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Introduction et définitions
Fonction de l’information génétique
Protéines
. Fonctions diverses
. Structure (protéines membranaires)
. Contractilité (actine, myosine)
. Transport (Hb, Alb)
. Hormones (insuline)
. Enzymes (biosynthèses)
. # 100.000 protéines différentes
. Constituées d’acides aminés
. Synthèse contrôlée : traduction
Activité biologique
Forme dans l’espace (conformation)
Nature et ordre d’enchaînement
des acides aminés (séquence)
Information génétique -> acides nucléiques
Support de l’information génétique
Présents chez tous les organismes vivants et les virus
Polymères d’unités simples nommées nucléotides
En fonction de la structure chimique des nucléotides :
. Acide désoxyribonucléique (ADN)
. Acides ribonucléiques (ARN)
ADN : Acide désoxyribonucléique (1)
. Support de l’information génétique composant le génome
. Transmis au cours de la mitose -> étape de synthèse d’ADN : réplication (ou duplication)
. Indispensable à la vie de la cellule (mitose -> dégénérescence ou apoptose)
. Organisé en unités fonctionnelles nommées gènes
. Enchaînement de nucléotides (séquence nucléotidique) nécessaire et suffisant à la
synthèse d’un ARN fonctionnel (transcription)
. Détermine la séquence nucléotidique de l’ARN synthétisé
. Permet la régulation dans le temps et dans l’espace de la synthèse de cet ARN, en
fonction des besoins de la cellule ou de l’organisme (ex : insuline)
. ARN messager (ARNm), ARN transfert (ARNt), ARN ribosomique (ARNr)…
. Si le produit du gène est un ARNm, le gène code une protéine
. Chez les Eucaryotes, présence de grandes régions intergéniques, sans rôle connu
ADN : Acide désoxyribonucléique (2)
. Cellule végétale ou animale (Eucaryotes) : présence d’un noyau
ADN nucléaire
Nombre de molécules variable d’une espèce à l’autre
Nombre de molécules constant au sein d’une même espèce
Condensation variable, dynamique : chromatine <=> chromosomes
Chez l’Homme : 23 paires, soit 46 molécules d’ADN nucléaires
Paires identiques sauf chromosomes sexuels chez l’homme
Linéaires et de taille variable selon la paire considérée
# 25.000 gènes codant # 100.000 protéines
# 6.109 paires de nucléotides (# 2 mètres)
ADN mitochondrial (ADNmt) Présent dans les mitochondries (# 300 à 500/cellules)
# 10 copies identiques dans chaque mitochondrie
Circulaire et de petite taille (#16.500 pb, # 5 mm)
37 gènes : 22 ARNt, 2 ARNr et 13 ARNm (protéines mitochondriales)
ADN chloroplastique
Circulaire et de petite taille
Plusieurs copies identiques dans chaque chloroplaste
Taille variable selon les espèces : 120.000 à 160.000 pb
ADN : Acide désoxyribonucléique (3)
. Bactéries (Procaryotes) : absence de noyau
Génome
Chromosome unique, circulaire et de grande taille (# 150.103 à 12.106 pb)
INDISPENSABLE à la vie de la bactérie
Absence de noyau : chromosome dans le cytoplasme
Plasmides
Circulaires et de petite taille (3.103 à 100.103 pb)
Multiples copies identiques dans chaque bactérie
Plusieurs plasmides différents par bactérie
