cystéine chlorhydrique et de 2mg/l d‘acide nalidixique .Trois boites de chaque dilution sont
incubées dans une jarre d‘anaérobiose avec des gas-pack capable de produire du H2 et du CO2
pendant 72 h à 37°C (Frank et al., 1993; Beerns, 1990 ) (figure 11).
Figure 11: Protocole d‘isolement des bifidobactéries à partir du lait fermenté.
Page 39
CHAPITRE II
Matériel et méthodes
4. Pré identification des bifidobactéries
Après la purification par repiquage successif dans le milieu sélectif (milieu MRS
additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique), à partir des
boites contenant des colonies bactériennes, nous avons effectué les démarches suivantes :
4.1. Etude macroscopique
Cette étude consiste à noter l‘aspect des colonies bactériennes obtenues après
purification (contour, couleur, viscosité).
4.2. Etude microscopique
Après l‘examen macroscopique des colonies sur gélose (MRS additionné de
0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique), les isolats ont été soumis à la
coloration de Gram (Larpent et Larpent, 1990), puis à l‘observation microscopique.
5. Identification du genre
5.1. Recherche de la catalase (Marchal et al., 1991)
Le test consiste à déposer sur une lame une goutte d‘eau oxygénée à 10 volumes et à y
dissocier directement un peu de la culture prélevée sur milieu solide.
L‘apparition d‘un dégagement gazeux témoigne de la présence de la catalase dans le
métabolisme bactérien.
5.2. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose
Les souches sont repiquées sur milieu MRS additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique
et de 2 mg/l d‘acide nalidixique) liquide contenant une cloche de Durham. L'incubation
s'effectue en anaérobiose à 37°C pendant 24 h (Garvie, 1984).
La présence du gaz dans la cloche indique que la souche a un caractère fermentaire avec
production de CO2.
5.3. Recherche de citrate perméase sur milieu Kempler et Mc Kay 1980
Ce test permet de mettre en évidence la citrate perméase. Les souches sont ensemencées
sur boite de Pétri contenant le milieu KMK par la méthode des stries et incubées à 37 C°
pendant 24h en anaérobiose. Le résultat positif se traduit par l‘apparition des colonies
bactériennes de couleur bleue et le résultat négatif se traduit par l‘apparition des colonies
blanches.
5.4. Mise en évidence de l’uréase
Une suspension dense de chaque souche est ensemencée dans un tube contenant 0,5 ml
de milieu urée indole. Après incubation à 37°C pendant 24 h,
La présence de l‘uréase se traduit par un virage de l‘indicateur du jaune au rouge.
Page 40
CHAPITRE II
Matériel et méthodes
5.5. Mise en évidence de la production d’indole
Les souches sont ensemencées sur milieu urée-indole. Après 24 h d‘incubation quelques
gouttes de réactif Kovacs (mélange de para-diméthyl-aminobenzaldehyde et d‘alcool
amylique plus de l‘HCl pure) sont ajoutées.
La réaction positive se traduit par l'apparition d'un anneau rouge en surface.
5.6. Protéolyse de la gélatine
Les souches sont ensemencées par piqûre centrale dans des tubes de milieu gélatine, puis
laissés à la température ambiante du laboratoire (25°C).
La liquéfaction de la gélatine indique que les souches sont gélatinase positive
L‘absence de tout changement permet de conclure que les souches sont gélatinase
négative.
6. Caractérisation des espèces
Les bifidobactéries sont identifiées au niveau de l‘espèce, en déterminant leur profil
fermentaire (Scardovi, 1986). Plusieurs colonies isolées d‘une culture pure ont été repiquées
dans 5ml de milieu (MRS additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide
nalidixique) liquide, incubé à 37°C pendant 24 h.
Après incubation, 4ml de la culture sont centrifugés à 4000 g pendant 10 mn et lavés
deux fois avec de l‘eau physiologique (à 0,05 % de cysteine-HCl).
Le surnageant est éliminé et le culot est suspendues dans 1ml d‘eau physiologique
cystéinée.
Cette suspension sert à inoculer le milieu (MRS additionné de 0.05%cystéine
chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique) liquide, dépourvue de sucre et d'extrait de
viande, additionné de 40mg /l de pourpre de bromocrésol (BCP) comme indicateur de pH et
supplémenté de 2 % des sucres suivants: arabinose, amidon céllobiose, fructose, galactose,
lactose, lévulose, maltose, mannitol, raffinose, rhamnose, ribose, sorbitol, tréhalose, xylose.
Les préparations sont recouvertes de 1 ml de l‘huile de paraffine stérile pour obtenir
l‘anaérobiose. L'incubation s‘effectue à 37°C pendant 48 h.
La fermentation d‘un sucre donné par la souche bactérienne testée se traduit par la
formation d‘acide qui se manifeste par le virage de la coloration rouge en jaune.
7. Conservation des Souches
Les souches sont cultivées sur milieu MRS additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et
de 2 mg/l d‘acide nalidixique gélosé inclinés à 37°C pendant 48h.
Ensuite les tubes sont conservés à 4°C. Les cultures sont repiquées toutes les deux
semaines (Scardovi, 1986).
Pour une conservation à long terme les souches sont conservées à –20°C dans du lait
écrémé contenant 30 % de glycérol, 0,1 % d‘extrait de levure et 0,05 % de cysteine-HCl
(Saidi et al ; 2002, Franck et al., 1993).
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CHAPITRE II
Matériel et méthodes
8. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de
bifidobactéries
Avant chaque expérience les cultures sont rajeunies par incubation dans un bouillon
MRS (additionné de 0.05% de cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique) à
37°C pendant 24 h en anaérobiose pour obtenir des cultures en fin de la phase exponentielle.
En effet, d‘après la littérature scientifique, 18 à 20 h d‘incubation sont nécessaires pour
atteindre la fin de la phase exponentielle, indiquée par l‘apparition des troubles dans le
bouillon qui témoigne de la présence d‘une biomasse bactérienne.
8.1. Mise en évidence des propriétés technologiques
L‘objectif de cette partie de l‘étude est d‘évaluer le comportement des souches étudiées
envers les conditions rencontrées au cours de la fabrication et le l‘entreposage de produit.
8.1.1. Croissance en présence de l’oxygène
Réalisation du test
Des tubes contenant 10 ml de bouillon MRS sans cystéine (agent réducteur) sont inoculés
avec 5% v/v de la culture jeune de chacune des souches étudiées (en général, le taux
d‘inoculation dans l‘industrie laitière varie entre 2 et 7%), les tubes sont incubés à 37°C en
aérobiose pendant 8h (selon Lamoureux (2000), au niveau industriel, une fermentation de 2 à
6 heures à des est généralement suffisante pour obtenir un lait coagulé) .
Des tubes contenant 10 ml de bouillon MRS additionné de 0.05% de cystéine
chlorhydrique, inoculé avec 5% v/v de la culture jeune de chacune des souches étudiées et
incubés à 37°C en anaérobiose sont utilisés comme témoins.
Détermination de la cinétique de croissance
Nous avons procédé à la préparation d‘une série de dilutions décimales jusqu‘à 10-5 à
partir de chacun des tubes contenant les souches étudiées (0h, 4h et 8h), en mettant 1 ml de
chaque tube dans des tubes contenant 9 ml d‘une solution saline (0,9 % de NaCl) et 0,2% de
la cysteine chlorhydrique. Une aliquote de 0,1 ml de la dernière dilution (10-5) est
ensemencée en masse dans une gélose MRS (additionnée de 0.05% de cystéine chlorhydrique
et de 2 mg/l d‘acide nalidixique). Après incubation à 37°C pendant 48h en anaérobiose, la
quantité de biomasse bactérienne (log UFC/ml) est déterminée et les vitesses spécifiques
maximales de croissance (µmax) de chaque souche en présence et en absence de l‘oxygène sont
calculées.
Page 42
CHAPITRE II
Matériel et méthodes
8.1.2. Croissance en 43°C
Réalisation du test
Des tubes contenant 10 ml de bouillon MRS (additionnée de 0.05% de cystéine
chlorhydrique) sont inoculés avec 5% v/v de la de la culture jeune de chacune des souches
étudiées, l‘incubation se fait à 43°C en anaérobiose pendant 8h.
Des tubes contenant 10 ml de bouillon MRS additionné de 0.05% de cystéine
chlorhydrique, inoculé avec 5% v/v de la culture jeune de chacune des souches étudiées et
incubés à 37°C en anaérobiose sont utilisés comme témoins.
Détermination de la cinétique de croissance
Le protocole de détermination de la cinétique de croissance est le même que celui décrit
dans le test précédent (tolérance à l‘oxygène). , la quantité de biomasse bactérienne (Log
UFC/ml) est déterminée et les vitesses spécifiques maximales de croissance (µmax) de chaque
souche sont calculées.
8.1.3. Viabilité pendant l’entreposage à 4°C
Préparation du lait fermenté
Des tubes de 10 ml de lait écrémé stérile sont inoculés avec 5% v/v de la culture
jeune de chacune des souches étudiées, conformément au protocole d‘inoculation utilisé en
industrie (en général, le taux d‘inoculation varie de 2 à 7%). Après 8h d‘incubation à 37°C
en anaérobiose, le lait fermenté est transféré à l‘entreposage à 4°C et conservé à cette
température pour une durée totale de 21 jours. L‘évaluation de la viabilité est effectuée juste
après la fin de la période d‘incubation (nombre initial de cellules) et ensuite à 7 jours
d‘intervalle de stockage frigorifique (après 7, 14 et 21 jours de stockage à 4 °C) (Georgieva
et al., 2009). L‘expérience est indépendamment répétée trois fois.
Dénombrement des cellules viables
Nous avons procédé à la préparation d‘une série de dilutions décimales jusqu‘à 10-5 à
partir de chacun des tubes contenant le lait fermenté par les souches étudiées (0j, 7j et 21j),
en mettant 1ml de chaque tube dans des tubes contenant 9 ml d‘une solution saline (0,9 % de
NaCl) et 0,2% de la cysteine chlorhydrique. Une aliquote de 0,1 ml de la dernière dilution
(10-5) est ensemencée en masse dans une gélose MRS (additionnée de 0.05% de cystéine
chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique). Après incubation à 37°C pendant 48h en
anaérobioses, la quantité de biomasse bactérienne (log UFC/ml) est déterminée.
La viabilité est calculée selon l‘équation donnée par Ustunol et Gandhi, (2001)
Viabilité (%) ═ (UFC après n jour (s) de stockage / UFC initial) × 100
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CHAPITRE II
Matériel et méthodes
8.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C
La post-acidification du lait fermenté par chacune des souches étudiées entreposé à
4°C est suivie par la mesure du pH pendant 21 jours de stockage frigorifique à 4°C.
L‘expérience est indépendamment répétée trois fois.
8.1.5. Influence des arômes sur la viabilité
Réalisation du test
Les arômes utilisés sont : la banane 0,2 % v/v et la vanille 0,2 % v/v. Les concentrations
choisies pour cette étude correspondent à celles utilisées dans l'industrie laitière algérienne.
