Abstract - ETH E

Thèse
EPFZN010251
RÉGULATION
DU
MÉTABOLISME
SECONDAIRE
ET
GÉNÉTIQUE
DE LA
CYANOGÉNÈSE
DE
PSEUDOMONAS
FLUORESCENS
CHAO,
UNE
SOUCHE
ANTAGONISTE
DE
CHAMPIGNONS
PHYTOPATHOGÈNES
présentée
à
L'ÉCOLE
POLYTECHNIQUE
FÉDÉRALE
DE
ZURICH
pour
l'obtention
du titre de
DOCTEUR
ES
SCIENCES
NATURELLES
par
JACQUES
LAVILLE
dipl.
ing.
agr.
EPFZ
né le 13 mai 1963
originaire
de
CHEVENEZ
(JU)
acceptée
sur
proposition
de
Prof. Dr.
D.
Haas,
rapporteur
Prof.
Dr
H.
Hennecke,
corapporteur
Zurich,
1993

Résumé
9
RÉSUMÉ
Pseudomonas
fluorescens
CHAO
est
une
souche
bactérienne isolée
d'un
sol
de la
région
de
Payeme
(Suisse romande)
pour
son
aptitude
à
coloniser la
rhizosphère
et
à
protéger
les racines
de
plantes
cultivées
contre
les
attaques
de
champignons
phytopathogenes.
La souche
CHAO
produit
une
variété de
métabolites
secondaires
(dont
l'acide
cyanhydrique
et
différents
antibiotiques)
et
des
exoenzymes
durant
la
phase
stationnaire.
Il
a
été démontré
que
l'acide
cyanhydrique
et
au
moins
un
antibiotique,
le
2,4-diacétylphloroglucinol,
jouent
un
rôle
important
dans la
suppression
par
la bactérie de
la
pourriture
noire du
tabac
causée
par
Thielaviopsis
basicola
en
système gnotobiotique.
Les mécanismes
conduisant
à la
protection
des
plantes
par
la
bactérie
semblent
liés
à
la
présence
dans la
rhizosphère
de
produits
du métabolisme secondaire
bactérien.
Une
région génomique
de 3.8
kb,
complémentant
spécifiquement
des
mutants
défectueux
dans la
production
de
HCN,
a
été clonée
et
séquencée.
Trois
gènes
contigus
hcnABC
ont
été identifiés.
Leur
promoteur
a
été caractérisé:
le site d'initiation de
transcription
a
été localisé
et
un
domaine
typique
de
liaison
au
régulateur
ANR/FNR
(contrôle
anaérobie) apparaît
en
position
-40.
Les
gènes
hcnABC
sont
nécessaires
et
suffisants
à
la
cyanogénèse
dans Pseudomonas
et
Escherichia
coli.
L'expression
hétérologue
des
gènes
hcnABC nécessite
un
promoteur
additionnel
reconnu
par
E. coli.
Les
protéines
HcnA,
HcnB
et
HcnC
ont
été
mises
en
évidence
dans Pseudomonas
et
dans
E. coli
à
l'aide d'un
système
d'expression
utilisant le
promoteur
T7. Les
poids
moléculaires
apparents
coïncident
avec
les valeurs
calculées. Ce
système
d'expression
permet
en
outre
une
surexpression
de la
cyanogénèse
d'un facteur
10 dans
Pseudomonas.
L'analyse
des
séquences protéiques
déduites
indiquent
dans les trois
polypeptides
l'existence
de
segments
transmembranaires.
HcnB
et
HcnC
ont
des
analogies
avec
certaines
déshydrogénases
et
oxydo-réductases
et
comportent
un
domaine
typique
de liaison
avec
FAD/NAD. Certaines
analogies
structurelles
indiquent
que
HcnA
pourrait
avoir
une
fonction
d'activase,
cette
activation
se
produisant
par
la
formation d'un radical sur un
groupe
glycyl
dans
HcnC.
L'enzyme
codée
par
hcnABC,
la
cyanide synthase,
apparaît
donc
comme une
flavoprotéine
membranaire
composée
de 2
ou
3
sous-unités.
La souche
CHA500,
un
mutant
dérivé du
type
sauvage
CHAO
après mutagénèse
par
transposon,
est
altérée
dans la
production
des
métabolites
secondaires
et
dans
sa
capacité
de
protection
du tabac
contre
la
pourriture
noire.
Un
cosmide,
isolé d'une
librairie
génomique
de
la
souche
CHAO,
restaure
le métabolisme secondaire de
CHA500
ainsi
que
son
aptitude
à
supprimer
les
attaques
de
T.
basicola
en
conditions
gnotobiotiques.
Le
locus
responsable
de
cette
complémentation
a
été
séquence.
Un
gène appelé gacA
(pour
global
activateur)
a
été identifié.
Il
porte
le code d'un
transactivateur de
24
kDa du
type
FixJ/DegU
de la
famille
des
régulateurs
à
deux
composantes.
La
protéine
GacA
a
pu
être
mise
en
évidence
dans
une
expérience
d'expression
en
maxicelles
dans E. coli.
La mutation
gacA,
reconstruite
par
échange
d'allèles dans
la souche
sauvage,
bloque
la
production
de
HCN,
d'antibiotiques,
d'exoenzymes
et
modifie la
morphologie
des colonies.
Un
mutant
anr
(régulation
anaérobie)
de P. fluorescens
CHAO
construit
par
remplacement
de
gène
ne
produit
pas
d'acide
cyanhydrique
et
n'entrave
pas
la virulence
de
T. basicola dans
un
sol
peu
aéré.
A l'aide
de
fusions
translationnelles
hcn'r.'IacZ
plasmidiques
et
chromosomiques,
il
est
démontré
que
l'expression
de la
cyanogénèse
est
inductible
par
des conditions
micro-aéobies
et
que
la
transcription
des
gènes
hcnABC
est
contrôlée
par
ANR de
manière très stricte. Dans
un
mutant
gacA,
une
légère
expression
des
gènes
hcnABC
été détectée.
Le
régulateur
GacA
est
probablement
un
élément-clé dans
un
système
de
transmission
de
signaux responsable
du
déclenchement du métabolisme
secondaire
dans Pseudomonas.
Dans
le
cas
de
l'expression
des
gènes
hcnABC,
ANR
est
vraisemblablement l'activateur
primaire,
alors
que
GacA
semble
jouer
un
rôle
de
modulateur.

