Thèse 2016 - Theses en bretagne

Profil moléculaire du LB régulateur : influence du micr-oenvironnement, application en
physiopathologie
1Contexte scientifique e
Les maladies autoimmunes sont des maladies chroniques pour la plupart incurables touchant en
particulier une population agée. La prévalence globale des maladies auto-immunes est de 5 à 10%
dans la population générale. Les traitements de première intention font recours à des
immunosuppresseurs, plus récement le developpement de nombreuses biothérapies ont vu leur
efficacité révélée mais de manière très variable selon les pathologies et n'apportant toujours qu'une
guérison partielle de ces maladies. Le coût de ces thérapies est de plus très élevé et largement
supérieur à 20 keuros/an. Parallèlement, la transplantation rénale est la transplantation la plus
courante dans le monde. L'induction d’une tolérance à l'allogreffe est actuellement un des objectifs
de santé publique majeur. Si les traitements actuels permettent un contrôle quasi total des rejets à
médiation cellulaire, le rejet humorale chronique (mené par les lymphocytes B) reste la première
cause de perte du greffon.
Les mécanismes physio-pathologiques conduisant à l'auto-immunité et à l'allo-immunité (rejet)
sont encore mal compris. De nombreux modèles murins tendent à montrer l'importance de la
fonction des LB régulateurs dans l'induction et/ou le maintien de la tolérance.
La littérature confère volontiers à certaines sous populations particulières de LB un phénotype de
LB régulateurs. Cependant, il n'y encore aucune identification précise et consensuelle chez l'homme
de ces cellules comme cela a pu exister pour les LT par l'identification du facteur de transcription
spécifique FOXP-3. De plus, il semblerait que les LB puissent acquérir des propriétés régulatrices
différentes selon leur micro-environnement. Dans une précedente étude, nous avons mis à profit les
analyses bioinformatiques d'interprétation de nos données de cytométrie en flux associées à des
approches fonctionnelles pour démontrer qu' il existe plusieurs catégories de LB régulateurs. En
analysant leur distribution chez des patients présentant certaines pathologies auto-immunes, nous
avons montré qu'il existait un défaut de présence de certaines sous populations comme au cours du
syndrome de gougerot-sjogren primaire (SGS) ou du lupus erythémateux disséminé (LED) par
rapport aux sujets sains. (Simon, JACI, 2015).
Dans un autre travail, nous avons caractérisé phénotypiquement et fonctionnellement les LB
dans le sang
de patients souffrant d'un rejet humoral chronique (cABMR) lors d'une
transplantation rénale. Ainsi, nous avons observé des différences dans la distribution des souspopulations de LB uniquement chez les patients cABMR qui se caractérisent notamment par une
augmentation des LB mémoires. De plus, nous avons pu mettre en évidence que ces même LB
présentaient un défaut de propriété régulatrice dans un modèle de co-culture impliquant des LT
autologues.(Nouel, Kidney Int, 2014).
Fort de ces observations, nous désirons maintenant poursuivre l'analyse de ces LB régulateurs
dans les deux types de pathologies (auto-immune et allo-immune) par une approche moléculaire.
Nous disposons au laboratoire d'un modèle in vitro nous permettant d'analyser les capacités des LB
à reguler la prolifération ou la différenciation des LT autologues. Nous avons déjà pu observer par
des analyses préliminaires que selon la population de LT en présence et/ou la pathologie, les LB
présentaient des voies de différenciation différentes les menant ou non vers une fonction régulatrice.
Nous souhaiterions à partir de ces résultats determiner une signature moléculaire caractéristique des
LB regs.
L'équipe participe depuis février 2014 au projet IMI PRECISESADS “Molecular
Reclassification to Find Clinically Useful Biomarkers for Systemic Autoimmune Diseases" dont le
but est d'utiliser la puissance des techniques dites « OMIQUES » (génomique, transcriptomique,
épigénomique, métabolomique, protéomique), et la bioinformatique pour re-classifier ces maladies
connues pour partager des mécanismes physiopathologiques communs. Cette étude nous permettra
un très grand acces a de nombreux prélevements de patients présentant diverse pathologies autoimmunes et de pouvoir analyser leurs différentes signature moléculaires. De plus, en collaboration
avec le servide nde Nephrologie du CHRU de Brest, nous avons mis en place une étude multicentrique étendue su 15 centres de transplantation du grand Ouest (etude BHL) sur la fonction des
LB nous ayant permi de recruter actuellement plus d'une centaine de patients transplantés rénaux.
