Verticillium

221
UNIVERSITE MOHAMMED V- Agdal
FACULTE DES SCIENCES
RABAT
THESE DE DOCTORAT D’ETAT
Présentée par
Amina REGRAGUI
Discipline : Biologie
Spécialité : Phytopathologie
Contribution à l’étude de l’influence de la salinité sur
le couple tomate –Verticillium : Conséquences
physiologiques et impact sur la bioprotection des
tomates contre la verticilliose
Soutenue le…22 décembre 2005…..devant le jury :
LAHLOU H.
Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat
Présidente
BENKHEMMAR O.
Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat
Examinateur
FASSI FIHRI O.
Professeur à l’I.A.V. Hassan II, Rabat
Examinateur
TIJANE M.
Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat
Examinateur
ZAID H.
Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat
Examinateur
231
JE DEDIE CE TRAVAIL…
A mes petits enfants
Zineb
Youssef
Jad
et……
229
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé au sein de l’équipe de phytopathologie
du laboratoire de Botanique de la Faculté des Sciences de Rabat.
Qu’il me soit permis ici de remercier vivement le professeur H.
LAHLOU pour la confiance qu’elle m’ a toujours témoignée ainsi que
la formation de chercheur qu’elle m’a donnée avec bienveillance et
humanité.
Ses
qualités
scientifiques,
ses
conseils
et
ses
encouragements incessants m’ont beaucoup soutenue pendant la
l’élaboration
de
ce
travail.
Je
lui
exprime
ma
profonde
reconnaissance et lui porte mon grand respect.
Je remercie très vivement le professeur H. ZAID pour sa
disponibilité, ses conseils fructueux et son aide scientifique et
matérielle. Il a bien voulu accepter de participer à ce jury de thèse
en qualité de rapporteur. Qu’il trouve ici l’’expression de ma
profonde gratitude.
Madame O. FASSI FIHRI, professeur de microbiologie à l’’IAV
HASSAN II, m’a agréablement accueillie dans son laboratoire. J’ai
pu bénéficier de ses compétences scientifiques et de son savoir faire.
Pour l’accueil chaleureux qu’elle m’a réservé et pour avoir accepté
de faire le rapport de ce mémoire, je lui exprime mes plus vifs
remerciements.
Mes sincères remerciements sont adressés aux professeurs M.
TIJANE et O. BENKHEMMAR pour l’’honneur qu’ils me font de
juger cette thèse.
230
Je
désire
remercier
particulièrement
mes
collègues
les
professeurs A. EL AISSAMI, E. BERRAHO et M. RAHOUTI pour
leur collaboration efficace.
Je désire remercier également Madame AGOUMY, ingénieur
au ministère de l’énergie et des mines pour son aide précieuse lors de
la réalisation de l’analyse minérale des échantillons.
Que mes collègues du laboratoire de Botanique qui m’ont
apportés une aide morale et matérielle trouvent ici l’’expression de
ma meilleure sympathie.
Je
remercie
vivement
M.
BENCHAKRI
pour
son
aide
technique efficace et son dévouement.
Enfin, mes remerciements vont à tous les membres de ma
famille pour leur soutien moral et leur encouragement affectueux.
232
Liste des publications
1. REGRAGUI A., LAHLOU H. et ZAID H., 1989. La prémunition de la
tomate contre la verticilliose causée par Verticillium albo-atrum, forme à
microsclérotes. Conséquences physiologiques du phénomène.
Cryptogamie, Mycol. 10 (3) : 243-256
2. REGRAGUI A. ZAID H. and LAHLOU H., 1990. Verticillium alboatrum effect on nitrate reductase activity in young tomato plants.
Proceeding of 8th congress of the Mediterranean Phytopathological Union,
Agadir (Morocco) October 28th ,233-235.
3. BALESDENT M.H., REGRAGUI A., LAHLOU H. and BOMPEIX,
1990. Early diagnostic of Verticillium albo-atrum microsclerotia form, and
inoculum evaluation by enzyme linked immunosorbent assay in infected
tomato plants.
Proceeding of 8th congress of the Mediterranean Phytopathological Union,
Agadir (Morocco) October 28th , 75-77.
4. REGRAGUI A., RAHOUTI M. et LAHLOU H., 2003. Effet du stress
salin sur Verticillium albo-atrum: pathogénécité et production d’enzymes
cellulolytiques in vitro
Cryptogamie, Mycol. 24 (2) : 167-174.
5. REGRAGUI A. and LAHLOU H., 2005. Effect of Salinity on in vitro
Trichoderma harzianum Antagonism against Verticillium dahliae.
Pakistan Journal of Biological Sciences 8 (6):872-876
222
SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE .................................................................................................... 1
CHAPITRE I : ETUDE DE L’INFLUENCE DE LA SALINITE SUR LE
COMPORTEMENT DE LA TOMATE (LYCOPERSICON ESCULENTUM) ET SUR LE
DEVELOPPEMENT IN VITRO DE VERTICILLIUM ALBO-ATRUM ..................................... 7
I. EFFET DE LA SALINITE SUR LE COMPORTEMENT DE DEUX GENOTYPES DE TOMATE .......... 7
Introduction ........................................................................................................................... 7
A. Matériel et méthodes ........................................................................................................ 9
1. Le matériel végétal........................................................................................................ 9
2. Effet du sel sur la germination des graines ................................................................... 9
2.1. Protocole de germination....................................................................................... 9
2.2. Conditions de culture............................................................................................. 9
2.3. Observations........................................................................................................ 10
3. Effet du sel sur la croissance végétative des plantes................................................... 10
3.1. Conditions de culture........................................................................................... 10
3.2. Lecture des résultats ............................................................................................ 11
4. Analyse statistique des données.................................................................................. 11
B. Résultats ......................................................................................................................... 11
1. Action du sel sur le pouvoir germinatif des graines.................................................... 11
1.1. Effet sur la vitesse de germination ...................................................................... 11
1.2. Effet sur le taux de germination .......................................................................... 13
2. Action du sel sur la croissance végétative des plantes................................................ 15
2.1. Effet sur la taille de l’axe aérien.......................................................................... 15
2.2. Effet sur la biomasse des parties aériennes ......................................................... 16
C. Discussion et conclusion ................................................................................................ 18
II. INFLUENCE DE LA SALINITE DU MILIEU SUR LE DEVELOPPEMENT IN VITRO D’UN ISOLAT
DE VERTICILLIUM ALBO-ATRUM D’ORIGINE TOMATE ............................................................... 19
Introduction ......................................................................................................................... 19
A. Matériel et méthodes ...................................................................................................... 21
1. La souche fongique ..................................................................................................... 21
2. Ensemencement .......................................................................................................... 22
3. Traitement par le sel ................................................................................................... 22
4. Estimation de l’effet du sel sur la croissance de Verticillium .................................... 23
4.1. Croissance diamétrale.......................................................................................... 23
4.2. Croissance pondérale........................................................................................... 23
5. Effet sur l’intensité de la conidiogénèse ..................................................................... 23
6. Effet sur le pouvoir germinatif des conidies ............................................................... 24
7. Effet sur les organes de résistance .............................................................................. 24
B. Résultats ......................................................................................................................... 24
1. Effet de l’apport de NaCl sur la croissance de Verticillium........................................ 24
1.1. Croissance diamétrale.......................................................................................... 24
1.2. Croissance pondérale........................................................................................... 25
2. Effet de la salinité sur la conidiogénèse et le pouvoir germinatif des conidies .......... 25
2.1. Intensité de la sporulation.................................................................................... 25
223
2.2. Pouvoir germinatif des conidies .......................................................................... 28
3. Effet de la salinité sur la sclérogénèse ........................................................................ 28
4. Influence de l’interaction salinité-température sur la croissance de Verticillium ....... 31
C. Discussion et conclusion ................................................................................................ 32
CHAPITRE 2 : ETUDE DES EFFETS DE LA SALINITE SUR LA RELATION HOTEPARASITE DANS LE CAS DE LA VERTICILLIOSE ............................................................ 38
INTRODUCTION ........................................................................................................................... 38
I. EFFET DE L’INTERACTION SALINITE-VERTICILLIUM SUR LA MANIFESTATION DE LA
MALADIE CHEZ LA TOMATE ....................................................................................................... 39
A. Matériel et méthodes ...................................................................................................... 39
1. Plantes hôtes et conditions de culture ......................................................................... 39
2. Inoculation des plantules............................................................................................. 39
2.1. L’agent pathogène : Verticillium albo-atrum, forme à microsclérotes................ 39
2.2. Préparation de l’inoculum ................................................................................... 40
2.3. Protocole d’inoculation ....................................................................................... 40
3. Traitement par le sel ................................................................................................... 40
4. Notations des résultats ................................................................................................ 40
4.1. Croissance des plantes......................................................................................... 40
4.2. Emission des feuilles ........................................................................................... 41
4.3. Colonisation des plantes par le pathogène........................................................... 41
4.4. Analyse statistique des résultats .......................................................................... 42
B. Résultats ......................................................................................................................... 42
1. Manifestations externes de la combinaison Salinité-Verticillium sur les plantes de
tomate hôtes .................................................................................................................... 42
1.1. Effet sur la croissance des plantes ....................................................................... 42
1.2. Effet sur l’émission de feuilles ............................................................................ 45
2. Manifestations internes ............................................................................................... 48
C. Discussion et conclusion ................................................................................................ 49
II. EFFET DE LA SALINITE SUR LA VARIABILITE DU POUVOIR PATHOGENE DE VERTICILLIUM
ALBO-ATRUM ................................................................................................................................ 51
Introduction ......................................................................................................................... 51
A. Impact de la salinité sur le niveau infectieux de l’inoculum du Verticillium sur les
plantes de tomate................................................................................................................. 53
1. Matériel et méthodes................................................................................................... 53
1.1. Inoculation........................................................................................................... 53
1.2. Traitement par le sel et conditions de culture...................................................... 54
1.3. Estimation des résultats ....................................................................................... 54
2. Résultats : effet de la salinité sur le pouvoir infectieux de l’inoculum de Verticillium
vis-à-vis de la tomate ...................................................................................................... 54
2.1. Effet sur la tomate Marmande Claudia................................................................ 54
2.2. Effet sur la tomate Marmande VR....................................................................... 56
3. Discussion et conclusion............................................................................................. 56
B. Influence de la salinité sur l’expression du pouvoir pathogène de deux isolats de
Verticillium sur la tomate .................................................................................................... 59
1. Matériel et méthodes................................................................................................... 59
224
1.1. Test de pathogénécité .......................................................................................... 59
1.2. Lecture des résultats ............................................................................................ 60
2. Résultats...................................................................................................................... 60
3. Discussion et conclusion............................................................................................. 60
C. Influence de la salinité sur la variabilité de la spécificité parasitaire d’un isolat de
Verticillium d’origine tomate .............................................................................................. 63
1. Matériel et méthodes................................................................................................... 63
1.1. Choix des plantes hôtes inhabituelles.................................................................. 63
1.2. Inoculation et traitement par le sel ...................................................................... 63
1.3. Lecture des résultats ............................................................................................ 64
2. Effet de la salinité sur la variation du pouvoir pathogène de l’isolat P80 au contact de
nouvelles plantes hôtes. .................................................................................................. 64
2.1. Effet sur l’expression du pouvoir pathogène au contact de la luzerne ................ 64
2.2. Effet sur l’expression du pouvoir pathogène au contact de l’aubergine.............. 65
3. Discussion et conclusion............................................................................................. 68
CHAPITRE 3 : CONSEQUENCES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE
L’INTERACTION SALINITE-VERTICILLIUM CHEZ LA TOMATE ................................. 73
INTRODUCTION ........................................................................................................................... 73
A. EFFETS SUR LES TENEURS EN CATIONS MAJEURS................................................................ 74
1. Introduction................................................................................................................. 74
2. Matériel et méthodes................................................................................................... 76
3. Résultats...................................................................................................................... 76
3.1. Teneurs en ions sodium ....................................................................................... 76
3.2. Teneurs en ions potassium................................................................................... 78
4. Discussion et conclusions ........................................................................................... 78
B. EFFETS SUR LES TAUX DE SUCRES SOLUBLES TOTAUX ........................................................ 81
1. Introduction................................................................................................................. 81
2. Matériel et méthodes................................................................................................... 82
2.1. Extraction des sucres solubles totaux .................................................................. 83
2.2. Réaction à l’anthrone........................................................................................... 83
3. Résultats...................................................................................................................... 83
3.1. Chez Marmande Claudia ..................................................................................... 83
3.2. Chez Marmande VR ............................................................................................ 84
4. Discussion et conclusion............................................................................................. 84
C. EFFETS SUR L’ACCUMULATION DE LA PROLINE .................................................................. 87
1. Introduction................................................................................................................. 87
2. Matériel et méthodes................................................................................................... 88
2.1. Extraction ............................................................................................................ 88
2.2. Dosage ................................................................................................................. 88
3. Résultats...................................................................................................................... 89
3.1. Chez la variété Marmande Claudia ..................................................................... 89
3.2.Chez la variété Marmande VR ............................................................................. 89
4. Discussion et conclusion............................................................................................. 89
D. EFFETS DE L’INTERACTION SALINITE-VERTICILLIUM SUR CERTAINES ACTIVITES
ENZYMATIQUES DES PLANTES DE TOMATE ............................................................................... 93
1. Effets sur l’activité nitrate réductase........................................................................... 93
1.1. Introduction ......................................................................................................... 93
225
1.2. Matériel et méthodes ........................................................................................... 94
1.3. Résultats .............................................................................................................. 95
1.4. Discussion et conclusion ..................................................................................... 95
2. Effets sur l’activité peroxydasique.............................................................................. 98
2.1. Introduction ......................................................................................................... 98
2.2. Matériel et méthodes ......................................................................................... 100
2.3. Résultats ............................................................................................................ 100
2.4. Discussion et conclusion ................................................................................... 103
CHAPITRE 4 : IMPACT DE LA SALINITE DU MILIEU SUR LES MECANISMES
D’ACTION DE VERTICILLIUM ALBO-ATRUM.................................................................... 107
I. EFFET DE LA SALINITE SUR LA TOXINOGENESE DE L’AGENT PATHOGENE ....................... 107
Introduction ....................................................................................................................... 107
A. Matériel et méthodes .................................................................................................... 108
1. Préparation des filtrats de culture de l’isolat P80 de Verticillium............................. 108
2. Mise en évidence de la toxicité des filtrats de culture de Verticillium par des tests
biologiques.................................................................................................................... 109
2.1. Test graine ......................................................................................................... 109
2.2. Test plante entière ............................................................................................. 110
B. Résultats ....................................................................................................................... 110
1. Effet du NaCl sur la phytotoxicité des filtrats de culture de l’isolat P80 de Verticillium
sur la croissance racinaire de deux espèces végétales................................................... 110
1.1. Manifestation sur la tomate ............................................................................... 110
1.2. Manifestation sur le cresson .............................................................................. 111
2. Effet du NaCl sur la phytotoxicité des filtrats de culture de l’isolat P80 de Verticillium
sur la croissance végétative de deux plantes hôtes ....................................................... 111
2.1. Manifestation sur la tomate Claudia.................................................................. 111
2.2. Manifestation sur l’aubergine Reina negra........................................................ 113
C. Discussion et conclusion .............................................................................................. 113
II. INFLUENCE DE LA SALINITE SUR L’ACTIVITE DES ENZYMES PECTOCELLULOSIQUES
PRODUITES IN VITRO PAR VERTICILLIUM ALBO-ATRUM .......................................................... 116
Introduction ....................................................................................................................... 116
A. Matériel et méthodes .................................................................................................... 117
1. Les isolats de Verticillium utilisés ............................................................................ 117
2. Analyse de l’activité carboxyméthylcellulase........................................................... 117
2.1. Production de l’enzyme..................................................................................... 117
2.2. Révélation.......................................................................................................... 118
3. Analyse de l’activité pectine méthyle estérase ......................................................... 119
3.1. Production de l’enzyme..................................................................................... 119
3.2. Révélation.......................................................................................................... 119
B. Résultats ....................................................................................................................... 120
1. Croissance de deux isolats de Verticillium développés sur milieu CMC enrichi en
NaCl .............................................................................................................................. 120
2. Effet de la salinité sur l’activité carboxyméthylcellulase ......................................... 120
3. Effet de la salinité sur l’activité pectine méthyle estérase ........................................ 120
C. Conclusion et discussion .............................................................................................. 123
226
III. INFLUENCE DE LA SALINITE SUR L’ACTIVITE PHENOLOXYDASIQUE DE VERTICILLIUM
ALBO-ATRUM .............................................................................................................................. 124
Introduction ....................................................................................................................... 124
A. Matériel et méthodes .................................................................................................... 125
1. Les souches fongiques .............................................................................................. 125
2. Détection des phénoloxydases. ................................................................................. 126
1.2. Les réactifs ........................................................................................................ 126
2.2. Révélations ........................................................................................................ 126
B. Résultats ....................................................................................................................... 126
1. Influence de la salinité sur la cinétique de la production des Pox ............................ 126
1.1. La souche sauvage P 80..................................................................................... 127
1.2. La souche hyaline P1......................................................................................... 127
2. Influence de la salinité sur l’activité phénoloxydasique globale de Verticillium...... 127
C. Discussion et conclusion .............................................................................................. 130
IV. EFFET DE LA SALINITE DU MILIEU SUR LE PROFIL PROTEIQUE DE L’ISOLAT P80 DE
VERTICILLIUM ALBO-ATRUM..................................................................................................... 131
Introduction ....................................................................................................................... 131
A. Matériel et méthodes .................................................................................................... 132
1. Concentration des protéines...................................................................................... 132
2. Dosage des protéines ................................................................................................ 132
3. Analyse des protéines par électrophorèse ................................................................. 133
3.1. Préparation des gels........................................................................................... 133
3.2. Préparation des échantillons .............................................................................. 133
3.3. Migration ........................................................................................................... 133
3.4. Révélation.......................................................................................................... 133
3.5. Lecture des résultats .......................................................................................... 134
B. Résultats ....................................................................................................................... 134
1. Effet de la salinité sur le taux des protéines secrétées dans les filtrats de culture par
Verticillium. .................................................................................................................. 134
2. Effet de la salinité sur l’évolution du pH des filtrats de culture................................ 135
3. Effet de la salinité sur les profils protéiques de l’isolat P80 ..................................... 136
3.1. Analyse des protéines sur gel de polyacrylamide.............................................. 136
3.2. Comparaison de l’expression des protéines....................................................... 137
C. Discussion et conclusion .............................................................................................. 139
CHAPITRE 5 : INFLUENCE DE LA SALINITE SUR L’ANTAGONISME MICROBIEN
VIS-A-VIS DE VERTICILLIUM ALBO-ATRUM ET SUR LA BIOPROTECTION DES
TOMATES CONTRE LA VERTICILLIOSE .......................................................................... 141
INTRODUCTION ......................................................................................................................... 141
I. EFFET DE LA SALINITE SUR L’ANTAGONISME IN VITRO DE QUELQUES MICROORGANISMES
BENEFIQUES DU SOL VIS-A-VIS DE VERTICILLIUM ALBO-ATRUM ............................................ 144
Introduction ....................................................................................................................... 144
A. Matériel et méthodes .................................................................................................... 145
1. Choix des microorganismes antagonistes ................................................................. 145
1.1. Penicillium sp .................................................................................................... 145
1.2. Fusarium oxysporum ......................................................................................... 145
227
1.3. Talaromyces flavus............................................................................................ 146
1.4. Trichoderma harzianum..................................................................................... 146
1.5. Bacillus sp ......................................................................................................... 146
2. Protocole des cultures en confrontations .................................................................. 146
3. Estimation de l’effet antagoniste .............................................................................. 146
B. Résultats ....................................................................................................................... 147
1. Effets de la salinité sur la compétitivité in vitro de quelques microorganismes
fongiques avec Verticillium .......................................................................................... 147
1.1. Confrontations Penicillium sp-Verticillium ...................................................... 147
1.2. Confrontation Fusarium oxysporum-Verticillium............................................. 149
1.3. Confrontation Talaromyces flavus-Verticillium ............................................... 149
1.4. Confrontation Trichoderma-Verticillium .......................................................... 149
2. Effet de la salinité sur l’antagonisme de Bacillus sp avec Verticillium .................... 153
C. Discussion et conclusion .............................................................................................. 153
II. INFLUENCE DE LA SALINITE SUR L’ANTAGONISME IN VITRO DE TRICHODERMA
HARZIANUM VIS-A-VIS DE L’ISOLAT P80 DE VERTICILLIUM ................................................... 157
Introduction ....................................................................................................................... 157
A. Matériel et méthodes .................................................................................................... 158
1. Le matériel fongique ................................................................................................. 158
1.1. Le pathogène ..................................................................................................... 158
1.2. L’antagoniste ..................................................................................................... 158
2. Mesure du phénomène d’antagonisme...................................................................... 159
2.1. Capacité de colonisation.................................................................................... 159
2.2. Antagonisme par antibiose ................................................................................ 159
B. Résultats ....................................................................................................................... 161
1. Influence de la salinité du milieu sur le développement de T. harzianum................ 161
1.1. Morphologie des cultures .................................................................................. 161
1.2. Poids sec du mycélium ...................................................................................... 161
1.3. Taux de sporulation ........................................................................................... 161
2. Influence de la salinité sur l’expression de l’activité antagoniste de T. harzianum visà-vis de Verticillium...................................................................................................... 161
2.1. Antagonisme par compétition............................................................................ 161
2.2. Antagonisme par antibiose ................................................................................ 164
C. Discussion et conclusion .............................................................................................. 170
III. INFLUENCE DE LA SALINITE SUR L’EXPRESSION DE L’ANTAGONISME IN VIVO DE
TRICHODERMA HARZIANUM VIS-A-VIS DE VERTICILLIUM ALBO-ATRUM DE LA TOMATE ...... 172
Introduction ....................................................................................................................... 172
A. Matériel et méthodes .................................................................................................... 173
1. Protocole de bioprotection des plantes ..................................................................... 173
1.1. Préinoculation avec Trichoderma...................................................................... 173
1.2. Inoculation avec la souche pathogène ............................................................... 174
2. Evaluation des manifestations de la maladie ............................................................ 174
2.1. Croissance des plantes....................................................................................... 174
2.2. Altérations foliaires ........................................................................................... 174
2.3. Ré-isolement du champignon ............................................................................ 175
B. Résultats ....................................................................................................................... 175
1. Recherches des conditions optimales pour l’expression de l’antagonisme in vivo de
Trichoderma harzianum vis-à-vis de Verticillium albo-atrum. .................................... 175
228
1.1. Effet de l’inoculation simultanée par le mélange de spores des deux champignons
1.2. Effet du délai de pré-inoculation par Trichoderma sur l’expression de la
bioprotection............................................................................................................. 178
1.2.
Discussion et conclusion ............................................................................. 181
2. Impact de la salinité sur le succès de la bioprotection des tomates contre la
verticilliose par Trichoderma harzianum...................................................................... 184
2.1. Réponses des plantes prétraitées avec Trichoderma à la surinfection par
Verticillium en fonction de la salinité du milieu ...................................................... 184
2.2. Discussion et conclusion ................................................................................... 186
CONCLUSION GENERALE ..................................................................................................... 189
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................... 200
ANNEXES..................................................................................................................................... 216
1
Introduction générale
La culture de la tomate Lycopersicon esculentum Mill, a connu une grande
extension au Maroc. La superficie globale occupée par les cultures de primeurs et
de saison s’élève à 20655 ha en 2001/02 et assure une progression de 18.7% par
rapport à 2000/01. Cette progression concerne aussi bien la tomate sous serre que
celle de plein champ. La production globale est passée de 307000 tonnes en 1989 à
560000 tonnes en 1999 (S.A.M., 2002).
Cependant cette culture est confrontée à de nombreuses contraintes qui affectent
aussi bien le rendement que la qualité des fruits. Ces contraintes sont liées à des
changements dans l’environnement de la plante, notamment la température et la
salinité, et au développement des maladies.
La culture de la tomate a dominé depuis les quatre dernières décennies les régions
du littoral atlantique, régions où règnent une humidité relative élevée et des
températures hivernales douces. Or, la proximité de l'océan atlantique fait que
cette culture subit la salinité des eaux d'arrosage puisées de la nappe phréatique
salée et les embruns qui entraînent une importante accumulation de sel dans le sol
(Besri, 1981). Par ailleurs, ces conditions semblent propices au développement des
maladies vasculaires dues principalement aux champignons du genre Verticillium.
La verticilliose de la tomate due à Verticillium albo-atrum, forme à microsclérotes
représente actuellement l’une des principales maladies de cette culture au Maroc.
Elle se manifeste par un rabougrissement des parties aériennes, des altérations
foliaires et des flétrissements conduisant parfois à la mort de la plante. L’agent
pathogène est un adélomycète vasculaire qui se conserve dans le sol sous forme de
microsclérotes. Ces propagules dormantes se développent sur les débris végétaux
au cours de la vie saprophytique du champignon et représentent l’inoculum de la
maladie. En présence de la plante hôte, les microsclérotes germent en réponse aux
exsudats racinaires et pénètrent dans les racines même en absence de toute
blessure. Le parasite se développe et colonise la totalité de la plante puis reste
localisé à l’intérieur des vaisseaux conducteurs provoquant leur obstruction et par
voie de conséquence le flétrissement de la plante infectée.
2
La colonisation des tissus par le parasite est rendue aisée par la production
d’enzymes de dégradation des parois cellulaires de l’hôte (Cooper et al., 1978 ;
Durand & Cooper, 1988). Une corrélation positive existe entre l’activité des
cellulases et des pectinases produites par des isolats de Verticillium et leur
agressivité vis-à-vis de leurs plantes hôtes (Gupta & Heale, 1971, Durand & Cooper,
1988). En outre, ce champignon est apte à produire des métabolites toxiques à
l’intérieur des tissus infectés et qui seraient impliqués dans l’expression des
symptômes de la maladie (Nachmias et al, 1982 ; 1984 et Meyer et al., 1994).
Il est connu que le comportement des plantes envers les agents pathogènes est
conditionné par certains facteurs de l’environnement. Ayres, (1984) a rapporté que
les stress abiotiques comme la sécheresse, la pollution, la chaleur ou la salinité
peuvent augmenter les symptômes des maladies par un effet direct sur la plante ou
sur le pathogène.
Quelques travaux ont montré l’influence de la salinité du milieu sur l’augmentation
de la sensibilité de la tomate à la fusariose (Standaert, 1975) et à la verticilliose
(Besri & Afaïlal, 1993). Selon ces auteurs, cette plus grande sensibilité est en
relation avec une colonisation plus intense des tiges par le parasite.
Le sel semble avoir une action néfaste aussi bien sur la plante hôte que sur l’agent
pathogène. Quelques rares hypothèses ont été avancées pour expliquer les
mécanismes par lesquels agit le chlorure de sodium pour accentuer la sévérité de
ces maladies. Messiaen & Lafon (1971) ont émis l’hypothèse que l’ion sodium
augmente la sensibilité de la tomate à la fusariose vasculaire par suite d’une
insuffisance en calcium provenant d’une interférence ionique entre ces deux
cations. Sur d’autres pathosystèmes, Mac Donald, (1984) et Sulistyowati & Keane,
(1992), estiment que la salinité prédispose les plantes aux attaques de
Phytophthora en inhibant la synthèse de phytoalexines, substances intervenant
dans la protection des plantes contre l’invasion par les agents pathogènes.
Benyahyia, (1998), travaillant sur le couple Citrus-Phytophthora a montré l’effet
spécifique des ions chlore sur l’interaction hôte-parasite. Cet ion agit sur la
3
physiologie de la plante et prédispose les porte-greffes à des attaques sévères par
l’agent pathogène.
