2. Regu Expression Genes
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Régulation de l‘Expression des Gènes A. Galmiche, 2013-2014 1. Généralités 2. Régulation transcriptionnelle 2.2. Régulation des Facteurs de Transcription 2.3. Régulation de la Chromatine 3. Régulation Post-transcriptionnelle 3.1. Modalités spécifiques 3.2. Interférence ARN Régulation de l‘Expression des Genes La régulation de l‘expression des gènes est l‘étape ultime, intégratrice pour la plupart des régulations cellulaires Régulation à court et moyen termes envisagées dans ce cours; les modalités de régulation de l‘expression des gènes sur le long terme seront envisagées dans le cours consacré a l‘épigénétique Régulation de l‘Expression des Gènes Régulations transcriptionnelles (Recrutement et activation des facteurs de transcription, Régulation de la chromatine) Régulations post-transcriptionnelles: Stabilité du messager, localisation, traduction contrôlent également l‘expression des genes. 1. Généralités 2. Régulation transcriptionnelle 2.2. Régulation des Facteurs de Transcription 2.3. Régulation de la Chromatine 3. Régulation Post-transcriptionnelle 3.1. Modalités spécifiques 3.2. Interférence ARN Les Etapes de la Transcription Recrutement des facteurs de Transcription Organisation locale de la chromatine Capping Elongation - Epissage Terminaison – ajout polyA Cell 2002; 108: 439-451 Le complexe ARN Polymérase ARN Pol-II, un complexe qui ouvre la molécule d‘ADN, permet l‘entrée et la polymérisation des nucleotides, puis la sortie de l‘ARN ARN Recrutement ? Activation ? Régulation Transcriptionnelle Les Séquences actives en Cis / Trans Séquences en CIS: séquences jouant un rôle sans être traduites, comme les éléments du promoteur et les enhancer(s) en TRANS: Les séquences qui régulent la transcription par l’intermédiaire de la production de protéines régulatrices Séquences actives en CIS: Promoteurs ARN -35 TATA -25 +1 +30 ADN ARN Ilots CpG -120 -60 +1 ADN Promoteur situé au niveau du site de démarrage de la transcription Séquences actives en CIS: Enhancers Enhancers: éventuellement éloignés par rapport au site de démarrage de transcription: plusieurs milliers de pb (en amont ou en aval) ARN -40 +40 Enhancer ADN Core Promoter combinaison propre promoteur / enhancer permet réponses transcriptionnelles finement régulables et adaptées à chaque gène … Séquences actives en TRANS: Facteurs de Transcription Protéines capables d‘interagir avec ADN de facon séquence-spécifique Régulent l‘expression des gènes en contrôlant l‘assemblage et l‘activation de la machinerie transcriptionnelle Facteurs de transcription généraux / spécifiques Les Facteurs de Transcription Domaine d‘interaction avec l‘ADN Helix turn Helix, Zn finger, Leu zipper... reconnaissant souvent l‘ADN sous formes de dimères … reconnaissance de séquences palindromiques Domaine de transactivation de la transcription C‘est à dire le domaine qui recrute et active la machinerie transcriptionnelle Les domaines d‘interaction avec l‘ADN des Facteurs de Transcription: le motif HLH Dimère HLH HLH palindrome Les Facteurs de Transcription sont l‘objet d‘une régulation complexe Régulés par modifications post-traductionnelles, localisation sub-cellulaire, interaction avec d‘autres proteines, interactions avec ligands ou metabolites, niveau d‘expression. Ces modalités étant la plupart du temps intriquées. Régulation des Facteurs de Transcription par les Modifications post-traductionnelles: phosphorylation Cascades de Kinases impliquées dans transduction intracellulaire des signaux mitogènes, et régulant notamment l‘expression des gènes de la prolifération cellulaire. Régulation par phosphorylation de certains facteurs de transcription Régulation du Facteur de Transcription Elk-1 par Phosphorylation ERK pp Elk-1 Elk-1 SRF