NON INDISPENSABLES à la vie de la bactérie ( génome)
Confèrent des propriétés supplémentaires (ex : résistance aux antibiotiques)
. Virus
Génome
Molécule d’ADN unique, de petite taille (contenue dans une capside)
Linéaire (ex : Herpès virus) ou circulaire (ex : Papillomavirus)
Multiplication du virus APRES infection d’une cellule hôte
Les acides ribonucléiques
Synthèse
(Transcription)
Site
d’action
. ARNm (P/E)
ARN messagers
N, Mit (13)
Cyt, Mit
. ARNt (P/E)
ARN de transfert
N, Mit (22)
Cyt, Mit
. ARNr (P/E)
ARN ribosomiques
N, Mit (2)
Cyt, Mit
. snRNA (E)
small nuclear RNA
-> snRNP (snurps)
N
N
. siRNA et miRNA (E)
short interfering RNA et microRNA
ARN interférents (empêchent la traduction de certains ARNm)
. Virus à ARN, rétrovirus
Une seule molécule d’ARN : VHC, VIH, Ebola, Influenza A H1N1
Deux molécules d’ARN appariées : rotavirus
Multiplication après infection d’une cellule hôte et rétrotranscription
Structure des acides nucléiques
1. Structure des nucléotides
Structure des constituants des nucléotides (1)
Pyrimidine et bases pyrimidiques majeures
2-oxy-4-aminopyrimidine
2,4-dioxy-5-méthylpyrimidine
ou 5-méthyl-uracile
2,4-dioxypyrimidine
Bases pyrimidiques mineures
Modification post-réplicative
Méthylase - Îlots GC
H
H
Dihydro-uracile
H
Structure des constituants des nucléotides (2)
Purine et bases puriques majeures
6-amino-purine
2-amino-6-oxy-purine
Bases puriques mineures
Hypoxanthine
N1-méthyl-guanine
N2-diméthyl-guanine
Structure des constituants des nucléotides (3)
D-ribose et 2’-désoxy-D-ribose (pentoses sous forme furanose)
‘
‘
1
‘
‘
‘
‘
‘
Acide phosphorique
O-
O = P
O-
O-
Structure et nomenclature des nucléosides
Formation des nucléosides
Structure générale
3N
Liaison ose (C1’) – base azotée (N1/N9)
(sauf pseudouridine : C1’->C5)
Nomenclature des nucléosides
Base
Ribose (ARN)
Désoxyribose (ADN)
Adénine
Guanine
Cytosine
Thymine
Uracile
Adénosine
Guanosine
Cytidine
(Thymine ribonucléoside)*
Désoxyadénosine
Désoxyguanosine
Désoxycytidine
Désoxythymidine
Uridine
(Désoxyuridine)*
* Nucléosides rares
Structure et nomenclature des nucléotides
Formation des nucléotides
Structure générale
Liaison ester ose – phosphate
O
Adénosine 5 ’-triphosphate
(ATP)
AMPc
Nomenclature des nucléotides
Base
Ribose (ARN)
Désoxyribose (ADN)
Adénine
Adénosine-5'-monophosphate
= acide-5'adénylique – AMP
Guanosine-5'-monophosphate
= acide-5'guanylique – GMP
Cytidine-5'-monophosphate
= acide-5'cytidylique – CMP
Désoxyadénosine-5'-monophosphate
= acide-5'désoxyadénylique – dAMP
Désoxyguanosine-5'-monophosphate
= acide-5'désoxyguanylique – dGMP
Désoxycytidine-5'-monophosphate
= acide-5'désoxycytidylique – dCMP
Désoxythymidine-5'-monophosphate
= acide-5'désoxythymidylique – dTMP
Guanine
Cytosine
Thymine
Uracile
* Nucléotides rares
(Thymine ribonucléotide-5'- monophosphate
= acide-5'thymidylique – TMP)*
Uridine-5'-monophosphate
= acide-5'uridylique – UMP
(Désoxyuridine-5'-monophosphate
= acide-5'désoxyuridylique – dUMP)*
Fonctions biologiques des nucléotides
. Participer à la structure des acides nucléiques (!)
