La transcription - L`UNF3S en 2015, c`est
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UE1 : Biochimie – Biologie moléculaire Chapitre 5 : La transcription Professeur Joël LUNARDI Année universitaire 2011/2012 Université Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits réservés. Chapitre 5. La transcription Chapitre 5. La transcription 5’ ---CGTTAACGTAGTCATCGT-----GCAATTGCATCAGTAGCA---5’ 5’---CGUUAACGUAGUCAUCGU--- I. Transcription, ARN polymérase et matrice ADN II. Mécanisme de la transcription III. Maturation des ARN chez les eucaryotes IV. Dégradation des ARN V. Inhibiteurs de la transcription Mise en évidence expérimentale Mise en évidence expérimentale 1. Cellules cultivées en présence d’H d-thymidine et de P -uridine 3 32 ADN marqué par H3 ARN marqué par P32 2. Extraction et visualisation de l ’ADN et de l ’ARN par centrifugation sur un gradient de densité radioactivité dépôt acides nucléiques marqués au P32 et H3 ARN ADN + ARN densité association ADN/ARN I. ADN, ARN polymérase et transcription I. ARN polymérase et ADN Seul l ’ADN des gènes est transcrit grâce à une ARN polymérase ADN dépendante Chez les eucaryotes, la chromatine doit être dans une conformation « active », obtenue en particulier grâce à des modifications des histones L ’ARN polymérase recopie le brin « + » de l’ADN en ARN 5’ ---CGTTAACGTAGTCATCGT--3’ ---GCAATTGCATCAGTAGCA--- 5’ ---CGUUAACGUAGUCAUCGU--- brin + brin - brin matrice ARN = séquence du brin + Un seul des 2 brins est transcrit par unité de transcription brin 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ brin - 5’ L ’ARN polymérase catalyse la polymérisation du brin d’ARN L ’ARN polymérase est un complexe protéique ARN polymérase des bactéries liaison à l ’ADN ’ ARNm, ARNt, ARNr reconnaissance du promoteur site actif de l ’élongation ARN polymérases des eucaryotes ( 5 à 10 su ) ARN pol I (nucléole) ARN pol II (nucléoplasme) ARN pol III (nucléoplasme) ARNr ARNm ARNt répétitions du motif d’acide-aminés Y-S-P-T-P-S CTD (carboxy terminal domain) Structure d’une ARN polymérase procaryote II. Mécanisme de la transcription 1. Phase d ’initiation II. Mécanisme de la transcription L ’ARN polymérase reconnaît une séquence localisée en 5 ’ du gène : le promoteur qui contient des motifs particuliers d’après Pollard and Earnshaw, Cell Biology, 2008 La fixation du complexe ARN polymérase entraîne l’ouverture de la double hélice transcription 5’-GG(T/C)CAATCT----TATA(A/T)(A/T)A----TCAGTTCGTACTGTAGTCATG-5’-GG(T/C)CAATCT----TATA(A/T)(A/T)A---3’-CC(A/G)GTTAGA----ATAT(T/A)(T/A)T----AGTCAAGCATGACATCAGTAC-3’-CC(A/G)GTTAGA----ATAT(T/A)(T/A)T---≈-35/45 brin + ≈ -25 avant le début de la transcription TCAGTTCGTACTGTAGTCAG-- brin + 5’-GG(T/C)CAATCT----TATA(A/T)(A/T)A---3’-CC(A/G)GTTAGA----ATAT(T/A)(T/A)T---AGTCAAGCATGACATCAGTC-- La reconnaissance du promoteur implique de nombreux facteurs protéiques - procaryotes : facteurs - eucaryotes : nombreux facteurs de transcription spécifiques des différentes ARN polymérases : ARNpol II (TFIIA-H), ARN pol I (TAFs), ARN pol III (TFIIIA-C) La fixation de l’ARN polymérase est conditionnée par la séquence d’intervention des facteurs de transcription TFII-D +1 1. reconnaissance de TATA Mécanisme de la transcription TATA TFII-A TFII-H ARN pol II 2. stabilisation TFII-B TFII-E TFII-F 3. fixation de ARN pol 4. phosphorylation transcription P P ARN 5’ in vivo, la formation du complexe pré-initiateur nécessite de nombreux facteurs protéiques et s’accompagne d’une modification de la structure de la chromatine Formation du complexe pré-initiateur 2. Phase d’ élongation L ’élongation se fait