L‘effet des arômes sur la viabilité des souches est déterminé dans un bouillon MRS
(additionnée de 0.05% de cystéine chlorhydrique) 5% v/v de chaque souche est inoculé
dans des tubes tests contenant 5 ml de milieu de culture en plus des arômes avec les
concentrations mentionnées. Des tubes témoins contenant les cultures microbiennes sans
arôme sont préparés. Après incubation à 37°C en anaérobiose pendant 8h, les tubes sont
transférés à l‘entreposage frigorifique à 4°C pendant 21j. L‘évaluation de la viabilité est
effectuée juste avant la mise au réfrigérateur (nombre initial de cellules) et ensuite à 7 jours
d‘intervalle de stockage frigorifique (après 7, 14 et 21 jours).
Dénombrement des cellules viables
Le protocole appliqué pour le dénombrement des cellules viables est le même utilisé dans
le test précédent (Viabilité pendant l‘entreposage à 4°C).
8.1.6. Cinétique de croissance et d’acidification dans milieu lait
Préparation du lait fermenté
Les tubes contenant 10 ml de lait écrémé stérile sont ensemencés par les différentes
souches de Bifidobacterium étudiées à la concentration de 2% chacune, puis incubés à 37°C
en anaérobiose. Un échantillon est recueilli avant le démarrage (0 h), puis à chaque 4h
d‘intervalle pendant la fermentation pour la mesure du pH, l‘acidité titrable et la cinétique de
croissance au temps 0 h, 4h, 8h… jusqu'à 48h d‘incubation.
L‘expérience est indépendamment répétée trois fois.
Etude de la cinétique de croissance
La cinétique de croissance des souches de bifidobactéries étudiées a été réalisée par un
dénombrement sur milieu MRS (additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l
d‘acide nalidixique) solide, au temps 0 h, 4h, 8h… jusqu'à 48h d‘incubation.
Suivi du pH au cours de la croissance
L‘acidité développée dans le lait est suivi par la mesure de pH à l‘aide d‘un pH mètre
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CHAPITRE II
Matériel et méthodes
Détermination de l’acidité titrable
Le dosage de l‘acidité au cours de la croissance dans le lait est effectué selon la méthode
décrite par (Accolas et al., 1977), en utilisant le NaOH (N/9) en présence de l‘indicateur
Phénolphtaléine (à 1 % dans l‘alcool).
A partir des tubes incubés contenant les cultures en lait, le contenu d‘un tube est versé
dans un bêcher dans lequel sont ajoutées 5 gouttes de phénolphtaléine. Le titrage s'effectue à
l‘aide d‘une burette avec de la soude dornic sous agitation. On considère que le virage est
atteint, quand la couleur blanche du lait vire au rose pâle et persiste pendant une dizaine de
secondes.
Les résultats sont exprimés en degré Dornic selon la formule suivante :
Acidité (°D)= V NaOH x10
Sachant que 1°D = 0.1g d‘acide lactique par 1 litre de lait (Guiraud, 1998).
Figure 12: Dispositif utilisé pour la mesure de l‘acidité titrable.
8.1.7. Activité protéolytique
Pour mettre en évidence l‘activité protéolytique des souches étudiées ces dernières sont
ensemencées par touche sur milieu MRS (additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2
mg/l d‘acide nalidixique) solide, à différentes concentrations de lait écrémé (1% et 2%).
Après incubation de 24h à 37°C en anaérobiose, les diamètres des halos clairs apparus
autour de chaque colonie sont mesurés.
8.1.8. Activité lipolytique
L‘activité lipolytique de nos souches a été déterminée selon la méthode de Guessas et al.
(2012) sur milieu agar au tween 80. L‘activité lipolytique est indiquée par l‘apparition d‘un
précipitât visible, résultant du dépôt des cristaux du sel de calcium formé par la libération des
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CHAPITRE II
Matériel et méthodes
acides gras libérés par l‘enzyme ou un précipitât clair autour de la colonie dû à la dégradation
complète des sels des acides gras. Après incubation de 24h à 37°C en anaérobiose, les
diamètres des zones claires apparues autour des clonies sont mesurés.
8.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques
L‘objectif de cette partie de l‘étude est d‘évaluer le comportement des souches de
bifidobactéries étudiées envers les conditions rencontrées au cours du passage à travers le
tractus gastro-intestinal humain.
8.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées
Tolérance aux conditions acides de l’estomac
Ce test a été réalisé selon la technique décrite par (Izquierdo, 2009; Thirabunyanon et al.,
2009; Kanam et al., 2007 ; Mosilhey, 2003) et qui comporte les étapes suivantes :
Préparation des solutions acides simulées au pH de l’estomac humain
Des solutions d‘eau distillée sont ajustées au pH 2 et 3 avec l‘HCl 1 M. L‘eau
distillée au pH 6,5 est utilisée comme témoin. Les solutions sont préparées dans des tubes de
10ml de, stérilisées et conservées à température ambiante avant leur utilisation. Par la suite,
0,1 ml de chaque culture jeune des souches étudiées est transféré dans les tubes contenant
les solutions acides, l‘incubation est faite à 37oC en anaérobiose pour 180 minutes afin de
simuler la survie des espèces dans les conditions acides de l‗estomac humain. Le
dénombrement des cellules viables est ensuite effectué.
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CHAPITRE II
Matériel et méthodes
Figure 13: Protocole de de détermination de l‘effet du pH gastrique simulé sur la viabilité des
souches.
Enumération des cellules viables dans les solutions de pH gastrique simulé
Pour dénombrer les cellules viables dans les solutions acides, nous avons prélevé des
aliquotes de 1 ml de chaque culture après le temps d‘incubation prédéterminé et avons réalisé
des dilutions en cascade jusqu'à 10-6 dans une solution saline (0,9 % de NaCl et 0,2% de
cysteine chlorhydrique). Les dernières dilutions (10-6) de chaque tube sont ensemencées en
masse sur la gélose MRS (additionnée de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide
nalidixique). Les boîtes de Pétri ainsi préparées sont incubées à 37°C pendant 48h en
anaérobiose. L‘expérience est indépendamment répétée trois fois.
Résistance aux sels biliaires
La technique décrite par (Kotikalapudi, 2009; Thirabunyanon et al., 2009 ; Vijendra et
Prasad, 2005 ; Mosilhey, 2003) a été appliquée :
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CHAPITRE II
Matériel et méthodes
Préparation des solutions biliaires
Une concentration de 0,5% de sels biliaires est préparée dans l‘eau distillée. L‘eau
distillée sans sels biliaires est utilisée comme témoin.
Les solutions sont préparées dans des tubes de 10 ml, stérilisées et conservées à
température ambiante avant leur utilisation. Le choix de la concentration de bile pour
(0,5%) était basé sur sa concentration physiologique dans le duodénum
(Brashears et al., 2003). Par la suite, 0,1 ml de la culture jeune de chaque souche testée
est transféré dans les tubes contenant la solution des sels biliaires (0,5%). Nous avons
également préparé des tubes témoins (sans sels biliaires). Les tubes sont incubés à 37oC en
anaérobiose pour 240 minutes, le dénombrement est effectué avant l‘incubation (t0) et après
240 minutes d‘incubation (t240).
Enumération des cellules viables dans les solutions de sels biliaires
Nous avons prélevé 1 ml de chaque tube et préparé des dilutions en cascade jusqu'à 10 -6
dans une solution saline (0,9 % de NaCl et 0,2% de cysteine chlorhydrique). Nous avons
ensuite procédé à l‘ensemencement dans une gélose MRS (additionnée de 0.05%cystéine
chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique), suivi d‘incubation à 37°C en anaérobiose
pendant 48h.
8.2.2. Mise en évidence de l’activité antibactérienne
Il s‘agit d‘étudier l‘activité inhibitrice de nos souches vis–à-vis des bactéries pathogènes.
Les souches pathogènes utilisées dans ce test sont Escherichia coli ATCC 25922
Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Listeria innocua ATCC 33090.
Préparation de cultures jeunes de bactéries pathogènes
Les souches pathogènes sont rajeunies dans un bouillon nutritif et incubées à 37°C
pendant 18h.
Réalisation de test
La technique choisie est celle de Fleming et al., (1975), elle consiste à ensemencer les
différentes espèces de Bifidobacterium dites inhibitrices à la surface du milieu MRS
additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique) solide à l‘aide d‘un multipoint, après séchage 30
mn à la température ambiante, les boite de Pétri sont incubées à 37 °C pendant 18h sous
conditions d‘anaérobiose.
Les cultures sont ensuite recouvertes de 7 ml de milieu Mueller Hinton inoculé avec
500 µl de culture de la souche pathogène. Après solidification, les boites sont remises à
l‘étuve à 37°C pendant 24h sous condition d‘anaérobiose.
La présence des zones claires autour des souches ensemencées par touche indique
l‘inhibition de la souche indicatrice. Les diamètres des zones d‘inhibition sont mesurés.
Page 48
CHAPITRE II
Matériel et méthodes
Recherche de l’agent responsable de l’inhibition
D‘après la littérature, l‘effet antagoniste des bifidobactéries est généralement attribué
à la production des acides organiques (acide acétique, acide lactique) (Roy, 2005) , Quelques
souches de bifidobactéries peuvent élaborer des bactériocines (Cheikhyoussef et al., 2010;
Von Ah, 2006).
D‘où vient l‘importance d‘écarter le facteur acidité d‘abord avant de passer aux autres
facteurs.
Dans notre travail nous avons éliminé le facteur de l‘acidité en utilisant le milieu MRS
tamponné à pH 7 (à l‘aide d‘un tampon phosphate 0,1M) contenant 0,25% de glucose pour
minimiser l‘acidification du milieu.
La lecture des résultats consiste à comparer ceux obtenus en milieu tamponné et non
tamponné.
8.2.3. Résistance aux antibiotiques
Pour chaque inoculum bactérien a été standardisé dont la DO660 varie entre 0.08 et 0.1
puis ensemencé par inondation (1ml) à la surface de la gélose MRS (additionnée de
0.05%cystéine chlorhydrique), déjà coulée et solidifiée, l‘excès de l‘inoculum a été récupéré
par une micropipette, les boites ont été laissées sécher à température de laboratoire, puis les
disques contenant les antibiotiques testés sont déposés. Après incubation à 37°C pendant 24h
en anaérobiose, les diamètres des zones d‘inhibition ont été mesurés (Leroy et al., 2007).
Les résultats ont été exprimés comme, sensibles (S), intermédiaires (I) , et résistantes (R),
selon les normes recommandés (Comité de l‘antibiogramme de la société française de
microbiologie, 2007).
Les antibiotiques utilisés sont résumés dans le tableau suivant :
Page 49
CHAPITRE II
Matériel et méthodes
Tableau 8: Les antibiotiques utilisés pour évaluer l‘antibiorésistance des souches.