. A l’état libre :
. Mise en réserve d’énergie sous une forme facilement mobilisable
exemples : ATP, GTP
. Transport intracellulaire de molécules sous forme activée
exemples : UDP-glucose, UDP-galactose
. Médiateurs intracellulaires (fonction «seconds messagers»)
exemples : AMPc, GMPc
. Nucléotides d’origine végétale à activité pharmacologique (SNC)
exemples : caféine (café), théobromine (cacao), théophylline (thé)
. Analogues de structure synthétiques à activité pharmacologique
exemples : 5-fluorouracile (anticancéreux)
Structure des acides nucléiques
2. Structure de l’ADN
Structure primaire de l’ADN
Désoxyribonucléosides 5’-monophosphate : dAMP, dGMP, dCMP, dTMP, rares
Enchaînement des nucléotides
Structure primaire d’un trinucléotide
O-
Liaison phosphodiester
Ecriture
de la séquence
5’-AGCTTAGC-3’
AGCTTAGC
3’
AG5MeCTTAGC
AGCPyTAGC
APuCTTAGC
AGCTNAGC
Structure secondaire de l’ADN (1)
ADN forme B – Double-hélice de Watson et Crick
3.54 nm
Caractéristiques structurales
. deux brins antiparallèles
. double-hélice droite
. diamètre : # 2.4 nm
. pas : 3.54 nm ou # 10.5 pb
. grand sillon
largeur : 1.20 nm
profondeur : 0.85 nm
. petit sillon :
largeur : 0.60 nm
profondeur : 0.75 nm
Structure secondaire de l’ADN (2)
Appariement des bases complémentaires
Pu
Pu
Py
-
Pu
Py
Py
Pu
Pu
Py
-
Pu
Pu
Pu
Py
-
Pu
Py
-
- Py
- Py
Pu
- Py
- Py
Pu - Pu
Py - Py
Pu - Py
Pu - Pu
Pu
Paire A – T
A–T
A–C
G–T
G–C
Pu
Paire G – C
Structures secondaires rares de l’ADN
Configurations syn et anti
Comparaison des formes A, B et Z de l’ADN
Type d’hélice
Forme
Configuration liaisons
Sens
Diamètre (nm)
Distance inter-plans (nm)
Pas (pb)
Pas (nm)
Grand sillon
Petit sillon
A
B
Z
large
intermédiaire allongée
anti
anti
syn : G
droite
droite
gauche
2.6
2.4
1.8
0.23
0.34
0.38
11
10.5
12
2.53
3.54
4.56
étroit
large
plat
très profond profond
large
étroit
très étroit
peu profond profond
profond
Conséquences de la structure bicaténaire
.
.
.
Ecriture de la séquence : un seul des deux brins
Distances mesurées en paires de bases (pb) ou kpb
A=T
G=C
A+G=C+T
A/T=G/C=1
A+T/G+C : rapport de dissymétrie, variable et spécifique d’espèce
Structures tertiaires de l’ADN (1)
Exemple :
chromosome bactérien
Surenroulements
Surenroulements : introduisent une contrainte -> compaction de la molécule
Superhélices ou supertorsions : compensent la contrainte
Surenroulement
Positif
Négatif (désenroulement)
Nbre d’enlacements
Superhélices/supertorsions
Augmenté
Positives, gauches
Diminué
Négatives, droites
Surenroulements négatifs :
. Les plus fréquents
. Introduisent une contrainte : compaction de la molécule
. Exposent l’information génétique
Structures tertiaires de l’ADN (2)
Topoisomères
. Molécules d’ADN strictement identiques
(même séquence)
. Organisation dans l’espace différente
Topoisomérases
Topoisomérases I :
Réduisent les surenroulements négatifs
Clivage d’un seul des deux brins d’ADN
Relâchement de la molécule d’ADN
Ne consomment pas d’énergie
Topoisomérases II :
Augmentent les surenroulements négatifs
Clivage des deux brins d’ADN
Introduisent des contraintes dans la molécule d’ADN
Consomment de l’ATP
Structures tertiaires de l’ADN (3)
Eucaryotes
Chromatine
Condensation
# 105
Chromosome
Dénaturation de l’ADN
Mécanisme
Influence de la composition en bases
Dénaturation
Renaturation
Température de fusion : Tm
-> Hybridation moléculaire
