Abstract - ETH E
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Thèse EPFZN010251 RÉGULATION DU MÉTABOLISME SECONDAIRE ET DE GÉNÉTIQUE DE LA CYANOGÉNÈSE PSEUDOMONAS FLUORESCENS CHAO, UNE SOUCHE ANTAGONISTE DE CHAMPIGNONS PHYTOPATHOGÈNES présentée à L'ÉCOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALE DE ZURICH pour l'obtention du titre de DOCTEUR ES SCIENCES NATURELLES par JACQUES LAVILLE dipl. ing. agr. EPFZ né le 13 mai 1963 originaire de CHEVENEZ acceptée sur (JU) proposition de Prof. Dr. D. Haas, rapporteur Prof. Dr H. Hennecke, corapporteur Zurich, 1993 Résumé 9 RÉSUMÉ Pseudomonas fluorescens CHAO est une souche bactérienne isolée d'un sol de la région de Payeme (Suisse romande) pour son aptitude à coloniser la rhizosphère et à protéger les racines de plantes cultivées contre les attaques de champignons phytopathogenes. La souche CHAO produit une variété de métabolites secondaires (dont l'acide cyanhydrique et différents antibiotiques) et des exoenzymes durant la phase stationnaire. Il a été démontré que l'acide cyanhydrique et au moins un antibiotique, le 2,4-diacétylphloroglucinol, jouent un rôle important dans la suppression par la bactérie de la pourriture noire du tabac causée par Thielaviopsis basicola en système gnotobiotique. Les mécanismes conduisant à la protection des plantes par la bactérie semblent liés à la présence dans la rhizosphère de produits du métabolisme secondaire bactérien. Une région génomique de 3.8 kb, complémentant spécifiquement des mutants défectueux dans la production de HCN, a été clonée et séquencée. Trois gènes contigus hcnABC ont été identifiés. Leur promoteur a été caractérisé: le site d'initiation de transcription a été localisé et un domaine typique de liaison au régulateur ANR/FNR (contrôle anaérobie) apparaît en position -40. Les gènes hcnABC sont nécessaires et suffisants à la cyanogénèse dans Pseudomonas et Escherichia coli. L'expression hétérologue des gènes hcnABC nécessite un promoteur additionnel reconnu par E. coli. Les protéines HcnA, HcnB et HcnC ont été mises en évidence dans Pseudomonas et dans E. coli à l'aide d'un système d'expression utilisant le promoteur T7. Les poids moléculaires apparents coïncident avec les valeurs calculées. Ce système d'expression permet en outre une surexpression de la cyanogénèse d'un facteur 10 dans Pseudomonas. L'analyse des séquences protéiques déduites indiquent dans les trois polypeptides l'existence de segments transmembranaires. HcnB et HcnC ont des analogies avec certaines déshydrogénases et oxydo-réductases et comportent un domaine typique de liaison avec FAD/NAD. Certaines analogies structurelles indiquent que HcnA pourrait avoir une fonction d'activase, cette activation se produisant par la formation d'un radical sur un groupe glycyl dans HcnC. L'enzyme codée par hcnABC, la cyanide synthase, apparaît donc comme une flavoprotéine membranaire composée de 2 ou 3 sous-unités. La souche CHA500, un mutant dérivé du type sauvage CHAO après mutagénèse par transposon, est altérée dans la production des métabolites secondaires et dans sa capacité de protection du tabac contre la pourriture noire. Un cosmide, isolé d'une librairie génomique de la souche CHAO, restaure le métabolisme secondaire de CHA500 ainsi que son aptitude à supprimer les attaques de T. basicola en conditions gnotobiotiques. Le locus responsable de cette complémentation a été séquence. Un gène appelé gacA (pour global activateur) a été identifié. Il porte le code d'un transactivateur de 24 kDa du type FixJ/DegU de la famille des régulateurs à deux composantes. La protéine GacA a pu être mise en évidence dans une expérience gacA, reconstruite par échange bloque la production de HCN, d'antibiotiques, d'exoenzymes et modifie la morphologie des colonies. Un mutant anr (régulation anaérobie) de P. fluorescens CHAO construit par remplacement de gène ne produit pas d'acide cyanhydrique et n'entrave pas la virulence d'expression d'allèles maxicelles dans E. coli. La mutation en dans la souche de T. basicola dans plasmidiques et un sauvage, sol peu aéré. A