Antibiotique
Charge de disque (µg)
Symbole
Vancomycine
30
VA
Cefotaxime
30
CTX
Penicilline
10
P
Oxacilline
5
OX
Ampicilline
10
AM
Acide nalidixique
30
NA
Azithromycine
15
AZM
Amoxicilline
25
AMX
Fosfomycine
50
FOS
Gentamycine
10
GM
Acide fusidique
10
FA
8.2.5. Traitement statistique des résultats
Les données expérimentales de l‘étude sont statistiquement traitées par une analyse de
variance (ANOVA). XLSTAT [version 2014] et Excel 2010 [Microsoft Corporation, USA],
ont été utilisé et le seuil de signification de 0.05 a été retenu.
Page 50
CHAPITRE III
Résultats et discussion
1. Pré-identification des souches
1.1. Aspect macroscopique
Les colonies de bifidobactéries développées sur le milieu MRS additionné de 0.05% de
cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique sont d‘apparence variable. Elles sont
punctiformes, luisantes, de coloration blanchâtre et crème, de contour régulier et de diamètre
variable. Cet aspect macroscopique est souvent rencontré chez les bifidobactéries (figure 14).
Figure 14: Aspect macroscopique des souches de Bifidobacterium sur milieu MRS.
A: R1
B: R2
C: L1
D: L2
E: BN
1.2. Aspect microscopique
L‘observation microscopique après la coloration de Gram des frottis réalisés à
partir des colonies apparues, révèle la présence des bactéries à Gram positif, des
bacilles en formes Y et V ou incurvés avec des extrémités bifurqués (figure 15). Ce
pléomorphisme est typique aux bifidobactéries, il est généralement pris comme un indice
d‘orientation dans l‘identification du genre.
Page 51
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Figure 15: Aspect macroscopique des souches de Bifidobacterium. Gr x 1000.
A: R1
B: R2
C: L1
D: L2
E: BN
2. Identification du genre
Les aspects macroscopique et microscopique des souches sont représentés dans le tableau
suivant :
Tableau 9: Aspects macroscopique et microscopique des souches de bifidobactéries.
Souche
L1
L2
R1
R2
BN
Aspect macroscopique
Colonies blanchâtres,
visqueuses, à contour régulier
Colonies blanchâtres,
visqueuses, à contour régulier
Petites colonies, opaques, blanchâtres,
surface lisse, contour régulier
Petites colonies, opaques, blanchâtres,
surface lisse, contour régulier
Punctiformes, luisantes,
blanchâtres à crème, contour régulier
Aspect Microscopique
Forme spatulée, extrémité
arrondie, forme bifid (V, Y)
Forme spatulée, extrémité
arrondie, forme bifid (V, Y)
Bâtonnets courts, extrémité
arrondie, forme bifid (V, Y)
Bâtonnets courts, extrémité
arrondie, forme bifid (V, Y)
Forme spatulée et arrondie,
forme bifid (V)
Page 52
CHAPITRE III
Résultats et discussion
2.1. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose
Toutes les souches ensemencées dans le milieu MRS (additionné de 0.05% de cystéine
chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique) liquide renfermant la cloche de Durham ont
montré une bonne croissance sans dégagement de gaz dans la cloche (figure 16).
Figure 16: Test de production du gaz à partir du glucose.
A: R1
B: R2
C: L1
D: L2
E: BN
2.2. Mise en évidence des autres enzymes
Les résultats pour la recherche des activités enzymatiques : catalase, uréase, gélatinase et
la production d‘indole sont négatifs tandis que la citrate perméase est positive (tableau 10).
Tableau 10: Mise en évidence des activités enzymatiques des souches de bifidobactéries.
Enzyme
Souche
L1
L2
R1
R2
BN
Catalase
Citrate Uréase Production Gélatinase
perméase
indole
-
(+) résultat positive (présence)
+
+
+
+
+
-
-
-
(-) résultat négative (absence)
Page 53
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Figure 17: Test de citrate perméase sur milieu KMK.
A: R1
B: L1
C: BN
Figure 18: Mise en évidence de l'uréase.
A: Témoin B : L1
C : R1
Page 54
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Figure 19: Mise en évidence de la production de l'indole.
A: Témoin B : L1
C : R1
Figure 20: Test de la gélatinase.
A: R1
B: R2
C: L1
D: L2
E: BN
Page 55
CHAPITRE III
Résultats et discussion
3. Caractérisation des espèces
Les résultats de la fermentation des différents sucres après 48 h d‘incubation sont
regroupés dans le tableau 11. Ces résultats montrent que toutes les souches fermentent
certains sucres (glucose, fructose, maltose et le lactose). Les souches L1 et L2 fermentent
l‘arabinose. Cette propriété semble distinguer l‘espèce B. longum des autres espèces. D‘autre
part les souches, R1 et R2 ne fermentent ni l‘arabinose, ni le xylose par contre elles fermentent
le céllobiose et le sorbitol.
La comparaison avec le profil fermentaire décrit par Scardovi, (1986) a conduit à
identifier deux espèces de Bifidobacterium :
L‘espèce B. breve qui regroupe les souches R1 et R2.
L‘espèce B .longum représentée par les souches L1 et L2.
Tandis que la comparaison avec le profil fermentaire obtenu avec la souche
B. animalis ssp. lactis (BB12), nous a orienté à classer la souche BN dans l‘espèce B. animalis.
Page 56
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Tableau 11: La fermentation des sucres par les souches de Bifidobacterium.
SUCRES
L-Arabinose
Amidon
Cellobiose
Fructose
Galactose
Lactose
Lévulose
Maltose
Mannitol
Raffinose
Rhamnose
Ribose
Sorbitol
Tréhalose
Xylose
L1
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(+) fermentation
L2
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+/+ /+
+
+
Souches
R1
+/+
+
+
+
+
+
+
+
-
(-) pas de fermentation
R2
+/+
+
+
+
+
+
+
+
-
BN
+/+
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+
-
BB12
+
+
+ /+
+
+
+
+
+
+
+
-
(+/-) pas de virage franc.
Figure 21: Profil fermentaire de la souche BN.
1: L-Arabinose
Mannitol
2: Amidon 3: Cellobiose 4: Fructose 5: Galactose 6: Lactose 7: Lévulose 8: Maltose 9:
10: Raffinose 11: Rhamnose 12: Ribose 13: Sorbitol 14: Tréhalose 15: Xylose
Page 57
CHAPITRE III
Résultats et discussion
4. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de
bifidobactéries
4.1. Mise en évidence des propriétés technologiques
4.1.1. Croissance en présence de l’oxygène
Parmi les obstacles rencontrés au cours de la fermentation à l‘échelle industrielle,
l‘oxygène se révèle comme facteur majeur influençant la viabilité des bifidobactéries dans le
produit laitier, donc la capacité de se croitre en présence de l‘oxygène constitue un facteur
technologique déterminant pour une telle souche destinée à être utilisée comme probiotique.
Dans notre étude, la capacité des souches étudiées à croitre en présence de l‘oxygène a
été évaluée pour une durée d‘incubation de 8 heures (temps de fermentation appliqué en
industrie laitière), à 37°C en aérobiose.
8.6
Log UFC/ml
8.4
8.2
R1
8
R2
7.8
L1
7.6
L2
7.4
BB12
7.2
BN
7
0
2
4
6
8
Temps (h)
Figure 22: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en présence de
l'oxygène.
Page 58
CHAPITRE III
Résultats et discussion
8.8
8.6
Log UFC/ml
8.4
R1
8.2
R2
8
L1
L2
7.8
BB12
7.6
BN
7.4
7.2
0
2
4
Temps (h)
6
8
10
Figure 23: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en absence de
l'oxygène.
D‘après les résultats obtenus (figure 23 et 24), il apparait que les souches R1, R2, L1, L2,
BB12 et BN avaient la capacité de pousser en présence de l‘oxygène, dont on a arrivé à des
charges comprises entre 8,14 Log UFC/ml et 8,25 Log UFC /ml , à partir des charge initiales
variant entre 7,3 Log UFC /ml et 7,5 Log UFC/ml, après 8 h de fermentation, mais ces valeurs
sont plus faibles en comparaison avec celles enregistrées en absence de l‘oxygène (les charge
finales entre 8,41 Log UFC/ml et 8,6 Log UFC/ml à partir des charge initiales entre 7,5 Log
UFC/ml et 7,6 Log UFC/ml , signifiant que l‘oxygène a influencé négativement la croissance
de toutes les souches.
Les résultats du test ANOVA démontrent que la variation de la cinétique de croissance
des souches étudiées en présence de l‘oxygène n‘est pas significativement différente d‘une
souche à une autre (sig = 0,053>0,05).
4.1.2. Croissance en 43°C
Etant donné, la température de fermentation appliquée en industrie laitière est de 43°C,
donc la capacité des souches des bifidobactéries de croitre à cette température représente un
caractère technologique indispensable pour arriver à une concentration adéquate à la fin de
processus de fermentation.
Les figures 25 et 26 comprennent les résultats de l‘évaluation de la cinétique de
croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN lors de l‘incubation à 43°C et à 37°C
respectivement.
Les résultats obtenus indiquent que la croissance de toutes les souches étudiées est
affectée par l‘incubation en 43°C dont on a remarqué la présence d‘une phase d‘adaptation
(de 0 h à 3 h) caractérisée par une augmentation très faible da la charge bactérienne.
Page 59
CHAPITRE III
Résultats et discussion
9
Log UFC/ml
8.5
R1
R2
8
L1
7.5
L2
BB12
7
BN
6.5
0
2
4
6
8
Temps (h)
Figure 24: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12
et BN incubées en 43°C.
8.8
Log UFC/ml
8.6
8.4
R1
8.2
R2
8
L1
7.8
L2
BB12
7.6
BN
7.4
7.2
0
2
4
6
8
10
Temps (h)
Figure 25: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12
et BN incubées en 37°C.
Les résultats du test ANOVA démontrent que la cinétique de croissance des souches
incubées en 43°C est significativement différente d‘une souche à une autre (sig=0,031< 0,05).
La meilleure vitesse de croissance a été enregistrée chez les souches L1 et L2 , dont elles
ont arrivé à une charge bactérienne de 8,26 Log UFC/ml et 8 Log UFC/ml respectivement à la
fin de la période d‘incubation (8 h), à partir d‘une charge initiales de 7,285 Log UFC/ml pour
Page 60
CHAPITRE III
Résultats et discussion
la première et 7, 205 Log UFC/ml pour la deuxième, tandis que la souche R 2 avait la plus
faible vitesse de croissance avec une charge finale de 7,593 Log UFC/ml à partir d‘une charge
initiale de 7,315 Log UFC/ml.
4.1.3. Viabilité pendant l’entreposage à 4°C
Une propriété très importante des souches destinées à être utilisées comme probiotiques
est qu‘elles doivent demeurer viables pendant l‘entreposage frigorifique
avant la
consommation du produit laitier, donc soit présentes en un nombre suffisant de cellules
viables au moment de la consommation.
Dans notre étude, la viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN a été évaluée
pendant une durée de stockage de 21 jours à 4°C. La période de 21 jours est la durée de vie
des produits laitiers fermentés de la date de fabrication jusqu‘à la date de péremption dans
l‘industrie laitière algérienne.