Structure des acides nucléiques
3. Structure des ARN
Ribonucléosides 5’-monophosphate : AMP, GMP, CMP, UMP, rares
ARNr
ARNt
ARNm
75 à 80%
15 à 20%
< 5%
Structure des ARN (1)
Structure primaire
ARN de transfert (ARNt)
75 à 90 nucléotides
O-
Riches en bases mineures
Dérivant de modifications post-transcriptionnelles
3’
H
. N1-méthylguanine
méthylation du GMP
. N2-diméthylguanine
méthylations du GMP
. Hypoxantine (inosine)
désamination oxydative de l’AMP
. N1-méthylhypoxanthine (N1-méthylinosine)
. Dihydrouracile
réduction de l’UMP
. Pseudouridine (liaison C1’-C5)
. Thymine
méthylation de l’UMP
Structure des ARN (2)
Structure secondaire
ARN de transfert (ARNt)
Monocaténaires
Pseudo doubles-hélices
Structure secondaire
Structure tertiaire
Boucle de l’anticodon
Py.Py.X.Y.Z.PuM.N
ou boucle variable
Boucle du TC
Bras accepteur
75 à 90 nucléotides
Boucle
de la DHU
Structure des ARN (3)
Ribosomes
Constante de sédimentation
Unité Svedberg
ARN ribosomaux (ARNr)
120 à 5000 nucléotides
Exemple : structure secondaire de l’ARNr 16S d’E.coli
Propriétés physico-chimiques : tailles de génomes et de gènes
Gènes chez l’Homme (kbp)
Génomes (pb)
ARN chez l’Homme
3.109 pb par génome haploïde
ARNt
ARNr
ARNm
75 à 90 nucléotides
120 à 5000 nucléotides
variable (cf. tableau)
Propriétés physico-chimiques : solubilité, spectre d’absorption
Spectre d’absorption dans l’UV
Solubilité
. Molécules chargées, hydrophiles
Effet hyperchrome
. Solubles dans l’eau
. Insolubles dans les solvants
apolaires (phénol, choloroforme)
. Précipitation dans l’éthanol à 70°
en présence de sels
=> Dosage des acides nucléiques
par spectroscopie UV
=> Extraction de l’ADN
ADN : 1 DO -> 50 ng/ml
ADN dénaturé : 1 DO -> 37 ng/ml
ARN : 1 DO -> 40 ng/ml
Réplication de l’ADN
Introduction
Définition
Coordination réplication – mitose
. Cas général :
Pas de mitose sans réplication
Pas de réplication sans mitose
. Exception : plasmides, virus (réplication épisomale, réplicons)
Caractéristiques générales de la réplication (1)
Semi-conservative
Bi-directionnelle
Culture de Bacillus subtilis et photographies de microscopie électronique à des temps variables
Bulle
de réplication
3’
5’
5’
3’
Fourches
de réplication
Caractéristiques générales de la réplication (2)
ADN polymérases ADN dépendantes : ADN pol I et ADN pol III
(ADN pol II)
Caractéristiques générales
. Nécessité d’une matrice ADN
. Nécessité d’une amorce d’ARN : intervention d’une ARN polymérase (primase)
. Synthèse dans le sens 5’ -> 3’ : activité polymérase 5’ -> 3’
. Correction des erreurs
Brin d’ADN matrice
3’
Amorce
ARN
5’
5’
3’
Brin complémentaire en cours de synthèse (élongation)
Réplication de l’ADN chez les Procaryotes (1)
Première étape : initiation (protéines du primosome)
1 – Formation de la bulle de réplication
Origine de réplication
3’
5’
5’
3’
Fourches
de réplication
Séquence oriC
Réplication de l’ADN chez les Procaryotes (2)
Première étape : initiation
2 – Progression de la fourche de réplication
(hélicases [dnaB, PriA], DNA gyrase)
3’
3’
5’
5’
4 – Synthèse de l’amorce (ARN)
3 - Protéines SSB : single strand binding proteins
Primase
Réplication de l’ADN chez les Procaryotes (3)
Deuxième étape : élongation du brin direct
Réaction catalysée par ADN pol III (sous-unité a)
5’
3’
3’
PPi
5’
ADN pol III
3’
5’
(dNMP)n + 1 dNTP -> (dNMP)n+1 + 1 PPi