l'aide de fusions translationnelles hcn'r.'IacZ est démontré que l'expression de la cyanogénèse chromosomiques, il est inductible par des conditions micro-aéobies et que la est contrôlée par ANR de manière très stricte. expression des gènes hcnABC été détectée. transcription des gènes hcnABC un mutant gacA, une légère Dans régulateur GacA est probablement un élément-clé dans un système de signaux responsable du déclenchement du métabolisme secondaire dans Pseudomonas. Dans le cas de l'expression des gènes hcnABC, ANR est vraisemblablement l'activateur primaire, alors que GacA semble jouer un rôle de Le transmission de modulateur. 10 Abstract ABSTRACT Pseudomonas fluorescens CHAO is a root-colonizing soil bactenum which suppresses root diseases of several plants, mcluding cereals and other industnal crops Différent phytopathogenic fungi are antagonized in vitro by strain CHAO Pseudomonas fluorescens CHAO produces a range of low-molecular-weight compounds in stationary growth phase, (mcluding hydrogen cyanide and antibiotics) as well as exoenzymes At least two secondary métabolites, the antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol and hydrogen cyanide, hâve been shown to be involved in suppression of black root rot of tobacco, a disease caused by Thielaviopsis basicola under gnotobiotic conditions Plant protection appears to dépend on bactenal secondary métabolites compléments specifically HCN-defective mutants of strain sequenced Three gènes, hcnA, hcnB and hcnC were identified promoter, which contains a typical ANR/FNR box in the -40 région, was A 3 8 kb région, which CHAO, was cloned and The hcnABC mapped by primer extension The hcnABC gènes are necessary and sufficient for hydrogen cyanide production in Pseudomonas and Eschenchia coli Heterologous hcnABC gène expression depended on an external vector promoter in E coli The pro¬ teins HcnA, HcnB and HcnC were overexpressed in Pseudomonas and in E coli using a T7-based expression System The apparent molecular weights are in agreement with the calculated values Using the same expression System, it was possible to increase cyanide production by a factor of 10 in Pseudomonas The analysis of the deduced amino acid séquences indicates that ail three products may be membrane-bound HcnB and HcnC share similanties with various dehydrogenases or oxidoreductases and contain a typical FAD/NAD-bmding domain Structural analogies indicate that HcnA might be an activating enzyme generating a radical on a glycyl residue in HcnC Thus, the hcnABC gènes appear to encode a 2 or 3-subunit, membrane-bound flavoenzyme, the cyanide synthase a mutant denved from CHAO by transposon mutagenesis, is improduction of secondary métabolites and does not suppress black root rot of tobacco under gnotobiotic conditions A locus from a genomic library of wild type CHAO restonng the mutant's secondary metabolism and suppression ability has been charactenzed and sequenced The identified gène, called gacA (for global activator), encodes a 24-kDa response regulator belongmg to the FixJ/DegU family of two-component regulatory Systems The GacA protein was overexpressed in E coli maxicells Reconstructed gacA mutations in the wild type strain CHAO pleiotropically blocked the pro¬ duction of hydrogen cyanide, antibiotics and exoenzymes, and affected colony morphology Strain paired in CHA500, the replacement (anaérobie régulation) mutant of P fluorescens CHAO constructed by gène does not produce hydrogen cyanide and does not protect tobacco against T basicola poorly aerated soil An anr in Plasmidic and chromosomal hcn' 'lacZ translational fusions showed that hcnABC gène expression was mducible by oxygen limitation and stnctly controlled by ANR at the transcnptional level In a gacA mutant, which is also HCN-negative, some hcnABC expression was détectable regulator is a key élément in a signal transduction system leading to actisecondary metabolism In the case of hcnABC expression, ANR is presumably the pnmary transcnptional activator, whereas GacA may hâve modulating effects The GacA vation of