dans le sens 5 ’- 3 ’ par formation de liaisons phosphodiester 2. Phase d’ élongation La lecture du brin « - » par l’ARN polymérase s’accompagne de l’ouverture de la double hélice d ’ADN et est suivi par le ré-appariement des 2 brins d’ADN. La transcription s’accompagne d’un remodelage des histones et des nucléosomes. ARN polymérase 5’ D’après Pollard and Earnshaw, Cell Biology, 2008 3. Phase de terminaison 3. Phase de terminaison L’arrêt de la transcription chez les procaryotes fait intervenir des séquences « terminateur » et des facteurs de terminaison (facteur rho) D’après Pollard and Earnshaw, Cell Biology, 2008 Chez les eucaryotes, la terminaison de l’activité pol III impliquerait des séquences riches en résidus U, celle de Pol I un facteur protéique qui bloquerait la transcription. En ce qui concerne Pol II, la terminaison est couplée à la maturation des ARNm 4. Transcription des procaryotes vs eucaryotes Chez les procaryotes, la transcription est couplée à la traduction alors que chez les eucaryotes les ARNm seront exportés hors du noyau avant d’être traduits. ADN ARN pol ADN ARNm ARNm protéine traduction eucaryote procaryote Chez les procaryotes, plusieurs gènes peuvent être transcrits à partir d’un promoteur unique promoteur commun gène A 5’ gène B gène C ARN poly cistronique protéines III. Maturation des ARN eucaryotes III. Maturation 1. Maturation des ARNm région flanquante 5’ des ARN eucaryotes gène région flanquante 3’ 5’ région 5’ UTR 3’ traduction transcription région 3’ UTR fin de traduction fin de transcription L’extrémité 5 ’ de l ’ARN hn est « coiffée » 1.1. l ’extrémité 5 ’ de l ’ARN hn est « coiffée » (capping) + phosphate + pyrophosphate OH + OH méthylation GTP OH m7G-PPP- ARN migration des ARNm vers le cytoplasme favorise l’initiation de la traduction stabilise l‘extrémité 5’ des ARNm 1.2. l ’extrémité 3 ’ de l ’ARN hn est modifiée L ’extrémité 3 ’ de l ’ARN hn est modifiée reconnaissance d’un motif de polyadénylation par CstF et CPSF -AAUAAA-AAUAAA- arrêt de l ’ARN pol II, clivage de l’ARN par une endonucléase spécifique intervention de la poly A polymérase qui qui ajoute des motifs adényliques en présence d’ ATP, stabilisation de l’extrémité 3’ le motif polyA est terminé, l’ARNm est prêt à sortir du noyau 1.3. les ARN hn sont épissés 1.3. les ARNgène hn sont épissés exons ARN hn m7G AAAAAAAA 5’ --AG GUA/GAGU------A-----PyPyPyPyAG GC --- 3’ intron excision des introns et épissage des exons ARNm m7G AAAAAAAA L ’épissage est réalisé par le spliceosome constitué de protéines associées à des snRNA : les snRNP (U1, U2, U4, U5, U6) Epissage 1 snRNP = 1 snRNA + 10-20 polypeptides site de branchement exon 5’ GU-----------------A---------AG exon bornes de l ’intron o Reconnaissance des bornes donneur et accepteur A snRNP U1 5’ GU snRNP U2 AG o Fixation des snRNP U1 et U2 sur les bornes Epissage A GU 5’ snRNP U1 AG snRNP U2 o 1ère réaction de trans-estérification A 5’ GU AG o Recrutement du spliceosome Epissage snRNP U4/6, U5, …. A 5’ AG spliceosome o 2ème trans-estérification lariat A 5’ 5’ + Les mutations affectant les sites d’épissage modifient la nature du transcrit et sont généralement la cause de maladies. Les ARNm matures sont exportés dans le cytosol Epissage transport sur le cytosquelette diffusion aléatoire et piégeage dégradation associée à une protection localisé début de la transcription AUG = début de la traduction fin de transcription stop de traduction AAAAAAAAAAA M7G 5’ UTR (untranslated region) 3’ UTR 2. Maturation des ARNr les ARNr sont le produit de gènes multi-copies (28+18+5,8s et 5s) 2. Maturation des ARNr les