Noms des roneotypeurs

Virologie – Diagnostic & Dépistage Virologique – page 1/13
Blondie
Le 03/04/2009
Puis Gaudex/Cluzel
VIROLOGIE
14h-16h
Marie Salissard & Chevallereau Virginie
Bertagnoli
Diagnostic et Dépistage Virologique
Introduction : Diagnostic Vs Dépistage
 Le dépistage : c’est la recherche systématique à l’aide d’examens, dans une population, des
individus (ou des groupes) atteints par un trouble de santé donné, même s’il a pu passer inaperçu.
 Le diagnostic : c’est l’identification d’une maladie chez un sujet qui présente des troubles. Il
est malade et on veut en connaitre la cause, l’agent responsable de la maladie.
 Un diagnostic est donc mis en œuvre sur des sujets malades (présence de symptômes ou de
lésions), tandis que le dépistage est appliqué sur des sujets apparemment sains (absence de
symptôme et de lésion).
Les principales différences entre le diagnostic et le dépistage sont les suivantes :
Les différences sont donc essentiellement au niveau de la stratégie.
Le diagnostic est un acte individuel pour répondre à une question précise à laquelle on veut une
réponse précise ; on peut donc mettre en œuvre plusieurs méthodes d’investigation en même temps.
A l’opposé, pour le dépistage, il n’y a en général pas de signe clinique comme signe d’appel mais on
ne peut pas non plus utiliser plusieurs techniques d’investigation ; en effet, les tests sur l’ensemble
d’une population couteraient trop chers et poseraient des problèmes d’interprétation. On choisit donc
un seul test en fonction de son cout, de son efficacité de détection ...
Dans quelles situations faut-il mettre en place un diagnostic ou un dépistage ?
 On réalise un diagnostic pour des :
- Maladies pour lesquelles la démarche d’un diagnostic étiologique est nécessaire (mise en place
traitement, prophylaxie, pronostic)
- Zoonoses dans le but de prévenir le propriétaire des risques encourus de contamination.
- Maladies pour lesquelles le statut indemne est requis (commerce, concours, insémination…)

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- Maladies émergentes ou ré-émergentes : lorsque des symptômes font penser à une maladie
émergente ou ré-émergente (fièvre aphteuse, FCO), il y a une suspicion clinique où il faut lever le
doute grâce à un diagnostic.
Remarque : - un diagnostic individuel peut-être utile au groupe : exemple de la prophylaxie.
- un diagnostic de zoonose peut-être utile pour le propriétaire.
 On réalise un dépistage lors de :
- Surveillance épidémiologique organisé à échelle nationale en général
- Programmes d’éradication : exemple de la Brucellose.
- Programmes de contrôle passant par la vaccination, d’où la nécessité de savoir différentier les
animaux vaccinés des animaux vaccinés et infectés.
- Maladies émergentes (exemple de l’influenza aviaire) ou des maladies ré-émergentes
Il existe des plans d’échantillonnage et des tests de dépistage.
 Dans les 2 cas, le test diagnostic idéal serait un test rapide, simple, sensible, spécifique et bon
marché mais cela n’existe que dans un « monde parfait ».
Les tests diagnostics dépendent du marché ou de la filière auquel on s’intéresse: par exemple on est
prêt à payer plus cher pour les chevaux de courses que pour les productions animales en particuliers
pour les lapins ou les volailles.
En ce moment la demande des tests est surtout portée sur la rapidité, la simplicité d’emploi et
d’interprétation.
Le diagnostic doit permettre une interprétation rapide et plus simple pour pouvoir réagir très
vite donc on privilégie plutôt les méthodes directes (mise en évidence de l’agent pathogène ou d’un
de ses composants tel que l’Ag). Cependant, parfois on n’a pas le choix et on utilise la méthode
indirecte (essentiellement les tests sérologiques de mise en évidence d’Ac).
A l’opposé, lors de dépistage, on cherche avant tout un coût peu élevé et une mécanisation possible
du test, tel que l’on peut en avoir avec les méthodes indirectes comme la sérologie.
Les problèmes du diagnostic étiologique (c-à-d de recherche des causes d’une pathologie) sont les suivants :
 Pour les méthodes traditionnelles : en général elles sont trop lentes pour permettre une
action efficace sur un cas individuel.
 Pour les nouvelles méthodes dites rapides : elles sont plus adaptées à une médecine
individuelle. Il existe ainsi de plus en plus de kits commerciaux à la disposition du praticien où l’on a
une réponse qualitative : le test est positif ou négatif. Les laboratoires équipés peuvent maintenant
également donner des réponses rapides suite à des tests moléculaires.
Souvent en
association avec

