Le milieu Kligler Hajna

Le milieu Kligler Hajna
I.
Principe
C’est un milieu complexe, il permet la lecture des caractères suivants :
 Utilisation du glucose avec ou sans production de gaz
 Utilisation du lactose
 Production d’H2S (hydrogène sulfureux)
 Recherche de la β-galactosidase
Ce milieu est intéressant pour l’indentification rapide des bacilles Gram -.
II.
Composition et rôle des constituants
Pour 1L d’eau distillée :
 Extrait de viande de bœuf : 3 g, apportent des facteurs de croissance.
 Extrait de levure : 3 g, apportent des facteurs de croissance.
 Peptone : 20 g, nutriments essentiels, source de N, C…
 NaCl : 5 g, participe au maintien de la pression osmotique.
Système de lecture de production d’H2S :
 Thiosulfate de sodium : 0.3 g, source de sulfate qui seront ou pas réduit par la bactérie.
 Citrate ferrique: 0.3 g, source d’ions Fer III qui réagiront avec la forme réduite des sulfates si
ceux-ci sont réduits.
Système de lecture des caractères glucose et lactose :
 Lactose : 10 g, source de carbone et d’énergie.
 Glucose : 1 g, source de carbone et d’énergie.
 Rouge de phénol : 25 mg, indicateur coloré de pH.
 Agar : 12 g, permet au milieu de lui donner son aspect solide.
 pH : 7.4
III.
Mode opératoire
Le milieu est habituellement présenté en pente, sinon le fondre et le solidifier avec une pente et un
culote d’environ 3 cm.
Ensemencer d’abord la pente en stries serrées, puis le culot pas piqûre centrale avec la même
pipette, la pente doit être largement ensemencé, contrairement au culot.
Dévisser en partie le bouchon du tube pour permettre une incubation en aérobiose.
Incuber a 37°C entre 18 à 24 heures.
IV.
Lecture
Tube A : Tube non ensemencé
Tube B : Fragmentation de la gélose : gaz +. Pente jaune : lactose +. Culot jaune : glucose +.
Tube C : Pente rouge : lactose -, faire la recherche de la β-galactosidase. Culot jaune : glucose +.
Tube D : Pente rouge : lactose -, faire la recherche de la β-galactosidase. Culot rouge : glucose -.
Tube E : Présence de noir dans le tube : H2S +. Pente non visible : lactose ? et faire la recherche de la
β-galactosidase. Culot non visible : glucose ?.
Résultat en fonction des couleurs :
Pente :
 Rose/Rouge : Lactose - / faire teste ONPG.
 Jaune : Lactose + / obligatoirement ONPG +.
 Noire : Lactose ? / faire test ONPG.
Culot :
 Rose/Rouge : Glucose –.
 Jaune : Glucose +.
 Noir : Glucose ? voir le milieu Hugh et Leifson.
Ensemble du tube :
 Noircissement : H2S +.
 Fragmentation de la gélose : Gaz +.
V.
Test ONPG
Pour toute souche lactose -, il faut faire la recherche de la β-galactosidase ou test ONPG.
L’utilisation du lactose requiert :
 Une lactose perméase, transporteur membranaire qui permet la pénétration du lactose dans
le cytoplasme de la bactérie.
 Une β-galactosidase qui catalyse son hydrolyse en glucose et galactose.
Pour mettre en évidence la β-galactosidase, on utilise un substrat synthétique, l’Ortho-Nitro-PhénylGalactoside (ONPG), molécule incolore capable de pénétrer dans le cytoplasme bactérien et qui
libère par hydrolyse l’OrthoNitroPhénol : ONP qui est de couleur jaune.
La recherche de la β-galactosidase se fait uniquement a partir d’un milieu lactosé, car il s’agit d’une
enzyme inductible, enzyme qui est synthétisée uniquement en présence du substrat qui agit comme
inducteur.
A partir de la culture prélevée sur la pente du milieu Kligler Hajna, réaliser une suspension dense
dans environ 0.5 cm3 d’eau distillée stérile, ajouter un disque d’ONPG dans le tube à hémolyse.
Incuber à 37 °C pendant au moins 30 minutes.
Tube jaune : ONPG +, β-galactosidase +.
Tube blanc : ONPG -, β-galactosidase -.
VI.
Remarques
Si la suspension n’est pas suffisamment dense, l’apparition de la coloration jaune peut être retardée.
Une bactérie utilisant le lactose utilisera obligatoirement le glucose.
Une bactérie glucose – sera obligatoirement lactose -.
VII.
Zone du
tube
Culot
Pente
Récapitulatif des lectures
Caractère
recherché
Interprétation
Lecture
Inchangé
Pas d'acidification donc absence d'utilisation du glucose en
"anaérobiose"
Glucose -
Jaune
Le pH est acide, donc acidification du milieu
car utilisation du glucose
Glucose +
Rose/rouge
Le pH alcalin est dû à l'utilisation des peptones. Le glucose a
été utilisé dans un 1er temps, mais il a été épuisé dans le
milieu. Le lactose ne peut être utilisé, la croissance se
poursuit aux dépens des peptones.
Lactose -
Jaune
Le pH est acide, le glucose, en petite quantité dans le
milieu, est utilisé dans un 1er temps, puis la croissance des
bactéries se poursuit grâce à l'utilisation du lactose, le pH
du milieu reste acide.
Lactose +
Inchangé
Pas de production de gaz.
Gaz -
Bulles
La production de gaz lors de la fermentation du glucose
provoque une fragmentation de la gélose.
Gaz +
Inchangé
Absence d'un précipité de sulfure de fer.
H2S -
Noir
Présence d'un précipité de sulfure de fer :
S2- + Fe2+ = FeS de couleur noire.
H2S +
Glucose
Lactose
Gaz
Culot
Jonction
culot pente
Aspect
H2S