SRF: serum response Factor Interaction SRE (serum response Element) SRF Immediate early genes (c-fos) Régulation de la localisation subcellulaire: le Facteur de Transcription NFκ κB NFκB joue un rôle majeur dans la réponse inflammatoire dans les cellules de mammifères Une étape de translocation nucléaire constitue l‘étape cruciale de la régulation de NFκB A l‘état de base, NFkB est séquestré par un inhibiteur cytoplasmique appelé IkB. L‘activation de NFkB passe par la destruction d‘IkB Protéolyse Régulée de l’Inhibiteur Cytoplasmique Iκ κB Et translocation nucléaire de NF-κ κB IκB Stimuli inflammatoires IκB IκB NFκB NFκB NFκB Pore nucléaire Cox2, IL-6 Régulation par ligands: Superfamille des Récepteurs Nucléaires Environ 50 membres chez l‘homme, caractérisés par conservation séquences entre les membres de cette superfamille Les ligands sont en général de petites molécules lipophiles, par exemple hormones (TR: hormone thyroidienne T3) et produits du métabolisme (PPAR: acides gras) Superfamille des Récepteurs Nucléaires Type I: cytoplasmiques au repos, translocation nucléaire contemporaine de l‘activation Interaction avec ADN sous forme d‘homodimères récepteurs Stéroides (oestrogènes, androgènes, glucocorticoides, progestérone) Type II: résidents nucléaires, même en l‘absence de ligand Interaction avec ADN sous formes d‘hétérodimeres avec RXR (retinoid X Receptor) Par ex, récepteurs de l‘hormone thyroidienne T3, de l‘acide rétinoique Structure Générale des Récepteurs Nucléaires DNA Binding Domain N Ligand Binding Domain C DNA binding domain est la région la plus conservée Deux doigts de Zn2+, coordonnés par résidus Cys Interaction avec séquences courtes de l‘ADN Quelques Ligands des Récepteurs Nucléaires Note: certains récepteurs ne possèdent pas de ligand connus, et ne sont peut-être régulés que par des signaux transductionnels Récepteurs nucléaires PPAR et contrôle du métabolisme PPAR: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α, β/δ, et γ Les récepteurs PPAR sont exprimés dans tous les tissus, avec cpdt des niveaux d‘expressions plus élevés dans les tissus „métaboliques“ Régulation des gènes impliqués dans métabolisme, particulièrement adipogenèse / adipolyse Ligands naturels sont lipides Agonistes synthétiques de PPARγ (thiazolidinediones, dont rosiglitazone) utilisés comme anti-diabétiques Médicaments actifs sur les PPAR et le métabolisme 1. Généralites 2. Régulation transcriptionnelle 2.2. Régulation des Facteurs de Transcription 2.3. Régulation de la Chromatine 3. Régulation Post-transcriptionnelle 3.1. Modalités spécifiques 3.2. Interférence ARN Organisation de l‘ADN en chromatine 1. ADN 2. Fibre 11 nm 4. Chromatine interphase 3. Fibre 30 nm 5. Chromosome métaphasique La fibre de 11 nm nucléosomes Entre nucléosomes, ADN Linker (20 a 100 pb suivt les espèces) Le Nucléosome Histones Protéines extrèmement conservées chez les eucaryotes Les histones contiennent le domaine histone caractéristique: organisation commune en α-hélices qui assure dimérisation des histones et interaction avec l‘ADN chaque dimère d‘histone (H2A-H2B et H3-H4) reconnait l‘ADN sur environ 30 pb Le nucléosome interagit avec l‘armature phosphate de la molécule d‘ADN, mais pas avec les bases: pas de discrimination suivant séquence d‘ADN ! Histones Contrairement au domaine histone, la queue N-ter des histones ne contribue pas à la structure de base ou à la stabilité du nucléosome forme des boucles, qui établissent interactions avec d‘autres protéines régulatrices et concentrent modifications post-traductionnelles Acetylation, Methylation, Phosphorylation… Les principales Modifications Post-Traductionnelles des Histones HDACs Acetylation (Lys) HATs HDMs Histones HMTs Methylation (Lys, Arg) S-adenosyl Methionine Acetyl-CoA Kinases Phosphatases ATP Phosphorylation (Ser) Variants d‘Histones Histone H2A: variants impliqués dans adaptations de la structure de la chromatine à différents évènements pouvant affecter le noyau H2A.Z associé à des régions silencieuses de la chromatine H2A.X rôle dans la réparation de l‘ADN phosphorylé au niveau des sites de cassure dble brin Macro-H2A associé au chromosome X inactivé Histone H3 existent également en plusieurs variants L‘environnement Chromatinien des Gènes Actifs diffère de celui des Gènes Inactifs Sensibilité à la DNAse différencie des régions de la chromatine qui sont riches en gènes actifs (accessibles) de gènes inactifs (résistant) Régulation par remodelage de la chromatine… variants d’histones, modifications post-traductionnelles histones Organisation de la chromatine territoires nucléaires Heterochromatin Euchromatin Régulation chromatinienne de l‘expression des gènes Régulation chromatinienne de l‘expression des gènes Le complexe POLII possède une taille voisine de celle du nucléosome: la transcription requiert la mobilisation des histones et l‘ouverture locale de la chromatine ARN Visualisation des évènements contemporains de l‘activation transcriptionnelle Les techniques d‘imagerie sur cellules vivantes permettent d‘analyser en continu les phénomènes survenant lors de l‘activation de la transcription Janicki SM et al. (2004) From silencing to gene expression: Real-time analysis in single cells. Cell 116, 683-98. Activation transcriptionnelle en „live“ (1) ADN mRNA Pol II Epissage polyA Décondensation locale rapide de la chromatine Recrutement de ARN polymerase II et des facteurs jouant rôle dans maturation RNA Activation transcriptionnelle en „live“ (2) Disparition Histone H3 tri-meK9 Apparition variant histone H3.3 Que retenir concernant les histones ? 1. L‘organisation dynamique du noyau permet l‘échange rapide des facteurs contrôlant transcription et maturation du messager 2. Décondensation locale rapide de la chromatine, activation transcriptionnelle et maturation du messager sont des processus rapides et survenant de façon synchrone 3. Remplacement rapide des histones par certains variants et modifications post-traductionnelles jouent un rôle dans le contrôle de l‘expression : „code histone“ L‘Initiation de la Transcription n‘est pas la seule étape Régulée Addition 5‘-Cap Addition queue Poly-A en 3‘ Epissage Export nucléaire Recrutement des facteurs de Transcription Organisation locale de la chromatine Capping Elongation - Epissage Terminaison – ajout polyA Cell 2002; 108: 439-451 1. Généralites 2. Régulation transcriptionnelle 2.2. Régulation des Facteurs de Transcription 2.3. Régulation de la Chromatine 3. Régulation Post-transcriptionnelle 3.1. Modalités specifiques 3.2. Interférence ARN Régulations Post-Transcriptionnelles recouvrent de nombreuses modalités: stabilité du messager, distribution subcellulaire, utilisation du messager pour la synthèse des protéines s’appliquent « par-dessus » les régulations transcriptionnelles pour réguler l’expression d’un gène et permettre adaptation fine La régulation du métabolisme du fer illustre l‘importance et la variété des régulations post-traductionnelles dans le contrôle de l‘expression des gènes 1. Généralites 2. Régulation transcriptionnelle 2.2. Régulation des Facteurs de Transcription 2.3. Régulation de la Chromatine 3. Régulation Post-transcriptionnelle 3.1. Modalités specifiques 3.2. Interférence ARN Métabolisme du fer à l‘échelle de la Cellule Fe Transferrine et son récepteur (TfR) permettent entrée du fer transferrine (Tf) Récepteur de la transferrine (TfR) Ferritine Ferritine, protéine de stockage intracellulaire du fer Métabolisme du fer à l‘échelle de la Cellule Trop de fer: la cellule tend à diminuer l‘entrée (moins de TfR), et à augmenter le stockage intracellulaire (plus de ferritine) Pas