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Les stratégies du diagnostic virologique vont être décidées en fonction :
1) De l’objectif fixé c’est-à-dire en général, en fonction de la situation sur le terrain
2) Du virus recherché : on émet une hypothèse sur un ou quelques agents pathogènes possibles
afin d’orienter la mise en culture (facile, difficile, sur milieu pparticulier) et donc le(s) test(s)
réalisé(s), afin d’aider au diagnostic. On ne va évidemment pas rechercher tous les virus existants, il
faut une orientation préalable !
3) Du type de prélèvement dont dépend la richesse en virus (différences si le prélèvement a été
fixé ou non, congelé ou juste conservé à 4°C, effectué sur animal vivant ou mort ...)
I- Méthodes directes de détection virale :
1) Diagnostic histopathologique :
Les prélèvements sont réalisés sur cadavre ou par biopsie. Ils sont le plus souvent ensuite fixés dans
du formol à 10% (attention le formol ne sera bientôt plus utilisé). Le tissu est alors fixé et on peut
rechercher les effets cytopathiques (ECP) caractéristiques c’est-à-dire les ECP viro-induits ; on peut,
par exemple, identifier des corps d’inclusion lors de la maladie de Carré (image à gauche) et des
images en marguerite intra-nucléaire lors d’adénovirus (image à droite).
Cette méthode est réalisée en laboratoire donc il est important pour le clinicien de bien cibler le tissu
prélevé c’est-à-dire qu’on doit avoir une idée de ce que l’on cherche avant pour prélever le tissu le
plus touché. Il faut également bien identifier son prélèvement (sa localisation, ce qu’on soupçonne...)
avant de l’envoyer au laboratoire.
Ainsi le laboratoire nous donne en réponse la famille virale et parfois en plus, l’espèce virale.
2) Microscopie électronique :
 Aspects généraux de la méthode
C’est une méthode directe, spécifique au diagnostique virologique qui a été mise au point dans les
années 50.
Le diagnostic se fait sur la morphologie des virus grâce à une observation en microscopie
électronique. C’est donc plus ou moins précis selon les caractéristiques +/- spécifiques d’une famille
ou mieux d’une espèce. Par contre, c’est pratique pour les virus inconnus car cette méthode ne
nécessite pas, par exemple, de colorants spécifiques. Enfin, une limite est que la microscopie
électronique, comme toute méthode d’observation par l’Homme, dépend de la sensibilité de
l’opérateur.