La sévérité de la maladie en présence de sel serait liée également à une action
directe du sel sur l’agent pathogène. En effet, l’augmentation du chlorure de
sodium dans le sol stimule le développement et la conservation des champignons
vasculaires (Besri, 1981 ; Afailal, 1987 ). De la même manière, la croissance et la
production de sporanges chez Phytophthora citrophthora sont stimulées par la
présence de sel dans le sol et dans les eaux d’irrigation (Benyahyia, 1998).
D’autres facteurs biotiques sont incriminés dans l’augmentation de l’incidence des
trachéomycoses chez la tomate. On peut citer entre autres l’intervention des
nématodes sur la plante hôte et sur l’agent pathogène et l’augmentation de
l’inoculum dans le sol (Besri, 1991). Ces facteurs peuvent interagir avec le facteur
salinité et accentuer, par conséquent, la sévérité de la maladie.
Si de multiples travaux ont porté sur le rôle du sel dans la prédisposition des
plantes aux maladies, peu d’études ont été entreprises pour élucider les
mécanismes physiologiques et biochimiques qui régissent le changement de la
sensibilité des plantes stressées aux agressions fongiques.
Dans la nature, les relations hôte-parasite-environnement sont très complexes. La
réponse des plantes à la fois aux stress abiotique et biotique est la résultante de
plusieurs processus physiologiques et métaboliques mis en route pour adapter la
plante d’une part aux contraintes hydriques et nutritionnelles et d’autre part, pour
élaborer les mécanismes de défense contre les outils pathogéniques de l’agent
causal de la maladie.
L’interprétation de l’influence du milieu nutritif sur la sensibilité des plantes à la
maladie
requiert
une
connaissance
approfondie
des
caractéristiques
physiologiques des plantes stressées par la salinité et des modifications
métaboliques liées à l’interaction salinité-pathogène.
Dans cette directive, nous avons successivement :
-
Evalué séparément l’effet de la salinité sur le comportement de la plante et
sur les activités biologiques in vitro de l’agent pathogène. Ces recherches
ont été conduites respectivement sur deux variétés de tomate choisies pour
4
leur sensibilité à la verticilliose et sur un isolat de Verticillium albo-atrum
se montrant agressif sur les deux variétés de tomate testées,
-
Montré l’influence de la salinité sur la manifestation de la maladie et sur la
variabilité du pouvoir pathogène d’un isolat de Verticillium d’origine
tomate.
-
Etudié les conséquences physiologiques et biochimiques liées à la salinité en
relation avec l’infection par Verticillium chez les tomates doublement
stressées et enfin,
-
Mis en évidence l’impact de la salinité sur les mécanismes d’action de
l’agent pathogène notamment sa capacité à produire les toxines et les
enzymes cellulolytiques.
Cette étude s’est appuyée sur la modélisation des interactions hôte-pathogèneenvironnement représentées par Van Der Plank sous forme d’un triangle ; le
triangle de la maladie. Ce modèle peut être développé et inclure l’Homme, ce qui
implique une nouvelle schématisation des interactions de la maladie sous forme
d’un tétraèdre (Agrios, 1988), l’Homme occupant le sommet de la pyramide. En
effet, l’Homme peut influencer les trois autres facteurs en intervenant dans le
choix des espèces végétales, le choix des sols et sur les méthodes de lutte.
A ce propos, en raison de la gravité des problèmes posés par la salinité sur le
développement de la verticilliose et de la nécessité de mettre au point une stratégie
de lutte efficace contre Verticillium dans de telles conditions de l’environnement,
nous avons visé, dans la dernière partie de ce travail, d’examiner l’influence de la
salinité sur le succès de la bioprotection des tomates contre la verticilliose. Mais
pourquoi une lutte biologique ?
En fait, plusieurs méthodes ont été préconisées pour réduire l’incidence de la
maladie.
La rotation culturale a montré des résultats intéressants, mais son efficacité est très
contestée vu le mode de conservation du champignon dans le sol sous forme de
microsclérotes. Ces propagules ont une longue survie et peuvent contaminer des
plantes adventices non hôtes, ce qui contribue à l’augmentation du taux d’inoculum
dans le sol.
5
La lutte chimique est largement utilisée. Plusieurs fongicides comme le benlate, le
propiconazole et le paclobutrazol ont réussi à diminuer l’incidence de la maladie.
Cependant, ces produits très coûteux présentent des inconvénients pour l’Homme et
l’environnement auxquels s’ajoute le risque d’apparition de nouveaux pathotypes
résistants.
La lutte génétique est l’une des méthodes les plus efficaces pour lutter contre la
verticilliose. L’utilisation des variétés résistantes à la race 1 de Verticillium a fait ses
preuves pendant plusieurs années. Néanmoins, son efficacité a diminué avec
l’apparition d’une nouvelle race, la race 2 (Besri et al. ; 1984 ; Tjamos, 1984), à
laquelle aucune variété ne présente une résistance satisfaisante.
La prise en conscience des limites des méthodes chimique et génétique de lutte,
considérées un moment comme susceptibles à elles seules de résoudre les problèmes
des maladies des plantes, a incité les chercheurs à s’orienter vers la lutte biologique.
Ce moyen de lutte met en œuvre des organismes vivants ou des substances
biologiques pour réduire les dégâts causés par les agents phytopathogènes.
Le contrôle biologique avec les microorganismes bénéfiques permet d’augmenter le
rendement en supprimant directement l’inoculum pathogène et/ou en induisant la
résistance des plantes. La résistance induite représente actuellement une nouvelle
stratégie de défense des plantes contre les agressions pathogènes.
Plusieurs tentatives de lutte biologique contre la verticilliose ont abouti soit par
l’induction de la résistance soit par l’utilisation des microorganismes antagonistes.
C’est le cas de la bioprotection de l’aubergine par l’utilisation de champignons
antagonistes comme Talaromyces flavus (Fravel, 1996 ; Kim et al., 1988 ) et
Trichoderma harzianum (D’Ercole et al., 2000), celle de l’érable par Bacillus subtilis
(Hall & Schreiber, 1984) et de la luzerne par Sinorhizobium meliloti (El Aissami,
1999). La bioprotection des tomates contre Verticillium a été obtenue par
prémunition à la suite de la pré-inoculation des jeunes plants par une souche
avirulente du même champignon avant l’infection agressive (Regragui et al., 1989).
Cependant, il a été établi que l’efficacité des microorganismes bénéfiques à supprimer
les maladies est influencée par les facteurs de l’environnement (Lewis & Papavizas,
1987 ; Harman et al., 1981). Il est donc important de connaître dans la mesure du
6
possible l’écologie des agents du contrôle biologique et leurs interactions avec le
pathogène, la plante hôte et la communauté microbienne de la rhizosphère (Larkin &
Fravel, 2002).
A la lumière de ces données, et dans l’objectif de vérifier dans quelle mesure la
salinité peut affecter la réussite du phénomène de bioprotection, on s’est proposé de
protéger les tomates soumises au stress salin contre la verticilliose par l’utilisation de
Trichoderma harzianum, un puissant agent antagoniste. Cette tentative a été
précédée par des essais conduits in vitro afin d’examiner l’effet de la salinité sur le
développement et la reproduction de l’agent de lutte biologique et sur l’efficacité de
ses différents modes d’action antagoniste à l’encontre du champignon pathogène.
7
Chapitre I : Etude de l’influence de la salinité sur le
comportement de la tomate (Lycopersicon esculentum) et
sur le développement in vitro de Verticillium albo-atrum
I. Effet de la salinité sur le comportement de deux génotypes
de tomate
Introduction
La culture de la tomate au Maroc connaît une grande extension en zone irriguée et
en zone côtière. Les eaux utilisées pour l’irrigation des parcelles de tomate le long
du littoral atlantique appartiennent aux classes C3 (0.48 g/l – 1.44 g/l) et C4 ( 1.4
g/l – 3.2 g/l) définies par Richards (1969). Ce sont donc des eaux salées à très
salées (Amor, 1991). Il en résulte une accumulation de sel dans le sol en plus des
embruns qui apportent de grandes quantités de NaCl (Besri, 1977). Lorsque la
salinité est de 2.5 g/l, le rendement baisse de 10%. Cependant, la baisse du
rendement peut atteindre 25% à une salinité de 4g/l.
La salinité des sols et des eaux d’irrigation ne constituent pas un facteur limitant la
culture de la tomate mais peut constituer un facteur qui limite la qualité de la
production. En effet, l’impact de la salinité est plus grave sur le rendement export
suite à la réduction du calibre des fruits ( PNTTA, 1999)
La salinité a été rapportée comme un facteur de l’environnement qui augmente la
sensibilité des tomates aux maladies d’origine fongique principalement la fusariose
(Standaert, 1978), la verticilliose (Afailal 1987, Besri, 1990) et la pourriture
racinaire due à Phytophthora parasitica (Swiecki & Mac Donald, 1991).
Cette différence de sensibilité induite par le sel serait la résultante de l’interaction
du milieu nutritif avec la physiologie de la plante d’une part, et celle du parasite
d’autre part. Toute interprétation de l’augmentation de l’incidence de la maladie
dans ce cas requiert une bonne connaissance du comportement de la plante vis-àvis de la salinité du milieu.
Dans cette optique, nous avons évalué le niveau de tolérance vis-à-vis du stress
salin de deux variétés de tomate choisies pour leur grande sensibilité à la
verticilliose, principal handicap de cette culture au Maroc.
8
La tolérance d’une plante à la salinité est définie par son aptitude à se développer
normalement en conditions salines. Le degré de tolérance dépend du stade
physiologique de la plante. En général, les plantes sont plus sensibles au stade
germination et émergence. Le degré de sensibilité diminue ensuite avec l’âge.
La résistance des plantes à la salinité dépendrait de leur capacité à maintenir des
conditions favorables à leur fonctionnement en évitant ou en tolérant les fortes
concentrations ioniques à l’intérieur de leurs cellules. Les différences entre les
espèces résident dans l’efficacité des moyens mis en œuvre pour la protection de
leur équilibre (Hamza, 1980).
La tolérance de la tomate à la salinité a fait l’objet de plusieurs études ( Shalhevet
& Yaron, 1973 ; Perez-alfocea et al., 1996 ; Katerji et al., 1998). D’après ces auteurs,
la tomate est moyennement tolérante à la salinité. Cependant, cette tolérance varie
d’une espèce à l’autre et même entre les variétés d’une même espèce (Cruz &
Cuartero, 1990). Des différences de sensibilité au sel ont été constatées entre
différentes variétés de tomate appartenant à l’espèce cultivée Lycopersicon
esculentum et entre les espèces sauvages de tomate aussi bien in vitro qu’in vivo
(Amor, 1991).
Plusieurs critères sont utilisés pour tester la tolérance à la salinité des tomates en
phase de croissance végétative. Cruz & Cuartero (1990) ont testé la tolérance de 39
génotypes appartenant à 5 espèces de Lycopersicon en évaluant 16 caractères
différents. Ces auteurs recommandent d’utiliser quatre caractères fiables ; la
hauteur des tiges, le poids frais des tiges et les concentrations foliaires en Na+ et en
Cl-. Ces caractères changent avec la concentration saline indépendamment des
génotypes.
C’est ainsi que nous avons testé la tolérance au sel des deux variétés de tomate lors
de la germination et du développement végétatif. Celui ci a été évalué par la
hauteur des plantes et le poids frais des parties aériennes. Les teneurs en éléments
minéraux qui caractérisent hautement la tolérance à la salinité seront étudiées
dans le prochain chapitre parmi les effets physiologiques et biochimiques du sel
sur le couple tomate-Verticillium.
9
A. Matériel et méthodes
1. Le matériel végétal
La tomate (Lycopersicon esculentum, Mill.) est une plante maraîchère largement
cultivée au Maroc. Deux variétés ont été retenues pour notre étude ; la Marmande
Claudia sensible à la verticilliose et la Marmande VR possédant le gène Ve de la
résistance à la race 1 de Verticillium, mais sensible à la race 2 du même
champignon. Les semences nous ont été gracieusement fournies par " Semences
Clauses " de Brétiny (France).
2. Effet du sel sur la germination des graines
2.1. Protocole de germination
Les graines des deux variétés de tomate sont stérilisées par trempages successifs
dans les bains suivants :
- Hypochlorite de sodium à 15% pendant 2 minutes
- Deux rinçages à l'eau distillée stérile
- Alcool 90° pendant une minute
Les graines sont séchées sur papier filtre stérile avant d'être déposées dans des
boîtes de Pétri contenant deux couches de papier filtre stérile imbibé d'une
solution saline à différentes concentrations :0 ; 20 ; 40 ; 60 ; 80 et 100 mM de
NaCl soit 0 ; 1.16 ; 2.36 ; 3.50 ; 4.67 et 5.84 g/l. Les lots témoins sont placés sur
papier filtre imbibé d'eau distillée stérile.
2.2. Conditions de culture
Les boîte de Pétri, contenant chacune 25 graines, sont placées à l'obscurité dans
une étuve à 24±1°C pendant une semaine. De l'eau distillée stérile est ajoutée en
cas de dessèchement du papier filtre. Dix répétitions sont prévues pour chaque
traitement et par variété.
10
2.3. Observations
Les boîtes de Pétri sont examinées tous les deux jours pour suivre la germination
des graines. Le nombre de graines ayant germé est noté et le pourcentage de
germination est ainsi calculé. Une graine germée est celle qui parvient à émettre
une radicule et les deux cotylédons. L'effet du NaCl est estimé par le pourcentage
d'inhibition de la germination apprécié comme suit :
%IG = PGte - PGtr / PGte x 100
PGte: pourcentage de germination du lot témoin
PGtr : pourcentage de germination du lot traité par le sel
3. Effet du sel sur la croissance végétative des plantes
3.1. Conditions de culture
3.1.1. Le substrat
Les cultures de tomate sont conduites sur du sable calibré de 1 à 2 mm de grosseur.
Il est lavé à l'eau , puis mis à tremper dans l'acide chlorhydrique technique
pendant 24 heures. Il est ensuite rincé une dizaine de fois avec de l'eau distillée
jusqu'à stabilisation du pH autour de 3.5, puis lavé trois fois avec la solution
nutritive jusqu'à ce que le pH qui percole s'établisse aux alentours de 6. Ce sable
est ensuite stérilisé deux fois à l'autoclave pendant une heure à 24 heures
d'intervalle. Avant son utilisation, le substrat est ré-imbibé avec la solution
nutritive d’arrosage (annexes).
3.1.2. Préparation des pépinières
Les graines sont stérilisées par trempage dans l'alcool à 90° pendant deux minutes.
Elles sont ensuite séchées sur papier filtre puis semées en pépinière. Elles sont
arrosées tous les deux jours avec la solution nutritive complète sans sel.
3.1.3. Traitement par le sel
Arrivées au stade « premières vraies feuilles », les plantules sont déterrées
délicatement et replantées dans des pots de sable de 450 cm3. Les plantules sont
arrosées tous les deux jours avec la solution nutritive enrichie avec différentes
concentrations de NaCl :0 ; 20 ; 40 ; 60 ; 80 et 100 mM soit 0 ; 1.16 ; 2.33 ; 3.50 ;
11
4.73 et 5.84 g/l. Les pots sont percés à la base pour permettre à la solution
d'arrosage de percoler en cas d'excès.
3.1.3. La chambre de culture
Les cultures en pépinière et en pots sont effectuées dans une chambre de culture
climatisée à 24 ± 1°C sous une photopériode de 16 heures et une humidité relative
de 65%.
3.2. Lecture des résultats
Après six semaines d’observation, la croissance des plantes est estimée par deux
variables : la hauteur de l’épicotyle et le poids frais des parties aériennes. Quatre
heures après le dernier arrosage, les plantes sont délicatement déterrées et
excisées au niveau de la cicatrice des cotylédons. Elles sont ensuite pesées. Les
tests sont réalisés sur des lots de 15 plantes pour chaque variété de tomate et par
concentration saline.
4. Analyse statistique des données
Chaque test est répété au moins deux fois. Les analyses statistiques sont effectuées
à l’aide du logiciel SPSS. Les moyennes sont comparées par analyse des variances
au seuil de 5% suivie par le test de Newman-Keuls.
B. Résultats
1. Action du sel sur le pouvoir germinatif des graines
1.1. Effet sur la vitesse de germination
Les pourcentages de germination des variétés Marmande Claudia et Marmande VR
ont été relevés tous les deux jours. Leur évolution en fonction du temps est
illustrée sur la figure 1.
En absence de sel (figure 1A), les deux courbes obtenues, en forme de S, sont
parallèles et présentent une zone linéaire située entre 2 et 4 jours au cours de
12
Figure 1. Effet de la salinité sur la vitesse de germination des graines de
deux variétés de tomate.
Figure 1 B. 40mM de NaCl
Figure 1 A. 0m M de NaCl
100
M arm ande Claudia
M arm ande VR
90
80
Pourcentage de germination
Pourcentage de germination
100
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
90
Marmande Claudia
80
Marmande VR
70
60
50
40
30
20
10
0
8
0
Tem ps après sem is (en jours)
Figure 1 C. 80mM de NaCl
4
6
8
Figure 1 D. 100mM de NaCl
100
100
90
Marmande Claudia
80
Marmande VR
Pourcentage de germination
Pourcentage de germination
2
Temps après semis (en jours)
70
60
50
40
30
20
90
Marmande Claudia
80
Marmande VR
70
60
50
40
30
20
10
10
0
0
0
0
2
4
6
Temps après semis (en jours)
8
2
4
6
Temps après semis (en jours)
8
13
laquelle la vitesse de germination est maximale. Entre 4 et 8 jours, la pente des
courbes diminue et les valeurs des % de germination tendent à se stabiliser.
En présence de sel, la vitesse de germination diminue avec l’augmentation de la
salinité comme le montrent les pentes des courbes des figures 1B ; 1C et 1D. De
même, un retard de la germination est noté. L’apparition de la radicule a lieu 48
heures après le semis chez les témoins ou chez les graines soumises aux
concentrations modérées de sel. Cependant, elle ne se manifeste qu’entre 2 et 4
jours aux concentrations supérieures ou égales à 80mM de NaCl.
1.2. Effet sur le taux de germination
L’analyse des résultats consignés sur la figure 2 montre que la salinité affecte le
taux de germination des deux variétés Marmande Claudia et Marmande VR. Les
pourcentages de germination diminuent en fonction des concentrations
croissantes de NaCl. Pour chacune des deux variétés, on note des différences
significatives entre les différents traitements salins.
Néanmoins, pour un même traitement, les % de germination des deux variétés
diffèrent statistiquement. En effet, après 8 jours de semis, les % de germination en
absence de sel sont de 89.80% et 82.27% respectivement pour Claudia et VR. Cette
différence est maintenue en présence de sel mais s’amplifie aux fortes
concentrations. A 100mM de NaCl, le pourcentage de germination est de 46.53 %
pour Marmande Claudia alors qu’il ne dépasse guère 23.5% pour Marmande VR.
Cette dernière semble plus affectée par les fortes concentrations de sel par rapport
à Marmande Claudia pour l’expression du pouvoir germinatif.
L’effet inhibiteur du sel se manifeste sur le pouvoir germinatif des variétés Claudia
et VR dès la concentration de 20mM de NaCl (figure 3). Aux concentrations faibles
et modérées, l’effet du sel s’exprime avec la même importance ; les pourcentages
d’inhibition de la germination par rapport aux témoins sans sel ne montrent pas de
différences significatives entre les deux variétés après 8 jours de semis. Aux fortes
concentrations (100 mM de NaCl), les pourcentages d’inhibition de la germination
s’écartent de manière hautement significative et sont de 48.21 % pour Marmande
Claudia et 71.96 % pour Marmande VR.
14
Pourcentage de germination
Figure 2. Effet de la salinité sur le taux de germination de
deux variétés de tomate après 8 jours de semis
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Marmande Claudia
Marmande VR
0
20
40
60
80
100
Concentration en NaCl (mM)
Figure 3. Pourcentage d'ihnibition de la germination des graines
de deux variétés de tomate en fonction de la salinité
Pourcentage d'inhibition de la
germination
80
70
60
50
Marmande Claudia
Marmande VR
40
30
20
10
0
20
40
60
80
Concentration en NaCl (mM)
100
15
2. Action du sel sur la croissance végétative des plantes
Cette étude a été menée pour évaluer l’influence de la salinité sur la croissance
végétative de la plante entière. Les résultats des mesures de la taille et du poids
frais ont été analysés.
2.1. Effet sur la taille de l’axe aérien
Après six semaines d’observation, les deux variétés de tomate soumises au
traitement par le sel montrent une réduction régulière et significative de la taille de
l’épicotyle sous l’effet des concentrations croissantes de NaCl de la solution
d’arrosage (figure 4). Pour chacune des deux variétés, on note des différences
significatives entre les différents traitements par le sel à l’exception des
traitements de 60mM et 80mM dont les effets sont similaires.
Les réductions de la croissance par rapport aux témoins sans sel sont reportées sur
le tableau 1.
Tableau 1. Inhibition de la taille des tomates après traitement par NaCl.
Pourcentage d’inhibition de la taille des plantes de tomate
Concentration en NaCl (mM/l)
Variétés
Claudia
20
60
80
100
15.90 ± 4.86 27.22 ± 7.71 45.41 ± 4.65 47.40 ± 5.71 70.80 ± 2.35
a
VR
40
b
c
c
d
16.16 ± 4.48 33.46 ± 6.60 46.84 ± 4.89 53.28 ± 4.72 69.32 ± 2.45
a
b
c
c
d
Deux résultats lus sur une même ligne diffèrent statistiquement au seuil de 5% s’ils ne sont affectés
d’aucune lettre en commun.
Les résultats montrent une certaine analogie dans les réponses des deux variétés.
Pour une même salinité, les % de réduction de la croissance sont statistiquement
similaires. L’inhibition de la croissance, faible aux premières concentrations de
l’expérience, atteint à 60mM 45.41% pour Claudia et 46.84% pour VR. Elle
16
s’accentue avec l’augmentation de la salinité pour atteindre respectivement à
100mM de NaCl 70.8% et 69.32% pour Claudia et VR. L’analyse de la variance à
deux critères ne montre pas de différence significative entre les deux variétés.
2.2. Effet sur la biomasse des parties aériennes
Les plantes ayant servi à l’étude de l’élongation des tiges sont excisées au niveau
des cicatrices des feuilles cotylédonnaires puis pesées. Les résultats sont consignés
sur la figure 5.
L’effet de la salinité s’est manifesté sur les deux variétés par une réduction
significative du poids frais des tiges et feuilles corrélée avec l’augmentation de la
salinité des eaux d’arrosage. Des différences significatives existent entre les
traitements salins. L’effet de la salinité se manifeste selon le même schéma que
pour l’effet sur la taille (tableau 2.). Les pourcentages d’inhibition de la biomasse
des parties aériennes à 60 mM sont de 50.21 % et 51.59 % respectivement pour
Claudia et VR, et de 67.27 % et 72.68 % à 100 mM. La différence notée entre les
deux variétés n’est pas significative pour ce paramètre de la croissance.
Tableau 2. Inhibition du poids frais des parties aériennes des tomates
après traitement par NaCl
Pourcentage d’inhibition du poids frais des parties aériennes
Concentration en NaCl (mM/l)
Variétés
Claudia
20
60
80
100
18.17 ± 9.67 35.06 ± 9.56 50.21 ± 6.61 53.12 ± 6.88 67.27 ± 5.25
a
VR
40
b
c
c
d
24.51±10.60 24.51±10.60 51.59 ± 7.74 53.66 ± 5.70 72.68 ± 4.64
a
b
c
c
d
Deux résultats lus sur une même ligne diffèrent statistiquement au seuil de 5% s’ils ne sont affectés
d’aucune lettre en commun.
17
Figure 4. Effet du sel sur la hauteur de l'épicotyle des
plantes de tomate après six semaines
Longueur de l'épicotyle (en cm)
40
35
Marmande VR
30
Marmande Claudia
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
Concentration des solutions d'arrosage en NaCl (mM)
Figure 5. Effet du sel sur le poids frais des parties aériennes
des plantes de tomate après six semaines
Poids frais de l'axe aérien en g
7
Marmande Claudia
6
Marmande VR
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
100
concentration des solutions d'arrosage en NaCl (mM)
18
C. Discussion et conclusion
L’influence de la salinité sur le pouvoir germinatif des deux génotypes de tomate
s’est manifestée par une réduction du taux et de la vitesse de germination par
rapport aux témoins, réduction d’autant plus importante que la concentration en
sel est élevée. L’analyse des variances a montré des différences significatives entre
les deux variétés dans leur pourcentage de germination aux fortes concentrations
de sel. La variété Marmande Claudia semble mieux tolérer les concentrations
élevées de NaCl lors de la germination que Marmande VR. Nos résultats
confirment les recherches de Berstein, (1975) et Bozouk, (1981) qui ont montré que
chez la tomate cultivée (Lycopersicon esculentum), la germination est inhibée par
les conditions salines.
La tolérance au sel au cours de la germination est une réponse directe de
l’embryon à ses conditions nutritionnelles. Elle est directement liée à une
sélectivité efficace du plasmalemme à l’égard de l’ion sodium. Cette sélection au
stade embryonnaire est associée à une accumulation de calcium par la graine lors
de la phase de maturation (Guerrier, 1983).
L’étude de l’effet du NaCl sur la germination de semences est insuffisante pour
estimer la tolérance de la tomate au stress salin. En effet, la résistance au stress
salin peut apparaître au stade germination et changer ou non pendant les phases
suivantes de la croissance.
Le sel a eu un effet négatif sur la taille et le poids frais des tiges et feuilles des deux
variétés cultivées dans nos conditions expérimentales. Les concentrations
modérées de NaCl (60 mM) réduisent les performances de la croissance d’environ
50 % par rapport au témoin sans sel. Ce résultat correspond aux observations de
Babas (1985), sur les variétés Vémone et Carmello, et de Amor (1991) qui a
rapporté une baisse de la croissance de trois variétés de tomate, collectées dans les
régions pré-sahariennes marocaines, en fonction de la salinité du milieu. Cet
auteur a montré en outre, des différences nettes dans la réponse des différentes
variétés suivant leur niveau de tolérance. D’après nos données, il n’y a pas de
différence significative entre les deux génotypes pour les deux paramètres de la
croissance évalués. La réponse au stress salin de la variété Marmande VR s’est
19
alignée avec celle de Marmande Claudia durant la phase végétative de la croissance
contrairement au comportement différentiel observé lors de la germination.
Slama (1991) a évalué la tolérance au sel à partir du ralentissement de la vitesse de
croissance des plantes à la concentration de 50mM de NaCl. Sous des
concentrations voisines, la croissance des deux variétés de tomate a été réduite
d’environ 50%. Ces résultats reflètent donc le niveau moyen de la tolérance au sel
de ces deux génotypes. Ces derniers offrent ainsi un matériel de choix pour l’étude
des effets combinés de la salinité et de l’infection avec Verticillium, principal agent
des trachéomycoses au Maroc.
II. Influence de la salinité du milieu sur le développement in
vitro d’un isolat de Verticillium albo-atrum d’origine tomate
Introduction
Le développement des champignons phytopathogènes du sol dépend du
comportement de la population des plantes hôtes et des caractéristiques de
l’environnement. Les fluctuations de l’une ou l’autre de ces caractéristiques
peuvent agir sur le développement et les activités biologiques de ces agents
pathogènes et sur la relation hôte-parasite.