100
90
Viabilité (%)
80
70
R1
60
R2
50
L1
40
L2
30
BB12
20
BN
10
0
0
5
10
15
20
Durée d'entreposage (j)
Figure 26: Viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours de stockage à
4°C.
D‘après les résultats obtenus (figure 27), il apparaît que la viabilité des souches dans le
lait fermenté décroit graduellement durant la période de stockage réfrigéré. Après 7jours de
stockage à 4°C, la souche BB12 enregistre le plus grand pourcentage de cellules viables
(58,1%), en comparaison à R2 (52,8%), L1 (46,8%), BN (45 ,8%) et L2 (38,5%), une chute de
viabilité a été remarquée pour la souche R1 dont seulement 16,22% des cellules ont resté
vivantes. Après 14 jours de stockage, les souches BB12 et R2 gardent les meilleurs
pourcentages de cellules viables parmi les souches étudiées avec 50,9% et 48%
respectivement, Tandis que la souche L1 garde 38,7% de cellules vivantes, les trois autres
Page 61
CHAPITRE III
Résultats et discussion
souches ont connu un degré très élevé de mortalité des cellules dont le pourcentage de
viabilité s‘arrête à 13,8% pour L2, 11,6% pour BN et 7,14% pour R1 ce dernier est le faible. En
arrivant au dernier jour de stockage frigorifique (21eme jour), le maximum pourcentage de
viabilité s‘arrête à plus de 27%, cela est enregistré par les deux souches, BB12 (27,7%) et L1
(27,4%), la souche R2 garde un pourcentage de viabilité proche de ceux enregistrés par les
deux premières souches avec 20% de cellules viables, les trois dernières souches ont maintenu
une très faible viabilité à moins de 10% de cellules vivante avec 9 ,16% pour BN , 7,7% pour
L2 et 5,23% pour R1.
Les résultats du test ANOVA démontrent que la viabilité des souches étudiées à 4°C est
significativement différente d‘une souche à une autre, (Sig ═ 0,017 < 0,05) pour 7jours,
(Sig ═ 0,01 < 0,05) pour 14 jours, (Sig ═ 0,012 < 0,05) pour 21jours.
4.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C
La figure 28 comprend les résultats de la variation du pH du lait fermenté par les
souches de bifidobactéries étudiées durant la période de stockage réfrigéré à 4°C.
7
6.5
R1
6
pH
R2
L1
5.5
L2
BB12
5
BN
4.5
0
5
10
15
20
25
Durée d'entreposage (j)
Figure 27: Variation du pH du lait fermenté par les souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN
pendant le stockage à 4°C.
Le pH initial du lait fermenté par les souches étudiées était compris entre 6 et 6,33. Les
deux souches industrielles étaient les plus post-acidifiantes, dont on a enregistré un pH de
5,08 pour la souche BB12 et 4,98 pour la souche BN à la fin de la période de stockage
Page 62
CHAPITRE III
Résultats et discussion
frigorifique (21 jours), tandis que la souche L2 était la moins post-acidifiante avec un pH
atteignant 6,1. Les autres souches ont enregistré un pH autour de 5,5.
Les résultats du test ANOVA démontrent que la variation du pH entre les souches
étudiées est significativement différente durant toute la période de stockage
(Sig ═ 0,02 < 0,05).
4.1.5. Influence des arômes sur la viabilité
a. Arôme banane
La figure 29 comprend les résultats de l‘évaluation de la viabilité des souches R 1, R2 ,
L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours d‘entreposage frigorifique en présence de l‘arôme banane
utilisé dans l‘industrie laitière.
120
100
R1
Viabilité (%)
80
R2
60
L1
L2
40
BB12
BN
20
0
0
5
10
15
20
25
Durée d'entreposage (j)
Figure 28: Viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours d‘entreposage à
4°C en présence de 0,2% d‘arôme banane.
Les résultats obtenus indiquent que la viabilité des souches étudiées est affectée par la
présence de l‘arôme banane.
Après 07 jours de stockage, les souches R1, BB12 et BN ont gardé un taux viabilité
supérieure à 90% dont les valeurs respectives étant 92,3%, 95% et 93,03%. Une viabilité
moyenne a été enregistrée par les souches R2 et L1 (52,3% et 50,4% respectivement), par
contre la viabilité de la souche L2 était la plus faible avec seulement 35,4% de cellules
vivantes. En arrivant au 14eme jour de stockage, le taux de viabilité des souches continue sa
régression dont les meilleures valeurs ont été enregistrées par les souches BB12 et BN avec un
Page 63
CHAPITRE III
Résultats et discussion
taux de viabilité de 77,5% et 81,4% respectivement. Par contre le plu faible taux de viabilité
était de 22,2% noté pour la souche R2.
A la fin de la période d‘entreposage (21eme jour), la souche BB12 a maintenu la plus
grande fraction de cellules vivantes parmi toutes les souches testées (67 ,9%), suivie par les
souches R1 et BN (47% et 43,3% respectivement). Les trois autres souches avaient de très
faibles taux de viabilité aux alentours de 10%.
Les résultats du test ANOVA démontrent que la viabilité des souches étudiées à 4°C en
présence de l‘arôme banane est significativement différente d‘une souche à une autre, (Sig ═
0,015 < 0,05) pour 7jours, (Sig ═ 0,012 < 0,05) pour 14 jours, (Sig ═ 0,027 < 0,05) pour
21jours.
b. Arôme vanille
La Figure 30 comprend les résultats de l‘évaluation de la viabilité des souches R 1, R2 ,
L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours d‘entreposage frigorifique en présence de l‘arôme banane
utilisé dans l‘industrie laitière.
120
Viabilité (%)
100
R1
80
R2
L1
60
L2
40
BB12
BN
20
0
0
5
10
15
Durée d'entreposage (j)
20
25
Figure 29: Viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours d‘entreposage à
4°C en présence de 0,2% d‘arôme vanille.
Les résultats illustrés démontrent que la viabilité des souches étudiées est affectée par la
présence de l‘arôme vanille.
Après 07 jours de stockage, la souche R1 a maintenu un très bon taux de viabilité avec
96% de cellules vivantes, suivie par les souches R2, BB12, L1 et BN avec des valeurs
respectives de 80,3, 86,7, 87,2 et 87,3. Le plus faible taux de viabilité pour cette durée de
stockage a été enregistré par la souche L2 avec 58,4%. Au 14eme jour, la souche BN avait le
meilleur taux de viabilité (82%), suivie par les souches R1 et R2 (72,65% et 67,9%
Page 64
CHAPITRE III
Résultats et discussion
respectivement), des valeurs moyennes ont été obtenues par les souches L1 (41,9%) et BB12
(37,5%). En revanche, seulement 18,45% de cellules ont maintenu leur viabilité pour la
souche L2. En arrivant à la fin de la période de stockage (21eme jour), les souches ayant
préservé la plus grande fraction de cellules vivantes étaient BN (67,45%) et R2 (64,45%). Par
contre le plus faible pourcentage de viabilité a été toujours enregistré par la soucheL2 avec
seulement 14,4% de cellules viables, les trois autres souches ont enregistré un taux de
viabilité au voisinage de 30%.
Les résultats du test ANOVA démontrent que la viabilité des souches étudiées à 4°C en
présence de l‘arôme vanille est significativement différente d‘une souche à une autre, (Sig ═
0,012 < 0,05) pour 7jours, (Sig ═ 0,018 < 0,05) pour 14 jours, (Sig ═ 0,016 < 0,05) pour
21jours.
4.1.6. Cinétique de croissance et d’acidification dans milieu lait
a. Cinétique de croissance dans le lait
La figure 31 comprend les résultats de l‘évaluation de la cinétique de croissance des
souches R1, R2 , L1, L2, BB12 et BN dans le lait écrémé pour une incubation à 37°C en
anaérobiose pendant 48 heures.
Log UFC/ml
8.4
8.2
R1
8
R2
7.8
L1
7.6
L2
7.4
BB12
7.2
BN
7
0
10
20
Temps (h)
30
40
50
Figure 30: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12
et BN dans le lait écrémé.
La souche L1 avait le taux de croissance le plus élevé (0 ,133h-1), dont elle est arrivée à
une charge maximale de 8,3 Log UFC /ml, après 12 heures de fermentation à partir d‘un
nombre initiale de 7,46 Log UFC/ ml. Suivie par les souches BB12, BN, R2 et R1 dont les taux
de croissance sont 0,12h-1, 0,11h-1, 0,105h-1 et 0,103h-1 respectivement. Le plus faible taux de
croissance est noté pour la souche L2 (0,095h-1).
Le résultat du test ANOVA démontrent que la différence entre les taux de croissance des
souches étudiées est significative (Sig ═ 0,017 < 0,05).
Page 65
CHAPITRE III
Résultats et discussion
b. Cinétique d’acidification
L‘activité acidifiante des souches lactiques est principalement utilisée pour améliorer la
qualité organoleptique des produits laitiers fermentés, donc cette propriété représente un
paramètre technologique déterminant dans la sélection et l‘utilisation de ces dites souches.
Les résultats de l‘évaluation de la cinétique d‘acidification, ainsi la variation de pH
produites par les souches R1, R2, L1, L2, BB12, et BN dans le lait écrémé ; pour une incubation
de 48 heures à 37°C en anaérobiose sont regroupés dans la figure 32.
37
A
Acidité dornic (°D)
32
R1
27
R2
L1
22
L2
BB12
17
BN
12
0
10
20
30
40
50
Temps (h)
7.2
B
pH
7
R1
6.8
R2
6.6
L1
6.4
L2
6.2
BB12
BN
6
5.8
0
10
20
30
Temps (h)
40
50
Figure 31: Cinétique d'acidification (A) et variation de pH (B) produites par
les souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN dans le lait écrémé.
L‘analyse des courbes de la cinétique d‘acidification (A) et celles de la variation de pH
permet de conclure que la souche R1 était la plus acidifiante dont l‘acidité titrable arrive à une
valeur de 34,4°D à la fin de la période d‘incubation à partir de 19,4°D au départ , donc
Page 66
CHAPITRE III
Résultats et discussion
l‘acidité produite par cette souche est de 15°D , suivie par les souches L1, BN, R2 et BB12
dont les valeurs de l‘acidité élaborée par ces souches sont respectivement, 13,3°D, 12,5°D,
12,1°D et 11,5°D. En revanche la souche la moins acidifiante était L2 avec 8°D. De même, la
variation de pH est proportionnelle à la concentration des acides présente dans le milieu,
Dont le pH enregistré par les souches expérimentée à la fin de la période d‘incubation varie
entre 5,92 et 6,32.
Le résultat du test ANOVA démontrent que la différence entre les valeurs de l‘acidité
dornic enregistrées par les souches testées est significative (Sig ═ 0,0 35 < 0,05).
4.1.7. Activité protéolytique
La protéolyse est l'une des propriétés technologiques les plus importantes, elle permet
l‘hydrolyse des protéines du lait, en fournissant ainsi les acides aminés essentiels pour la
croissance des souches, cette activité contribue aussi au changement de la texture, le goût et
les arômes des produits laitiers fermentés.