Nos études scientifiques ont pour objectif, grâce à une meilleure compréhension
physiopathologique de ces maladies, de pouvoir proposer de nouveaux outils afin d'élaborer de
nouvelles pistes thérapeutiques personnalisées qui permetrant non plus de cibler des populations
générales de cellules mais des voies globales de régulation et/ou de dérégulation.
2-Hypothèses et Problématiques
Actuellement la plupart des traitements thérapeutiques de nouvelle génération sont des
biothérapies le plus souvent déplétantes entrainant l'élimination totale d'une population cellulaire
(Anticorps anti-LB) ou d'une cytokine (Anti-TNFalpha). Cependant leur efficacité reste encore très
variable selon les patients ou selon les pathologies malgré un cout global très élévé. Certaines
études ont soulevé l'idée qu'en dépletant la totalité d'une population, on pouvait aussi entrainer la
disparition de populations cellulaires bénéfiques pour le patient. Une étude a par exemple en
transplantation amontré que la déplétion totale des LB avant la greffe entrainait une augmentation
considérable des rejets ( Clatworthy, NJEM, 2009).
Nous souhaiterions pouvoir identifier au travers de différents modèles physio-pathologiques une
ou plusieurs signatures moléculaires (transcriptionnelle, miRNA) caractéristiques des LB
régulateurs nous permettant de pouvoir mieux comprendre leur mode d'induction et/ou de
régulation au sein du système immunitaire.
Existe-t-il une signature transcriptionnelle commune a l'ensemble des LB régulateurs ? Est-il
possible d'identifier des voies de différenciation ou des facteurs modulant la génération de LB
régulateurs ?
Est ce que ces voies sont altérées au cours des maladies autommunes ou lors du rejet de greffe?
Est il possible de moduler ces voies pour les rendre plus efficaces ?
3-Approche méthodologique
Pour répondre à la première question, nous utiliserons un modèle in vitro déjà validé au
laboratoire nous permettant d'étudier la fonction régulatrice des LB de volontaires sains sur la
réponse proliférative de LT et/ou sur leur différentiation. A partir de ce modèle nous évaluerons par
PCR quantitative au moyen de « puce » RT-PCR array (puce transcriptomique permettant d'anlayser
uen centaine de gènes à la fois) le profil transcriptionnel des LB régulateurs en étudiant plusieurs
voies : 1- l'etude globale des facteurs de transcrition impliqués dans la différenciation B, 2- Etude la
voie PI3K que nous avons déjà supecter impliquée dans la génération de LB regs dans une étude
précédente (Simon, JACI, 2015).
En parallèle nous envisagerons egalement une étude des micro-ARN (miR) différentiellement
exprimés en fonction de l'existence ou non d'une fonction régulatrice des LB toujours par PCR
quantitative.
En fonction des résultats (mRNA et mIR), nous essayerons de retracer une ou plusieurs
signatures transcritionnelle à l'aide de logiciels de bio-informatique (cytoscape, PCR array
analysis..) caractéristiques des LB régulateurs. Nous verifierons in vitro l'expression de protéines
particulières ayant démontré leur intérêt dans les voies d'induction de la fonction régulatrice par
differentes techniques d'analyses cellulaire (cytométrie en flux, western blot, confocal..)
Pour répondre à la deuxième question, nous profiterons du recrutement des deux cohortes de
patient en cours au laboratoire (PRECISADS et BHL) pour étudier la modulation de cette voie au
cours des processus pathologiques. Nous étudierons la signature moléculaire soit directement à
partir de l'expression de certains gènes issus des LB du sang périphérique de patients ou à partir
des miR extraits du plasma des différents patients.
Enfin, afin de répondre à la troisième question, nous pourrons mettre en place l'etude d'agents
inducteurs et/ou modulateurs (inhibiteurs de kinases, anticorps monoclonaux, cocktails
cytokiniques...) permettant de mettre en jeu les differentes voies impliquées dans la génération et/ou
la fonction des LB regulateurs et ainsi etudier si nous pouvons augmenter ou restaurer ces fonctions
quand elles sont déficientes.
4-Profil du candidat
Master 2 biologie santé.
Bonnes connaissances théoriques et pratiques en Immunologie (culture cellulaire, cytométrie en
flux, transfection, immunoprecipitation) et en biologie moléculaire (RT-qPCR, PCR quantitative,
microARN…).
L'excellence des résultats obtenus en licence et au Master, la motivation, ainsi que la qualité
scientifique du candidat seront les principaux critères de sélection.