ARNr eucaryotes 5,8s, 18s et 28s sont transcrits par l ’ARN pol I l’ARNr 5s est transcrit par l’ARN pol III les ARNr 5,8, 18 et 28s sont produits et maturés au niveau du nucléole présence d’un 5’ NTP, absence de polyadénylation : protection des extrémités par la formation de structures II et une association avec des protéines absence d’épissage ARN pol I - méthylations - pseudouridylation (snoRNAs) - association avec des protéines ribosomales 45s 18s petite sous-unité du ribosome 5,8s 28s grande sous-unité du ribosome Après formation de pré-ribosomes, ceux ci sont exportés dans le cytosol et subissent une maturation en ribosomes 40s et 60s Maturation des ARNr protéines ARN sous-unité 40s du ribosome -ARN 18S (1874 nt) - 33 protéines sous-unité 60s du ribosome -ARN 28S (4718 nt) + 5,8s (160 nt) + 5s (120 nt) - 50 protéines 3. Maturation des ARNt ARNt intron 3. Maturation des ARNt ARNt ADN transcription par ARN polIII exonucléase endonucléase 5’ P- RNAse P 5’ P- addition d’un motif CCA en 3’ par une nucléotidyltransférase modification des bases élimination de l’intron 4. Maturation des snRNAs et snoRNAs D’après Pollard and Earnshaw, Cell Biology, 2008 5. La transcription des ARN mitochondriaux 4. La transcription des ARN mitochondriaux Les 2 brins de l ’ADNmt sont transcrits : - 2 gènes ARNr - 22 gènes ARNt - 13 ARNm transcription d ’un ARN primaire polycistronique ARNtF 5’ ARN 12s ARN 16s ARNtV ARNtL ND1 ARNtI ARNtM ND2 IV. La dégradation des ARN IV. La dégradation des ARN élimination de la coiffe en 5’ par l’enzyme Dcp1p activé par la désadénylation de l’extrémité 3’, puis attaque par des exonucléases dégradation des ARNm non-sens par NMD (nonsense mediated decay): assure la dégradation des ARNm ayant une codon stop prématuré avant le dernier exon dégradation des ARN double brins exogènes par interférence d’ARN V. Inhibiteurs de la transcription V. Inhibiteurs de la transcription ARN pol niveau d’action rifampicine procaryote initiation-élongation streptolydigine procaryote élongation actinomycine D eucaryote :ARN pol I, II, III élongation -amanitine eucaryote: ARN pol II, III élongation La rifampicine se fixe à une poche de l’ARN polymérase normalement occupée par l’hybride ADN-ARN VI. ARN catalytiques : les ribozymes Que Quefaut fautil retenir il retenir a : - savoir définir le brin + de l’ADN lors de la transcription, la polarité 5’-3’ de synthèse du brin d’ARN - savoir décrire les 3 étapes de la transcription (reconnaissance du promoteur-initiation, élongation du brin transcrit, terminaison - connaître le rôle du promoteur, savoir ce que représente la notion de facteur de transcription (il n’est pas demandé de mémoriser le nom de tous les facteurs…) - connaître les phases de maturation des ARNm eucaryotes : - protection en 5’ (nature et positionnement du nucléotide servant de coiffe) - protection en 3’ (nature du motif de protection) - mécanisme d’excision épissage (le nom des snRNPs n’est pas demandé) - connaître les phases de maturation des ARNr et des ARNt - connaître les mécanismes de dégradation des ARN ( le nom des facteurs impliqués n’est pas demandé) - savoir expliquer pourquoi la transcription est une cible potentielle pour les antibiotiques a : les exemples numériques et de pathologies sont destinés à illustrer le cours et à permettre une meilleure intégration des connaissances Mentions légales L'ensemble de cette œuvre relève des législations française et internationale sur le droit d'auteur et la propriété intellectuelle, littéraire et artistique ou toute autre loi applicable. 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