Sur milieu MRS à 2% de lait écrémé, les souches L2 et R2 avaient une activité
protéolytique moyenne dont les diamètres des zones d‘hydrolyse étaient environ de 13mm;
tandis que le reste des souches ont montré une faible activité protéolytique dont les
diamètres des zones d‘hydrolyse étaient autour de 6 mm (figure 33).
Figure 32: Activité protéolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN
dans milieu MRS à 2% de lait écrémé
Les résultats de l‘évaluation de l‘activité protéolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12
et BN sur milieu MRS à 2% de lait écrémé sont mentionnés dans le tableau 12.
Page 67
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Tableau 12 : Activité protéolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN sur milieu
MRS à 2% de lait écrémé.
Souche
R1
R2
L1
L2
BB12
BN
Activité
protéolytique
+
++
+
++
+
+
(+) : faible activité
(++) : moyenne activité
(+++) : forte activité
4.1.8. Activité lipolytique
La lipolyse fait partie des caractères technologiques très demandés en industrie laitière,
notamment en fromagerie, cette activité induit la libération des acide gras comme résultat de
dégradation des graisses, ce processus est impliqué au développement des flaveurs des
produits laitiers.
Sur milieu agar au tween 80, les souches R1 et R2, avaient une activité lipolytique
moyenne dont les diamètres des zones étaient au voisinage de 12 mm ; une faible activité
lipolytique est notée pour les souches L1, L2 et BB12 avec des diamètres variant entre 7 et 9
mm, la souche BN avaient très faible activité lipolytique dont le diamètre de la zone de
lipolyse n‘a pas dépassé les 4 mm (figure 34).
Figure 33: Activité lipolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12, BN
sur milieu agar au tween 80.
Les résultats de l‘évaluation de l‘activité lipolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et
BN sur milieu agar au tween 80 sont mentionnés dans le tableau 12.
Page 68
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Tableau13: Activité lipolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN sur milieu agar
au tween 80.
Souche
R1
R2
L1
L2
BB12
BN
Activité
lipolytique
++
++
+
+
+/-
+
(++) : activité moyenne
(+) : faible activité
(+/-) : très faible activité
4.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques
4.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées
4.2.1.1. Tolérance aux conditions acides de l’estomac
L‘une des conditions principales pour qu‘une souche puisse répondre à la définition de
« probiotique » est qu‘elle doit être viable pendant le transit gastro-intestinal. Avant de
pouvoir adhérer et s‘installer au niveau de l‘intestin, les bactéries probiotiques doivent
survivre au passage par l‘estomac. Afin de déterminer cette capacité de survie chez les
souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN, l‘effet de l‘exposition à un milieu acide sur ces bactéries a
été examiné. Ces dernières ont été exposées à des pH acides 2 et 3 et pH 6,5 comme contrôle
pendant 180 minutes, ensuite la proportion de cellules viables a été évaluée.
D‘après les résultats obtenus, la concentration des cellules viables a diminué pour les
deux pH acides 2 et 3 avec la progression du temps de contact avec les pH acides par
rapport au pH 6,5 (témoin) dont la perte de viabilité était négligeable (figure 35).
Page 69
CHAPITRE III
Résultats et discussion
120
Taux de survie (%)
100
80
pH2
60
pH3
40
Ph6.5
20
0
R1
R2
L1
L2
BB12
BN
Souches
Figure 34: Résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN
aux pH acides (2 et 3).
La perte de viabilité à pH 6.5% était négligeable pour la totalité des souches testées, dont
la portion de cellules viables après 180 minutes d‘incubation était de 95% à 99%.
Lors de l‘exposition à pH 2, la souche BN a maintenu la plus grande portion de cellules
viables après 180 minutes d‘exposition à ce pH parmi toutes les souches en sujet (65,5%),
suivie par les souches L1, BB12 , R2 et L2
dont les taux de survie enregistrés sont
respectivement 61,33% , 59,9% , 58,45% et 45,4%. Le plus faible taux de survie pour ce pH
est noté pour la souche R1 (37,33%).
Pour le pH3, la plus grande portion de cellules ayant maintenu leur viabilité à la fin de la
période d‘exposition est enregistrée par la souche BB12 (83,9%), suivie par les souches R1, R2,
L1, BN et L2 avec des taux de survie respectives de 71,7%, 71% , 66,03% , 62,6% et 57,5%, ce
dernier était le plus faible.
Les résultats du test ANOVA ont montré que la différence de viabilité des souches
étudiées est significative pour pH2 (Sig = 0,027<0,05) et pH3 (Sig= 0,023< 0,05).
4.2.1.2. Résistance aux sels biliaires
Les sels biliaires sont l'une des barrières à franchir par les bactéries probiotiques pour
gagner leur site, de ce fait la résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en présence
de bile a été testée. Ces souches ont été exposées à 0,5% de bile pendant 240 minutes et
ensuite la proportion de cellules viables a été évaluée.
D‘après les résultats présentés dans la figure 36, il apparaît que les souches L2, BB12, BN
et R2 ont montré une excellente résistance aux sels biliaires avec des taux de survie
Page 70
CHAPITRE III
Résultats et discussion
respectives de 85,7% , 85,6% , 84,5% et 83,7% après 240 minutes d‘incubation dans une
solution contenant 0,5% de sels biliaires. Par contre, les souches R1 et L1 ont faiblement
résisté à ces conditions dont les taux de viabilité enregistré par ces deux souches sont de
49,7% pour la première et 35,3% pour la deuxième. En l‘absence de sels biliaires, la
diminution de la viabilité de toutes les souches était négligeable, dont le taux de survie était
compris entre 95,6% et 98, 59%.
120
Taux de survie (%)
100
80
60
0% SB
0.5% SB
40
20
0
R1
R2
L1
L2
BB12
BN
Souches
Figure 35: Résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN à 0,5% de sels biliaires.
Les résultats du test ANOVA ont montré que la différence de résistance des souches étudiées
à 0,5% de sels biliaires est significative (Sig= 0,0 34< 0,05).
4.2.2. Activité antibactérienne
Ce test permet de mettre en évidence les caractéristiques que possèdent les souches
testées à inhiber la croissance de quelques souches pathogènes.
Les résultats de ce test sont présentés dans le tableau 13.
Tableau 14: Activité inhibitrice des souches R1, R2, L1, L2 BB12 et BN envers des bactéries
pathogènes.
Diamètre de zone
d’inhibition (mm)
R1
R2
L1
L2
BB12
BN
Escherichia coli
15
14
12.5
18
14
12
Staphylococcus aureus
16
18
16
17.5
17
14.5
Listeria innocua
4
7.5
4
5
5.5
4
Page 71
CHAPITRE III
Résultats et discussion
D‘après les résultats obtenus, il est clair que toutes les souches de bifidobactéries testées
avaient une bonne activité inhibitrice envers les deux germes pathogènes Escherichia coli et
Staphylococcus aureus avec des diamètres de zones d‘inhibition variant entre 12 et 18 mm.
En revanche, une faible inhibition a été notée pour toutes les souches de bifidobactéries en
test sur Listeria innocua dont les diamètres des zones d‘inhibition n‘ont pas dépassé 7,5 mm
dans le meilleur des cas.
Figure 36: Activité inhibitrice des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN sur Staphylococcus
aureus.
L‘activité inhibitrice a persisté, lors de l‘incubation des souches pathogènes avec les
surnageant natifs issus des cultures des souches de bifidobactéries en test (figure 38), mais
aucune zone d‘inhibition n‘a été observée en cas de l‘incubation avec les surnageants
tamponnés dans la totalité des cas. Ce qui indique que l‘inhibition est due aux acides élaborés
par les souches de bifidobactéries étudiées.
Page 72
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Figure 37: Activité inhibitrice des surnageants natifs des souches R1, R2 et L1
sur Escherichia coli.
4.2.3. Résistance aux antibiotiques
Les résultats de l‘évaluation de la résistance et la sensibilité des souches de
bifidobactéries aux antibiotiques sont groupés dans le tableau 14. Les souches présentant un
diamètre de zone d‘inhibition supérieur à 15mm sont considérées comme sensibles.
Tableau 15: Résultats de l‘évaluation de l‘antibiorésistance des souches.
Antibiotique
Vancomycine
Cefotaxime
Penicilline
Oxacilline
Ampicilline
Acide nalidixique
Azithromycine
Amoxicilline
Fosfomycine
Gentamycine
Acide fusidique
Charge de
disque (µg)
Symbole
30
30
10
5
10
30
15
25
50
10
10
VA
CTX
P
OX
AM
NA
AZM
AMX
FOS
GM
FA
R : Résistante
R1
R2
L1
L2
BB
BN
12
I : Intermédiaire
R
S
I
I
R
R
S
S
R
R
S
R
S
I
S
R
R
S
S
R
R
S
R
S
I
I
R
R
I
S
R
R
S
R
S
I
I
R
R
S
S
R
R
S
R
S
I
R
R
R
S
S
R
R
S
R
S
R
R
R
R
I
S
R
R
S
S : Sensible
Page 73
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Figure 38: Antibiogramme de la souche L2
Toutes les souches ont montré une résistance à 5 parmi 11 antibiotiques testés (la
vancomycine l‘ampicilline, l‘acide nalidixique, la fosfomycine et la gentamycine). Une
sensibilité de toutes les souches étudiées à 4 antibiotiques à savoir : la cefotaxime,
l‘azithromycine, l‘amoxicilline et l‘acide fusidique a été notée, une différence de
comportement des souches testées vis-à-vis la penicilline et l‘oxacilline a été enregistrée. Il
faut signaler que la résistance ou la sensibilité d‘une souche donnée envers un tel antibiotique
peut être liée à l‘antibiotique lui-même, comme peut être liée à la dose utilisée d‘où la
nécessité de tester plusieurs concentrations pour confirmer les résultats obtenues.
Page 74
CHAPITRE III
Résultats et discussion
DISCUSSION
1. Isolement et identification des bifidobactéries
L‘isolement des bifidobactéries nécessite des conditions spécifiques, qui mettent en jeu
des systèmes d‘anaérobiose comme les anaerocults ou les gas-pack et des milieux de cultures
très riches tel que TPY, milieu Beerns, MRS cystéine, milieu Columbia modifié (Hadadji et
al, 2005 ; Scardovi, 1986).
L‘identification des souches est basée sur l‘aspect macroscopique et microscopique.
Les bifidobactéries qui poussent sur le milieu MRS-cysteine forment de petites
colonies à contour régulier et aspect variable, dépourvues de toute activité catalase.
Microscopiquement les cellules formant les colonies sont à Gram positif caractérisées par
des formes variables, mais souvent des formes bifides qui sont typiques au bifidobactéries
(Tabasco et al, 2007 ; Scardovi, 1986).
Le pléomorphisme observé chez les bifidobactéries est souvent associé à la composition
du milieu de culture, des études ont démontré que la morphologie cellulaire des
bifidobactéries est influencée par la nature de la source de carbone présente dans le milieu de
culture (Biavati et Mattarelli., 2001 ; Tamime et al., 1995).