Verticillium est un champignon tellurique qui se conserve dans le sol sous forme
de microsclérotes. Ces formes de résistance peuvent rester à l’état dormant
pendant plusieurs années en l’ absence de toute culture sensible. En présence de la
plante hôte, les microsclérotes peuvent germer et attaquer les plantes par les
racines. Le champignon prolifère à l’intérieur des vaisseaux du xylème et provoque
par la suite des altérations foliaires et le flétrissement de la plante. Ce champignon
vasculaire est ainsi soumis aux variations physico-chimiques du sol avant
l’infection et à la variation de la composition chimique de la sève qui en découle
une fois installé dans les vaisseaux du xylème.
Plusieurs travaux ont rapporté que l’augmentation de la salinité du milieu favorise
la croissance et la conservation de Verticillium dahliae et de Fusarium oxysporum
fsp lycopersici , principaux agents des trachéomycoses au Maroc (Besri, 1977 ;
Ioannou et al., 1977 ; Besri, 1981 ). Ces deux agents vasculaires tolèrent des
20
potentiels osmotiques extrêmement bas, alors que la salinité excessive peut être
toxique pour d’autres champignons du sol. De même, la réduction du potentiel
osmotique à des valeurs comprises entre –2 et –20 bars stimule la croissance
mycélienne et la sporulation de Verticillium dahliae, mais la production des
organes de résistance est moins sensible à la baisse du potentiel osmotique
(Ioannou et al., 1977 ). Une stimulation de la formation des organes de
conservation chez Fusarium oxysporum fsp lycopersici par la baisse du potentiel
osmotique correspond aux observations de Besri (1977 et 1981 ) à condition que la
disponibilité en eau du sol soit satisfaisante.
Ducan & Himelik (1986) ont montré que lorsqu’on cultive artificiellement
Verticillium dahliae sous un potentiel de pression négative de –0.039 MPa, la
production de conidies augmente de 800% par rapport au témoin non traité.
L’influence de la salinité sur la germination des conidies de quelques isolats de
Verticillium lecanii a été étudiée par Chandler et al. (1994). Selon ces auteurs, le
pouvoir germinatif diminue avec la baisse du potentiel osmotique. Un seul isolat
de V. lecanii a été sélectionné pour sa rapide germination après 12 heures à –2.8
MPa.
L’effet de la salinité a été étudié sur d’autres champignons pathogènes. C’est le cas
des Phytophthora. Spp. Benyahya, (1998) a montré que l’augmentation de la
salinité du milieu favorise la croissance mycélienne in vitro de Phytophthora
citrophthora et P. parasitica , agents de la pourriture racinaire des agrumes, avec
un optimum situé entre –1.44 et –3.11 bars. Au delà de cet intervalle, les activités
biologiques régressent et la production de sporanges est complètement inhibée.
D’autres espèces du même genre tolèrent des valeurs du potentiel osmotique
beaucoup plus basses, comme Phytophthora cinnamomi qui montre une
croissance optimale à –15 bars, alors que pour P. megasperma, la croissance
diminue avec la baisse du potentiel osmotique (Sommers et al., 1970).
Les travaux de Swiecki & Mac Donald (1991) rapportent que la formation des
sporanges de Phytophthora parasitica est plus importante en présence de
concentrations modérées de NaCl et de CaCl2 par rapport aux témoins sans sel.
21
Cependant le nombre de zoospores produites et leur mobilité sont nettement plus
faibles que ceux des témoins.
Parallèlement à ces travaux concernant l’action directe du sel sur le développement
de ces champignons phytopathogènes, des études ont montré l’impact de la salinité
sur la sensibilité des plantes aux maladies d’origine fongique. Dans ce sens,
plusieurs auteurs rapportent une augmentation de la sensibilité des tomates à
Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici
(Davet, 1966, Standaert, 1978) et à
Verticillium dahliae (Besri, 1991 ; Besri & Afailal, 1993).
L’interprétation de l’effet de la salinité sur la plus grande sensibilité de la tomate à
ces maladies est à rechercher, comme nous l’avons déjà précisé, au niveau de
l’interaction de la plante et du pathogène avec l’environnement. La baisse de la
croissance des plantes de tomate suite au stress salin décrite au paragraphe
précédent représente un des aspects physiologiques de cette interaction. Il paraît
donc nécessaire d’examiner dès lors l’impact de la salinité sur le développement de
l’agent pathogène. A cette fin, nous nous proposons d’étudier in vitro l’effet de la
salinité sur le développement de l’isolat P80 de Verticillium connu pour son fort
pouvoir pathogène vis-à-vis des variétés Marmande Claudia et VR. Cette étude in
vitro contribuera à mieux comprendre le comportement du champignon dans les
sols riches en sel et à l’intérieur des vaisseaux conducteurs des plantes hôtes
soumises au stress salin partant du fait que la composition chimique de la sève est
le reflet de l’interaction physiologique de la plante avec son milieu nutritif .
A. Matériel et méthodes
1. La souche fongique
Lahlou (1983) a isolé Verticillium d’une tige de tomate, sévèrement atteinte de
verticilliose, de la région de Dar Bouazza. L’isolat initial a été cloné et identifié
comme appartenant à l’espèce Verticillium albo-atrum R & B, forme à
microsclérotes. Le clone P3 , de phénotype sauvage, s’est montré très agressif sur
la variété Marmande sensible.
Au cours de nos expériences préliminaires, des plantes de tomate, variété
Marmande VR, ont été artificiellement infectées avec l’isolat P3 et régulièrement
22
arrosées avec une solution enrichie en NaCl. En fin d’expérience, le champignon a
été ré-isolé d’une plante montrant des symptômes caractéristiques de
rabougrissement. Cet isolat fut nommé P80 et a été utilisé dans tous nos essais.
Le champignon est cultivé en boîte de Pétri sur milieu PDA ou milieu Malt gélosé,
à l’obscurité et à 24± 1° C.
Le clone P80 est caractérisé par un mycélium blanchâtre d’aspect cotonneux et une
sclérogénèse abondante apparaissant après 6 à 7 jours de culture. Il est très
agressif sur la variété Marmande Claudia sensible mais aussi sur la variété
Marmande VR possédant le gène Ve de la résistance. Il a été identifié donc comme
appartenant à la race 2 de Verticillium.
2. Ensemencement
Les cultures liquides sont réalisées dans des fioles de 250 ml à raison de 100 ml
par fiole. Elles sont ensemencées avec 1 ml d’une suspension de spores à 10
6
spores /ml fraîchement préparée à partir d’une culture de Verticillium âgée de 12
jours.
Les cultures solides, conduites sur boites de Pétri, sont ensemencées avec des
rondelles de 4 mm de diamètre préalablement découpées à l’emporte pièce dans la
zone de croissance active d’une culture âgée de deux semaines et présentant
l’aspect caractéristique du type sauvage. Les thalles montrant des secteurs hyalins
sont systématiquement écartés. Les boutures sont déposées au centre de la boîte et
à l’envers pour que le champignon soit en contact direct avec le milieu de culture.
Les boîtes sont fermées avec un ruban de parafilm pour éviter tout changement
dans la pression osmotique du milieu par une éventuelle perte d’eau. Toutes les
cultures sont mises à incuber à l’obscurité et à 24 ± 1°C.
3. Traitement par le sel
Les cultures fongiques sont conduites sur milieu à base d’extrait de malt liquide ou
gélosé (2%) enrichi de chlorure de sodium à différentes concentrations 0 ; 5 ; 10 ;
15 ; 20 ; 30 ; 40 ; 50 ; 60 ; 80 et 100g/l selon le type d’expérience. Dix répétitions
sont prévues pour chaque traitement salin.
23
4. Estimation de l’effet du sel sur la croissance de Verticillium
4.1. Croissance diamétrale
Les cultures sont examinées régulièrement, tous les jours. Les mesures des
moyennes des deux diamètres perpendiculaires de chaque colonie sont faites tous
les 5 jours. Le test a duré 20 jours.
4.2. Croissance pondérale
Bien que la croissance diamétrale soit la méthode la plus utilisée pour estimer
l’effet d’un facteur de l’environnement sur un champignon, elle reste toutefois
insuffisante car elle ne tient pas compte de la densité des filaments mycéliens ni du
taux de la croissance spécifique. Pour palier à cette lacune, le poids sec du
mycélium a été examiné comme un autre paramètre de la croissance pour estimer
l’effet de la salinité sur le développement de Verticillium.
Après trois semaines d’incubation, les cultures liquides de Verticillium sont filtrées
sur mousseline. Le mycélium recueilli est lavé deux fois à l’eau distillée, puis essoré
entre plusieurs couches de papier filtre avant d’être séché à 80°C pendant 24
heures. Le poids sec du mycélium (mg) est ensuite déterminé.
5. Effet sur l’intensité de la conidiogénèse
Sur les boîtes ayant déjà servi pour l’étude de la croissance des colonies, dix
rondelles de 5 mm de diamètre sont découpées à l’emporte pièce à 2mm environ
du front de la croissance de chaque thalle. Elles sont ensuite placées dans un tube à
vis contenant 10 ml d’eau stérile. Les tubes sont agités au vortex pendant 20
secondes, ce qui permet l’éclatement des sphérules portées par les conidiophores
et la libération des conidies. Le contenu de chaque tube est ensuite filtré sur
mousseline afin d’éliminer les fragments mycéliens et les morceaux de gélose. Le
comptage du nombre total des conidies libérées par les dix rondelles est effectué
avec un hématimètre ( cellule de Malassez) à raison de 5 comptages par suspension
et de 10 boîtes par traitement salin. Les résultats sont exprimés en nombres de
conidies par unité de surface (cm2).
24
6. Effet sur le pouvoir germinatif des conidies
Pour chaque traitement salin, une goutte contenant 100 conidies de Verticillium,
issue d’une suspension de spores de l’isolat P80 fraîchement préparée, est étalée
sur la surface de milieu gélosé à base d’extrait de malt enrichi en NaCl : 0 ; 4 ; 8 ;
12 ; 16 et 20 g/l. Dix boîtes sont prévues pour chaque concentration saline. Les
étalements, incubés à l’obscurité et à 24°C, sont observés 24, 48 et 72 heures après
ensemencement. Les pourcentages de germination des conidies sont alors
déterminés.
7. Effet sur les organes de résistance
Cette étude a été faite en parallèle avec celle de la croissance diamétrale. L’effet de
l’apport de NaCl dans le milieu de culture sur les microsclérotes est apprécié d’une
part, par le délai d’apparition des organes de conservation et d’autre part, par
l’estimation de l’étendue de la zone pigmentée visible sur le revers des boîtes de
Pétri, la coloration noire des cultures de Verticillium étant due à la mélanisation
des parois des microsclérotes. Tous les résultats sont comparés par analyse de la
variance selon le test de Newman-Keuls.
B. Résultats
1. Effet de l’apport de NaCl sur la croissance de Verticillium
1.1. Croissance diamétrale
La croissance diamétrale des colonies de Verticillium soumis à différentes
concentrations de sel a été notée tous les cinq jours durant 20 jours. Les résultats
sont reportés sur la figure 6. Dès les cinq premiers jours qui suivent la mise en
culture, l’effet de la salinité s’est manifesté par une stimulation de la croissance
diamétrale du champignon pour les concentrations comprises entre 0 et 10 g/l de
NaCl. Au delà de cet intervalle, la croissance diminue en corrélation avec
l’augmentation de la salinité du milieu.
Après 20 jours de culture, l’intervalle des concentrations stimulatrices de la
croissance s’étend à 20 g/l de NaCl. Au delà de cette concentration et jusqu’à 60
25
g/l , l’effet du sel s’est traduit par une réduction linéaire de la croissance mais qui
reste toutefois supérieure et de manière significative à celle des témoins sans sel.
Seules les très fortes concentrations inhibent la croissance mycélienne de
Verticillium. Cette inhibition est de l’ordre de 51.7% et 78.5% respectivement à 80
et 100 g/l de NaCl par rapport aux témoins sans sel.
L’apport de sel dans le milieu de culture agit également sur la vitesse de la
croissance diamétrale des colonies (figure 7) par rapport aux témoins sans sel
comme le montrent les pentes des différentes courbes de croissance. Durant la
période d’incubation, la vitesse moyenne est de 1.27 mm /jour en absence de sel
alors qu’elle atteint 2.05 mm /jour en présence de 20g/l de NaCl.
1.2. Croissance pondérale
Le poids sec du mycélium est évalué après un mois de culture en milieu liquide
enrichi en NaCl. Les résultats reportés sur la figure 8 montrent que le poids sec du
mycélium n’est pas modifié pour les concentrations de NaCl comprises entre 0 et
10 g/l. A partir de 10 g/l, on remarque une réduction régulière de la croissance
pondérale du mycélium en fonction des salinités croissantes du milieu de culture.
L’inhibition du poids sec est de 23.1% ; 60.9% et 93.9% respectivement à 20; 40 et
60 g/l de NaCl.
2. Effet de la salinité sur la conidiogénèse et le pouvoir germinatif
des conidies
2.1. Intensité de la sporulation
Les résultats de l’estimation de la sporulation de Verticillium en fonction de la
salinité du milieu sont résumés sur la figure 9. Il apparaît clairement que l’effet du
sel se traduit par une stimulation de l’intensité de la conidiogénèse pour les
26
Moyenne des deux diamètres des
colonies (en mm)
Figure 6. Effet de la salinité sur la croissance
diamétrale de l'isolat P80 de Verticillium
après 5 jours
après 15 jours
après 10 jours
après 20 jours
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
20
30
40
50
60
Concentration en sel (en g/l de NaCl)
80
100
Diamètre moyen des colonies (en
mm)
Figure 7. Vitesse de la croissance des colonies de
l'isolat P80 de Verticillium en fonction de la salinité
du milieu
0g/l
10g/l
20g/l
0
5
10
40g/l
60g/l
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
15
Temps d'incubation (en jours)
20
27
Figure 8. Effet de la salinité sur le poids sec
du mycélium de l'isolat P80 de Verticillium
après un mois de culture
Poids sec du mycélium en mg
350
300
250
200
150
100
50
0
0
5
10
20
30
40
50
60
Concentration de NaCl (en g/)l
Figure 9. Effet de la salinité sur l'intensité de la
conidiogénèse de l'isolat P80 de Verticillium
après un mois de culture
180
160
5
Nombre de spores x 10 /cm
2
200
140
120
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
40
Concentration de NaCl (en g/)l
60
28
concentrations de NaCl allant de 0 à 15 g/l. En effet, à la concentration optimale,
(15g/l), on enregistre une augmentation du nombre de conidies produites de 130 %
par rapport au témoin sans sel. Pour les autres concentrations de l’expérience
supérieures à 15 g/l, l’intensité de la sporulation diminue mais reste
statistiquement supérieure à celle du témoin sans sel jusqu’à 40g/l.
2.2. Pouvoir germinatif des conidies
La germination in vitro des conidies de Verticillium a été suivie pendant 72h. Les
résultats montrent que les conidies ont germé à toutes les salinités de l’expérience
(figure 10). A 4 g/l de NaCl, le pourcentage de germination des conidies est
semblable à celui du témoin non traité et atteint 71.8 %. La germination subit une
hausse significative sous les concentrations salines comprises entre 8 et 16g/l de
NaCl (Planche 1). En revanche, l’apport dans le milieu de 20g/l de sel réduit le
pouvoir germinatif des conidies traitées. Le pourcentage de germination, bien que
statistiquement plus faible que celui des conidies témoins sans sel, est encore
appréciable ; il est de 67.6%.
3. Effet de la salinité sur la sclérogénèse
L’estimation de l’abondance des microsclérotes par la mesure du diamètre de la
zone pigmentée où se localisent les microsclérotes n’est certes pas très précise mais
permet de faire des comparaisons entre les effets des différents traitements salins
sur la formation des organes de résistance.
Des résultats présentés dans la figure 11, il ressort que l’apport de faibles quantités
de sel (0 à 5 g/l) n’altère pas l’importance de la formation des microsclérotes. Leur
abondance ne diffère pas de celle des témoins sans sel. Cependant l’augmentation
des concentrations de NaCl dans le milieu de culture a entraîné une diminution
nette de la sclérogénèse. Cette réduction est d’autant plus marquée que la
concentration saline est élevée. L’effet de la présence de concentrations de sel
supérieures à 5 g/l touche aussi bien l’étendue de la zone pigmentée que l’intensité
de la coloration qui devient de plus en plus claire.
29
Pourcentage de germination des conidies
Figure 10. Effet de la salinité sur le pouvoir
germinatif des conidies de l'isolat P80 de
Verticillium après 72 heures
100
90
80
70
60
50
40
0
4
8
12
16
20
Concentration en NaCl (en g/)l
Figure 11. Effet de la salinité sur l'intensité de la
sclérogénèse de l'isolat P80 de Verticillium après
un mois de culture
Diamètre moyen de la zone
sombre (en cm)
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
5
10
15
20
40
Concentration en NaCl (en g/l)
60
30
Planche 1. Effet de la salinité du milieu sur la germination des conidies
de l’isolat P80 de Verticillium albo-atrum après 4 jours d’incubation.
[0 ; 4 ; 8 ; 12 ; 16] : concentration saline du milieu en g/l de NaCl
31
Par ailleurs, les concentrations de sel supérieures à 10 g/l entraînent en plus un
retard dans l’apparition des microsclérotes. Alors que le délai d’apparition des
microsclérotes est de 7 jours chez les témoins non traités et les cultures traitées
avec 5 g/l, l’augmentation de la salinité du milieu allonge ce délai. Ainsi les
microsclérotes apparaissent après 10; 12 et 20 jours d’incubation respectivement
pour les concentrations de 10; 20 et 40 g/l de NaCl.
4. Influence de l’interaction salinité-température sur la croissance
de Verticillium
Des boutures de Verticillium sont ensemencées sur du milieu Malt gélosé
additionné de 0 ; 4 ; 8 ; 12 et 16 g de NaCl par litre. Les boîtes de Pétri sont
réparties en 5 lots de 10 boîtes chacun. Chaque lot est mis à incuber pendant 3
semaines à une température déterminée : 18°C soit la température ambiante ;
24°C ; 30°C et 36°C. L’estimation de la croissance est faite selon le protocole décrit
auparavant. Les résultats de l’interaction salinité-température sont résumés sur le
tableau 3.
L’effet de la salinité se traduit par une stimulation de la croissance diamétrale des
colonies et ceci pour toutes les températures de l’expérience. Néanmoins, la
comparaison des pourcentages de stimulation de la croissance, due à la présence
de sel, montre des différences significatives entre les différents traitements
thermiques. Ainsi, à 18°C, la croissance est stimulée de 49.03 % avec la présence
de 16 g/l de sel par rapport au témoin sans sel. Le pourcentage de stimulation
diminue à 24°C et à 30°C, mais augmente brusquement à 36°C puisqu’il atteint
131.57 % par rapport aux témoins sans sel incubés à la même température.
L’effet de la température sur la croissance de Verticillium dépend de la
température à laquelle est soumis le champignon. Une stimulation de la croissance
est notée pour les températures de 24°C et 30°C par rapport à celle notée à 18°C.
La température optimale dans nos conditions de culture correspond à 30°C.
Cependant, une chute brutale de la croissance des thalles est observée à 36°C, et
ce, pour toutes les concentrations salines de l’expérience. La comparaison des
pourcentages d’inhibition de la croissance due à l’exposition des cultures à 36°C
32
montre des différences significatives entre les différents traitements salins. Ainsi,
en absence de sel, le pourcentage d’inhibition de la croissance due à l’exposition
des cultures à 36°C est de 81.61 % par rapport à la croissance enregistrée à 18°C.
En présence de sel, l’inhibition de la croissance diminue avec l’augmentation de la
salinité du milieu. Elle n’est que de 74.82 % et 71.42 % respectivement à 12 et 16
g/l de NaCl (Planche 2).
Tableau 3. Effet de l’interaction salinité-température sur la croissance
diamétrale de l’isolat P80 de Verticillium.
Diamètre moyen des colonies (cm) après 3 semaines d’incubation
Température d’incubation en °C
Concentration
18
24
30
36
en NaCl (g/l)
Inhibition*(%)
à 36°C
0
31.0±0.9
34.6 ±1.1
36.1±0.6
5.7±0.2
81.6
4
32.8±0.7
35.5±0.8
37.3±0.4
6.5±0.4
80.1
8
34.3±0.8
37.2±0.5
38.6±1.0
11.6±1.0
66.1
12
42.1±0.9
41.2±0.9
41.9±0.4
10.6±0.6
74.8
16
46.2±0.4
43.2±0.7
47.6±1.0
13.2±0.5
71.4
Stimulation **
49.0
24.8
31.8
131.5
-
(%)
* Pourcentage d’inhibition de la croissance diamétrale à 36°C par rapport à celle de 18°C.
** Pourcentage de stimulation de la croissance diamétrale à 16g/l par rapport aux témoins sans sel
C. Discussion et conclusion
En se basant sur les taux de la croissance mycélienne de l’isolat P80 de
Verticillium observés sur milieux enrichis en sel, on peut en conclure que le
chlorure de sodium stimule le développement de ce parasite même à de très fortes
concentrations allant jusqu’à 60g/l.
33
Planche 2. Effet de l’interaction salinité-température sur la croissance
diamètrale de l’isolat P80 de Verticillium après trois semaines
d’incubation.
A. Croissance diamétrale du champignon exposé à 24°C
B. Croissance diamétrale du champignon exposé à 36°C
[0 ; 4 ; 8 ; 12 ; 16] : concentration saline du milieu de culture en g/l de NaCl
34
Bien que sa croissance décline au delà de ces concentrations, le champignon tolère
des salinités extrêmement élevées.
Les concentrations de sel les plus favorables sont situées entre 5 et 20g/l de NaCl.
Sous ces concentrations salines, la vitesse de croissance journalière est plus grande
que celle manifestée en absence de sel. Nos résultats concordent avec ceux de Besri
(1977); Ioannou et al. (1977) et Afailal (1987). Ces auteurs ont montré la capacité
de Verticillium à se développer sous des potentiels osmotiques bas, avec une
stimulation de la croissance à des concentrations salines qui rappellent celles de
nos résultats.
Une autre composante de la biologie de Verticillium est également stimulée par la
présence de sel à savoir la conidiogénèse. Le taux de sporulation est fortement
augmenté sous 15g/l de NaCl. Notre concentration optimale diffère de celle de
Ioannou et al. (1977). Ces auteurs ont montré que l’augmentation de la production
de conidies a lieu pour des potentiels osmotiques compris entre –2 et –20 bars soit
des concentrations allant de 3.5 à 29 g/l de sel respectivement.
La stimulation de la sporulation sous l’effet de la salinité serait due à un effet
spécifique des ions (Benyahya, 1998).
Selon cet auteur, les ions Na+ et Cl-
stimulent la production des sporanges de P. citrophthora et P. parasitica alors que
l’effet osmotique inhibe cette activité biologique.
Chez Verticillium, l’augmentation de la sporulation sous l’effet du sel ne semble
pas être due uniquement à l’effet des ions Na+ et Cl- mais aussi à l’effet osmotique.
Ducan & Himelick, (1986) ont montré que la sporulation de Verticillium dahliae
peut être fortement stimulée par un potentiel de pression négative sans que le
milieu ne soit amendé de sel. Ces auteurs ont cultivé Verticillium sur des milieux
nutritifs placés dans un dispositif permettant le maintien d’un potentiel de
pression négative de –0.039 PMa rappelant l’environnement des vaisseaux du
xylème.
Nos résultats concernant l’effet du sel sur la formation des microsclérotes n’ont pas
montré, dans nos conditions expérimentales, d’effet stimulateur du sel sur la
sclérogénèse. L’aptitude de l’isolat P80 à former les organes de conservation est
maintenue stable par les faibles concentrations de sel (0 à 5 g/l) mais diminue avec
35
l’augmentation de la salinité. Néanmoins, les microsclérotes sont encore produits à
la concentration de 60g/l de NaCl mais tardivement sur des cultures âgées. Ces
résultats ne sont pas en accord avec ceux de Afailal (1987) qui a observé une
stimulation de la sclérogénèse pour une augmentation de la salinité de 0 à 6g/l de
NaCl. Cependant, Ioannou et al. (1977) ont bien rapporté que chez Verticillium, la
production des microsclérotes est moins sensible à la baisse du potentiel
osmotique que la sporulation ou la croissance mycélienne.
L’étude de l’effet de la combinaison salinité-température sur le développement de
l’isolat P80 a permis de dégager les constatations suivantes:
- La salinité stimule la croissance du champignon alors que l’exposition à
36°C la réduit sévèrement.
- La stimulation de la croissance avec la salinité est relativement plus
importante à 36°C que celle observée pour les températures plus basses de
l’expérience.
- L’inhibition de la croissance due à l’exposition à 36°C par rapport à celle
enregistrée à 18°C est plus faible en présence de 16g/l de NaCl qu’en absence de
sel. Alors que l’exposition à 36°C réduit la croissance in vitro de Verticillium sur
milieu dépourvu de sel de 81.61%, la salinité semble réduire l’effet néfaste de cette
température élevée puisque l’inhibition de la croissance n’est que de 71.42% à
16g/l.
Nos résultats laissent supposer une action positive de la salinité sur la capacité du
Verticillium à mieux tolérer les températures élevées. Cette hypothèse est appuyée
par les travaux de Subbarao et al., (1993a). Ces auteurs ont étudié l’effet de
l’interaction température-potentiel osmotique sur la croissance de Fusarium
moniliforme, agent de la pourriture du figuier. Ils ont montré que la croissance de
F. moniliforme est plus importante à 35°C pour les potentiels osmotiques bas que
pour les potentiels osmotiques élevés. Ils ont déduit quant à la capacité de
Fusarium moniliforme à se développer dans un environnement chaud et sec.
Les raisons de cette inversion de la croissance ne sont pas claires mais ce
phénomène a été observé chez d’autres champignons (Subbarao et al., 1993a et b).
36
Les parasites du genre Verticillium se rencontrent fréquemment sous les climats
tempérés. Garber & Presley (1971) ont montré que les températures élevées
réduisent l’effet des isolats de Verticillium du coton. Beye (1982) a attribué la
dominance de Verticillium dans l’écosystème du littoral atlantique marocain, entre
autres, à la douceur des températures.
D’après nos résultats, on peut penser que la combinaison salinité-température
pourrait favoriser la survie et l’adaptation de Verticillium à des conditions de
sécheresse et de chaleur. La croissance du champignon est certes faible à 36°C en
présence des fortes concentrations de sel mais plus importante qu’en absence de ce
dernier. L’étude de l’interaction de ces
deux facteurs abiotiques sur le
développement du Verticillium dans un sol salin, naturellement infesté,
apporterait plus d’informations sur la conservation du champignon en conditions
de chaleur.
La réponse du Verticillium aux potentiels osmotiques bas peut avoir un intérêt
significatif pour la survie en dehors des plantes hôtes (Ioannou et al., 1977). En
effet, les parasites qui vivent dans le sol sont amenés à s’adapter aux conditions de
dessèchement entraînant l’augmentation de la concentration saline de la surface
du sol. Ducan & Himelick, (1986) suggèrent à leur tour que la réponse de
Verticillium à la baisse du potentiel osmotique peut être également avantageuse
pour supporter les potentiels de pression négative qui règnent dans les vaisseaux
du xylème. Sous de telles conditions, la sporulation serait stimulée comme le
démontrent nos résultats et les travaux pré-cités, ce qui favoriserait la prolifération
du parasite et la distribution du pathogène dans toute la hauteur de la plante.