Réaction irréversible
1000 nucléotides/seconde
Réplication de l’ADN chez les Procaryotes (4)
Deuxième étape : élongation du brin retardé
Sens de progression
de la fourche de réplication
3’
5’
3’
5’
3’
Brin direct
5’
3’
Brin retardé
Fragments
d’Okazaki
5’
Elimination des amorces
Réplication de l’ADN chez les Procaryotes (5)
Deuxième étape : synthèse coordonnée des brins direct et retardé
Réaction catalysée par ADN pol III (sous-unité a)
Réplisome
5’
3’
3’
PPi
5’
5’
Structure multimérique
de l’ADN pol III
(dNMP)n + 1 dNTP -> (dNMP)n+1 + 1 PPi
Réaction irréversible
1000 nucléotides/seconde
Synthèse coordonnée
des deux brins d’ADN
par l’ADN pol III multimérique
Réplication de l’ADN chez les Procaryotes (6)
Vue générale
Mécanismes de préservation de l’intégrité
de l’information génétique
. Objectif : prévenir, à tout moment, la fixation
de mutations génétiques
. En dehors de la phase de réplication :
mécanismes de réparation de l’ADN
. Au cours de la réplication :
fonction d’édition des ADN polymérases
activité exonucléase 3’->5’
taux d’erreurs : 10-4 -> 10-7 (facteur 1000)
Réplication de l’ADN chez les Eucaryotes (1)
Phase S du cycle cellulaire
Semi-conservative et bi-directionnelle
Plusieurs origines de réplication par chromosome (30 à 300 kpb)
Exemple de la levure :
. Séquences ARS (Autonomously Replicating Sequence)
. Reconnues par un complexe protéique composé de 6 protéines : ORC (Origin of Replication Complex)
. Stabilisation des brins par la protéine A de réplication (# SSB)
Intervention d’hélicases et de topoisomérases (gyrases)
Synthèse dans le sens 5’ -> 3’ des brins direct et retardé
Réplication de l’ADN chez les Eucaryotes (2)
Initiation et élongation
ADN pol a :
complexe ADN polymérase a/primase
initiation et début d’élongation (# 20 nucléotides)
déplacée par PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)
(? dépourvue de fonction d’édition ?)
ADN pol d :
remplace ADN pol a (commutation des polymérases)
activité exonucléase 3’->5’
Elimination des amorces
RNase H + MF1 (maturating factor 1, activité exonucléase 5’->3’)
Synthèse du brin complémentaire par l’ADN pol d
Rétablissement de la continuité du squelette par la DNA ligase I
NB
ADN pol g : réplication de l’ADNmt, autonome
ADN pol b et e : mécanismes de réparation de l’ADN
Réplication et intervention thérapeutique (1)
Inhibiteurs de la gyrase bactérienne
. Bloquent la formation de superhélices négatives
. Entravent la réplication bactérienne
. Spécifiques de la gyrase bactérienne
Antibiotiques antibactériens de la famille des quinolones
Acide nalidixique
Acide oxolinique
Norfloxacine
Ciprofloxacine
Negram®
Urotrate®
Noroxine®
Ciflox®
Réplication et intervention thérapeutique (2)
Inhibiteurs de topoisomérases eucaryotes
. Bloquent la religation des brins clivés
. Entravent la réplication eucaryotes
. Ciblent les cellules cancéreuses riches en topoisomérases
Anticancéreux inhibiteurs de topoisomérases I
Topotécan
Hycamtin®
Anticancéreux inhibiteurs de topoisomérases II
Doxorubicine
Etoposide
Adriblastine®
Etopophos®
Réplication et intervention thérapeutique (3)
Agents alkylants
G
G
G
G
Pont intracaténaire
Pont intercaténaire
. Bloquent la réplication et la transcription
. Bloquent la prolifération cellulaire et entraînent la mort cellulaire
Anticancéreux alkylants
Cyclophosphamide
Ifosfamide
Endoxan®
Holoxan®