Les souches obtenues ne forment pas d‘indole, ne possèdent pas une activité uréique
et ne liquéfient pas la gélatine, ces caractères biochimiques concordent avec les
caractéristiques spécifiques au genre Bifidobacterium, rapporté par (Mitsuoka, 1984).
La différenciation des espèces de bifidobactéries repose sur la fermentation des
carbohydrates. La souche NCC 2705 de Bifidobacterium longum possède des gènes
codant pour des enzymes ( fumarase, oxoglutarate déhydrogénase et le maltate
déhydrogénase) qui permettent la dégradation de plusieurs sucres comme arabinose,
xylose, ribose, cellobiose, melibiose, maltose, raffinose, et mannose (Schell et al., 2002).
Les souches L1et L2 fermentent l‘arabinose et le xylose. Cette propriété semble distinguer
l‘espèce B. longum des autres espèces. D‘autre part les souches R1, R2 ne fermentent ni
l‘arabinose, ni la xylose par contre elles fermentent le sorbitol.
On se référant au profil fermentaire décrit par Scardovi, 1986, les souches obtenues à
partir de la collection du LMA appartiennent aux deux espèces de Bifidobacterium: l‘espèce
B. breve qui regroupe les souches R1, R2 et l‘espèce B. longum présentée par les souches L1,
L2.
La comparaison avec le profil fermentaire de la souche B. animalis ssp. lactis (BB12)
nous a permis de classer la souche BN isolée à partir du lait fermenté probiotique (Danone
Activia) au sein de l‘éspèce B. animalis, l‘éspèce prédominante dans les produits
probiotiques commercialisés (Fasoli et al; 2003).
Page 75
CHAPITRE III
Résultats et discussion
2. Etudes des propriétés téchnologiques des souches de bifidobactéries
Plusieurs aspects technologiques sont pris en compte lors de la sélection des souches
probiotiques en citant, la viabilité pendant le processus de fabrication, la stabilité dans le
produit au cours de l‘entreposage, le maintien des propriétés organoleptiques et la résistance
au phage, cela a pour but d‘arriver avec des quantités suffisantes de cellules vivantes au
moment de la consommation (Deraz et al ; 2007).
La tolérance à l‘oxygène se révèle un caractère technologique indispensable pour
permettre à une telle souche de surmonter cet obstacle rencontré au cours d‘une fermentation
à l‘échelle industrielle. En général, les bifidobactéries sont considérées comme hautement
sensibles à l‘oxygène. En revanche la tolérance à l‘oxygène se diffère selon l‘éspèce, par
exemple : la souche B. animalis ssp. lactis (BB12) a montré une bonne tolérance a ce facteur
(Roy, 2005).
Les résultats obtenus montrent clairement la capacité de toutes les souches indigènes
étudiées de se croitre en présence de l‘oxygène dont les charges microbiennes enregistrées
étaient très proches de celles inscrites par les deux souches industrielles. La comparaison des
valeurs obtennues avec celles enregistrés en cas de l‘absence d‘oxygène montre l‘effet néfaste
de ce facteur sur la croissance de toutes les souches étudiées caractérisé par la diminution des
charges microbiennes inscrites, en effet,
Elizabeth et al. (2011) et Hadadji, (2007) ont
rapporté la capacité de l‘oxygène d‘affecter négativement la croissance des bifidobactéries
dans le lait et la différence de degré de tolérance à ce facteur selon l‘espèce et le milieu de
culture.
D‘après la littérature, la température de fermentation appliquée dans la fabrication des
yaourts et des laits fermentés varie entre 40°C et 46°C, en général autour de 43°C (Béal et
Sodini, 2012 ; Lamoureux, 2000), de ce fait, l‘évaluation du comportement des souches
étudiées envers ce facteur tient une grande importance.
En générale, les espèces de bifidobactéries d‘origine humaine sont des mésophiles dont
la température optimale de croissance se situe entre 36 °C et 38 ºC par contre les espèces
d‘origine animales peuvent se croître a des température plus élevée qui varie entre 41º
et 43°C (Scardovi, 1986).
L‘analyse des courbes de croissance en cas de l‘incubation à 43°C indique la présence
d‘une phase d‘adaptation pour toutes les souches, cette phase dure environ de 3 h, en
revanche, on a remarqué l‘absence de cette phase en cas de l‘incubation à 37°C, dont l‘effet
néfaste de cet température (43 °C) sur la croissance de nos souches est constaté, cet effet
perturbant a été signalé par Hadadji, (2007), dont il a observé un ralentissement de croissance
avec un temps d‘adaptation d‘une heure (1h), pour des souches de bifidobactéries incubées à
42 °C.
Page 76
CHAPITRE III
Résultats et discussion
En dépassant cette dite phase, les souches se multiplient à des vitesses différentes où les
deux souches indigènes L1 et L2 arrivent à des charges de de 8,26 Log UFC/ml et 8 Log
UFC/ml respectivement après 8h d‘incubation, cela dépasse les charges atteintes par les
autres souches y compris les souches industrielles.
Ces observations montrent d‘une part que la température d‘incubation est un paramètre
important qui peut affecter la croissance des bifidobactéries, dont le comportement envers ce
facteur se diffère selon l‘espèce et la souche. D‘autre part, confirment la capacité des souches
de bifidobactéries d‘origine humaine de s‘adapter à des températures élevées (43 °C). De
même, Hadadji, (2007) et Rasic, (1983) ont rapporté que des souches de bifidobactéries
d‘origine humaine peuvent se développer à une température de 42°C.
La survie des bifidobactéries dans un lait fermenté doit être assurée jusqu'à la
consommation du produit puisqu'on doit y dénombrer plus de 105-106 cellule par gramme ou
millilitre du lait fermenté pour exercer des effets probiotiques (Shah, 1997).
Les résultats de l‘évaluation de la viabilité des souches durant l‘entreposage à 4 °C ont
montré une perte importante de viabilité de toutes les souches le long de cette période qui a
duré 21 j, cette perte de viabilité se diffère entre les éspèces, et même entre les souches en
sein de la même espèce, cela est observé aussi par Hadadji, (2007) dont il a remarqué une
différence des taux de viabilité entre deux souches appartenant à la même espèce (B. breve),
après 21 jour de stockage frigorifique dans le lait de chèvre.
En arrivant au 21eme jour du stockage frigorifique, le meilleur taux de viabilité se situe
autour de 27%, enregistré par les souches BB12 (souche industrielle) et L1 (souche indigène),
avec 27,7% et 27,4% de cellule vivantes respectivement, la souche indigène R2 garde un
taux de viabilité proche de ceux inscrits par les deux premières souches avec 20% de cellules
viables. En revanche, les trois autres souches, y compris la souche industrielle BN ont subis
une mortalité notable dépassant 90% du nombre initiales des cellules.
Cette perte importante de viabilité des bifidobactéries durant le stockage frigorifique a
été rapporté par plusieurs auteurs (Hadadji, 2007 ; Gilliland et al., 2002; Shin et al., 2000).
Plusieurs facteurs peuvent influencer la viabilité des bifidobactéries dans le lait fermenté
pendant le stockage à froid y compris, l‘oxygène, l‘épuisement nutritif et les acides
organiques issues de la fermentation (Takahashi et al., 2004).
La suivie de la variation du pH le long de la période de stockage à froid montre que les
souches de bifidobactéries ont continué d‘acidifier le lait pendant le stockage, mais cette
acidification étaient faible dont le pH le plus bas était 4,98 enregistré par la souche
industrielle BN, cela indique que les bifidobactéries n‘influencent pas la qualité du produit
fermenté lors du stockage frigorifique, en effet, certains auteur ont signalé cette faible activité
poste-acidifiante des bifidobactéries (Riazi et Ziar, 2012 ; Hadadji, 2007)
Page 77
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Les résultats de l‘évaluation de l‘effet des deux arômes utilisés en industrie (banane et
vanille) ont montré d‘une part l‘impact négatif de ces arômes sur la viabilité des souches
étudiées, ceci pourrait expliquer l‘écart noté entre les concentrations des cellules viables
dénombrées dans les tubes contenant les arômes et les tubes témoins sans arômes, d‘autre
part ils ont indiqué une différence de comportement entre les souches mais aussi selon
l‘arôme utilisé, cela est constaté par une simple comparaison entre le taux de viabilité inscrit
par la souche industrielle R2 et celui enregistré par la souche industrielle BB12 cette dernière a
maintenu un bonne fraction de cellules viables arrivant à 67 ,9% avec l‘arôme banane, et ce
n‘était pas le cas avec l‘arôme vanille, dont une chute de viabilité a été noté en s‘arrêtant à
37,5% de cellules viable. Par contre, la souche R2 a enregistré un très bon taux de cellules
viables atteignant 64,45% avec cet arôme (vanille), contrairement à l‘autre arôme (banane)
dont elle est classée parmi les souches ayant les plus faibles viabilités.
Certaines études ont constaté l‘effet perturbant des arômes ou de mélanges commerciaux
d‘arôme-colorants utilisés en industrie laitière sur la viabilité de quelques souches lactiques
(St. thermophilus, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus et Lb. acidophilus), même aux
concentrations recommandées par les fournisseurs (Bouchefra, 2012 ; Vinderola et al., 2002).
On note qu‘aucune étude spécifiant l‘effet des arômes sur la viabilité des bifidobactéries n‘a
été trouvée.
L‘évaluation du développement de la biomasse produite par les souches étudiées au cours
de la croissance dans le lait écrémé révèle une différence entre les vitesses spécifiques de
croissance, dont le taux de croissance le plus élevé (0,133h-1) est inscrit par la souche indigène
L1, suivie par les autres souches dont les taux de croissance enregistrés étaient autour de
0,1 h-1. De même, Martinez-Villaluenga et Gomes, (2007) ont observé que les taux de
croissance et les temps de génération des bifidobactéries dans le lait UHT varient selon les
souches.
Il est à signaler que la croissance des bifidobactéries dans le lait écrémé est lente. En
effet, plusieurs auteurs ont constaté que le lait ne constitue pas un milieu optimal de
croissance pour les bifidobactéries, cela est dû à plusieurs facteurs dont la carence en facteurs
de croissance et en source d‘azote facilement assimilable dans le lait et aussi la faible activité
protéolytique des bifidobactéries (Prasanna et al., 2014 ; Shihata et Shah, 2000 ; Murti et
al.,1992)
Pour stimuler la croissance des bifidobactéries dans le lait, plusieurs sources d‘azote
facilement assimilables sont ajoutées (peptides, l‘hydrolysât de caséine, concentré protéique
de petit lait, ou bien le petit lait) (Dave shah, 1998). Hadadji, (2007) a rapporté que l‘ajout de
0,5 % de l‘extrait de levure et un inoculum à 5% semble avoir un effet stimulateur sur la
croissance des bifidobactéries dans le lait.
