10 ml - Spiral

Protocole conjugaison triparentale pour une
transposition
- Cellule donneuse : E. coli HB101 pJBA28
- Cellule helper : E. coli HB101 RK600
- Cellule receveuse : Pseudomonas putida KT2440
Jour 1
- Faire une préculture dans 5 mL de LB une nuit avec agitation.
Jour 2
Lavage des cellules
- Centrifuger 500 lde chaque culture dans des Eppendorf de 1,5 ml
(6500 rpm, 6 min, 4°C).
- Eliminer le surnageant et rincer le culot cellulaire avec 500 lde
NaCl 0,9%.
- Centrifuger ànouveau la suspension cellulaire (6500 rpm, 6 min,
4°C).
- Eliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire avec 500 l
de NaCl 0,9%.
Mélange conjugatif
- Mélanger dans un Ependorf de 1,5 ml.
-10 lde cellule donneuse : E. coli HB101 pJBA28
-10 lde cellule helper : E. coli HB101 RK600
-30 lde cellule receveuse : Pseudomonas putida KT2440
- Déposer sur une boite de LB la goutte de 50 lde conjugaison ainsi
que les différents témoins négatifs et incuber 24Hà28°C.
Témoin négatif
10 l cellule réceptrice
Témoin négatif
10 l cellule helper
Témoin négatif
10 l cellule donneuse
Conjugaison triparentale
50 l de mélange