10
Abstract
ABSTRACT
Pseudomonas
fluorescens
CHAO
is a
root-colonizing
soil
bactenum which
sup-
presses
root
diseases
of
several
plants,
mcluding
cereals
and
other industnal
crops
Différent
phytopathogenic
fungi
are
antagonized
in
vitro
by
strain
CHAO
Pseudomonas
fluorescens CHAO
produces
a
range
of
low-molecular-weight compounds
in
stationary
growth phase,
(mcluding
hydrogen
cyanide
and
antibiotics)
as
well
as
exoenzymes
At
least
two
secondary
métabolites,
the
antibiotic
2,4-diacetylphloroglucinol
and
hydrogen
cyanide,
hâve
been
shown
to
be
involved
in
suppression
of black
root
rot
of
tobacco,
a
disease
caused
by
Thielaviopsis
basicola
under
gnotobiotic
conditions Plant
protection
appears
to
dépend
on
bactenal
secondary
métabolites
A
3 8
kb
région,
which
compléments
specifically
HCN-defective
mutants
of
strain
CHAO,
was
cloned
and
sequenced
Three
gènes,
hcnA,
hcnB
and
hcnC
were
identified
The
hcnABC
promoter,
which
contains
a
typical
ANR/FNR box
in
the
-40
région,
was
mapped by
primer
extension
The
hcnABC
gènes
are
necessary
and
sufficient
for
hydrogen cyanide production
in
Pseudomonas and Eschenchia
coli
Heterologous
hcnABC
gène
expression
depended
on
an
external
vector
promoter
in
E coli The
pro¬
teins
HcnA,
HcnB
and
HcnC
were
overexpressed
in
Pseudomonas
and
in
E coli
using
a
T7-based
expression
System
The
apparent
molecular
weights
are in
agreement
with
the
calculated
values
Using
the
same
expression
System,
it
was
possible
to
increase
cyanide
production by
a
factor
of
10
in
Pseudomonas The
analysis
of
the deduced
amino
acid
séquences
indicates that
ail three
products
may
be
membrane-bound HcnB
and HcnC share similanties with
various
dehydrogenases
or
oxidoreductases and
contain
a
typical
FAD/NAD-bmding
domain
Structural
analogies
indicate
that
HcnA
might
be
an
activating
enzyme
generating
a
radical
on a
glycyl
residue
in
HcnC
Thus,
the
hcnABC
gènes appear
to
encode
a
2
or
3-subunit,
membrane-bound
flavoenzyme,
the
cyanide
synthase
Strain
CHA500,
a
mutant
denved
from
CHAO
by
transposon
mutagenesis,
is im-
paired
in
the
production
of
secondary
métabolites and does
not
suppress
black
root rot
of
tobacco
under
gnotobiotic
conditions
A
locus
from
a
genomic
library
of
wild
type
CHAO
restonng
the
mutant's
secondary
metabolism and
suppression
ability
has
been
charactenzed
and
sequenced
The
identified
gène,
called
gacA
(for
global
activator),
encodes
a
24-kDa
response
regulator
belongmg
to
the
FixJ/DegU
family
of
two-compo-
nent
regulatory
Systems
The
GacA
protein
was
overexpressed
in
E
coli
maxicells Re-
constructed
gacA
mutations
in the
wild
type
strain
CHAO
pleiotropically
blocked the
pro¬
duction of
hydrogen cyanide,
antibiotics and
exoenzymes,
and affected
colony
mor-
phology
An
anr
(anaérobie régulation)
mutant
of P
fluorescens
CHAO constructed
by
gène
replacement
does not
produce hydrogen
cyanide
and
does
not
protect
tobacco
against
T
basicola
in
poorly
aerated soil
Plasmidic and chromosomal hcn'
'lacZ translational
fusions
showed
that
hcnABC
gène
expression
was
mducible
by
oxygen
limitation
and
stnctly
controlled
by
ANR
at
the
transcnptional
level
In
a
gacA
mutant,
which
is also
HCN-negative,
some
hcnABC
expression
was
détectable
The GacA
regulator
is
a
key
élément
in a
signal
transduction
system
leading
to acti-
vation
of
secondary
metabolism In the
case
of
hcnABC
expression,
ANR
is
presumably
the
pnmary
transcnptional
activator,
whereas
GacA
may
hâve
modulating
effects