Le développement des bifidobactéries dans le lait est accompagné de production d‘une
acidité titrable, le pouvoir acidifiant se diffère entre les souches étudiées dont la souche
indigène R1 était la plus acidifiante avec 15°D d‘acidité dornic produite après 48 h
d‘incubation, dont le pH arrive à une valeur minimale de 5,92, par contre la plus faible valeur
Page 78
CHAPITRE III
Résultats et discussion
était 8°D, inscrite par la souche indigène L2, les autre souches ont enregistré des valeurs
proches variant entre 11,5 °D et 13,3 °D. Cette différence de production d‘acidité est signalé
par plusieurs auteurs (Martinez-Villaluenga and Gomes, 2007; Crittenden et al., 2001; Meile
et al., 1997 )
Le suivi de l‘évolution de l‘acidité titrable produite par les bifidobactéries a montré un
pouvoir acidifiant faible de ces souches, cette faible acidification a été signalée dans
certaines autres études (Hadadji et Bensoltane, 2006 ; Mahi et al., 2006; Samona et al.,1996).
Ceci est un caractère technologique limitant, car une acidification lente
a comme
conséquence un temps prolongé de fermentation ; l'industrie laitière fait face à ce problème en
employant des cultures combinées des bifidobactéries et d'autres bactéries lactiques (Roy,
2005).
L‘activité protéolytique est l‘un des caractères technologiques les plus demandés en
industrie laitière, elle permet l‘hydrolyse des protéines du lait, en fournissant ainsi les acides
aminés essentiels pour la croissance des souches, elle contribue aussi à la détermination des
propriétés organoleptique du produit laitier fermenté.
Les souches de bifidobactéries étudiées ont montré une moyenne voir faible activité
protéolytique sur milieu MRS à 2% de lait écrémé dont les diamètres des zones d‘hydrolyse
varient entre 6mm et 13mm. Nos résultats sont en accord avec ceux décrits par Shihata et
Shah, (2000) et Abu -Tarabush et al. (1998).
En effet, Hadadji, (2007) a rapporté que la croissance lente des bifidobactéries en culture
pure dans le lait peut être due à cette faible activité protéolytique.
En industrie laitière, les bifidobactéries sont utilisées en culture mixtes avec des souches
protéolytiques, notamment Lb. acidophilus, et Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (Shihata et
Shah, 2000).
Klaver et al. (1993) ont aussi démontrés que le taux de croissance des bifidobactéries
dans le lait pouvait être augmenté par la présence de souches protéolytiques telles que Lb.
acidophilus, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus ou Lb. casei.
La lipolyse fait partie des caractères technologiques essentiels en industrie laitière,
notamment en fromagerie, cette activité induit la libération des acide gras comme résultat de
dégradation des graisses, ce processus est impliqué au développement des flaveurs des
produits laitiers.
Sur milieu agar au tween 80, les souches de bifidobactéries testées ont montré une
moyenne voir faible activité lipolytique avec des diamètres de zone de lipolyse bouleversant
entre 7mm et 12 mm à l‘exception de la souche industrielle BN qu‘avaient une très faible
activité lipolytique dont le diamètre de la zone de lipolyse n‘a pas dépassé les 4 mm. En effet,
selon De Roissart et Luquet (1994) ; les bactéries lactiques sont considérées comme
faiblement lipolytiques.
Page 79
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Une comparaison de nos résultats s‘avère impossible vu l‘indisponibilité d‘une étude
spécifiant l‘activité lipolytique des bifidobactéries.
3. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques des
bifidobactéries
Il est admis que pour que la majorité des probiotiques puissent avoir des rôles bénéfiques
sur la santé humaine, il faut qu‘ils gardent une certaine viabilité lors du transit intestinal. De
ce fait, les probiotiques doivent pouvoir passer sans dommage irréversible la barrière acide de
l‘estomac, puis l‘effet inhibiteur éventuel des sels biliaires. Ainsi, la capacité de survie des
probiotiques dans l‘hôte après leur ingestion, dépend de leur résistance intrinsèque, des
facteurs de l‘hôte et du véhicule par lequel ils ont été ingérés (Marteau and Shanahan, 2003).
Les résultats obtenus montrent clairement la diminution progressive du nombre des
cellules viables pour toutes les souches mises en contact avec les deux pH acides 2 et 3 avec
le temps de contact aux pH acides, en comparaison avec le pH 6,5 (témoin) où la perte de
viabilité était négligeable.
Les souches mises en contact avec le pH 3 ont montré une excellente viabilité après 180
min de contact, dont le plus faible taux de survie inscrit a dépassé 57%, cela est enregistré par
la souche indigène L2, les autre souches indigènes ont maintenu une très bonne portion de
cellules viables arrivant jusqu'à 71,7%; tandis que la meilleure viabilité est réservée pour la
souche industrielle BB12 avec environ de 84% de cellules viables à la fin de la période de
contact avec ce pH acide.
Le contact avec le pH 2 a induit une diminution de la portion des cellules viables pour
toutes les souches, en comparaison avec celles enregistrées avec le pH 3, où le taux de survie
le plus élevé était aux alentours de 66%, noté pour la souche industrielle BN, la souche
indigène L1 a également inscrit une bonne viabilité dont elle a maintenu plus de 61% de sa
charge initiale; par contre, la souche indigène R1 était la moins viable avec seulement 37,33%
de cellule restant vivante après le contact a ce pH.
Les souches étudiées ont montré une différence de comportement selon le pH acide (2 et
3), toutefois les souches industrielles étaient les plus viables pour les deux pH étudié. Les
résultats obtenus sont en accord avec ceux décrits par Sanz (2007).
De même, Matsumoto et al. (2004) et Alander et al. (2001) ont rapporté que la résistance
au pH acide de l‘espèce Bifidobacterium animalis peut être reliée à son excellente survie au
passage du TGI de l‘Homme ; chez cette espèce, une forte induction de l‘activité des ATPases
membranaires a été observée, pouvant ainsi expliquer la résistance élevée au pH acide cette
activité n‘étant pas induite chez les souches moins résistantes aux environnements acides.
Le flux biliaire assure un rôle physiologique très important puisque facilitant la digestion
des composés lipophiles provenant de l‘alimentation. C‘est également un agent antimicrobien
influençant l‘établissement du microbiote intestinal. La tolérance à la bile est un critère
Page 80
CHAPITRE III
Résultats et discussion
déterminant de sélection des bactéries probiotiques, permettant ainsi la survie pendant le
passage à travers le TGI et la colonisation de l‘environnement intestinal.
D‘après les résultats inscrits, il apparait clairement que les souches de bifidobactéries
mises en contact avec une solution de sels biliaires à 0,5% pendant 240 minutes ont maintenu
une remarquable fraction de cellules viables allant jusqu‘à 85,7% (enregistré par la souche
indigène L2), à l‘exception des deux souches indigènes L1 et R1 où le taux de viabilité n‘ a pas
dépassé 50% du nombre initiale des cellules. Bruno, (2012) a affirmé que la résistance à la
bile est une caractéristique souche dépendante et extrêmement variable au sein des espèces et
des genres. D‘après l‘étude de Noriega et al. (2004), Plusieurs souches de Bifidobacterium ont
été adaptées de façon stable aux sels biliaires, à travers une adaptation progressive après une
croissance dans des extraits de sels biliaires en concentration croissante.
Le mécanisme d‘adaptation à la bile chez les bifidobactéries a été corrélé à des
changements stables au niveau du profil de fermentation des sucres, de l‘activité glycosidase,
ainsi qu‘au niveau de la composition en acides gras et du profil protéique membranaire (Ruiz
et al., 2012 ; Ruiz et al., 2007 ; Gueimonde et al., 2005).
En outre, une étude faite par Alp et Aslim, (2010) a mentionné la relation entre la
résistance aux sels biliaires et au pH acide et la production des exopolysaccharides (EPS) par
les bifidobactéries.
La capacité inhibitrice in vitro des bactéries lactiques vis-à-vis des germes pathogènes
semble être une bonne propriété probiotique, comme elle peut jouer un rôle dans la
préservation de la qualité hygiénique des denrées alimentaires (Ammor et al., 2006).
Plusieurs études ont rapporté l‘activité inhibitrice des bifidobactéries envers un grand
nombre de microorganismes pathogènes in vitro et in vivo (Hadadji, 2007., De Vuyst et al.,
2004 ; Sevrin, 2004).
En contact direct avec les germes pathogènes, les souches de bifidobactéries ont présenté
une bonne activité inhibitrice envers Escherichia coli et Staphylococcus aureus où les
diamètres des zones d‘inhibition obtennues varient de 12mm à 18mm, contrairement au
contact avec Listeria innocua dont les diamètres des zones d‘inhibition n‘ont pas dépassé les
7,5 mm.
Cette activité inhibitrice a persisté avec l‘utilisation du surnageant non tamponné issu des
cultures jeunes des souches de bifidobactéries étudiées. Cependant l‘activité inhibitrice a
disparue avec l‘utilisation du surnageant tamponné et cela pour toutes les souches de
bifidobactéries testées. De ce fait, nous avons constaté que l‘activité inhibitrice de nos
souches envers les souches pathogène est due aux acides organiques secrétés dans le milieu.
Ces résultats sont en accord avec ceux trouvés par Hadadji, (2007) et Markas et De Vuyst,
(2006).
Bien que certains rapports ont suggéré que la production d'acides organiques est en partie
responsable de l'activité inhibitrice de bifidobactéries (Bruno and Shah, 2002; Ibrahim and
Page 81
CHAPITRE III
Résultats et discussion
Salameh, 2001). Des travaux récents ont mené à l‘isolement et l‘identification des
bactériocines élaborées par certaines souches de bifidobactéries, comme il est le cas de la
bactériocine nommée « Bifidin I » isolée chez la souche B. infantis BCRC 14602 par
Cheikhyoussef et al. (2010). Cependant, certains rapports ont mentionné des difficultés liées
à l‘élaboration et la purification de ces substances inhibitrices (Cheikhyoussef et al., 2008 ;
Von Ah, 2006 ; Yaldirim and Johnson, 1998).
L‘évaluation de l‘antibiorésistance des souches à usage probiotique a une grande
importance à fin de mettre en évidence une éventuelle multirésistance qui peut être
transformée à la flore intestinale après consommation du produit. Les autorités européennes
ont récemment conclu que quelques bactéries utilisées pour la production d‘aliment pourraient
poser un risque à la santé humaine et animale en raison d'héberger des souches avec les gènes
de résistance transmissibles (Ammor et Mayo, 2007).
Toutes les souches ont montré une résistance à la vancomycine l‘ampicilline, l‘acide
nalidixique, la fosfomycine et la gentamycine, Ces antibiotiques sont utilisés comme agents
sélectifs dans les milieux synthétiques pour l‘isolement et le dénombrement des
bifidobactéries (Ventura et al., 2004).
Une sensibilité de toutes les souches envers la cefotaxime, l‘azithromycine,
l‘amoxicilline et l‘acide fusidique a été enregistré, une différence de comportement vis-àvis la penicilline et l‘oxacilline a été enregistrée. Ces résultats sont en concordance avec ceux
décrits par plusieurs auteurs (D‘Aimmo et al.,2007., Masco et al.,2006., Delgado et al.,2005).