assez de fer: plus de TfR, moins de ferritine Protéines régulatrices du Métabolisme du Fer IRP (Iron Binding Protein) des protéines sensibles aux concentrations intracellulaires de fer Les IRP sont capable de reconnaitre des IRE (Iron Response Elements), qui sont des séquences adoptant une structure secondaire en épingle à cheveux et présentes dans les ARNs codant la ferritine / le récepteur de la transferrine Augmentation des niveaux de fer dans la cellule inactive protéines IRP Régulation Post-transcriptionnelle du Métabolisme du Fer par les IRPs IRP IRP prévient traduction Ferritine En présence de fer, traduction accrue de ferritine IRE IRP stabilise le messager TfR IRE X 5 En présence de fer, mRNA TfR décroit Regulation de la Stabilité des mRNA L‘étape de disparition des mRNA est régulée au même titre que la transcription Différentes modalités de régulation de la décroissance des mRNA AU-rich elements (ARE) dans la région 3‘ des gènes Eléments déstabilisant dans région codante Présence d‘un codon stop prématuré micro-RNA Première étape de déadénylation commune à toutes ces modalités La Poly(A)nuclease est l‘enzyme qui réalise cette coupure Régulation de la Stabilité des mRNA Des régions spécialisées du cytoplasme, les P-bodies (processing bodies, en rouge), jouent un role dans le turn-over des messagers 1. Généralites 2. Régulation transcriptionnelle 2.2. Régulation des Facteurs de Transcription 2.3. Régulation de la Chromatine 3. Régulation Post-transcriptionnelle 3.1. Modalités spécifiques 3.2. Interférence ARN Interférence ARN et Régulation de l’expression des Gènes petits ARN de 21-24nt complémentaire reconnaissant ARN messager tendent à réduire son expression L’ARN messager ciblé est dégradé et / ou sa traduction inhibée A l’origine, mécanisme découvert chez plantes Introduction gène codant enzyme synthèse pigments Résultat attendu Résultat observé Machinerie interférence ARN présente dans toutes les cellules eucaryotes… ARN interférent Expérimentalement ou in vivo, l‘ARN interférence peut être déclenchée de plusieurs façons Le mécanisme d‘action repose toujours sur la formation d‘un petit ARN simple brin, dit ARN interférent, qui est actif au sein d‘un complexe enzymatique appelé RISC(RNA-Induced Silencing Complex) L‘ARN interférent peut aussi bien reconnaitre directement le gène que les régions non traduites du mRNA Interférence ARN et Régulation de l’expression des Gènes Homologie parfaite Dégradation ARN Homologie partielle Blocage traduction ARNs interférents exogènes et endogènes L’interférence ARN peut être induite par ARN exogènes: siRNA (small interfering RNA) C’est aussi un mécanisme endogène: les miARN (micro ARN), dont la synthèse est dirigée à partir de gènes nucléaires propres Biogenèse des miARN 1. Transcrit primaire de 90 à 200 nt par ARN polymérase, avec coiffe et poly-A: appariements internes en épingles c’est le pri-RNA (primary RNA) 2. Dans le noyau, précurseur maturé par Drosha, une RNAse active sur l’ARN double brin, donnant pre-miRNA exporté dans le cytoplasme 3. DICER libère ARN mature simple brin actif au sein du RISC Biogenèse des miARN 2 1 3 4 Fonctions Physiologiques des miARN environs 1000 gènes de miRNA identifiés à ce jour dans le génome humain un microRNA tend à réguler l’expression de plusieurs centaines de protéines … Rôle des mi-RNA dans coordination de l’expression des gènes au sein de “programmes transcriptionnels” ? Fonctions Physiologiques des miARN rôles extrèmement étendus….. Régulation différenciation cellulaire, en pathologie: cancers, Protection vis à vis intrusion de génomes étrangers (virus) Conclusions Tous les gènes font l‘objet d‘un contrôle de leur expression. Large variété des modalités de contrôle: à toutes les étapes initiation de la transcription - maturation du messager traduction