Par ailleurs, nos résultats ont montré une stimulation du pouvoir germinatif des
conidies avec l’augmentation de la salinité de 0 à 15 g/l. Vu la rareté des travaux
sur l’influence de la salinité sur cette activité biologique du Verticillium alboatrum , nous n’avons pas pu faire de comparaisons quant à la concentration
optimale stimulatrice de la germination des conidies. Néanmoins, l’effet du sel sur
la germination des conidies semble dépendre de l’espèce de Verticillium.
Effectivement, la baisse du potentiel osmotique inhibe le pouvoir germinatif des
conidies de Verticillium lecanii (Chandler et al., 1994).
37
Les résultats permettent encore une fois de montrer que la salinité favorise la
reproduction de l’agent pathogène in vitro. Ils laissent supposer une action
positive du sel in vivo dans les tissus des plantes infectées si celles-ci sont
soumises à un stress salin ou hydrique. La richesse de la sève en sel pourrait
stimuler la sporulation du champignon et favoriser la colonisation de la plante.
Pour vérifier cette hypothèse, nous nous proposons d’étudier l’effet de la salinité
sur le développement in vivo de Verticillium albo-atrum et l’interaction des deux
facteurs, abiotique et biotique, sur le comportement des plantes hôtes.
38
Chapitre 2 : Etude des effets de la salinité sur la relation
hôte-parasite dans le cas de la verticilliose
Introduction
La
verticilliose
est
une
maladie
vasculaire
qui
cause
chez
la tomate
rabougrissement et flétrissement. Au Maroc, elle présente une prévalence dans les
sols où l’irrigation se fait avec des eaux salées (Besri, 1990).
La salinité est souvent réputée être responsable de l’attaque sévère des plantes par
les champignons pathogènes du sol. C’est le cas des trachéomycoses dues aux
champignons du genre Fusarium et Verticillium qui sont aggravées par la salinité
des sols et des eaux d’irrigation. Standaert (1978) a montré que la nutrition salée
augmente la sévérité de la fusariose chez la tomate. Green, (1981) dans un article
de synthèse a précisé que les symptômes de la verticilliose sont variables selon les
conditions du milieu, les plantes hôtes et le pouvoir pathogène des Verticillium.
Besri, (1990) et Besri & Afailal, (1993) ont rapporté que la salinité des sols et des
eaux d’arrosage contribue à l’aggravation de la verticilliose de la tomate en
augmentant la sensibilité de la plante à l’attaque par Verticillium dahliae.
Nachmiais et al., (1993) ont étudié l’effet de la salinité et son interaction avec deux
maladies de la pomme de terre ; le flétrissement dû à Verticillium dahliae et le
"blight" précoce causé par Alternaria solani. Ces auteurs ont rapporté une hausse
dans l'expression des symptômes chez les plantes cultivées en milieu semi-aride et
arrosées avec des eaux à différents degrés de salinité. Dans le même sens, Howel et
al., 1994) ont signalé que le comportement de deux variétés de luzerne vis-à-vis de
Verticillium albo-atrum change si les cultivars sont exposés à des irrigations avec
des eaux sodées.
Chez d’autres pathosystèmes, la réaction des plantes hôtes à l’attaque fongique est
également exagérée par le stress salin. Ainsi, une augmentation des symptômes
des pourritures dus à Phytophthora sp. a été observée sur plusieurs espèces
cultivées notamment sur Chrysanthemum (Mac Donald, 1984), sur Citrus (Blaker
& Mac Donald, 1986, El Guilli et al., 2000) et sur tomate (Swiecki & Mac Donald,
1991 ; Snapp & Shennan, 1994). De même, une aggravation des attaques de
39
quelques variétés de Maïs par P. phaseoli a été constatée avec l'augmentation de la
concentration en sel des eaux d'irrigation utilisées (El Mahjoub et al., 1979). Dans
le même sens et selon Duczek (1993), il existe une corrélation positive entre le
degré de salinité et l'apparition du piétin commun du blé et de l'orge de printemps.
Soliman & Kostandi, (1998) ont montré que la sensibilité de certaines variétés de
maïs à Ustilago maydis est conditionnée par le stress salin. Elle serait inversement
en rapport avec la tolérance à la salinité.
Ces données nous ont incité à étudier, dans le cadre de la verticilliose, l’effet de la
salinité sur la relation hôte-parasite. Dans cette voie, nous proposons d’examiner,
en conditions salines de culture, la manifestation d’un isolat de Verticillium alboatrum sur de jeunes plantes de tomate et d’étudier l’effet de la richesse du milieu
nutritif en NaCl sur la variabilité de son pouvoir pathogène sur la tomate mais
aussi envers d’autres plantes hôtes non habituelles.
I.
Effet
de
l’interaction
salinité-Verticillium
sur
la
manifestation de la maladie chez la tomate
A. Matériel et méthodes
1. Plantes hôtes et conditions de culture
Les caractéristiques des variétés de tomate testées, la mise en culture en pépinière
et en pots et les conditions de culture ont été décrites au chapitre I.
2. Inoculation des plantules
2.1. L’agent pathogène : Verticillium albo-atrum, forme à
microsclérotes
L’isolat P80 de V. albo-atrum a été utilisé pour infecter artificiellement la tomate.
Les caractéristiques morphologiques et pathogènes de cet isolat ont été décrites au
chapitre précédent. Le champignon est cultivé en boite de Pétri sur milieu PDA ou
milieu Malt gélosé à 2 %, à l’obscurité et à 24± 1° C.
40
2.2. Préparation de l’inoculum
Une pré-culture est réalisée en étalant une suspension concentrée de spores à
partir de la culture mère de l’isolat P80, sur des boites de Pétri de 9cm contenant
25ml du milieu PDA. Les cultures sont lavées quatre jours plus tard avec de l’eau
distillée stérile. La densité de la suspension de spores recueillie est ajustée à 10
6
par estimation de la densité initiale sur cellule de Malassez puis dilution.
2.3. Protocole d’inoculation
Les plantes de tomate, Marmande Claudia et Marmande VR, âgées de trois
semaines, arrivées au stade premières vraies feuilles, sont délicatement arrachées
de la pépinière. Les racines blessées sont trempées pendant 20 minutes dans
l’inoculum fraîchement préparé. Les plantes sont ensuite transplantées dans des
pots en plastique de 450 cm3, contenant du sable stérile préparé selon le protocole
décrit précédemment, et arrosées au niveau du collet avec 3 ml du même
inoculum. Les lots témoins subissent le même traitement mais l’eau stérile
remplace la suspension de spores.
3. Traitement par le sel
L’application de la solution nutritive d’arrosage enrichie de NaCl a lieu deux
heures après la transplantation des plantes témoins et infectées. Les
concentrations en sel utilisées sont 0 ; 30 ; 60 et 90 millimoles de NaCl par litre
soit 0 ; 1.75 ; 3.50 et 5.25 g/l. Ces concentrations se rapprochant des taux de
salinité des sols du littoral atlantique marocain.
Pour chaque traitement salin, deux lots de 15 plantes chacun sont constitués ; un
lot de plantes saines et un lot de plantes infectées à raison de trois plantules par
pot de culture.
4. Notations des résultats
4.1. Croissance des plantes
La verticilliose se traduit par divers symptômes caractéristiques parmi eux le
déficit de la croissance et les altérations foliaires. Le sel affecte également la
41
croissance de la tomate et provoque aux fortes concentrations de sel un
jaunissement des feuilles. Pour estimer l’action combinée des deux stress sur les
plantes de tomate, nous avons opté pour l’évaluation de la croissance en mesurant
la hauteur de l’épicotyle, et le poids frais des parties aériennes. Il a été difficile
d’estimer l’action du champignon par les altérations foliaires vu que le
jaunissement des feuilles parfois non typiques peut être attribué à l’effet de la
salinité.
4.2. Emission des feuilles
Ce paramètre est souvent utilisé comme indicateur de la sensibilité de la tomate à
la salinité mais aussi comme un critère de sélection pour la résistance à la
verticilliose chez la tomate (Bey & Lafay, 1985). Les feuilles bien développées sont
dénombrées en fin d’expérience.
4.3. Colonisation des plantes par le pathogène
Outre les critères d’évaluation de l’action des deux stress sur le développement des
plantes, nous avons jugé nécessaire d’évaluer l’action de la salinité sur le pouvoir
de colonisation de la plante par l’agent pathogène comme critère propre à
l’infection avec Verticillium.
Le ré-isolement de l’agent pathogène est effectuée en fin d’expérience. Le
champignon est recherché dans les racines, l’hypocotyle et le dernier entrenoeud
de toutes les plantes. Des rondelles de 3mm d’épaisseur de chaque partie sont
stérilisées dans l’alcool pendant deux minutes, rincées plusieurs fois à l’eau
distillée stérile, séchées rapidement sur un papier absorbant avant d’être déposées
à la surface de boites de Pétri contenant de l’eau gélosée à 2%. La lecture des
résultats a lieu après une semaine d’incubation à 24°C. En cas de succès, on peut
voir au bout d’une semaine une colonie se développer à proximité des fragments
du végétal. Les résultats sont exprimés en pourcentage des plantes ayant donné un
ré-isolement positif (PRP) pour chaque niveau de la plante et par traitement salin.
Il est calculé comme suit :
42
PRP = nombre de plantes ayant donné un ré-isolement positif x 100
Nombre total des plantes de chaque série
4.4. Analyse statistique des résultats
Nous avons procédé à une analyse des variances à deux critères de classification.
Cette analyse est suivie par le test de Newman-keuls au seuil de 5% pour la
comparaison des moyennes. Le logiciel utilisé est le SPSS.
B. Résultats
1. Manifestations externes de la combinaison Salinité-Verticillium
sur les plantes de tomate hôtes
1.1. Effet sur la croissance des plantes
- Effet sur la variété Marmande Claudia
Chez les plantes saines cultivées sur substrat arrosé avec la solution saline, la
croissance est ralentie avec l’augmentation de la concentration en NaCl. La
réduction de la croissance touche aussi bien la taille des plantes (figure 12) que le
poids frais des parties aériennes (figure 13). Des différences significatives sont
notées entre les différents traitements salins à l’exception des concentrations de 60
et 90mM pour lesquelles l’effet du sel est statistiquement le même (Planche 3).
En absence de sel, l’infection par l’isolat P80 de Verticillium se manifeste sur les
plantes par une réduction de la croissance par rapport aux plantes saines. Le
déficit de croissance est de l’ordre de 40 % pour la taille de l’épicotyle et de 22.1%
pour le poids frais des parties aériennes.
Les plantes infectées et soumises aux traitements par le sel enregistrent une
réduction sévère de leur croissance par rapport aux témoins sains sans sel. Aux
faibles concentrations de sel (30 mM), le pourcentage d’inhibition de la hauteur
des plantes due à l’effet combiné de la salinité et de l’infection par Verticillium est
de 63.4 %, celui du poids frais est de 45.22 %. Aux fortes concentrations de sel
(90mM), les plantes infectées sont très rabougries et enregistrent des déficits de
43
Figure 12 . Effet de la combinaison salinité-Verticillium sur
la taille de l'épicotyle des plantes de tomate Marmande
Claudia (après six semaines)
Longueur de l'épicotyle (en cm)
20
18
plantes saines
16
plantes infectées
14
12
10
8
6
4
2
0
0
30
60
90
Concentration en sel de la solution d'arrosage (en mM de NaCl)
Figure 13. Effet de la combinaison salinité-Verticillium sur
le poids frais des parties aériennes des tomates Marmande
Claudia (après six semaines)
Poids frais des parties aériennes en g
6
Plantes saines
5
Plantes infectées
4
3
2
1
0
0
30
60
90
Concentration en sel de la solution d'arrosage (en mM de NaCl)
44
Planche 3. Effet de la salinité sur la croissance des plantes de tomate,
variété Marmande Claudia, saines et infectées avec Verticillium après
six semaines de culture
A. Plantes saines témoins (T)
T0 ; T30 ; T60 ; T90 : plantes saines traitées 0 ; 30 ; 60 et 90mM de NaCl
B. Plantes inoculées avec l’isolat P80 de Verticillium (P)
P0 ; P30 ; P60 ; P90 : plantes infectées et traitées avec 0 ; 30 ; 60 et 90mM de
NaCl
45
croissance très importants ; 81.43% et 69.28% respectivement pour le déficit de la
taille et du poids frais des tiges.
- Effet sur la variété Marmande VR
En absence de sel, l’inoculation des plantes Marmande VR avec l’isolat P80 de
Verticillium provoque après six semaines d’observation une réduction de la taille
de l’ordre de 49.5 % (figure 14A) et du poids frais de 38.4 % (figure 14B).
En présence de sel, les plantes infectées ont le même comportement vis-à-vis des
effets combinés de la salinité et de l’infection que Marmande Claudia, à savoir une
régression très importante de la croissance des plantes par rapport à leurs témoins
sains sans sel. Les pourcentages d’inhibition de la croissance des plantes atteignent
aux faibles concentrations de sel 67.12 % pour le paramètre taille des plantes et
55.79 % pour le poids frais des parties aériennes. La réduction de la croissance
s’amplifie aux fortes concentrations de sel (90 mM) pour atteindre 80.98 % et 69.8
% respectivement pour la taille et le poids frais des tiges (Planche 4).
1.2. Effet sur l’émission de feuilles
Les cultures ont été arrêtées après 50 jours. Les feuilles bien développées par
chaque plant sont dénombrées. Les résultats sont consignés sur le tableau 4.
Ils montrent que l’émission des feuilles chez les deux variétés de tomate ne semble
pas être modifiée par le traitement salin qui leur est imposé. Le nombre de feuilles
bien développées chez les témoins sans sel ne diffère pas statistiquement de celui
des plantes traitées, indépendamment de la concentration saline des solutions
d'arrosage. En revanche, l’infection avec Verticillium provoque une légère mais
significative stimulation de l’émission des feuilles chez la variété Marmande
Claudia.
La combinaison salinité-Verticillium modifie les réactions des tomates observées
pour chacun des deux stress pris à part. En effet, l’interaction des deux facteurs se
manifeste chez les deux variétés de tomate par une réduction de l’émission des
feuilles par rapport aux témoins infectés sans sel alors qu’aucun des deux facteurs
ne réprime le développement foliaire à ce stade de la croissance. Cette réduction
est d’autant plus importante que la concentration en sel augmente.
46
Figure 14 A. Effet de la combinaison salinité-Verticillium
sur la taille des plantes de tomate Marmande VR
Longueur de l'épicotyle en cm
25
plantes témoins
20
plantes infectées
15
10
5
0
0
30
60
90
Concentration en sel de la solution d'arrosage en mM de NaCl
Poids frais des parties aériennes en g
Figure 14 B. Effet de la combinaison salinitéVerticillium sur le poids frais des parties aériennes des
tomates Marmande VR
6
plantes saines
5
plantes infectées
4
3
2
1
0
0
30
60
90
Concentration en sel de la solution d'arrosage en mM de NaCl
47
Planche 4. Effet de la salinité sur la croissance des plantes de tomate,
variété Marmande VR, saines et infectées avec Verticillium après six
semaines de culture
A. Plantes saines témoins (T)
T0 ; T30 ; T60 ; T90 : plantes saines traitées 0 ; 30 ; 60 et 90mM de NaCl
B. Plantes inoculées avec l’isolat P80 de Verticillium (P)
P0 ; P30 ; P60 ; P90 : plantes infectées et traitées 0 ; 30 ; 60 et 90mM de NaCl
48
Tableau 4. Effet de la combinaison salinité-Verticillium sur l’émission
de feuilles chez deux variétés de tomate
Nombre de feuilles bien émises
Variété
Marmande Claudia
Marmande VR
Plantes
Plantes
Plantes
Plantes
NaCl en mM
saines
infectées
saines
infectées
0
5.47±0.24 a
6.20±0.32 a
5.80±0.20 a
6.13±0.17 a
30
5.33±0.23 a
5.93±0.33 b
5.67±0.23 a
5.40±0.24 b
60
5.40±0.24 a
5.40±0.24 bc
5.73±0.22 a
5.20±0.27 b
90
5.40±0.24 a
5.27±0.22 c
5.73±0.33 a
4.67±0.23 c
Deux résultats lus sur une même colonne accompagnés de la même lettre ne diffèrent pas
statistiquement au seuil de 5%.
2. Manifestations internes
L’aptitude du champignon à coloniser les plantes de tomate soumises au stress
salin a été évaluée par la recherche du parasite à trois niveaux du végétal ; la
racine, l’hypocotyle et l’apex de la tige. Les résultats des pourcentages de réisolements positifs du pathogène à partir des plantes infectées et différemment
traitées par le sel sont consignés sur le tableau 5.
Chez les deux variétés de tomate, le champignon a été ré-isolé à partir des trois
niveaux des plantes infectées et ceci, pour tous les traitements salins appliqués.
Les pourcentages de ré-isolements positifs augmentent avec l’augmentation de la
concentration saline de la solution d’arrosage pour les trois niveaux du végétal. A
90mM de NaCl, le champignon a été ré-isolé à partir de toutes les plantes et à tous
les niveaux utilisés. Il faut signaler que le taux de colonisation de la base des tiges
est plus élevé que celui des racines. De même les pourcentages de ré-isolements de
Marmande Claudia sont plus élevés que ceux de Marmande VR.
49
Tableau 5. Effet de la salinité sur la colonisation des tomates par
l’isolat P80 de Verticillium estimé par le pourcentage de ré-isolement
positif (PRP) après huit semaines
Pourcentages des ré-isolements positifs (PRP)
Variétés
NaCl
Marmande Claudia
Marmande VR
Racine
Hypocotyle
Apex
Racine
Hypocotyle
Apex
0
52.4
72.2
45.3
45.3
62.2
35.2
30
64.7
81.2
55.1
52.4
78.3
52.0
60
89.8
92.4
82.8
72.3
85.4
75.5
90
100
100
100
100
100
100
(mM)
C. Discussion et conclusion
Pour estimer l’impact de la salinité sur le développement de la verticilliose, les
plantes de tomate infectées ont été soumises à des arrosages successifs avec des
eaux chargées de NaCl.
Les tomates, Marmande Claudia et VR, réagissent à l’infection par l’isolat P80 de
Verticillium, par un déficit de la croissance touchant la taille et le poids frais des
parties aériennes De même, bien que les variétés testées soient moyennement
tolérantes à la salinité, elles réagissent au stress salin par une réduction de la
croissance. La combinaison salinité-infection se manifeste par une aggravation des
symptômes de rabougrissement. Les mesures de la taille et du poids frais des tiges
montrent un effet additif des effets des deux facteurs séparés plutôt qu’un effet
synergique. L’existence donc d’une interaction entre les deux stress n’apparaît pas
pour le critère croissance des plantes. Nos résultats concordent avec les travaux de
Nachmias et al., (1993), sur la verticilliose de la pomme de terre cultivées dans les
zones semi arides à forte salinité. Ces auteurs ont montré que aussi bien la salinité
que l’infection par Verticillium induisent chacune la sénescence précoce de la
pomme de terre. Ils ont en outre observé une augmentation des effets de la
50
verticilliose avec l’augmentation de la salinité des sols sans toutefois qu’il y est
signe d’une interaction substantielle entre les deux facteurs.
L’émission des feuilles est parmi les critères d’évaluation de l’expression de la
verticilliose chez la tomate. Selon les variétés, la réaction à l’infection peut
s’exprimer par une stimulation ou une régression du développement de l’appareil
foliaire (Beye & Lafay, 1985). C’est le cas de la variété Marmande Claudia qui réagit
à l’infection par une légère stimulation de l’émission des feuilles alors que la
variété VR ne montre pas, au même stade du développement, de modifications
dans le déploiement des feuilles.
En outre, la salinité ne semble pas perturber l’émission de feuilles chez les deux
variétés de tomate après 7 semaines de culture.
La combinaison salinité-Verticillium modifie les réactions des tomates observées
pour chacun des deux facteurs pris à part. A cet effet, nos résultats démontrent un
ralentissement dans l’émission des feuilles chez les deux variétés comme effet
direct de l’interaction salinité-Verticillium sur le développement de l’appareil
foliaire. Cette perturbation serait en rapport avec une plus grande sensibilité des
variétés de tomate à la verticilliose en conditions salines. Cette hypothèse peut être
confirmée par nos résultats sur les niveaux de colonisation des tiges par l’agent
pathogène en présence de sel. En effet, la salinité semble augmenter le pouvoir
parasitaire du champignon qui envahit les tissus de la racine et se propage dans la
totalité de la tige puisqu’il a été ré-isolé, avec un grand pourcentage, de l’extrémité
des plantes traitées par les fortes concentrations de sel. Nous avons montré au
chapitre précédent que la salinité du milieu stimule la reproduction du
champignon in vitro. On peut supposer que in vivo, la composition de la sève qui
est le reflet de la composition du sol ou de la solution nutritive, stimulerait la
sporulation du champignon installé dans les racines et par voie de conséquence,
permettrait une colonisation plus aisée des vaisseaux conducteurs de la tige.
La stimulation de la colonisation des plantes par l’agent pathogène en présence de
NaCl a été rapportée par plusieurs travaux notamment ceux de Mac Donald (1984)
sur le couple Phytophthora cryptogea-Chrysanthemum, de Afailal (1987) sur le
couple Verticillium-tomate et ceux de Benyahia (1998) sur le couple P. parasitica-
51
agrumes. Ces auteurs ont tous montré que l’augmentation de la salinité du milieu
favorise une colonisation plus intense des plantes par l’agent pathogène.
La relation entre le taux de colonisation de la plante par le parasite et la sévérité de
la maladie a été établie par plusieurs auteurs ; Standaert (1975) et Smith & Hardy
(1982) sur le pathosystème Fusarium-tomate, Brand et al., (1984) sur le couple
Verticillium-menthe et Garas et al., (1986) sur le couple Verticillium-coton. Selon
ces auteurs, la différence de sensibilité entre les plantes hôtes réside dans
l’importance de la prolifération du champignon à l’intérieur des tiges des plantes
sensibles.
A la lumière de ces données, on peut supposer que la plus grande colonisation des
plantes de tomate soumises au stress salin de nos conditions expérimentales
témoigne de leur plus grande sensibilité à la maladie qui s’est traduite par les
symptômes sévères de rabougrissement.
II. Effet de la salinité sur la variabilité du pouvoir pathogène
de Verticillium albo-atrum
Introduction
Les champignons du genre Verticillium sont connus par leur grande facilité de
variations. Ces variations touchent aussi bien la morphologie des thalles que le
pouvoir pathogène (Boisson & Lahlou, 1980 ; 1982; Lahlou & Boisson, (1981). Ces
auteurs ont réussi à obtenir, après vieillissement d’une culture d’une souche
sauvage de Verticillium albo-atrum, des variants qui ont perdu, au cours de la vie
saprophytique, leur aptitude à la sclérogénèse et/ou leur pouvoir pathogène vis-àvis de la tomate. Ces variations sont spontanées. Lahlou, (1983) disait : « ..toute
population de microconidies issues d’une culture clonale de phénotype sauvage est
composée de lignées de pouvoir pathogène très variable. Lorsque la population est
inoculée en masse à de jeunes plants de tomates, les lignées qui s’expriment
peuvent être celles qui, testées isolément, ont un pouvoir pathogène fort, moyen ou
faible. La variabilité du pouvoir pathogène des lignées et leurs interactions au sein
52
des populations sont à l’origine des variations du pouvoir pathogène observées au
cours du vieillissement des cultures..».
L’expression du pouvoir pathogène de Verticillium est la résultante des
interactions entre l’agent pathogène et la résistance de la plante. Elle se traduit par
l’apparition des symptômes de la plante malade. Les mécanismes qui régissent ces
interactions sont bien connus ; la pathogénécité du champignon est relatée à ses
capacités à produire au contact de l’hôte des enzymes ( Mussel, 1973 ; Meyer et
Dubery, 1993) des toxines (Gour & Dube, 1985 ; Nachmiais et al., 1982) et des
phytohormones (Cronshaw & Pegg, 1976). Les variabilités de ces composantes de
l’agressivité peuvent expliquer les variations du pouvoir pathogène des individus
d’un même clone (Lahlou, 1983 ; Chaib, 1987 et Sebti, 1982).
Si l’origine des variations spontanées de la morphologie et du pouvoir pathogène
du Verticillium n’est pas suffisamment élucidée, il est établi que ces variations
peuvent être déclenchées par différents facteurs de l’environnement du pathogène.
Ainsi, la quantité d’inoculum du Verticillium peut avoir de grandes conséquences
sur l’expression du pouvoir pathogène. La relation entre la densité de l’inoculum et
la gravité de la maladie a fait l’objet de plusieurs études. Les travaux de
Schnathorst & Mathre, (1966) et ceux de Pullman & Devay, (1982) sur le coton, de
Franck et al., (1975) sur la pomme de terre, et de Ashworth et al., (1979), Grocan et
al., (1979) et Visser & Hatting, (1980) sur la tomate, ont montré une corrélation
positive entre le degré d’expression de la maladie et l’augmentation de la densité
de l’inoculum. La plus grande manifestation de la maladie serait liée à une plus
grande attaque des racines par le parasite et/ou une incapacité de la plante à
mettre en œuvre ses mécanismes de défense face aux attaques multiples du
parasite (Chaib, 1987).
Le maintien prolongé d’un isolat de Verticillium au contact d’une plante hôte
différente de la plante qui lui est spécifique peut être la cause de variations du
pouvoir pathogène. Ces variations vont dans le sens d’une perte de l’agressivité visà-vis de l’hôte d’origine et l’acquisition de nouvelles aptitudes pathogéniques à
l’encontre de l’hôte inhabituel. Ces variations sont souvent accompagnées d’un
changement dans les caractères culturaux (El Aissami, 1990). Par conséquent, la
53
notion de spécificité parasitaire chez Verticillium n’est pas figée. Elle est sujette à
évolution.
Ainsi, Fordyce & Green, (1963) sont parvenus, après plusieurs passages sur tomate
d’un isolat de Verticillium albo-atrum, connu pour sa spécificité à la menthe, à
l’adapter à ce nouvel hôte. Dans le même sens, l’adaptation d’un isolat de
Verticillium, d’origine tomate à de nouvelles plantes hôtes, après une série d’
inoculations et de ré-isolements successifs de l’agent pathogène, a été couronnée
de succès sur plusieurs pathosystèmes. Citons à titre d’exemples l’adaptation d’un
isolat de tomate au piment (Douira & Lahlou, 1989) et à la luzerne (El Aissami &
Lahlou, 1999). Selon ces derniers auteurs, la variation de la pathogénécité de cet
isolat vis-à-vis de l’hôte d’origine d’une part et l’hôte inhabituel d’autre part, serait
la conséquence d’un ensemble de modifications touchant les différents modes
d’action du parasite à la suite de la pression exercée par l’hôte inhabituel, la
luzerne, plante hautement sélective.
En se basant sur ces informations bibliographiques, nous nous sommes demandés
si la salinité du milieu nutritif pouvait avoir une influence sur la variabilité de
l’expression du pouvoir pathogène de Verticillium d’autant plus qu’une
augmentation de la gravité de la maladie a été constatée en présence de sel et que
la salinité favorise le développement et la reproduction du champignon in vitro.
Dans cette voie, nous avons successivement évalué l’impact de la salinité des eaux
d’arrosage sur:
-
le potentiel infectieux de l’inoculum de l’isolat P80 sur la tomate,
-
le comportement de la tomate (Marmande Claudia) vis-à-vis d’une
souche non pathogène de Verticillium
-
la spécificité parasitaire de l’isolat P80 d’origine tomate .