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La méthode de base est le contraste négatif, méthode non sélective utilisant des sels opaques
(sels d’argent). Sinon, la méthode peut être améliorée si on suspecte fortement un virus grâce à la
méthode d’immunomicroscopie (utilisation pour test d’agrégation avec des Anticorps anti-viraux).
Elle présente des avantages et des inconvénients résumés dans le tableau suivant :
 Les aspects généraux des virus en contraste négatif :
 Observation des virus nus :
Ils ont une forme régulière, mesurent 20 à 90 nm
-Les virus de grande taille (70-80nm) sont par exemple les Reoviridae, les Adenoviridae
-Les virus de taille moyenne (40-50 nm) ou petite taille (<40 nm) sont difficilement identifiables
(ex : Papillomaviridae)
-Les virus de petite taille (20-30 nm) : n’ont pas de caractéristiques morphologiques visibles
(ex : Parvoviridae, Picornaviridae)
La richesse des prélèvements permet de détecter des virus de toute petite taille. Cependant, le
diagnostic reste plus aisé pour les virus de grande taille.
 Observation des virus enveloppés :
Ils ont une membrane lâche le plus souvent, un aspect souvent pléomorphe, leur forme est souvent
grossièrement globulaire. Ce sont des virus lisses ou virus à spicules
- Poxviridae : forme de brique (150-350 nm)
- Rhabdoviridae : forme allongée
- Filoviridae : longueur variable
- Herpesviridae: « œuf au plat »
- Coronaviridae: couronne
Lorsque le test est positif cela indique une très forte valeur prédictive du virus.
3) Isolement viral
C’est la méthode d’origine, historique et toujours de référence parce qu’elle présente une grande
prédictivité). C’est la plus utilisée avant la mise en place des tests chimiques. Elle consiste en la mise
en culture du virus potentiel dans des cellules permissives, qui permettent son amplification et donc
la visualisation des effets cytopathiques ECP (Cf. TP de 1ère année avec la culture de cellules
contaminée par le virus de la myxomatose). On caractérise ensuite l’ECP grâce à des techniques
immuno-histochimiques.

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Comme indiqué, cette méthode est assez spécifique et sensible si le test est positif.
Mais s’il est négatif, il existe des biais tel que la quantité de virus insuffisante au départ. C’est un test
viro-dépendant. Il peut y avoir un problème de prélèvement car il est optimal durant la phase aigue de
la pathologie ; s’il est réalisé trop tôt ou trop tard, le test est la plupart du temps, voué à l’échec. Il
peut y avoir aussi un problème au niveau du transport durant lequel le virus résiste +/- bien. Par
exemple, le virus respiratoire syncitial des jeunes résistent très peu de temps. Il donc très important
de contrôler les conditions de conservation, en favorisant un froid positif et en tout cas, jamais à -
20°C car cela inactive la majorité des virus.
Il faut également un laboratoire habitué et équipé pour réaliser des cultures cellulaires (ce qui
représente un investissement important). Enfin, ce n’est pas un test très rapide, il nécessite plusieurs
jours à plusieurs semaines.
De plus, il existe des virus difficilement cultivables voire non cultivables in vitro auxquels il faut
penser. Ex : les calicivirus (hors félins). Il existe aussi des virus ne produisant pas d’ECP selon les
souches, par exemple les Pestiviridae (peste porcine et BVD). Ex : BVD. Il faut alors compléter par
une immunofluorescence (réaction Ag/Ac).  On a alors dans ces 2 cas des faux négatifs !
Bertagnoli «tiens, oups, j’ai parlé de tout ça extemporanément de la diapo ! » ........ mais bien sûr !
Les types de prélèvement sont du sang, des urines, ou des tissus qui seront ensuite broyés, centrifugés
et filtré pour éliminer les débris cellulaires. Les virus sont mis en culture avec beaucoup
d’antibiotiques pour empêcher les destructions cellulaires dues à des développements bactériens.
Le prélèvement doit être fait si possible, lors de la phase aiguë de la maladie, dès l’apparition des
premiers symptômes, sinon on est en dehors du pic de virémie. Cette fenêtre de temps est très courte,
cependant c’est elle qui conditionne la réussite de l’isolement. La conservation du prélèvement pour
une mise en culture doit se réaliser avec du froid positif : +4°C. On peut aussi les mettre à -80°C
dans l’azote liquide. Le froid négatif à -20°C n’est utilisé que pour la PCR puisqu’il inactive les
virus. Attention il faut réaliser un prélèvement propre !!!
Les méthodes sont peu rapides en méthode conventionnelle mais il existe des possibilité de méthodes
dites de « culture rapide » du type :
- Observation des cellules : Cellules primaires ; lignées (souches) cellulaires diploïdes ; cellules en
lignées continues. (Remarque : culture in ovo)
- Détection des virus : ECP ; hémadsorption/hémagglutination : exemple de l’influenza aviaire;
techniques immunologiques.
Au final, le test donne une réponse sûre que lorsqu’il est positif. La valeur prédictive positive est très
forte. C’est un diagnostic étiologique de quasi certitude.