Page 82
Conclusion et perspectives
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Si l‘utilisation des bifidobactéries en industrie laitière a connu une énorme évolution
dans les pays technologiquement avancés, l‘exploitation de ce genre est par contre très limitée
dans certains autres pays comme l‘Algérie, cette limitation concerne la diversité des produits
présents sur le marché, mais également le nombre des souches introduites dans les produits
laitiers, cela est liée aux contraintes posées par le genre Bifidobacterium.
L‘objectif de cette étude était d‘évaluer les principales aptitudes technologiques et
probiotiques de quelques souches indigènes de bifidobactéries pour une éventuelle
exploitation industrielle de ces dites souches. Pour atteindre ce but, quatre souches indigènes
ont été obtennues à partir de la collection du laboratoire de microbiologie appliquée (LMA),
dont elles ont été isolées à partir des selles de nourrissons allaités exclusivement au sein et
non subits un traitement antibiotique, une souche industrielle nous a été fournie par la laitière
« Hodna » de la Wilaya de M‘sila, finalement une autre souche industrielle a été isolée à
partir du lait fermenté probiotique « Danone Activia » contenant des bifidobactéries, produit
et commercialisé en Algérie.
L‘identification des souches a été réalisée par la détermination des caractéristiques
morphologiques, physiologiques et biochimiques. Les résultats de ces tests ont indiqué la
présence de trois espèces de bifidobactéries dont les souches indigène appartiennent aux deux
éspèces, B. breve et B. longum; tandis que les souches industrielles font partie de l‘espèce
B. animalis.
Les principales aptitudes technologiques évaluées sont la tolérance à l‘oxygène, la
croissance à une température de 43 °C, la viabilité et l‘évolution de la post-acidification
pendant 21 jours d‘entreposage à 4 °C, l‘effet des arômes utilisées en industrie laitière sur la
viabilité des souches, la cinétique de croissance et d‘acidification dans le lait et finalement
l‘activité protéolytique et lipolytique de ces souches.
Les mêmes souches ont été mises à une évaluation in vitro de leurs propriétés
probiotiques dont nous citons : la résistance aux conditions gastro-intestinales simulées (pH
acide et sels biliaires), l‘activité antibactérienne envers quelques souches pathogènes où nous
avons essayé de mettre en évidence la nature de l‘agent responsable de l‘inhibition,
finalement, un antibiogramme a été réalisé afin de déterminer le comportement de nos
souches envers les différents types d‘antibiotiques.
Les souches indigènes de bifidobactéries étudiées semblent avoir de bonnes aptitudes
téchnologiques en comparaison avec celles des souches utilisées actuellement en industrie
laitière en Algérie, dont :
Toutes les souches indigènes étudiées avaient la capacité de se croitre en présence de
l‘oxygène en arrivant à des charges proches de celles inscrites par les deux souches
industrielles.
De même les deux souches indigènes L1 et L2 ont enregistré des vitesses de croissance
supérieures à celles inscrites par les souches industrielles lors de l‘incubation à 43 °C.
La suivie de la viabilité des souches durant l‘entreposage frigorifique a révélé la présence
d‘une létalité très élevée où le meilleur taux de viabilité inscrit à la fin de la période de
stockage était environ 28% inscrit par la souche industrielle BB12, suivie par les deux souches
indigènes L1 et R2 avec des taux respectives de 27,4 % et 20 %.
Page 83
Conclusion et perspectives
Encore, la poste acidification le long de cette période de stockage était très faible pour
toutes les souches, cela démontre que les bifidobactéries n‘influencent pas la qualité
organoleptique du produit au cours de l‘entreposage frigorifique.
Une différence de comportement des souches étudiées envers les deux arômes
artificielles utilisées a été enregistrée avec une meilleure viabilité de 67 ,9% inscrite par la
souche industrielle BB12 pour l‘arôme banane et de 64,45% noté pour la souche indigène R2
pour l‘arôme vanille.
La suivie du développement de la biomasse produite par les souches étudiées au cours de
la croissance dans le lait écrémé révèle une différence entre les vitesses spécifiques de
croissance, dont le taux de croissance le plus élevé (0,133h-1) est inscrit par la souche indigène
L1. Ce développement est accompagné de production d‘une acidité titrable, cette dernière se
diffère entre les souches étudiées dont la souche indigène R1 était la plus acidifiante avec
15°D d‘acidité produite après 48 h.
Les souches étudiées ont montré des moyennes voir faibles activités protéolytique et
lipolytique, cela est caractéristique du genre Bifidobacterium.
Dans le même sens, les résultats fournis par l‘étude in vitro des aptitudes probiotiques
des souches de bifidobactéries, sont notamment intéressants. Les souches indigènes ont
montré une résistance remarquable vis-à-vis les conditions acides où elles ont pu préserver un
taux de survie proche de 72% avec un pH de 3 et de 61% avec un pH de 2. Encore une
excellente viabilité des souches indigène dépassant les 85% (enregistré par la souche L2) a été
notée après 240 minutes de contact avec 05% des sels biliaires.
Les résultats de l‘évaluation de l‘activité antibactérienne envers les souches pathogènes
ont désigné l‘existence d‘une bonne activité inhibitrice contre Escherichia coli et
Staphylococcus aureus. En revanche, une faible inhibition a été notée pour toutes les souches
de bifidobactéries contre Listeria innocua.
Cette activité inhibitrice semble à être lié à la production des acides organiques et à un
abaissement de pH du milieu.
Les souches étudiées ont montré une résistance à la vancomycine l‘ampicilline, l‘acide
nalidixique, la fosfomycine et la gentamycine, Ces antibiotiques sont généralement utilisés
comme agents sélectifs pour l‘isolement des bifidobactéries. Par contre, toutes les souches
ont montré une sensibilité envers la cefotaxime, l‘azithromycine, l‘amoxicilline et l‘acide
fusidique.
Notre étude mérite d‘être complétée par la réalisation des démarches suivantes :




Caractérisation génotypique des souches de bifidobactéries.
Etendre l‘étude à un plus grand nombre de souches indigène de bifidobactéries.
Evaluation des interactions des souches de bifidobactéries avec les ferments classiques
utilisés en industrie laitière.
Etude in vivo des propriétés probiotiques de ces souches.
Page 84
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ANNEXES
ANNEXES
Milieux de culture
A: Milieux solides
Milieu MRS
Extrait de levure
5g
Extrait de viande
10 g
Peptone
10 g
Acétate de sodium
5g
Citrate de sodium
2g
Glucose
20 g
KH2PO4
2g
MgSO4
0,25 g
MnSO4
0,05 g
Agar-agar
15 g
Cystéine-HCL
0,5 g
Eau distillée
1000 ml
PH = 6,8
Autoclavage à 120°C pendant 20 minutes
Agar Au Tween 80
Peptone
10g
NaCl
5.0g
CaCl2·2H2O
0.1g
Agar –Agar
20 g
Eau distillée
1000 ml
pH = 7.4
Autoclavage à 120°C pendant 20 min
2,5 ml de Tween 80 est stérilisé séparément puis ajouté au milieu.
ANNEXES
Milieu KMK
Extrait de levure
3g
Biopolytone
2,5g
Glucose
5g
Agar-Agar
Eau distillée
15g
1000 ml
pH = 7.4
Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 15 minutes à 121°C.
Au moment de l‘emploi on ajoute :
1 ml d‘une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v)
1 ml d‘une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p)
Ces solutions sont stérilisées par filtration sur filtre millipore 0.22 µm et sont conservées à
l‘obscurité à 4°C.
Milieu Mueller-Hinton
Infusion de viande de bœuf
Peptone de caséine
300 ml
17,5 g
Amidon de mais
1,5 g
Agar-agar
17 g
pH = 7.4
Autoclavage 20 minutes à 120°C
Gélatine nutritive
Extrait de viande
3g
Peptone
5g
Gélatine
13g
pH = 6.8
Autoclavage à 120°C pendant 20 minutes.
ANNEXES
B: Milieux liquides
Milieu MRS BCP
MRS (milieu liquide)
1000 ml
Bromocrésol pourpre
0,025 mg
pH = 7.0
Autoclavage à120 °C pendant 20 minutes
Bouillon nutritif
Extrait de viande
1g
Extrait de levure
2g
Peptone
5g
Chlorure de sodium
5g
Eau distillée
1000 ml
pH = 7,4
Autoclavage à 120 °C pendant 20 minutes
Lait écrémé
Lait en poudre
Eau distillée
100g
1000 ml
Autoclavage à 110°C pendant 10 minutes
Milieu urée-indole (I nstitut de pasteur Algérie)
Tryptophane
3g
Phosphate monopotassique
1g
Phosphate dipotassique
1g
Chlorure de sodium
5g
Urée
20g
Alcool à 95°
10 ml
Rouge de phénol
25 mg
Eau distillée
1000 ml
ANNEXES
Solutions
Solution de phénolphtaline à 1%
Phénolophtaline déshydraté
Ethanol 95%
1g
100 ml
Tampon phosphate de sodium
Solution (a): 27,8 g NaH2PO4 dans 100ml d'eau distillée
Solution (b): 53,65g Na2HPO4, 7 H2O dans 100ml d'eau distillée
Tampon 0,1 M: 39ml (a) + 61 ml (b) + eau distillée
pH= 7
Autoclavage à 110° pendant 20 min.
Eau physiologique
Chlorure de sodium
8,5 g
Peptone
0,5g
Eau distillée
1000 ml
pH = 7
Autoclavage à 120°C pendant 20 minutes
Résumé :
Notre étude a pour but d’évaluer les principales aptitudes technologiques et probiotiques
de certaines souches indigènes de bifidobactéries, dont, les résultats des tests d’identification
des souches indigènes ont révélé leur appartenance à deux espèces de bifidobactéries dont, B.
longum représentée par les souches L1 et L2 etB. breve représentée par R1 et R2. Bien que, la
souche industrielle BN a été classée au sein de l’espèce B. animalis.
Les résultats de l’évaluation des aptitudes technologiques indiquent que les souches
indigènes présentent des capacités très intéressantes exprimées par le pouvoir de se croitre en
présence de l’oxygène, une vitesse de croissance en 43°C dépassant celles inscrites par les
souches industrielles, une viabilité pendant l’entreposage frigorifique très proche de celle
enregistrée par les souches industrielles, une bonne viabilité lors de l’exposition aux arômes
artificiels, une vitesse de croissance dans le lait meilleure que celles des souches industrielles.
Encore, de très bonnes aptitudes probiotiques ont été enregistrées qui se caractérisent par
une notable résistance aux conditions gastro-intestinales, une bonne activité antibactérienne
envers les pathogènes. Finalement les souches étudiées ont montré une résistance envers
certains antibiotiques dont les souches du genre Bifidobacterium sont connues par leur
résistance naturelle à ces antibiotiques.
Mots clés :
Aptitudes Technologiques; Probiotiques; B. Longum; B. Breve B. Animalis; Souches
Indigènes; Viabilité; Entreposage; Bifidobactéries; Industrie Laitière; Danone Activia.