A. Impact de la salinité sur le niveau infectieux de l’inoculum
du Verticillium sur les plantes de tomate
1. Matériel et méthodes
1.1. Inoculation
54
Nous avons utilisé des suspensions de spores du champignon (voir chapitre II) de
concentrations croissantes ; 104 ; 105 ; 106 spores /ml. Les plantes de tomate,
Marmande Claudia et Marmande VR, âgées de trois semaines ont été inoculées par
trempage de leurs racines pendant 20 minutes dans une des suspensions de spores
préparées. Les témoins subissent un trempage dans de l’eau distillée stérile. Après
transplantation dans les pots, les plantes sont arrosées au niveau de leur collet
avec 3ml de leur inoculum respectif.
1.2. Traitement par le sel et conditions de culture
Les plantes témoins et infectées par les différents inoculums sont régulièrement
arrosées avec des solutions nutritives salines de différentes concentrations ; 0 ;
20 ; 40 ; 60 et 80mM de NaCl. Elles sont maintenues dans une chambre de culture
sous une photopériode de 16 heures à 24 ± 2°C. Pour chaque traitement salin,
quatre lots de 15 plantes sont constitués correspondant chacun à une densité de
l’inoculum.
1.3. Estimation des résultats
Après six semaines de culture, la taille de l’axe aérien des plantes différemment
traitées par le sel et par les différents inoculums a été mesurée. Les résultats sont
comparés selon le test de Newman-Keuls.
2. Résultats : effet de la salinité sur le pouvoir infectieux de
l’inoculum de Verticillium vis-à-vis de la tomate
2.1. Effet sur la tomate Marmande Claudia
Des résultats consignés sur la figure 15 se dégagent les points suivants :
-
en absence de sel, l’inoculation des plantes avec les inoculums à
différentes concentrations de spores induit une réduction de la
croissance de l’axe aérien par rapport aux témoins non inoculés.
L’inoculum à 104 spores/ml provoque un déficit de la croissance
semblable à celui induit par l’inoculum à 105 spores/ml mais diffère
statistiquement de l’effet provoqué par l’inoculation avec 106 spores/ml.
55
Figure 15. Influence de la salinité sur le niveau infectieux du
taux d'inoculum de l'isolat P80 de Verticillium vis-à-vis de
la tomate Marmande Claudia estimé par la taille des plantes
inoculées après six semaines de culture
30
plantes saines
Longueur de l'épicotyle en cm
25
4
inoculum à 10 spores/ml
5
inoculum à 10 spores/ml
20
6
inoculum à 10 spores/ml
15
10
5
0
0
20
40
60
80
Concentrations salines de la solution d'arrosage en mM de NaCl.
56
- En présence de sel, le comportement des plantes infectées avec les
différents inoculums dépend de la concentration saline imposée. Ainsi, pour
les concentrations comprises entre 20-60mM de NaCl, les plantes saines et
infectées montrent certes une taille plus faible que celles des témoins sans
sel, mais toujours avec des différences significatives entre l’effet de
l’inoculum à 104 et celui à 106 spores/ml. Néanmoins, à 80mM, la taille des
plantes, ayant reçu l’action de l’inoculum à 104 spores/ml au niveau de leurs
racines, est aussi affectée que celle des plantes inoculées avec 105 ou 106
spores/ml.
2.2. Effet sur la tomate Marmande VR
Les effets de l’inoculation avec différentes concentrations de spores diffèrent selon
que les plantes sont soumises ou non au stress salin. Les résultats de la figure 16
montrent qu’en absence de sel, les effets des inoculums à 105 et 106 spores/ml sur
la croissance des plantes sont de même importance et sont plus marqués que celui
enregistré avec l’inoculum à 104 spores/ml. Ce résultat rejoint les observations
faites sur la tomate Marmande Claudia. Cependant, dès que les plantes sont
soumises au régime salin de l’expérience, elles répondent à l’infection avec les
différents inoculums avec la même intensité quelque soit la concentration saline
des solutions d’arrosage. Ainsi, pour une même salinité, les mesures de la taille des
plantes infectées avec 104 , 105 ou106 spores/ml sont statistiquement semblables.
3. Discussion et conclusion
Le test de l’effet de la salinité sur le pouvoir infectieux de l’isolat P80 de
Verticillium a montré que dans les conditions salines de culture, un inoculum de
faible densité (104 spores/ml) est capable d’infecter les plantes de tomate et
d’induire des symptômes de rabougrissement aussi sévères que ceux provoqués
par un inoculum plus riches en spores (106 spores/ml), alors que sous un régime
nutritif normal sans apport de sel, ce même inoculum n’induit qu’un léger déficit
de la croissance.
57
Figure 16. Influence de la salinité sur le niveau infectieux de
l'inoculum de Verticillium vis-à-vis de la tomate
Marmande VR après six semaines de culture
35
Longueur de l'épicotyle en cm
plantes saines
30
4
inoculum à 10 spores/ml
inoculum à 10 5 spores/ml
25
6
inoculum à 10 spores/ml
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
Concentrations salines de la solution d'arrosage en mM de NaCl.
58
L’augmentation du potentiel infectieux de l’inoculum à 104 spores/ml en présence
de sel serait due à une action directe du NaCl sur les spores de l’inoculum et/ou sur
la sensibilité de la plante à l’agent pathogène.
Louvet et Alabouvette, (1988) ont proposé un modèle schématisant les interactions
entre les facteurs déterminant une maladie tellurique. D’après ce modèle, le
potentiel infectieux du sol dépendrait de la densité de l’inoculum et des effets de
l’environnement sur cet inoculum (température, humidité, salinité, pH…).
Dans nos conditions expérimentales, l’inoculation des racines est suivie par le
traitement du substrat par des solutions riches en NaCl. En se basant sur nos
résultats du premier chapitre concernant l’effet stimulateur de la salinité du milieu
sur la germination des conidies de Verticillium in vitro, on peut supposer une
action bénéfique du chlorure de sodium sur le pouvoir germinatif des conidies de
l’inoculum au contact de la plante hôte et par voie de conséquence, une
augmentation des points d’infection. Plus ces derniers sont nombreux, plus la
plante sera attaquée et plus le degré de la maladie sera important. Cette hypothèse
est corrobée par la plus grande sensibilité des plantes à un faible niveau
d’inoculum observée en conditions de stress salin.
Bien que dans les conditions normales de culture, la faible densité de l’inoculum de
Verticillium
n’entraîne
pas
d’apparition
importante
de
la
maladie,
les
modifications des concentrations salines du milieu nutritif peuvent contribuer à la
prédisposition des racines à l’infection par le pathogène. Cette suggestion a été
également avancée par Grote & Claussen, (2001). Ces auteurs ont, en effet, montré
une augmentation rapide de la quantité de Phytophthora nicotianae dans les
racines des tomates à la suite du traitement des plantes avec un faible taux
d’inoculum du pathogène et une forte concentration du milieu nutritif ou
l’exposition des plantes à une forte intensité lumineuse.
Il faut toutefois rappeler que l’infection des plantes avec les différents inoculums
dans nos conditions expérimentales a été réalisée artificiellement avec une
suspension de spores. Dans la nature, l’inoculum de Verticillium est
principalement constitué par les organes de conservation, les microsclérotes,
situés au niveau du sol. Ces propagules germent en réponse aux stimuli que sont
59
les exs udats racinaires de la plante hôte. Il faut être prudent avant de généraliser
quanà à l’effet de la salinité sur le pouvoir infectieux d’un sol car il n’ y a pas eu
d’expérience conduite dans ce sens. L’étude de l’influence du sel sur le pouvoir
infectieux de l’inoculum d’un sol naturellement infesté par Verticillium pourrait
lever ce doute.
B. Influence de la salinité sur l’expression du pouvoir
pathogène de deux isolats de Verticillium sur la tomate
1. Matériel et méthodes
1.1. Test de pathogénécité
1.1.1. L’isolat pathogène
L’isolat P80 a été choisi dans ce test pour son fort pouvoir pathogène vis-à-vis de la
tomate Marmande Claudia. Les caractéristiques de cet isolat ont été décrites au
premier chapitre.
1.1.2. L’isolat non pathogène
L’isolat P3A est un clone d’un isolat initial obtenu par Lahlou, (1983). Ce clone est
issu d’une culture mère conservée à 4°C pendant 9 mois. Inoculé à des plantes de
tomate var Marmande Claudia, l’isolat P3A s’est montré peu pathogène. Sa
morphologie n’a pas été modifiée par le vieillissement et rappelle celle de l’isolat
initial, à savoir un mycélium blanchâtre et dense et une sclérogénèse importante
apparaissant au bout de 6 à 7 jours de culture.
Les cultures fongiques sont conduites sur milieu PDA à l’obscurité et à 24 ± 1°C.
Une suspension de spores ajustée à 106 spores/ml est préparée à partir de chacun
des deux isolats et sert alors d’inoculum. Après l’inoculation, les plantes sont
arrosées régulièrement avec une solution nutritive complète enrichie en NaCl aux
concentrations de 0 ; 20 ; 40 ; 60 et 80mM.
60
1.2. Lecture des résultats
L’incidence de la maladie est estimée par la taille de l’épicotyle et le poids frais des
parties aériennes six semaines après inoculation. Les tests sont réalisés sur des lots
de 15 plantes par isolat et par traitement salin. Les résultats sont comparés par
analyse de variance suivie du test de Newman-Keuls.
2. Résultats
Après six semaines d’observation, les plantes saines soumises au traitement par le
sel montrent une réduction régulière de la croissance sous l’effet des
concentrations croissantes de NaCl de la solution d’arrosage allant de 0 à 80 Mm ;
concentrations fréquentes dans les sols du littoral atlantique marocain. L’effet de
la salinité se manifeste sur les deux paramètres de la croissance ; la taille des
épicotyles (figure 17 A) et le poids frais des parties aériennes (figure 17 B). A 80
mM de NaCl, la réduction de la taille par rapport aux témoins cultivés sans sel est
de l’ordre de 48 % , celle du poids frais est de 54 %.
Les plantes inoculées avec l’isolat pathogène P80 montrent des symptômes sévères
de rabougrissement. La taille et le poids frais des tiges sont significativement plus
faibles que ceux des témoins sains respectifs, à toutes les concentrations salines de
l’expérience.
Les plantes infectées avec l’isolat non pathogène montrent le même comportement
vis-à-vis de la salinité que les témoins sains et ce, pour les faibles concentrations
de NaCl. A partir de 60 mM, les deux paramètres de la croissance chutent
brusquement pour rejoindre ceux des plantes infectées avec l’isolat agressif . A 80
mM de NaCl, l’isolat non pathogène P3A provoque sur les tomates traitées les
mêmes dégâts que ceux causés par l’isolat pathogène P80.
3. Discussion et conclusion
L’effet de la salinité s’est manifesté sur l’expression du pouvoir pathogène des deux
isolats de Verticillium, pathogène et non pathogène vis-à-vis des tomates
Marmande Claudia. Ainsi, les plantes infectées et soumises au stress salin
montrent :
61
Figure 17A. Effet de la salinité de la solution d'arrosage sur
le pouvoir pathogène de deux isolats de Verticillium vis-àvis des tomates Claudia estimé par la taille des épicotyles
après six semaines.
Taille de l'épicotyle en cm
25
plantes saines
Plantes infectées par l'isolat P80
Plantes infectées par l'isolat P3A
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
Concentration de la solution d'arrosage en NaCl (mM)
Figure 17B. Effet de la salinité de la solution d'arrosage sur
le pouvoir pathogène de deux isolats de Verticillium vis-àvis des tomates Claudia estimé par le poids frais des parties
aériennes
Poids frais des parties
aériennes en g
7
plantes saines
6
Plantes infectées par l'isolat P80
5
Plantes infectées par l'isolat P3A
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
Concentration de la solution d'arrosage en NaCl (mM)
62
- une aggravation des symptômes de rabougrissement due probablement à l’effet
additif de la salinité et de l’infection par l’isolat agressif P80 sur la croissance des
plantes.
- l’acquisition de nouvelles aptitudes pathogènes pour l’isolat P3A connu
pour son faible pouvoir pathogène. Ainsi, les tomates Marmande Claudia peu
sensibles à cet isolat se trouvent attaquées par ce dernier sous l’effet de l’arrosage
par des solutions enrichies en NaCl alors qu’elles maintiennent leur caractère de
résistance en absence de sel.
Cette cassure de la résistance vis-à-vis de cet isolat pourrait être due, entre autres,
à une action directe du sel sur les plantes en les prédisposant à l’agression
parasitaire. Davet et al., (1966) ont déjà émis l’hypothèse que l’augmentation des
ions Na+ dans le milieu nutritif prédispose les tomates à la fusariose vasculaire par
suite d’une insuffisance en ions Ca++ provenant d’un antagonisme entre le sodium
et le calcium. En effet, dans les terrains irrigués par des eaux chargées en sel, les
ions Na+ ou Mg++ peuvent remplacer les ions Ca++ dans les chaînes pectiques des
parois cellulaires. Standaert, (1978) rapporte que l’augmentation du rapport
Na/Ca du milieu nutritif induit une moindre saturation en calcium de tous les
composés constitutifs des parois cellulaires des racines des tomates. Or, le calcium
joue un rôle important dans la physiologie de la plante. Il intervient dans la
préservation de la structure membranaire et règle le transport des ions et l’activité
enzymatique au niveau des membranes. En outre, il joue un rôle primordial dans
la résistance des plantes aux agressions parasitaires (William, 1993).
La carence en calcium induite par la salinité réduit la résistance des parois
cellulaires qui deviennent alors facilement dégradables par les enzymes fongiques.
Il est donc possible que l’arrosage des tomates par des eaux riches en chlorure de
sodium provoque une fragilité des parois cellulaires des racines , ce qui favoriserait
une colonisation aisée des tissus racinaires, et inhibe les mécanismes de défense de
la plante responsables du freinage de l’avancé du mycélium dans les tissus de la
plante. Cette dernière hypothèse peut être appuyée par les travaux de Sulistyowati
& Keane (1992) qui ont montré que la salinité cause une diminution de la synthèse
63
des phytoalexines dans les rhizomes du Citrus et augmente donc la sensibilité de la
plante à l’attaque par le champignon.
C. Influence de la salinité sur la variabilité de la spécificité
parasitaire d’un isolat de Verticillium d’origine tomate
1. Matériel et méthodes
1.1. Choix des plantes hôtes inhabituelles
- La luzerne
La luzerne (Medicago sativa L.), est la plus importante légumineuse cultivée sous
irrigation dans les régions arides et semi-arides dans le monde. Au Maroc, elle
constitue la plante fourragère la plus cultivée. Elle occupe environ 85 000 hectares
représentant environ 22% de la superficie totale consacrée aux plantes fourragères.
Son intérêt réside dans sa grande productivité (fauche, foin, pâturage,
déshydratation et ensillage). Les semences utilisées au Maroc appartiennent à la
variété Moapa choisie pour son faible repos hivernal et sa bonne adaptation aux
conditions édaphoclimatiques marocaines (Birouk et al, 1997).
- L’aubergine
L’aubergine (Solanum melongena L) est une plante très sensible au Verticillium.
Elle est souvent utilisée comme plante « piège » pour estimer le potentiel
infectieux d’un sol naturellement infecté par Verticillium.
La variété Reina negra a été retenue pour nos essais.
Les semences des deux plantes nous ont été gracieusement fournies par le service
de la certification des semences de l’INRA.
1.2. Inoculation et traitement par le sel
Après 15 jours de culture en pépinière pour la luzerne et 21 jours pour l’aubergine,
les jeunes plants sont inoculés par trempage de leurs racines dans une suspension
de spores à 106 préparée à partir d’une culture de l’isolat P80 d’origine tomate.
Après transplantation en pots, les plants sont arrosés avec des solutions salines de
64
différentes concentrations et sont placés dans les mêmes conditions culture
décrites auparavant.
1.3. Lecture des résultats
Après un mois de culture, la maladie est estimée par la taille de l’axe aérien des
plantes et par l’importance des dégâts foliaires. Un indice d’altération foliaire est
calculé en fin d’expérience. Il exprime l’intensité des altérations foliaires. Une note
est attribuée à chaque feuille :
-
0 : feuille saine
-
1 : flétrissement ou jaunissement des feuilles cotylédonnaires
-
2 : chute des feuilles cotylédonnaires
-
3 : chlorose des autres feuilles
-
4 : nécrose
-
5 : chute
La somme des notes rapportée au nombre de feuilles bien formées pour chaque
plante constitue l’indice d’altération foliaire (IAF).
Les tests sont réalisés sur des lots de 15 plantes pour chaque traitement. La
comparaison des moyennes est faite par l’analyse des variances selon le test de
Newman-Keuls.
2. Effet de la salinité sur la variation du pouvoir pathogène de
l’isolat P80 au contact de nouvelles plantes hôtes.
2.1. Effet sur l’expression du pouvoir pathogène au contact
de la luzerne
2.1.1. Effet sur la croissance des plantes
Des résultats consignés sur la figure 18, se dégagent les observations suivantes :
- Après un mois de culture, la taille de l’épicotyle des plantes de luzerne
saines est significativement réduite quand celles-ci sont irriguées avec des
solutions salines à 40 et 80mM de NaCl par rapport aux témoins cultivés sans sel.
65
La réduction de la croissance est de 45.63 % et 62.61 % respectivement à 40 et
80mM.
- En absence de sel, l’inoculation des plantes avec l’isolat P80 d’origine
tomate n’a pas induit de symptômes chez cet hôte inhabituel. En effet la croissance
des plantes infectées est similaire à celles des témoins non inoculés.
- Chez les plantes soumises au traitement salin, l’inoculation a induit un
déficit de la croissance par rapport aux témoins sains soumis au même stress salin.
En effet, des différences significatives existent entre les hauteurs des plantes saines
et infectées, soumises toutes les deux au même degré de salinité (Planche 5).
2.1.2. Manifestations foliaires
L’observation des plantes de luzerne soumises au stress salin montre que le
sel affecte également le développement de l’appareil foliaire. Ainsi, les plantes du
traitement avec 80mM de NaCl sont rabougries avec de petites feuilles de couleur
vert foncé mais sans jaunissement.
En absence de sel, l’infection avec l’isolat d’origine tomate ne perturbe pas
la fonction chlorophyllienne des feuilles des plantes inoculées. En revanche, la
combinaison du stress salin et de l’infection avec un isolat non spécifique induit
des altérations foliaires caractéristiques de la verticilliose de la luzerne :
jaunissement des nervures et coloration rose des folioles de la base qui finissent
par se dessécher. Les résultats de l’étendue de ces symptômes foliaires sont
reportés sur la figure 19. Ils montrent que les indices d’altération foliaire
augmentent avec l’augmentation de la concentration saline de la solution
d’arrosage (Planche 6).
2.2. Effet sur l’expression du pouvoir pathogène au contact
de l’aubergine
2.2.1. Effet sur la taille des plantes
Les plantes d’aubergine répondent aux différents traitements par le sel par une
réduction de la hauteur de l’axe aérien d’autant plus importante que la
concentration en sel est élevée (figure 20). Le déficit de la croissance est
66
Figure 18. Effet de la salinité sur l'expression du pouvoir
pathogène de l'isolat P80 de Verticillium d'origine tomate
au contact de la luzerne estimé par la taille de l'épicotyle
après six semaines
Longueur de l'épicotyle en mm
80
70
plantes saines
60
plantes inoculées
50
40
30
20
10
0
0
40
80
Concentrations salines de la solution d'arrosage en mM de NaCl
Figure 19. Effet de la salinité sur l'expression du pouvoir
pathogène de l'isolat P80 de Verticillium d'origine tomate
au contact de la luzerne exprimé par l'indice d'altération
foliaire
Indice d'altération foliaire
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
40
80
Concentrations salines de la solution d'arrosage en mM de NaCl
67
Planche 5. Effet de la salinité sur la manifestation de l’isolat P80 de
Verticillium, d’origine tomate, sur la luzerne estimé par la taille des
plantes après un mois de culture.
T0 ; T80 : plantes saines traitées respectivement avec 0 et 80mM de NaCl
P0 ; P80 : plantes infectées et traitées respectivement avec 0 et 80mM de NaCl
Planche 6. Effet de la salinité sur la manifestation de l’isolat P80 de
Verticillium, d’origine tomate, sur la luzerne estimé par les symptômes
foliaires après un mois de culture.
Absence de symptômes foliaires sur les plantes inoculées en absence de sel (P0)
chloroses et nécroses sur les feuilles des plantes inoculées et traitées avec 80mM
de NaCl (P80) en comparaison avec les plantes saines du même traitement salin
(T80)
68
accompagné d’une réduction de la surface des feuilles mais sans aucun signe de
chlorose. En outre, en absence de sel, l’inoculation des jeunes plantes avec un
isolat d’origine tomate a induit des symptômes de rabougrissement typiques de
verticilliose.
Les plantes soumises à la combinaison salinité et infection avec l’isolat de
Verticillium d’origine tomate ont montré des réductions sévères de la taille de
leurs axes aériens par rapport aux témoins malades cultivés en absence de sel mais
aussi par rapport aux témoins sains exposés à la même salinité.
2.2.2. Effet sur le système foliaire
L’effet de la salinité seule ne semble pas perturber la fonction chlorophyllienne des
feuilles des plantes traitées. Cependant, l’infection avec l’isolat P80 se traduit par
des altérations foliaires typiques des maladies de flétrissement (figure 21).
Les plantes infectées et soumises aux différents traitements par le sel montrent des
chloroses et nécroses dont l’importance augmente avec la concentration saline des
solutions d’arrosage. Les feuilles des plantes infectées et traitées avec 90mM de
NaCl sont pratiquement toutes atteintes (Planche 7).
3. Discussion et conclusion
Les résultats de ces essais montrent que la salinité du milieu nutritif peut modifier
l’expression du pouvoir pathogène de l’isolat P80 de Verticillium d’origine tomate
vis-à-vis de nouvelles plantes hôtes qui ne lui sont pas spécifiques.
Dans les conditions normales de culture, l’isolat P80 inoculé à la luzerne (Moapa)
s’est montré non pathogène sur cet hôte inhabituel. Ce résultat correspond aux
observations d’El Aissami, (1999). Cet auteur a précisé en plus que l’isolat d’origine
tomate a pu être isolé des racines de la luzerne, après la première inoculation, sans
qu’aucune manifestation pathologique ne soit déclarée. Cependant, des passages
successifs de cet isolat chez la luzerne ont conduit à l’émergence de lignées
d’aptitudes parasitaires et pathogènes nouvelles affichant une diminution du
pouvoir pathogène vis-à-vis de l’hôte d’origine et un gain d’agressivité à l’encontre
de l’hôte inhabituel.
69
Figure 20. Effet de la salinité sur l'expression du pouvoir
pathogène de l'isolat P80 de Verticillium d'origine tomate
au contact de l'aubergine estimé par la taille de l'épicotyle
Taille de l'épicotyle en mm
90
80
plantes saines
70
plantes infectées
60
50
40
30
20
10
0
0
30
60
90
Concentrations salines de la solution d'arrosage en mM de NaCl
Figure 21. Effet de la salinité sur l'expression du pouvoir
pathogène de l'isolat P80 de Verticillium d'origine tomate
au contact de l'aubergine exprimé par l'indice d'altération
foliaire
5
Indice d'altération foliaire
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
30
60
90
Concentrations salines de la solution d'arrosage en mM de NaCl
70
Planche 7. Effet de la salinité sur la manifestation de l’isolat P80 de
Verticillium, d’origine tomate, sur les plantes d’aubergine après un
mois de culture.
A. Plantes saines (T)
T0 ; T30 ; T60 ; T90 : plantes saines traitées avec 0 ; 30 ; 60 et 90mM de NaCl
B. Plantes inoculées (P)
P0 ; P30 ; P60 ; P90 : plantes infectées et traitées avec 0 ; 30 ; 60 et 90mM de
NaCl
71
Il apparaît donc que la spécificité parasitaire chez ce champignon est variable.
Cette variabilité serait due à une pression de sélection exercée par l’hôte inhabituel
qui favorise les formes de Verticillium les plus aptes à surmonter les obstacles que
lui oppose la luzerne (El Aissami & Lahlou, 1999).
En conditions de stress salin, les plantes de luzerne inoculées avec l’isolat d’origine
tomate ont manifesté dès le premier contact avec le parasite des symptômes
typiques de verticilliose, alors que sous un régime nutritif normal, des contacts
plus prolongés, 9 passages successifs selon El Aissami, (1999), s’avèrent
nécessaires pour induire des symptômes de même intensité que ceux obtenus à la
suite de l’infection par une souche de Verticillium spécialisée à la luzerne.
La salinité du milieu semble ainsi modifier l’expression du pouvoir pathogène de
l’isolat d’origine tomate vis-à-vis des plantes hôtes inhabituelles. Cette variation va
dans le sens d’un gain d’agressivité envers la plante hôte non spécifique dès le
premier contact, comme c’est le cas pour la luzerne et d’une augmentation du
pouvoir pathogène vis-à-vis d’une plante peu spécifique comme l’aubergine.
Face à ses données, rien ne nous empêche de penser que la salinité agit au niveau
des interactions pathogène-hôte inhabituel et qui s’opposent normalement à la
manifestation de la maladie.
Bien que la luzerne Moapa soit modérément sensible à la salinité, le sel semble
avoir :
-
une action sur la plante hôte en affaiblissant les moyens de défense
élaborés contre l’attaque par un isolat qui ne lui est pas spécifique,
-
une action sur le pathogène en stimulant sa reproduction et sa
progression à l’intérieur de la plante puisque nous l’avons ré-isolé de
l’apex des tiges alors qu’il ne dépasse guère les racines chez les plantes
inoculées et soumises à un régime nutritif normal.
Ce résultat se rapproche des travaux de Howell et al., (1994) qui ont montré que
l’addition de la salinité à l’inoculation de la luzerne par Verticillium albo-atrum
augmente la progression du parasite dans la plante et entraîne une diminution de
la production végétale.
72
En faisant allusion à nos précédents résultats relatifs à la stimulation de la
multiplication du champignon et la germination des conidies par la salinité, on
peut supposer que la progression du parasite dans la totalité de la plante s’opérera
rapidement avant que ne soient mises en route les différentes étapes de défense de
la plante hôte inhabituelle. Cette situation serait en faveur de l’agent pathogène.
La résistance de la luzerne à un premier contact avec l’isolat de Verticillium
d’origine tomate semble être brisée par les conditions salines de culture. Quelque
soit l’origine de cette cassure, la présence de génotypes de Verticillium, dans les
terrains où la maladie de certains cultivars n’est pas connue, doit être prise en
considération si le sol est irrigué avec des eaux salées.
Les sols salés du littoral atlantique marocain sont utilisés pour la culture de la
tomate. Certaines parcelles sont naturellement infestées par des souches de
Verticillium qui sont à l’origine de la verticilliose de la tomate. La verticilliose de la
luzerne n’a jamais été rapportée au Maroc. Ainsi, la culture de cette plante
hautement sélective dans ces sols salés peut entraîner assez rapidement la
sélection de souches de Verticillium de plus en plus pathogènes vis-à-vis de ce
nouvel hôte, d’où l’intérêt qu’il faut accorder aux tests de la résistance de la luzerne
aux champignons du genre Verticillium en incluant la présence de sel.
L’analyse des différents résultats présentés montre que l’interaction salinitéVerticillium s’est traduite par une plus grande sensibilité des plantes à l’agent
pathogène couplée d’une variation dans l’expression du pouvoir pathogène du
parasite. Ce phénomène est rendu apparent par l’apparition et/ou l’aggravation
des symptômes de rabougrissement caractéristiques de la verticilliose.
La réduction de la croissance serait due à des changements dans le potentiel
hydrique de la plante induits par la présence du champignon dans les vaisseaux du
xylème et à un déséquilibre ionique suite à une nutrition riche en sel.
Les causes du changement de la sensibilité des plantes à l’égard du champignon
sont donc à rechercher dans les interactions physiologiques milieu-hôte-parasite.
L’étude des modifications physiologiques et métaboliques liées à la salinité et à
l’infection verticillienne est une tentative d’éclaircissement du phénomène observé.
73
Chapitre 3 : Conséquences physiologiques et biochimiques
de l’interaction salinité-Verticillium chez la tomate
Introduction
Nos résultats précédemment présentés montrent que la salinité affecte la
physiologie de la tomate en réprimant sa croissance et en augmentant sa sensibilité
à la verticilliose. Elle intervient dans la relation hôte-pathogène favorisant une plus
grande expression du pouvoir pathogène du parasite.
Si la réaction des plantes à l’infection est connue pour être modifiée par les
facteurs de l’environnement (Ayres, 1984), le potentiel d’une interaction entre la
salinité et la maladie est une possibilité qui doit être prise en compte.
Face à cette situation, plusieurs questions affluent :
Si la salinité est incriminée dans l’augmentation de la sensibilité de la plante au
Verticillium, agit-elle sur le métabolisme impliqué dans les mécanismes de défense
des plantes ou bien sur les armes pathogéniques du pathogène qu’elle stimulerait ?
Et si c’est une action simultanée sur les deux à la fois, la réponse de la plante estelle la somme des deux effets individuels ou la résultante d’une interaction entre le
facteur sel et la relation hôte-parasite ? Quelles seraient alors les composantes de
cette interaction et qui doivent se traduire à la fin par l’apparition de la maladie ?
Pour répondre à toutes ces questions, nous avons été incité à chercher les réponses
au niveau de la physiologie nouvelle de la plante doublement stressée.
C’est ainsi que nous avons analysé les modifications physiologiques et
biochimiques induites par la salinité du milieu nutritif et touchant les teneurs en
éléments minéraux, les taux des solutés cytoplasmiques osmorégulateurs ; la
proline et les sucres solubles et l’activité de certaines enzymes de la plante telles la
nitrate réductase et la peroxydase. L’évolution de ces caractéristiques métaboliques
de la salinité chez les plantes infectées apporterait des renseignements sur les
finalités de l’interaction salinité-Verticillium et qui conduiraient à la gravité de la
maladie en conditions de stress salin.
74
A. Effets sur les teneurs en cations majeurs
1. Introduction
Verticillium albo-atrum est un champignon qui se développe dans les vaisseaux du
xylème de la plante hôte engendrant l’obstruction des vaisseaux et par conséquent
le flétrissement partiel ou total conduisant parfois à la mort de la plante infectée.
Le flétrissement serait dû à une perturbation du transport de l’eau et des sels
minéraux à la suite de la présence du champignon dans les vaisseaux conducteurs.
L’action physiologique du Verticillium sur les plantes infectées se traduit ainsi par
des déficiences ou des excès de certains éléments minéraux (Huber, 1978 ; 1980).
Guerrier et al., (1985) et Regragui et al., (1989) ont montré que l’infection des
tomates avec des isolats de V. albo-atrum provoque des altérations de l’absorption
et de l’accumulation des ions Na+ et K+ dans les racines et les parties aériennes ;
augmentation des teneurs en sodium et diminution des teneurs en potassium.
Cette perturbation de la nutrition minérale n’est pas due uniquement aux barrières
physiques liées à la présence du champignon dans les vaisseaux du xylème mais
également, à la libération d’enzymes et de toxines par le champignon à l’intérieur
des tissus infectés. En effet Gour & Dube, (1985) ont montré que les toxines de
Verticillium
dahliae
provoquent
une
augmentation
de
la
perméabilité
membranaire des cellules du coton sensible qui se traduit par des pertes sélectives
des ions Na+ et K+. De telles modifications ont été observées auparavant par
Dimond, (1967), dans les feuilles de coton infectées par le même champignon.
Certains éléments minéraux peuvent avoir un effet très important sur la sensibilité
de l’hôte à un agent potentiel. Ainsi, la carence en Ca++ peut augmenter la
sensibilité de la tomate à Fusarium oxysporum f.s.p. lycopersici. Le manque de
calcium sur les substances pectiques semblent augmenter la dégradation des
parois cellulaires par les enzymes fongiques (Corden, 1965).
En outre, l’augmentation du rapport Na/Ca augmente la sévérité de la fusariose
des plantes de tomate. Cette plus grande sensibilité semble provenir d’une
déficience en calcium, conséquence de l’antagonisme entre le calcium et le sodium
(Standaert, 1978).
75
Généralement, l’effet de la salinité se manifeste par un ensemble de perturbations
qui touchent aussi bien les caractères morphologiques que la physiologie de la
plante. L’effet le plus fréquent de la salinité est la réduction de la croissance. Cette
réduction serait due d’une part à une diminution de la disponibilité en eau
résultant de l’augmentation de la pression osmotique de la solution du sol et
d’autre part, à l’effet toxique de l’accumulation de divers ions dans la cellule à la
suite de leur augmentation dans le sol. D’après Shannon (1984) la réduction de la
croissance est positivement corrélée avec la pression osmotique croissante du
milieu et dépend en grande partie de l’espèce cultivée.
Selon Hamza, (1980), le sel affecte la perméabilité sélective des membranes, ce qui
favorise l’absorption excessive des ions lorsque ces derniers sont présents en
grande quantité dans le sol. Leur accumulation dans la cellule peut créer un état de
toxicité qui perturbe le fonctionnement normal de la plante et aboutit parfois à la
mort de celle-ci.
Pour se protéger contre le stress causé par la présence du chlorure de sodium dans
le sol, les glycophytes effectuent une exclusion sélective des ions en excès (Flowers
et al., 1977). Une autre stratégie des plantes glycophytes tolérantes au sel est
d’accumuler les ions sodium dans la vacuole. Tel est le cas de l’espèce sauvage de
tomate, Lycopersicon cheemanii (Hook) CH Mill, tolérante, qui accumule les ions
sodium dans les parties aériennes alors que l’espèce cultivée L. esculentum Mill,
moyennement tolérante, excrète les ions sodium à partir des feuilles (Rush et
Epstein, 1981). Tad & Shanon (1983) cité par Cruz & Cuartero (1990) ont conclu
que la tolérance au sel des plantes de tomate est liée à la teneur des feuilles en ions
sodium et chlore. Cependant certains hybrides de L. esculentum x L. pennellii ont
des concentrations de Na+ et de Cl- similaires à celles des lignées sensitives.
D’après Cruz et Cuartero, (1990) la concentration foliaire en Na+ et Cl- reste un bon
indicateur de la tolérance au sel chez les espèces de tomate puisque les 39
génotypes de tomate testés par les auteurs ont manifesté une augmentation des
teneurs en Na+ en réponse à l’exposition à différentes concentrations de NaCl.
Ces données bibliographiques rapportent donc une altération de la balance
minérale des plantes après exposition au sel ou à la suite de l’infection par les
76
champignons vasculaires. Ceci nous a incité à analyser l’influence de la
combinaison des deux stress sur la nutrition minérale des plantes de tomate. Deux
éléments ont été retenus : le sodium dont l’accumulation est corrélée avec la notion
sensibilité/tolérance à la salinité et le potassium , élément entrant en compétition
avec le sodium pour son absorption (Guerrier et al., 1985).
2. Matériel et méthodes
Après quatre semaines de culture, les plantes de tomate, variétés Claudia et VR,
saines et infectées par Verticillium, soumises à des différents traitements salins,
sont excisées au niveau de la cicatrice des cotylédons puis mises à l’étuve à 70°C
pendant 72 heures puis broyées dans un mortier. La poudre végétale est ensuite
pesée et placée dans des creusets en quartz puis mise à calciner à 400°C pendant
une nuit. Après refroidissement, les cendres sont récupérés dans un mélange
d’acide nitrique et d’acide chlorydrique à 10% et portées à ébullition. Les cendres
reprises sont transvasées dans une fiole jaugée qu’on ajuste avec de l’eau
bidistillée. Le dosage est effectué par absorption atomique après passage au
spectrophotomètre Perkin Elmer 2380. Les teneurs en Na+ et K+ sont exprimées
en gramme pour 100g de matière sèche. Les résultats, moyennes de trois
répétitions sont accompagnés des intervalles de confiance au seuil statistique de
5% selon le test de Newman-Keuls.
3. Résultats
Les teneurs en Na+ et K+, ont été analysées au niveau de l’ensemble tige+feuilles
des plantes de tomate différemment traitées par le sel, avec et sans infection avec
Verticillium.
3.1. Teneurs en ions sodium
Les variations des teneurs en Na+ chez lez plantules de tomate Claudia et VR, en
fonction de la salinité des eaux d’arrosage sont reportées sur les figures 22A et
22B. Les résultats montrent qu’en absence de sel, l’infection avec Verticillium
provoque une augmentation significative des teneurs en Na+ chez les deux variétés.
77
Figure 22 A. Teneurs en ions Na+ foliaires chez les
tomates Claudia saines ou infectées avec Verticillium
et soumises à différents traitements par NaCl après un
mois
Teneurs en Na+ en % du poids
sec
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
plantes saines
1
plantes
0,5
0
0
30
60
90
Concentrations des solutions d'arrosage en NaCl (mM)
Figure 22 B. Teneurs en ions Na+ foliaires chez les
plantes de tomate VR saines ou infectées par
Verticillium et soumises à différents traitements par
NaCl après un mois
Teneurs en ions Na+ en % du
poids sec
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
plantes saines
plantes inoculées
0,5
0
0
30
60
90
Concentrations en NaCl des solutions d'arrosage en mM
78
Par ailleurs, on constate chez les plantes saines une augmentation des teneurs en
Na+ lorsque la salinité des solutions d’arrosage s’élève. Ainsi à 90mM de NaCl,
l’augmentation atteint des valeurs 26 et 29 fois plus élevées que celles des témoins
sans sel respectivement chez Marmande VR et Marmande Claudia.
Chez les plantes infectées et soumises au stress salin, les teneurs en Na+ sont plus
élevées que celles des témoins sains principalement pour les concentrations
modérées de sel. Néanmoins, à 90mM de NaCl, les teneurs en Na+, bien que plus
élevées que celles des autres concentrations de sel, ne montrent plus de différences
significatives avec celles des plantes saines du même traitement salin.
Enfin, l’analyse des variances ne montrent pas de différence significatives entre les
deux variétés.
3.2. Teneurs en ions potassium
A l’opposé des ions Na+, l’infection avec Verticillium entraîne en absence de sel,
une diminution des teneurs en K+ par rapport aux plantes saines témoins des deux
variétés de tomate Claudia (figure 23 A) et VR (figure 23 B). Chez ces dernières , la
salinité provoque une chute des teneurs en K+ proportionnelle avec l’augmentation
de la concentration en NaCl des solutions nutritives d’arrosage. A 90 mM de sel, la
diminution est de l’ordre de 51.7% et 53.5% pour Claudia et VR respectivement.
Lorsque les plantes sont soumises à la salinité et à l’infection par le champignon,
les teneurs en K+ sont encore plus faibles que celles des plantes saines soumises au
même traitement salin sauf pour la concentration de 90mM de NaCl où la
déficience en K+ rejoint celle des plantes saines.
4. Discussion et conclusions
Nos résultats montrent l’existence d’une grande ressemblance entre l’effet de la
salinité et l’action de Verticillium sur la nutrition minérale des plantes de tomates.
En effet, les deux contraintes, appliquées séparément, provoquent une
perturbation de la nutrition minérale conduisant à une modification des teneurs en
ions monovalents qui se traduit par un déficit en ions K+ compensé par une
accumulation des ions Na+ dans les feuilles.
79
Teneurs en ions K+ en % du poids
sec
Figure 23 A. Teneurs en ions K+ foliaires chez les plantes de
tomate Claudia saines ou infectées avec Verticillium et
soumises à différents traitements par NaCl
8
7
6
5
4
3
plantes saines
2
plantes inoculées
1
0
0
30
60
90
Concentrations en NaCl des solutions d'arrosage en mM
Figure 23 B. Teneurs en ions K+ foliaires chez les
plantes de tomate VR saines ou infectées par
Verticillium et soumises à différents traitements par
NaCl
Teneurs en ions K+ en % du
poids sec
8
7
6
5
4
3
plantes saines
2
plantes inoculées
1
0
0
30
60
90
Concentrations en NaCl des solutions d'arrosage en mM
80
Ce résultat concorde avec les travaux de Tal et al., (1978) ; Arahou, (1986 ) et Ullah
et al., (1994) qui ont rapporté une augmentation des teneurs en Na+ des feuilles de
tomate en présence de sel. Rush & Epstein, (1981) et Schachtman & Munns,
(1992), ont attribué l’aptitude des plantes à transporter les ions Na+ dans les
feuilles avec la tolérance au sel. En outre, il a été montré que certaines plantes
tolérantes accumulent l’ion Na+ dans les feuilles alors que chez les plantes
sensibles comme la haricot, le Na+ n’est pas ou peu transporté vers les feuilles et
s’accumulent dans les racines (Slama, 1986).
L’effet physiologique de l’infection avec Verticillium sur la tomate se traduit
également par une élévation des teneurs en Na+ et une baisse des teneurs en K+.
Un résultat similaire a été reporté par Guerrier et al., (1985) concernant l’effet
physiologique de quelques souches de Verticillium albo-atrum sur la balance
ionique de jeunes plantes de tomate. Selon les mêmes auteurs, les perturbations
ioniques causées par l’infection par Verticillium seraient dues à un effet spécifique
du champignon sur l’absorption des éléments minéraux et sur le transport de ces
éléments dans le xylème. Il est connu que Verticillium libère, au contact de l’hôte
et à l’intérieur des tissus vasculaires, des toxines et des enzymes qui pourraient
agir sur les sites d’absorption des ions monovalents et sur la distribution de ces
ions dans les différents organes de la plante (Nachmias et al., 1982, 1985 ;
Balandina et al ., 1976 ; Gour & Dube, 1985 et El Aissami, 1999).
L’analyse de nos résultats montre donc une similitude entre l’effet de la salinité et
l’action de Verticillium sur la teneur des cations monovalents des plantes de
tomate soumises à l’une ou l’autre des deux contraintes.
Lorsque les plantes de tomate sont exposées à l’action concomitante de la salinité
et du champignon, les perturbations ioniques induites montrent un effet additif
des deux contraintes sur la composition minérale de la plante et qui se traduit par
une réponse exagérée dans l’accumulation et la déficience de ces ions. Cette
situation a été observée chez les plantes de tomate infectées et traitées par les
concentrations modérées de sel ne dépassant pas 60mM de NaCl. Ces plantes ont
montré des teneurs en Na+ bien supérieures à celles des témoins sains soumis
uniquement à la salinité et inversement pour les teneurs en K+ dont la baisse est
81
plus prononcée que celle des plantes saines. Néanmoins, aux fortes concentrations
de sel (90mM), les réponses des plantes infectées ne reflètent pas l’effet additif
attendu. Les teneurs en Na+ et en K+ ne diffèrent pas de celles des plantes saines
soumises uniquement à la même salinité.
Deux hypothèses peuvent être envisagées quant à la réduction de l’effet de
Verticillium sur les teneurs en ces ions aux fortes concentrations salines :
- Les modes d’action du champignon sur la perméabilité membranaire et le
transport des ions ne seraient pas optimum aux concentrations élevées de sel
(90mM) de nos conditions expérimentales.
- Le développement du champignon, stimulé par la salinité de la sève, peut
perturber le flux de cette dernière dans le xylème et agir sur le transport des ions
vers les feuilles.
En effet, il a été démontré que la présence des conidies de Verticillium dans le
xylème induit la formation de thylles et de gommoses qui obturent les vaisseaux et
entrainent le flétrissement de la plante (Page et al., 1992).
Nos résultats laissent supposer que l’augmentation de la sensibilité des plantes en
présence des concentrations modérées de sel serait due entre autres, à
l’augmentation excessive des teneurs en Na+ qui dépassent la réponse normale des
plantes à l’élévation de la salinité du milieu. Cet excès d’ions que la plante n’arrive
pas à exclure peut créer un état de toxicité qui nuirait à la croissance normale des
plantes.
En présence de fortes concentrations de sel, l’action du Verticillum sur
l’accumulation des ions Na+ étant réduite, des facteurs autres que l’altération de la
balance minérale semblent intervenir dans l’augmentation de la sensibilité des
plantes à la maladie.
B. Effets sur les taux de sucres solubles totaux
1. Introduction
Le stress salin induit chez plusieurs espèces de plantes des modifications dans les
teneurs relatives des hydrates de carbone avec une accumulation plus ou moins
importante des sucres solubles totaux (saccharose, glucose et fructose). Ces
82
derniers semblent jouer un rôle important dans l’ajustement osmotique (Rhodes,
1987). En effet, pour ajuster le potentiel osmotique interne perturbé par
l’absorption excessive des ions sodium, la plante accumule dans son cytoplasme
des solutés organiques principalement la proline (Handa et al., 1986) et les sucres
solubles (Rhodes, 1987).
Ces derniers protègent également les membranes contre la déshydratation
(Schwab et Gaff, 1986). Leurs teneurs ont été utilisées comme indicateurs du degré
de tolérance à la salinité chez plusieurs espèces (Rathert, 1984).
L’augmentation des teneurs en sucres solubles en conditions de stress salin a été
mise en évidence chez la tomate (Lycopersicon esculentum Mill.). La variété Radja
réagit aux concentrations modérées de sel (70mM de NaCl) par une élévation des
teneurs en sucrose. Par contre, ces teneurs chutent brutalement aux fortes
concentrations de sel (Perez-alfocea et al., 1996). Mitchell et al., (1991) ont
également mis en évidence une augmentation des teneurs en glucose et en fructose
dans les fruits immatures de tomate (L. esculentum Mill.cv. UC 82 B) après
l’arrosage des plantes par des solutions enrichies en sel.
Récemment, Goicoechea et al., (2000) ont montré pour la première fois une
augmentation des sucres solubles comme réaction des plantes de piment à
l’infection par Verticillium dahliae.
Il apparaît ainsi que l’accumulation de sucres solubles serait une réponse des
plantes aux stress salin et infectieux. Il serait alors intéressant d’étudier les
niveaux de ses solutés dans les feuilles des tomates soumises à la combinaison
salinité-Verticillium en vue d’évaluer l’interaction de ces deux stress sur la
physiologie des tomates.
2. Matériel et méthodes
Le dosage des sucres solubles totaux se fait par colorimétrie selon la méthode à
l’anthrone. Cette méthode est basée sur la déshydratation intramoléculaire des
oses en milieu acide (H2SO4 pur) à chaud. Les dérivés obtenus se condensent avec
l’anthrone pour donner des produits colorés ; bleu-vert avec les hexoses et rouge
avec les pentoses.
83
2.1. Extraction des sucres solubles totaux
L’extraction est réalisée sur des jeunes feuilles fraîchement coupées et prélevées
dans le 1/3 supérieur de la tige. 100mg environ de matière fraîche foliaire sont
broyés dans 3ml d’éthanol à 80%.
2.2. Réaction à l’anthrone
A 2 ml d’extrait sont ajoutés 4 ml du réactif d’anthrone préparé au moins 4 heures
à l’avance et rangé à l’obscurité (2g d’anthrone dans 100 ml d’H2SO4). Le mélange
doit passer dans de la glace fondante avant agitation. Les tubes sont ensuite fermés
et mis à ébullition au bain-marie à 100°C pendant 10 minutes. Après un
refroidissement de 30 minutes, l’absorbance, lue à 600nm, au spectrophotomètre
est référée à une courbe étalon effectuée à partir de quantités croissantes d’une
solution de glucose à 100µg.ml-1.
Les résultats, moyennes de 4 répétitions sont exprimés en mg de glucose.g-1 de
matière fraîche. Ils sont comparés par analyse des variances selon le test de
Newman-Keuls au seuil de 5%.
3. Résultats
L’accumulation des sucres solubles totaux a été estimée sur les feuilles des deux
variétés de tomate après un mois de culture, délai nécessaire pour l’apparition des
symptômes de verticilliose.
3.1. Chez Marmande Claudia
Les résultats sont traduits dans la figure 24 A. Ils montrent que chez les plantes
saines cultivées sur milieu enrichi en sel, les teneurs en sucres solubles diminuent
légèrement mais de manière significative par rapport aux témoins cultivés sur
substrat sans sel. A 90mM de NaCl, on note une diminution de 18.27 %.
En absence de sel, l’infection par l’isolat P80 de Verticillium n’a aucun effet sur les
taux de sucres puisque les teneurs des plantes infectées sont similaires à celles des
plantes saines. Cependant, en présence de sel, les teneurs en sucres solubles
diminuent dans les feuilles des plantes infectées et diffèrent de manière
84
significative de celles des plantes saines du même traitement salin. A 90mM de
NaCl, la baisse des teneurs en sucres est de l’ordre de 36.61% par rapport aux
plantes infectées de contrôle.
3.2. Chez Marmande VR
Les résultats de la figure 24 B montrent que cette variété réagit à l’égard de la
salinité du milieu par une baisse des teneurs en sucres pour les concentrations
supérieures à 30mM de NaCl. En effet, à la concentration de 30mM, on n’observe
pas de changement dans les teneurs en sucres solubles par rapport aux témoins
sans sel. La baisse des teneurs en sucres solubles relevées à 60 et 90mM est de
l’ordre de 16.68% et 26.61% respectivement.
En absence de sel, et contrairement à Marmande Claudia, l’infection avec
Verticillium entraîne une baisse significative des teneurs en sucres solubles par
rapport aux plantes saines de l’ordre de 30.18%.
Chez les plantes soumises à l’action combinée de la salinité et de l’infection, le taux
de sucres solubles totaux subit une augmentation à 30mM de NaCl par rapport aux
témoins infectés sans sel, puis diminue avec l’augmentation de degré de salinité.
Notons toutefois que les teneurs en sucres restent toujours plus faibles que celles
des plantes saines du même traitement salin.
4. Discussion et conclusion
Le stress salin appliqué aux plantes de tomate modifie le métabolisme des glucides
des deux variétés de tomate utilisées en diminuant l’accumulation des sucres
solubles totaux particulièrement pour les concentrations supérieures à 30 mM de
NaCl.
Ces résultats traduisent d’une part, la capacité des deux génotypes de tomate à
s’adapter à un stress salin faible (30mM) en utilisant les sucres solubles pour
ajuster le potentiel osmotique perturbé par la salinité et d’autre part, la sensibilité
de ces variétés aux salinités modérées et élevées comme en témoignent les faibles
teneurs en sucres solubles accumulés dans les feuilles. En effet, les teneurs en
85
Figure 24 A. Teneurs en sucres solubles totaux foliaires des
tomates Claudia saines ou infectées par Verticillium et
soumises à différents traitements par NaCl (après un mois)
Teneurs en sucres solubles totaux (mg
de glucose/g. MF)
12
10
8
6
4
plantes saines
2
plantes infectées
0
0
30
60
90
Concentrations en NaCl des eaux d'arrosage en mM
Teneurs en sucres solubles totaux (mg
de glucose/g. MF)
Figure 24 B. Teneurs en sucres solubles totaux foliaires
des tomates VR saines ou infectées par Verticillium et
soumises à différents par NaCl (après un mois)
12
10
8
6
4
plantes saines
2
plantes infectées
0
0
30
60
90
Concentrations en NaCl des eaux d'arrosage en mM
86
sucres sont utilisées comme critères de tolérance à la salinité chez plusieurs
espèces (Rathert, 1984 ; Misra & Dwivedi, 1995).
L’action de Verticillium sur les teneurs en sucres solubles dépend de la variété de
tomate et du traitement par le sel. Ainsi, chez la variété Marmande Claudia,
l’infection par Verticillium ne semble pas avoir d’effet sur les teneurs en sucres
solubles, cependant, elle semble accentuer l’effet néfaste de la salinité sur ces
composés organiques puisque les teneurs en sucres solubles des plantes infectées
atteignent des valeurs plus basses que celles des témoins sains de même salinité. A
l’inverse, l’infection des plantes Marmande VR par Verticillium entraîne une baisse
des teneurs en sucres solubles même en absence de sel. Cette action est maintenue
en présence de sel.
La baisse des teneurs en sucres solubles induite par la salinité et accentuée par
l’infection, ne permet plus à ces composés de jouer leur rôle dans l’ajustement
osmotique (Munns & Weir, 1981 ). Elle reflète une plus grande sensibilité des
tomates à la salinité et à la maladie dans les conditions salines ce qui peut
expliquer, en partie, l’augmentation de la sévérité de la verticilliose des tomates
sous stress salin.
La diminution des taux de sucres solubles pourrait favoriser la synthèse d’enzymes
fongiques impliquées dans l’apparition des symptômes de la maladie. Cette
hypothèse pourrait être étayée par les travaux de Standaert, (1975) qui a montré
que les faibles concentrations en glucose dans les filtrats de culture de Fusarium
oxysporum, favorisent la synthèse des endopectinases fongiques. On peut
supposer que la salinité agirait de manière indirecte sur l’aptitude du Verticillium
à produire les enzymes impliquées dans la pathogénèse du champignon en
diminuant les teneurs en sucres solubles.
L’étude de l’effet de la salinité sur les mécanismes d’action de Verticillium pourrait
vérifier cette suggestion. Elle fera l’objet du chapitre suivant.
87
C. Effets sur l’accumulation de la proline
1. Introduction
L’accumulation de la proline dans le système racinaire et foliaire est parmi les plus
remarquables manifestations du stress salin et hydrique. Cette accumulation serait
le signe d’une perturbation du métabolisme ou /et d’un processus de stockage de
l’azote nécessaire à la survie de la cellule (Hanson et al., 1977, Sivaranakrishnan &
al., 1988). En outre, la proline pourrait contribuer à l’ajustement du potentiel
osmotique interne de la plante (Voetberg & Sharp., 1991). L’augmentation de la
proline est souvent corrélée avec la capacité des plantes à survivre en condition de
stress. Cependant, cet acide aminé ne semble pas intervenir dans le phénomène de
tolérance au sel. C’est le cas de l’hybride Tricicum aestivum L cv Chinese Spring
(sensible) x Lophopyrum elongatum (tolérant) dont la teneur en proline est plus
faible que celle du parent sensible (Colmer et al., 1995).
Perez-alfocea et al., (1996) ont évalué la tolérance au sel de l’hybride F1 de tomate
(Radja) en utilisant entre autres l’accumulation de la proline comme critère
physiologique d’adaptation au sel. Ces auteurs ont rapporté que les concentrations
modérées de sel n’entraînaient pas d’accumulation de proline alors que, sous des
concentrations élevées, la proline s’accumule dans tous les organes de la plante.
Qader (1997), en étudiant les conséquences métaboliques de la salinité chez trois
cultivars de blé tendre, a mis en évidence l’existence d’une corrélation positive
entre la teneur en proline et la concentration de NaCl dans le milieu. Le même
auteur a montré que l’accumulation de la proline causée par le stress salin dépend
de l’organe considéré ; elle est plus importante dans les feuilles que dans les
racines.
L’augmentation des teneurs en proline a été également rapportée comme réponse
aux stress biotiques. Grote & Claussen, (2001) ont montré que l’inoculation des
tomates avec Phytophthora nicotianae entraîne une augmentation du taux de
proline dans les feuilles de tomates infectées. Ces auteurs suggèrent que les
teneurs en proline des feuilles de tomates peuvent être un bon indicateur de stress
induits aussi bien par des facteurs abiotiques que biotiques. De même, les travaux
88
de Goicoechea et al., (2000) sur le couple piment-Verticillium démontrent que les
taux de proline augmentent dans les feuilles des plantes après infection avec
Verticillium dahliae. Ces auteurs supposent que ces substances organiques
peuvent être des détecteurs des dommages causés par l’infection fongique.
A la lumière de ces données, nous avons été incités à suivre l’évolution des taux de
proline chez les tomates à la suite de leur exposition aux stress de la salinité et de
l’infection verticillienne.
2. Matériel et méthodes
La détermination de la proline est réalisée selon la méthode colorimétrique de
Troll et Lindsley (1955) reprise par Magné et Larher, (1992).
2.1. Extraction
Les échantillons de feuilles (150mg environ) prélevées près de l’apex subissent une
extraction alcoolique dans 3 ml de méthanol placé dans un tube à hémolyse.
L’ensemble est placé dans un bain-marie à 90°C pendant une heure. Les tubes où
se fait l’extraction doivent être bien fermés pour éviter l’évaporation du méthanol.
2.2. Dosage
Après refroidissement, à 1 ml de l’extrait sont ajoutés 2 ml d’une solution de
ninhydrine à 1% dans l’acide acétique glacial :eau (60 :40 V/V) et l’ensemble est
mis au bain-marie à 100°C pendant une heure. Après refroidissement, 5 ml de
toluène sont ajoutés et le mélange est agité vigoureusement. Le chromatophore
formé est stable pendant 24 heures. Pour la lecture de l’absorbance, on prélève la
phase supérieure après 30 minutes de repos. La densité optique est lue à 520nm.
Les résultats sont référés à une courbe étalon effectuée à partir de quantités
croissantes d’une solution de proline à 1µg/ml. Les résultats sont exprimés en µg/g
.MF. Trois répétitions sont prévues par traitement salin pour les plantes saines et
les plantes infectées.
89
3. Résultats
3.1. Chez la variété Marmande Claudia
Chez les plantes saines de cette variété (Figure 25 A), les teneurs en proline foliaire
augmentent régulièrement en fonction de la concentration saline des solutions
d’arrosage. A 90mM de NaCl, les teneurs en proline foliaires atteignent des valeurs
quatre fois plus élevées que celles des plantes cultivées sans sel.
En absence de sel, l’infection avec Verticillium induit une augmentation des
teneurs en proline de 133.7% par rapport aux plantes saines. Cependant, chez les
plantes infectées et cultivées en présence de sel, on ne remarque plus de
différences significatives dans les taux de proline des plantes saines et infectées
quelque soit la concentration saline imposée aux plantes.
3.2.Chez la variété Marmande VR
La variété VR réagit à la salinité par une légère accumulation de la proline dans les
feuilles des plantes traitées en rapport avec l’augmentation de la salinité du milieu
(figure 25 B). L’augmentation des teneurs en proline étant de l’ordre de 49.02% à
90mM de NaCl.
En absence de NaCl, l’infection avec Verticillium ne provoque pas, à ce stade de la
culture, de modifications dans l’accumulation de la proline dans les feuilles. Les
teneurs en cet acide aminé des plantes saines et infectées ne diffèrent pas
statistiquement.
En présence de sel, les plantes infectées accumulent plus de proline dans leurs
feuilles que les plantes saines cultivées en présence des mêmes concentrations
salines.
4. Discussion et conclusion
Les résultats démontrent, dans nos conditions expérimentales, que la salinité et
l’infection par Verticillium sont associées à une augmentation des teneurs en
proline dans les feuilles des tomates stressées.
En absence d’infection, les plantes cultivées dans les conditions salines élevées
(90mM) accumulent plus de proline que les plantes développées sous des
90
Figure 25 A. Teneurs en proline des feuilles des tomates Claudia
saines ou infectées par Verticillium et soumises au stress salin
(après un mois)
Teneurs en proline en µg/g. MF)
900
800
700
600
500
400
300
plantes saines
200
plantes infectées
100
0
0
30
60
90
Concentrations en NaCl des eaux d'arrosage en mM
Figure 25 B. Teneurs en proline des feuilles des tomates VR
saines ou infectées par Verticillium et soumises au stress
salin (après un mois)
Teneurs en proline en µg/g,MF
900
800
700
600
500
400
300
200
plantes saines
100
plantes infectées
0
0
30
60
Concentrations en NaCl des eaux d'arrosage en mM
90
91
concentrations modérées ou faibles (60 et 30mM). Ces résultats sont en accord
avec les observations de Pérez-alfocea et al., (1996) qui ont montré une
augmentation de la proline dans tous les organes de la plante principalement aux
fortes concentrations de NaCl.
Les teneurs en proline ont évolué également chez la tomate après l’infection avec
Verticillium. En effet, des teneurs élevées en proline ont été détectées dans les
feuilles des tomates Claudia infectées en comparaison à celles des témoins sains.
Toutefois, l’accumulation de la proline ne semble pas être affectée par l’infection
chez la variété VR. Chez cette dernière, une augmentation de la proline a été
observée lorsque la salinité a été ajoutée à l’infection.
Goicoechae et al., (2000) travaillant sur le piment (Capsicum annuum) ont
montré que l’infection des plantes avec Verticillium dahliae induit une
augmentation substantielle de proline après 20 jours d’inoculation. Des résultats
analogues ont été rapportés par Tzeng & Devay, (1985) . Ces auteurs ont montré
que des teneurs élevées en proline sont détectées dans les feuilles de coton
infectées par rapport à celles des plantes de contrôle. Les premiers auteurs
suggèrent que les toxines libérées par le champignon dans les tissus infectés
peuvent altérer la physiologie de la plante.
L’accumulation de la proline peut être due à une augmentation de la synthèse de
cet acide aminé ou à la diminution de son utilisation dans la synthèse de protéines
dans les plantes stressées (Delauney & Verma, 1993).
Plusieurs fonctions physiologiques ont été attribuées à l’accumulation de la proline
dans les cellules en conditions de stress. L’accumulation de cet acide aminé peut en
effet jouer un rôle dans l’osmorégulation des cellules en cas de déficit hydrique et
servir comme indicateur de la sécheresse et/ou un détecteur de stress (Aspinall &
Paleg, 1981 ; Grote & Claussen, 2001).
Chez la tomate, et selon Pérez-alfocea et al., (1993), la proline contribue avec une
faible proportion à l’ajustement osmotique par rapport aux autres solutés
accumulés dans le cytoplasme des plantes soumises aux conditions de stress
hydrique. En s’appuyant sur ces données, on peut supposer que l’augmentation de
la proline consécutive au traitement des tomates par la salinité et par l’infection
92
pourrait jouer un rôle différent dans la stratégie de la plante à éviter le stress ou au
moins être considéré comme un indicateur signalant l’intensité du stress (Grote &
Claussen, 2001).
Concernant ce dernier aspect, une relation a été établie entre l’accumulation de la
proline et le degré du déficit hydrique des plantes stressées par la sécheresse ou
par l’infection avec Verticillium. En effet, Goicoechae et al., (2000) ont démontré
que la diminution des teneurs relatives en eau des plantes de piment infectées
coïncide avec l’augmentation de l’accumulation de la proline. Un résultat similaire
a été observé par Irigoyen et al., (1992) chez la luzerne soumise à la sécheresse.
L’effet de l’infection par Verticillium se manifeste en général par le
rabougrissement et le flétrissement des plantes. Par suite de la présence du
champignon dans les vaisseaux du xylème, le transport de l’eau est perturbé. Il en
résulte un stress hydrique qu’on peut rapprocher de celui des plantes soumises à la
sécheresse ou à la salinité. De ce fait, l’augmentation de la proline dans les feuilles
de tomates infectées par Verticillium et traitées avec le sel serait le reflet de
l’importance du déficit hydrique de ces plantes et expliquerait, par la même
occasion, l’importance des symptômes de rabougrissement manifestés par ces
dernières par rapport aux plantes saines témoins sans sel.
Öncel et al., (1996) rapportent de leur côté que l’accumulation de proline serait en
relation avec la résistance des cultivars aux maladies. Chez les cultivars de piment
résistants à Phytophthora capsici, la proline est plus accumulée en comparaison
aux cultivars sensibles. Ces auteurs suggèrent que la proline peut jouer un rôle
important dans les mécanismes de défense de la plante contre cet agent pathogène.
Dans cette voie, on peut penser que la quantité de proline induite chez la tomate
par la combinaison salinité-Verticillium ne s’avèrerait pas suffisante pour assurer
la protection des tomates du double stress qui leur est imposé, ce qui pourrait
expliquer la plus grande sensibilité des plantes à la maladie sous stress salin. Cette
hypothèse peut être appuyée par les valeurs des teneurs en proline des tomates
Claudia infectées en conditions salines qui rappellent celles des témoins sains du
même traitement salin et qui ne reflètent pas l’effet additif attendu des deux stress
sur l’accumulation de la proline.
93
Enfin, quels que soient les mécanismes par lesquels intervient la proline dans la
gestion des stress de la plante, cet acide aminé paraît être un indicateur quantitatif
des stress qui affectent le statut hydrique des plantes de tomate (Grote & Claussen,
2001) comme la concentration saline élevée du milieu nutritif et l’attaque par
Verticillium.
D. Effets de l’interaction salinité-Verticillium sur certaines
activités enzymatiques des plantes de tomate
1. Effets sur l’activité nitrate réductase
1.1. Introduction
La nitrate réductase, enzyme catalysant la réaction des nitrates en nitrites est
l’enzyme limitante du processus d’assimilation de l’azote (Beevers & Hageman,
1969) par comparaison aux autres enzymes situées en aval telles que la nitrite
réductase, la glutamine synthétase et la glutamate synthase. De nombreux travaux
ont rapporté l’impact de la salinité sur les enzymes impliquées dans les voies de
l’assimilation de l’azote. La nitrate réductase, principalement, a été largement
évoquée (Misra & Dwivedi, 1990 ; Botella et al., 1993 a). L’altération du
métabolisme azoté par le sel serait attribuée à une inhibition de l’absorption de
NO3- et de son accumulation dans les tissus foliaires et racinaires (Soltani et al.,
1990 ).
La perturbation de la nitrate réductase peut en outre être induite par l’infection.
Regragui et al. (1990) ont montré que l’inoculation de jeunes plantes de tomate
avec différentes souches de Verticillium a provoqué des modifications de l’activité
nitrate réductase, principalement avec les souches pathogènes du champignon.
Selon ces mêmes auteurs, le champignon pourrait avoir une action inhibitrice
directe de l’enzyme par l’intermédiaire des métabolites toxiques qu’il sécrète à
l’intérieur des tissus de l’hôte.
L’étude des modifications du métabolisme azoté des plantes de tomate infectées et
soumises au stress salin pourrait contribuer à rendre explicite le comportement
des tomates face à ces deux stress.
94
1.2. Matériel et méthodes
Plusieurs méthodes ont été décrites pour la détermination de l’activité nitrate
réductase. Nous avons opté pour la méthode « in situ » telle qu’elle a été décrite
par Robin et al., (1983 a). Si on se réfère aux résultats de Robin et al., (1983 b) sur
le maïs, cette méthode permet d’évaluer avec une bonne approximation la
réduction réelle de nitrate en nitrite, contrairement à la méthode in vitro qui
mesure l’activité potentielle de l’enzyme.
Le principe consiste à doser le nitrite formé au moment de la réduction des
nitrates.
Après un mois de culture, les parties aériennes des plantes de tomate soumises au
stress salin et à l’infection par Verticillium sont prélevées après 6 heures du début
de la photopériode. Elles sont ensuite pesées et mises à incuber dans des vénojects
de 140ml en anoxie et à l’obscurité en présence de KNO3 ( 100mM) (Gojon et al.,
1983).
Après un temps d’incubation d’une heure, le nitrite accumulé est extrait par de
l’eau bouillante pour arrêter la réaction puis dosé par colorimétrie après addition
des réactifs de diazotation (N. Naphty Ethylène Diamine Dichlorure NNEDD) ;
0.2g/l) et de sulfanilamide (10g/l d’HCl). On laisse ensuite la coloration violette se
développer pendant au moins 30 minutes puis on mesure la densité optique au
spectrophotomètre à 540 nm. Les résultats , moyennes de six répétitions sont
exprimés en µM de NO2- /h/ g de matière fraîche en utilisant la formule qui suit :
A N R = DO x V
PF. E0.t
DO= densité optique lue à 540 nm
V= volume d’extraction en litre
t= temps d’incubation en heure
PF= poids frais en g
E0= coefficient d’extinction molaire
NNEDD : N.Naphty Ethylène Diamine Dichlorure
95
1.3. Résultats
L’évolution de l’activité nitrate réductase en fonction de la salinité et de l’infection
par Verticillium chez les plantes de tomate est représentée sur la figure 26.
En absence de sel, l’infection par ce pathogène entraîne une légère mais
significative baisse de l’activité nitrate réductase des plantes de tomate par rapport
aux plantes saines.
En présence de sel, l’activité nitrate réductase des plantes saines n’est pas
influencée par les concentrations faibles et modérées (30-60mM de NaCl). On note
toutefois à 90 mM, un effet dépressif du sel sur l’activité de l’enzyme de 79.76% par
rapport aux témoins non traités par le sel.
Par contre, les plantes infectées et soumises au stress salin voient leur activité
nitrate réductase diminuer fortement dès que la salinité du milieu commence à
augmenter. En effet, l’activité nitrate réductase chute brutalement à 30mM de
NaCl et manifeste des niveaux d’activité comparables pour toutes les
concentrations salines de l’expérience. Les réductions par rapport aux témoins
malades sans sel sont de l’ordre de 85.47% ; 80.34% et 84.18% à 30, 60 et 90mM
de NaCl respectivement. L’analyse de la variance montre que l’interaction salinitéVerticillium est hautement significative.
1.4. Discussion et conclusion
L’étude de l’activité nitrate réductase des tomates infectées par Verticillium et
soumises au stress salin rend compte des perturbations causées par ces deux stress
sur le métabolisme azoté de la plante.
Cette étude a porté d’abord sur l’action physiologique de Verticillium sur l’activité
nitrate réductase chez les tomates artificiellement infectées. Elle a montré que le
champignon affecte légèrement la capacité des plantes à réduire le nitrate. Nos
études précédentes (Regragui et al., 1990) sur cet aspect du parasitisme ont
montré que des souches de Verticillium de pouvoir pathogène différent affectent
différemment l’activité nitrate réductase des jeunes plantes de tomate ; l’enzyme
étant inhibée uniquement par les souches pathogènes.
96
Figure 26. Activité Nitrate Réductase des plantes de
tomate infectées par l'isolat P80 de Verticillium et soumises
au stress salin
plantes saines
plantes infectées
Activité nitrate réductase en
nmol/h/g M.F
700
600
500
400
300
200
100
0
0
30
60
90
Concentration en NaCl des solutions d'arrosage en mM
97
La répression de l’enzyme peut avoir plusieurs origines :
- Une action directe du champignon sur la nitrate réductase par le biais des
enzymes fongiques et des toxines libérées par le champignon au cours de
l’infection. En effet la nitrate réductase est connue pour être une enzyme très
instable, très sensible aux dégradations protéolytiques et qui perdrait sa capacité
de réduire le nitrate (Schrader et al., 1974).
- Un manque de la disponibilité en pouvoir réducteur, le NADH. Il est bien
établi que la nitrate réductase de la majorité des plantes supérieures utilise
spécifiquement le NADH comme cofacteur ( Schrader et al., 1968 ; Beevers &
Hageman, (1969). De même, Srivasta, (1980) et Duck & Duck, (1984) ont précisé
que les métabolites issus de la photosynthèse sont indispensables au
fonctionnement de l’enzyme. Dans le même sens, la limitation de la photosynthèse
par privation de CO2 retentit sur l’absorption et la réduction des nitrates (Pace et
al., 1990). L’épuisement du donneur d’électrons (NADH) serait donc la
conséquence d’une action plus profonde du Verticillium sur le métabolisme de la
plante (Guerrier et al., 1985) et qui se résumerait à une baisse de la synthèse
carbonée, substance représentant une source de pouvoir réducteur pour le
fonctionnement de la nitrate réductase.
- Une absence de l’induction de l’enzyme. La nitrate réductase est une
enzyme qui peut être induite par son substrat, le NO3- (Hageman et Flesher, 1960 ;
Beevers & Hageman, 1969 ; Hewitt & Cutting, 1979 cité par Bazzigalupi, et al.,
1992). La faible activité assimilatrice de l’azote constatée chez les plantes infectées
serait imputable à une absence de l’induction de l’enzyme consécutive à la
diminution de l’absorption de nitrate. On peut supposer que Verticillium altère
l’absorption de NO3- et par là même, empêche l’induction de l’enzyme.
D’un autre coté, il est connu que le stress hydrique ou salin affecte les enzymes
impliquées dans les voies de l’assimilation de l’azote ( Misra & Dwivedi, 1990 ;
Botella et al., 1993a). La modification de certaines enzymes est corrélée avec la
notion de sensibilité/tolérance à la salinité.
Nos résultats montrent que chez les tomates traitées par le sel, l’activité nitrate
réductase n’est pas influencée par les concentrations faibles et modérées de sel
98
(30mM et 60mM). Seules les concentrations élevées de NaCl (90mM) perturbent
l’aptitude des plantes à assimiler le nitrate. L’absence d’altération de l’activité
nitrate réductase constatée témoigne de la tolérance relative de la variété de
tomate aux concentrations modérées de sel. Cette tolérance semble être brisée par
l’infection par Verticillium comme le montrent les niveaux d’activité nitrate
réductase, très bas, enregistrés chez les plantes infectées et traitées par ces
concentrations de sel.
L’activité nitrate réductase est représentative du niveau des synthèses d’acides
aminés et de protéines. En effet, la réduction des nitrates conduit à la formation de
nitrites puis d’ammoniac lequel est incorporé dans un squelette carboné,
généralement le glutamate pour former la glutamine. La baisse de l’activité nitrate
réductase suite à l’interaction salinité-Verticillium ne peut être écartée comme une
cause possible de la réduction sévère de la croissance des plantes doublement
stressées.
En résumé, l’action combinée des effets de la salinité et de l’infection par
Verticillium perturbe de manière hautement dépressive l’activité nitrate réductase
et par voie de conséquence tout le métabolisme azoté de la plante. L’infection par
Verticillium semble augmenter la sensibilité des plantes à la salinité et les
prédisposer à l’attaque fongique.
2. Effets sur l’activité peroxydasique
2.1. Introduction
Les peroxydases sont des oxydoréductases qui catalysent l’oxydation de divers
groupes de composés organiques en utilisant le peroxyde d’hydrogène (H2O2)
comme accepteurs d’électrons (Dawson, 1988). Elles sont présentes dans tous les
tissus des végétaux et se présentent sous plusieurs formes isoenzymes ; les
isoperoxydases. On distingue deux groupes d’isoperoxydases ; les isoperoxydases
basiques localisées normalement dans la vacuole et les isoperoxydases acides liées
à la paroi cellulaire. Les isoperoxydases vacuolaires semblent être impliquées dans
plusieurs voies métaboliques comme le catabolisme auxinique. Les autres seraient
99
impliquées dans la biosynthèse de la lignine et de la subérine (Normanly et al.,
1995, Robert et al., 1988, Wetten et al., 1998).
Les peroxydases jouent un rôle important dans le métabolisme et la physiologie de
la plante et sont impliquées dans les réponses des plantes aux infections et aux
stress abiotiques.
Le stress salin a été rapporté comme facteur stimulant l’activité des peroxydases et
induisant la synthèse de la lignine et/ou la subérine. Il produit par conséquent une
altération du transport d’eau (Cruz et al., 1992). D’autres travaux (Quirago et al.,
2000) ont montré que le traitement par le sel entraîne une augmentation des
peroxydases des racines de tomates.
Le rôle des peroxydases et de leurs produits du métabolisme dans les mécanismes
de défense des plantes infectées a fait l’objet de plusieurs études (Maraitre, 1973 ;
Hammerschmidt et al., 1982 ; Andreeva, 1991).
Ces études ont porté sur plusieurs combinaisons hôte-parasite. Ainsi, une
importante augmentation de l’activité peroxydasique a été détectée après infection
du melon par Spaerotheca fuliginea ou de la tomate par Verticillium dahliae,
augmentation touchant aussi bien les plantes sensibles que résistantes (Reuveni &
Bothma, 1985 et Reuveni & Ferreira, 1985).
L’activité peroxydasique a été également associée avec l’induction de la résistance
systémique du concombre à Colletotrichum lagenarium (Hammerschmidt et al.,
1982).
Le rôle des peroxydases dans les phénomènes de résistance serait lié à la
production de lignine, de phenylalanine et de l’accumulation de phénols (Maxw ell
& Bateman, 1967 ; Pollok & Drysdale, 1976 et Carrosco et al., 1978). L’activité de
ces composés métaboliques serait apparentée à leurs propriétés anti-microbiennes,
au renforcement des parois cellulaires et à l’induction des réponses des plantes
(Clerivet et al., 1996).
Le présent travail a pour objectif de montrer l’influence de l’interaction
Verticillium-salinité sur les mécanismes de défenses des tomates via l’étude de
l’activité peroxydasique .
100
2.2. Matériel et méthodes
La détection de l’activité peroxydasique a été effectuée selon le protocole décrit par
Reuveni & Ferreira, (1985).
2.2.1. Préparation de l’extrait enzymatique
Des échantillons de racines de tomate Claudia pesant environ 0.5 g issus des
plantes de chaque traitement sont homogénéisés à froid dans un mortier en
présence de 5ml de tampon phosphate sodium 0.015M, pH 6. Après centrifugation
à 5000g pendant 20 minutes à 4°C, le surnageant constitue l’extrait enzymatique.
2.2.2. Mesure de l’activité de l’enzyme
L’activité peroxydasique est mesurée à température ambiante utilisant comme
substrat, le guaïacol. 50µl d’extrait sont additionnés à 3ml du mélange réactionnel
de composition suivante :
- 15mM du tampon phosphate , pH 6
- 1 mM de peroxyde d’hydrogène
- 0.1 mM de guaïacol
Le mélange enzyme–substrat est agité par inversion de la cuve et les variations de
l’absorbance à 450nm sont mesurées toutes les minutes pendant 6 minutes
d’incubation à l’obscurité, contre un extrait dépourvu d’enzyme.
Les activités peroxydasiques sont déterminées par les pentes des droites obtenues
et rapportées au poids de la matière fraîche (Absorbance à 450nm/min/g. MF)
2.3. Résultats
L’activité peroxydasique des racines des tomates différemment traitées par le sel et
par l’infection avec Verticillium a été évaluée après trois et quatre semaines de
culture.
2.3.1. Activité peroxydasique après trois semaines
Chez les plantes saines, l’activité peroxydasique augmente en fonction de la salinité
croissante du milieu (figure 27 A). Les augmentations par rapport aux témoins non
traités sont de l’ordre de 55% et 80.6 % respectivement à 60 et 90mM de NaCl.
101
Les réponses des plantes à l’infection se traduisent, en absence de sel, par une
hausse très importante de l’activité peroxydasique par rapport aux plantes saines,
de l’ordre de 190%.
En présence de sel, les niveaux d’activité de la peroxydase des plantes infectées
diminuent avec l’augmentation de la salinité. Cependant, ils restent toujours
significativement supérieurs à ceux des plantes saines. Cette constatation est
valable pour tous les traitements salins de l’expérience.
2.3.2. Activité peroxydasqiue après quatre semaines
Bien que l’évolution de l’activité peroxydasique en fonction de la salinité et de
l’infection soit parallèle à celle observée après trois semaines (Figure 27 B), il faut
signaler qu’en général, les niveaux d’activité ont diminué avec le temps aussi bien
chez les plantes infectées que saines.
Pour estimer l’effet de l’interaction salinité-Verticillium, nous avons comparé
l’augmentation des niveaux d’activité des peroxydases des plantes saines et
infectées en fonction de la salinité. Les résultats sont résumés sur le tableau 6.
Il apparaît clairement que pour une même salinité, l’activité des peroxydases des
plantes infectées est plus élevée que celles des plantes saines mais à des degrés qui
diffèrent selon la salinité. Le rapport R établi entre l’activité des plantes infectées
et celles des plantes saines est plus grand quand le milieu est dépourvu de sel. Ce
rapport diminue progressivement avec la salinité.
102
Activité peroxydasique
(Variation de l'absorbance /min/g,MF)
Figure 27 A. Influence de la salinité sur l'activité
peroxydasique des plantes de tomate infectées par l'isolat
P80 de Verticillium (après trois semaines)
8
plantes saines
7
plantes infectées
6
"
5
4
3
2
1
0
0
30
60
90
Concentration en NaCl des solutions d'arrosage en mM
Figure 27 B. Influence de la salinité sur l'activité
peroxydasique des plantes de tomate infectées par l'isolat
P80 de Verticillium (après quatre semaines)
Acivité peroxydasique
(Variation de l'absorbance/min/g, MF)
7
plantes saines
6
plantes infectées
5
4
3
2
1
0
0
30
60
90
Concentration en NaCl des solutions d'arrosage en mM
103
Tableau 6. Activité peroxydasique des racines de tomate saines et
infectées avec Verticillium en fonction de la salinité du milieu.
AP*
Après trois semaines
NaCl
Plantes
en mM saines
0
30
60
90
Plantes
Après quatre semaines
R**
infectées
2.27±0.21
7.34±0.13
a
a
2.53±0.11
5.23±0.05
a
b
3.52±0.3
5.27±0.05
b
b
4.10±0.05
4.50±0.16
c
c
3.23
2.06
1.49
1.09
Plantes
Plantes
saines
infectées
2.07±0.11
5.53±0.38
a
a
2.13±0.11
5.50±0.24
a
a
2.53±0.11
4.47±0.14
b
b
3.27±0.05
4.07±0.11
c
c
R**
2.67
2.58
1.76
1.24
* AP : activité peroxydasique
** Rapport R= AP des plantes infectées/AP des plantes saines
Deux résultats lus sur une même colonne et non accompagnés de la même lettre sont différents
statistiquement.
2.4. Discussion et conclusion
Nos résultats montrent que le stress salin, appliqué à la tomate (Marmande
Claudia) a entraîné, dans nos conditions expérimentales, une stimulation
progressive de l’activité peroxydasique dans les racines en fonction de la salinité
croissante des eaux d’arrosage. Ce résultat concorde avec celui de Quirago et al.,
(2000). Ces auteurs ont montré que le traitement des tomates (Lycopersicon
esculentum, cv Pera) par 100mM de NaCl induit l’augmentation de l’activité
peroxydasique des racines. Ce phénomène a été observé chez d’autres plantes
cultivées en présence de NaCl. C’est le cas notamment du blé tendre qui répond au
stress salin par une augmentation de l’activité des peroxydases (Qader, 1997).
La stimulation des peroxydases par la salinité semble être due à une activation du
gène de l’enzyme. Selon Quirago et al., (2000), le sel provoque des modifications
104
dans l’expression du gène TPXI de la peroxydase, gène isolé de la tomate par
Botella et al., (1993 b), et qui serait impliqué dans la synthèse de la lignine et de la
subérine.
La salinité pourrait entre autres agir sur l’activité de la peroxydase en favorisant la
disponibilité des composés phénoliques fournis par l’oxydation des glucides et/ou
la disponibilité du peroxyde d’hydrogène (H2O2). D’ailleurs, Hurkman et al., (1991)
ont bien rapporté que le sel stimule l’activité de l’oxalate oxydase, enzyme
catalysant la formation du peroxyde d’hydrogène.
L’infection des tomates par l’isolat P80 de Verticillium s’est manifestée elle aussi
par une augmentation considérable de l’activité peroxydasique des racines,
nettement supérieures à celle induite par la salinité. L’augmentation de l’activité
des peroxydases due à l’infection par les organismes pathogènes, a été détectée
chez
différentes
combinaisons
hôte-parasite
(Johnson
&
Lee,
1978 ;
Hammerschmidt et al., 1982).
A propos du couple tomate-Verticillium, Reuveni & Ferreira, (1985) ont rapporté
un résultat similaire au nôtre. Ces auteurs ont précisé en plus que l’augmentation
de l’activité de la peroxydase à la suite de l’infection par Verticillum touche aussi
bien les variétés de tomate sensibles que résistantes au champignon. Le rapport de
l’augmentation par rapport aux témoins sains étant plus élevé chez les plantes
sensibles.
L'exposition des tomates à la combinaison salinité-Verticillum ne s’est pas traduite
par un effet synergique des niveaux d’activité de la peroxydase supposés être
stimulés par la salinité ou par l’infection. Bien au contraire, cette activité, très
élevée chez les plantes infectées, chute graduellement si celles ci sont cultivées en
présence de sel. Le rapport établi entre l’activité peroxydasique des plantes
infectées et celles des plantes saines diminue avec la salinité. Tout se passe comme
si le facteur sel inhibe l’action du champignon sur la peroxydase.
La baisse des niveaux de l’activité de l’enzyme laissent prévoir une augmentation
de la sensibilité des plantes au Verticillium dans les conditions salines de culture.
Cette hypothèse peut être étayée par les travaux de Reuveni & Ferreira, (1985). Ces
auteurs ont observé des différences entre l’activité des peroxydases des tomates
105
sensibles et résistantes à Verticillium ; les niveaux d’activité étant plus élevés chez
les plantes résistantes que sensibles. De même, en étudiant les réponses de onze
variétés de tomate, ces auteurs ont établi une corrélation hautement positive entre
l’activité de la peroxydase des racines et la présence du gène Ve de résistance à
Verticillium dahliae.
Reuveni & Bothma, (1985) ont de leur côté mis en évidence une corrélation
positive similaire entre l’activité peroxydasique et la résistance de quatre variétés
de melon à Spaerotheca fuliginea. Des travaux plus récents (Reuveni et al., 1992),
ont montré que les niveaux d’activité peroxydasique de plusieurs variétés de melon
sont liés avec les différents niveaux de résistance des plantes à Pseudoperonospora
cubentis. De ce fait, l’activité des peroxydases serait un indicateur ou un marqueur
biochimique de la résistance des plantes à ces agents pathogènes et pourrait, à titre
d’exemple, être utilisé dans les programmes de sélection des variétés résistantes.
En se référant à ces données, nos résultats laissent supposer que la salinité
augmente la sensibilité des tomates à la verticilliose comme en témoigne la baisse
des niveaux d’activité de la peroxydase des plantes malades soumises au stress
salin. La réduction de l’activité de l’enzyme dans ce cas, serait la résultante des
perturbations métaboliques engendrées par l’interaction salinité-Verticillium sur
les mécanismes de défenses de la plante et qui pourrait se traduire par une baisse
de la synthèse de lignine et de subérine, facteurs très importants dans la résistance
des plantes aux pathogènes vasculaires (Pegg, 1981). En effet, les composés
phénoliques jouent un rôle complexe dans la pathogénèse des trachéomycoses.
L’augmentation de leur concentration a été associée avec l’augmentation de la
résistance aux champignons (Carrasco et al., 1978 ; Pegg, 1981 ; Candela et al.,
1995).
Cette étude biochimique a dévoilé une certaine analogie entre les effets
physiologiques de la salinité et ceux induits par l’infection. Certains paramètres
physiologiques sont des indicateurs de la tolérance au sel.
L’interaction salinité-Verticillium perturbe profondément les caractéristiques
physiologiques liées à l’adaptation au sel. Les conséquences de ces modifications
seraient à l’origine de la dépression sévère de la croissance des plantes et
106
traduisent une augmentation de la sensibilité de la plante à la salinité et/ou à la
maladie.
Cette
étude
biochimique
s’est
limitée
à
l’analyse
des
caractéristiques
physiologiques de la plante hôte doublement stressée. Mais qu’en est-il de l’effet
du sel sur la physiologie du parasite ?
L’étude de l’influence de la salinité du milieu nutritif sur les composantes
biochimiques de l’agressivité du champignon apportera plus d’éclaircissement.
107
Chapitre 4 : Impact de la salinité du milieu sur les
mécanismes d’action de Verticillium albo-atrum
I. Effet de la salinité sur la toxinogénèse de l’agent pathogène
Introduction
Les mécanismes physiologiques qui déterminent l’agressivité des espèces
pathogènes des champignons du genre Verticillium sont maintenant bien connus.
Il a été démontré depuis les six dernières décennies que Verticillium forme des
métabolites phytotoxiques qui sont importants dans la formation des symptômes
de flétrissement caractéristiques des verticillioses (Pegg, 1965 ; Michail & Carr,
1966 ; Keen & Long, 1972 ; Chaïb, 1987 ; Meyer et al., 1994). Ces métabolites
toxiques ont été détectés dans les filtrats de culture de Verticillium isolé de
diverses plantes hôtes, notamment le coton et la tomate (Keen & Long, 1972 ;
Cronshaw & Pegg, 1976). Leur caractérisation a fait l’objet de plusieurs travaux. Il
s’agit d’un complexe protéo-lipo-polysaccharidique PLPC considéré comme toxine
de Verticillium dahliae induisant flétrissement et chloroses sur les feuilles
détachées du coton (Keen & Long, 1972 ; Keen et al., 1972 ; Nachmias et al.,
(1982). Plus tard, Nachmias et al., (1985) ont purifié une fraction toxique de faible
poids moléculaire (< 3000) à partir du PLPC produit par un isolat de V. dahliae de
la pomme de terre.
Plus tard encore, Mansoori et al., (1995) ont étudié la production de mycotoxines
par Verticillium et ont réussi à purifier une toxine de poids moléculaire plus faible
(<1000). Cette toxine purifiée induit des chloroses et des nécroses sur feuilles
détachées de tomate et de pomme de terre sensibles, chloroses similaires aux
symptômes naturels.
Meyer et al., (1994) ont, de leur coté, purifié par électrophorèse un complexe
phytotoxique à partir de jeunes cultures de Verticillium. Des enzymes, cellulases et
polygalacturonases, ont été également identifiées dans ce complexe. Ce dernier
induit des symptômes de flétrissement accompagnés par une inhibition de
l’activité ATPase des membranes des cellules du coton. Le rôle du complexe
phytotoxique isolé de Verticillium dahliae semble augmenter la perméabilité des
108
cellules des feuilles et des racines des cotons sensibles et qui se traduit par la perte
des électrolytes à partir des cellules. Les pertes des ions Na+ et k+, mais pas celles
des ions Ca++, des tissus infectés suggèrent une altération du système spécifique du
transport des ions qui sont présents sur les membranes des cellules (Gour & Dube,
1985).
Le complexe PLPC, testé sur la germination du pollen, a réduit de manière
significative la germination et la croissance du tube pollinique des grains de pollen
des pommes de terre sensibles à Verticillium mais pas ceux des génotypes
résistants (Orenstein et al., 1994). Ce biotest permet d’une part de tester
l’agressivité du Verticillium par le biais de son complexe toxique et d’autre part, de
servir comme moyen de sélection des variétés résistantes avant la pollinisation des
pommes de terre.
La toxinogénèse des champignons dépend de facteurs génétiques et de conditions
liées au substrat et à l’environnement comme la température, le pH et l’humidité.
Les variations de ces paramètres peuvent fortement affecter d’une part, la
croissance fongique et d’autre part, modifier la production de mycotoxines
(Moreau, 1974).
A la lumière de ces données, nous nous sommes demandés si la faculté de produire
des toxines par Verticillium serait affectée par les changements de la concentration
saline du milieu. Dans cette optique, nous avons étudié in vitro l’effet de l’apport
du NaCl sur la toxinogénèse de l’isolat P80 de Verticillium afin de mieux
comprendre les interactions du milieu riche en sel avec les propriétés
physiologiques du champignon pour l’exercice de son pouvoir pathogène.
A. Matériel et méthodes
1. Préparation des filtrats de culture de l’isolat P80 de Verticillium
Des fioles contenant 100ml de milieu Czapeck enrichi en NaCl aux concentrations
de 0 ; 2 ; 4 ; 6 ; et 8 g/l sont ensemencées avec 1 ml d’une suspension de spores à
10
6
spores/ml obtenue à partir de pré-cultures de l’isolat P80 âgées de 4 jours.
Après trois semaines d’incubation à l’obscurité et à 24°C, les cultures sont filtrées
sur mousseline pour éliminer le mycélium. Les spores sont éliminées par filtration
109
sous vide sur filtre millipore à 0.22µ. Les cinq filtrats bruts ainsi obtenus sont prêts
pour les tests de toxicité.
2. Mise en évidence de la toxicité des filtrats de culture de
Verticillium par des tests biologiques
Deux tests ont été utilisés pour évaluer la toxicité des filtrats de culture de
Verticillium. La méthode a été inspirée de celle mise au point par Payen et al.,
(1983) utilisée pour détecter les moisissures toxinogènes. Ces tests consistent à
estimer la toxicité des filtrats de culture du champignon par l’inhibition de la
croissance racinaire des graines en germination (test graine) et du développement
des plantes entières (test plante).
2.1. Test graine
2.1.1. Choix des espèces végétales
La toxinogénèse de l’isolat P80 cultivé sous différents régimes salins a été testée
sur des graines appartenant à deux espèces végétales :
- la tomate, (Lycopersicum esculentum Mill) var Marmande Claudia, plante hôte
sensible au Verticillium
- le cresson (Lepidum sativum) var alénois, dont la germination est très rapide et
constitue un test sensible pour la mise en évidence des mycotoxines ( Samane et
al., 1991). Les graines germent au bout de 24 heures en présence d’eau distillée.
2.1.2. Action des filtrats de culture sur la croissance
racinaire des graines en germination
Les graines à tester sont stérilisées et mises à germer selon le même protocole
décrit au chapitre I. Après la sortie de la radicule, des graines d’apparence
homogène sont sélectionnées et déposées sur deux couches de papier filtre imbibé
par les différents filtrats de culture à raison de 10 graines par boite de Pétri. Trois
boites sont prévues par traitement salin. Les graines témoins sont imbibées de
solution saline de même concentration que les filtrats de culture. Les boites sont
mises à incuber à l’obscurité et à 24 ± 1°C. La longueur des racines est mesurée 72
110
heures plus tard. L’effet des filtrats de culture est estimé par le pourcentage
d’inhibition de la croissance racinaire calculé comme suit :
% ICR = Lte – Ltr x 100
Lte
Lte : accroissement moyen des radicelles témoins
Ltr : accroissement moyen des radicelles traitées
2.2. Test plante entière
Les plantes de tomate ou d’aubergine âgées de trois semaines et arrivées au stade
premières vraies feuilles sont délicatement déterrées de la pépinière et réparties en
cinq lots de 15 plantes. Chaque lot reçoit un traitement par un des 5 filtrats de
culture dont l’obtention est décrite précédemment. Le traitement des plantes
consiste en un trempage des racines pendant 30 minutes dans le filtrat. Les plantes
sont ensuite repiquées dans des pots de sable de 450 cm3 (3 plantes par pot) et
arrosées au niveau du collet avec 10ml du même filtrat de culture. Les plantes
témoins subissent le même traitement ; des solutions salines remplacent les filtrats
de culture. Les plantes sont placées dans une chambre de culture et arrosées
régulièrement avec une solution nutritive normale sans sel. La croissance des
plantes est estimée par la mesure de l’épicotyle après 6 semaines de culture.
B. Résultats
1. Effet du NaCl sur la phytotoxicité des filtrats de culture de l’isolat
P80 de Verticillium sur la croissance racinaire de deux espèces
végétales
1.1. Manifestation sur la tomate
Les graines de tomate pré-germées et soumises à l’action du filtrat de culture de
l’isolat P80 développé sans sel montrent une réduction de la croissance de leur
racine par rapport aux témoins traités avec de l’eau distillée stérile (figure 28).
Cette réduction est de l’ordre de 53.16 %.
111
Les différents filtrats de culture, obtenus après développement du champignon sur
milieux enrichis en NaCl, provoquent une réduction sévère de la croissance
racinaire, déficit d’autant plus important que la concentration en sel est élevée. Le
pourcentage d’inhibition de la croissance atteint 72.77 % sous l’action du filtrat de
culture du pathogène ayant été soumis à 8g/l de NaCl.
Rappelons que pour chaque traitement, la croissance racinaire des graines en
germination soumises à l’action des différents filtrats de culture est comparée à
celle de leurs témoins respectifs traités par la même concentration saline ; l’eau
distillée remplaçant le filtrat de culture. Le trouble de la croissance dans ce cas est
dû à la présence de substances inhibitrices excrétées par le champignon au cours
de son incubation.
1.2. Manifestation sur le cresson
En absence de sel, les racines du cresson se montrent sensibles à l’action du filtrat
de culture de l’isolat P80 de Verticillium. L’inhibition de la croissance racinaire est
de 39.65% (figure 29). Cependant, les filtrats de culture du champignon développé
sur milieux enrichis en NaCl induisent des réductions très importantes de la
longueur des racines. L’inhibition induite par le filtrat à 2g/l ne diffère pas
statistiquement de celle du filtrat sans sel. Mais à partir de 4g/l de NaCl, la toxicité
des filtrats de culture augmente brutalement ; la croissance des racines est
totalement inhibée par le filtrat de culture à 8g/l par rapport aux témoins soumis
au même degré de salinité.
2. Effet du NaCl sur la phytotoxicité des filtrats de culture de l’isolat
P80 de Verticillium sur la croissance végétative de deux plantes
hôtes
2.1. Manifestation sur la tomate Claudia
L’action toxique des filtrats de culture de Verticillium développé sur milieux à
différentes concentrations de sel s’est manifestée par une réduction de la taille des
plantes estimée six semaines après traitement.
112
Figure 28. Effet de la salinité sur la phytotoxicité des filtrats
de culture de Verticillium estimée par l'inhibition de la
croissance racinaire des plantules de tomate
Inhibition de la croissance racinaire en
%
100
90
80
70
60
50
40
30
0
2
4
6
8
Concentration en NaCl des filtrats de culture en g/l
Figure 29. Effet de la salinité sur la phytotoxicité des filtrats
de culture de Verticillium estimée par l'inhibition de la
croissance racinaire des plantules de cresson
Inhibition de la croissance racinaire en
%
120
100
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
Concentration en NaCl des filtrats de culture en g/l
113
Le filtrat de culture du champignon développé sans sel provoque chez les plantes
traitées un déficit de la croissance d’environ 30% (figure 30). Le traitement des
plantes par les différents filtrats de culture du champignon développé sur milieux
de plus en plus enrichis en sel entraîne un rabougrissement des plantes au fur et à
mesure que la salinité du milieu augmente sauf pour le filtrat de culture à 2g/l de
NaCl pour lequel le déficit de la croissance observé ne diffère pas statistiquement
de celui du filtrat dépourvu de sel. L’inhibition de la croissance atteint 58.29% chez
les plantes traitées par le filtrat à 8g/l. Il faut signaler que le trempage des racines
témoins dans l’eau distillée additionnée des mêmes concentrations de sel que les
filtrats de culture n’entraîne pas d’altération de la croissance. Ainsi, le déficit de la
croissance observé ne peut être dû à la salinité mais uniquement aux substances
secrétées par le champignon dans le milieu de culture.
2.2. Manifestation sur l’aubergine Reina negra
La phytotoxicité des filtrats de culture de l’isolat P80 d’origine de tomate a été
testée sur une plante d’une espèce différente de l’hôte habituel.
Les résultats de l’effet de la salinité sur la toxicité des filtrats de culture sur la
croissance des aubergines sont reportés sur la figure 31. Il apparaît clairement que
les filtrats de culture de l’isolat P80 développé sans sel ou en présence de 2 et 4g/l
de NaCl ne montrent pas d’action toxique sur la croissance des plantes
d’aubergine. En effet, la taille des plantes traitées par ces filtrats ne diffère pas
statistiquement de celle des témoins traités uniquement avec les solutions salines.
Cependant, les filtrats de culture du champignon développé sur milieux enrichis
avec 6 et 8g/l de sel, provoquent un déficit de la croissance des plantes traitées de
26.42 % et 41.89 % respectivement pour les filtrats à 6 et 8g/l de sel par rapport
aux témoins de contrôle.
C. Discussion et conclusion
Les résultats présentés confirment les travaux antérieurs de nombreux auteurs qui
ont montré que Verticillium produit des métabolites toxiques dans le milieu de
114
Figure 30. Effet de la salinité sur la phytotoxicité des filtrats
de culture de Verticillium estimée par l'inhibition de la
taille des plantes entières de tomate (après six semaines)
Inhibition de la taille en %
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
Concentration en NaCl des filtrats de culture en g/l
Figure31. Influencedelasalinitésurlaphytotoxicitédesfiltratsde
culturedeVerticilliumestiméeparl'inhibitiondelatailledesplantes
d'aubergine(aprèssixsemaines)
Inhibition de la taille en %
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
ConcentrationenNaCl desfiltratsdecultureeng/l
8
115
culture ( Chaib, 1987 ; Keen & Long, 1972 ; Cronshaw & Pegg, 1976 ; Nachmias et
al., (1982).
La toxicité des filtrats de culture de l’isolat P80 de Verticillium, facilement mise en
évidence par le biais de biotests, semble être influencée par la composition en sel
du milieu de culture. En effet, nos résultats montrent que l’apport de NaCl dans le
milieu augmente la phytotoxicité des filtrats de culture du champignon. Ces
résultats sont confirmés par l’augmentation de l’inhibition de l’élongation des
racines des graines pré-germées de tomate avec la salinité des milieux de culture
du pathogène ; l’action toxique est d’autant plus importante que la concentration
en sel est élevée.
Par ailleurs, la plus grande toxicité de l’isolat de Verticillium développé en
présence de sel n’est pas limitée aux plantules de tomate mais agit aussi sur une
plante non hôte ; le cresson. Les graines de cette plante sont souvent utilisées pour
la détection de mycotoxines chez les moisissures (Payen et al., 1983 ; Lemrani,
1992). Ces graines se sont montrées plus sensibles à l’action des toxines des
différents filtrats de culture que les graines de tomate.
D’autres biotests réalisés sur des plantes entières de tomate et d’aubergine ont
confirmé les résultats des tests graines. En effet, l’action toxique des différents
filtrats de culture appliqués sur les racines des plantes avant la transplantation en
pot s’est manifestée par une réduction de la croissance des plantes
particulièrement celles traitées par les filtrats du champignon développé en
présence d’une salinité importante.
L’influence de la salinité sur la physiologie du parasite se manifeste donc, non
seulement par une stimulation de la croissance et de la reproduction comme cela a
été décrit au premier chapitre, mais aussi par la stimulation de la production de
mycotoxines et/ou de leur action toxique.
Le rôle joué par les toxines émises par Verticillium est maintenant bien apprécié.
Elles sont impliquées dans la pathogénèse du champignon et constituent une
composante principale de l’agressivité (Keen & Long, 1972 ; Chaïb, 1987 ; Meyer et
al., 1994). D’après les résultats obtenus in vitro, on peut supposer que la présence
de sel in vivo pourrait augmenter les capacités pathogéniques du parasite. Ce
116
dernier vit dans la sève dont la composition minérale change avec les changements
de la concentration saline du milieu extérieur. Ainsi la richesse de la sève en sel des
plantes soumises au stress salin pourrait constituer un milieu favorable pour la
production de mycotoxines et/ou intervenir sur leur mode d’action à l’intérieur de
la plante hôte. Si une telle situation est réalisée, l’action pathogène ne pourra
qu’être amplifiée.
II. Influence de la salinité sur l’activité des enzymes
pectocellulosiques produites in vitro par Verticillium alboatrum
Introduction
De nombreux champignons phytopathogènes sont connus pour leur production
d’enzymes capables de dégrader les polysaccharides des parois cellulaires de leurs
plantes hôtes. Les cellulases et les pectinases seraient impliquées dans les maladies
des plantes et dans le processus de la dégradation des tissus durant la colonisation
par l’agent pathogène (Wood, 1960 ; Cooper & Wood, 1975).
Verticillium albo-atrum produit une gamme de polysaccharidases qui dégradent
les parois cellulaires des tissus vasculaires de la tomate (Cooper et al ; 1978 ;
Cooper & Wood, 1980 ; Durand & Cooper, 1988). Une augmentation de l’activité
endopectine lyase dans les vaisseaux conducteurs des tomates sensibles a été
enregistrée trois jours après l’infection par V. albo-atrum et bien avant l’apparition
de symptômes (Cooper & Wood, 1980).
Dans le processus de pénétration des champignons pathogènes à travers la paroi
cellulaire, un rôle essentiel est également joué par les enzymes hydrolysant les
hémicelluloses et les celluloses. En effet, Russel, (1975) a montré que l’infection
des tomates avec V. albo-atrum entraîne une augmentation de l’activité
cellulolytique aussi bien chez les plantes sensibles que résistantes. Cet auteur
stipule que les cellulases sont produites par les plantes mais aussi en grande partie
par le pathogène.
117
La production des polysaccharidases par les champignons dépend de la nature de
la source de carbone du milieu (Gupta & Heale, 1971 ; Bahkali, 1995). Les études
menées in vitro par Gupta & Heale, (1971) ont montré que parmi le grand nombre
de sucres et de polysaccharides, seul les substrats à base de cellulose et de
cellobiose peuvent induire la production de cellulases. Selon le même auteur,
l’activité cellulase peut être convenablement étudiée en utilisant plusieurs formes
de cellulose soluble et incluant les sels de Na+ du carboxyméthylcellulose comme
substrat.
Bateman, (1969) a rapporté que l’environnement où se développent certains
champignons phytopathogènes influe sur le type et la quantité d’enzymes
pectocellulosiques qu’ils produisent.
Toujours dans le sens d’expliquer la plus grande sensibilité des tomates à la
verticilliose sous stress salin, nous nous sommes demandés si la sévérité de la
maladie ne serait pas le résultat d’une modification de l’activité des enzymes du
pathogène sous l’effet de la salinité du milieu ?
Dans cet esprit, nous avons étudié l’impact de la salinité sur la production in vitro
des enzymes cellulolytiques par deux souches de Verticillium qui diffèrent par leur
pouvoir pathogène vis-à-vis de la tomate.
A. Matériel et méthodes
1. Les isolats de Verticillium utilisés
Deux isolats de Verticillium albo-atrum, d’origine tomate, P80 et P3A,
respectivement pathogène et non pathogène sur tomate, Marmande Claudia, ont
été utilisés. L’origine et les caractéristiques de ces deux isolats ont été décrites au
chapitre précédent.
2. Analyse de l’activité carboxyméthylcellulase
2.1. Production de l’enzyme
118
La carboxyméthylcellulase est la principale enzyme cellulolytique produite par les
isolats de Verticillium d’origine tomate (El Aissami et al., 1998). Elle a été retenue
pour étudier l’effet de la salinité sur l’activité cellulase de Verticillium.
A partir d’une culture des deux isolats de Verticillium âgée de 15 jours menée sur
milieu PDA, des rondelles de 3 mm de diamètre sont découpées sur le pourtour des
thalles et déposées au centre de boîtes de Pétri (9cm) contenant 25 ml de milieu
(CMC) approprié à la production de l’enzyme, formé de (en g/l ): KH2PO4,1 ;
NaCO3, 2 ; KCl, 0,5 ; MgSO4, 0,5 ; Agar 20. La carboxyméthylcellulose (2%, p/v)
est utilisée comme seule source de carbone ; le saccharose ou le glucose
n’induisant pas de production optimale de cellulases chez Verticillium ( Gupta &
Heale, 1971 ; Bahkali, 1995). Le sel est ajouté au milieu de culture aux
concentrations de 0 ; 4 ; 8 ; 12 et 16 g/l. Le pH est de 5. Les cultures sont mises à
incuber à 24 ± 1°C à l’obscurité.
2.2. Révélation
L’activité enzymatique est mise en évidence par un test quantitatif rapide inspiré
de la méthode des cup-plate (Mann, 1962). Il est basé sur la diffusion radiale de
l’enzyme libérée par le champignon dans le substrat gélosé. La révélation est
réalisée
sur
les
cultures
après
12
jours
d’incubation.
Les
diamètres
perpendiculaires de chaque colonie sont mesurés pour l’estimation de la croissance
mycélienne des deux isolats sur milieu CMC. Les boîtes portant les cultures sont
ensuite inondées d’une solution aqueuse de rouge Congo à 0,5% pendant 30
minutes sous agitation à température ambiante. Elles sont ensuite rincées par trois
bains successifs d’une solution de NaCl (1M) d’une durée de 15 minutes chacun.
Un dernier et 4ème bain de NaCl dure une nuit. L’activité enzymatique est mise en
évidence par la présence d’un halo clair ou très foncé qui apparaît autour de la
culture fortement colorée en rouge . Elle est estimée par la mesure de la zone
d’activité ; différence entre le diamètre de la zone claire et le diamètre de la
colonie.
Les valeurs obtenues sont la moyenne de huit répétitions. Les résultats sont
comparés par l’analyse des variances au seuil de probabilité de 5% selon le test de
Student.
119
3. Analyse de l’activité pectine méthyle estérase
3.1. Production de l’enzyme
Le champignon est mis en culture dans des fioles de 250ml contenant 100ml de
milieu Czapeck liquide modifié : le saccharose est remplacé par de la pectine
comme seule source de carbone et le milieu est enrichi en vitamine B1 à raison de
375µg par litre. Le traitement par le sel consiste en l’addition au milieu de culture
de 4 ;8 ;12 et 16g/l de NaCl. Le pH final est ajusté à 5.9 par addition de NaOH.
Après autoclavage, chaque fiole est ensemencée par 5.104 spores de Verticillium
prélevée d’une suspension de spores fraîchement préparée. Après deux semaines
d’incubation à 24°C, les cultures sont filtrées selon le protocole décrit
précédemment. Les filtrats de culture servent immédiatement au dosage de
l’activité enzymatique.
3.2. Révélation
La révélation de l’enzyme est faite dans des boites de Pétri contenant 30ml du
milieu suivant :
- Pectine (pectin apple)
- Agar noble
0.5 %
2%
- Tampon citrate phosphate 0.05 M, pH 6.5
L’enzyme est dosée selon la technique des cup-late ( Mann, 1962). On dépose 50µl
de chaque filtrat de culture dans des puits creusés à l’emporte pièce dans des
boites de Pétri contenant le milieu gélosé de révélation de l’enzyme à raison de 3
puits par boite.
Après 16 heures d’incubation à 30°C les boites sont submergées d’acide malique
0.1 M et mises en agitation pendant une heure à la température ambiante. Les
boites sont ensuite rincées et inondées avec une solution aqueuse de rouge de
ruthénium à 0.02 %. Après une nuit, un halo clair apparaît autour des puits et
indique la présence de la pectine méthyle estérase.
120
B. Résultats
1. Croissance de deux isolats de Verticillium développés sur milieu
CMC enrichi en NaCl
Les deux isolats P80 et P3A, cultivés sur milieu CMC enrichi en sel, semblent
tolérer des concentrations importantes de sel à en juger par les valeurs des
diamètres des colonies à 16 g/l de NaCl (figure 32). On note cependant une légère
réduction de la croissance mycélienne avec l’augmentation de la salinité par
rapport aux témoins respectifs cultivés sur le même milieu sans sel. Cette baisse du
développement ne dépasse guère 30% et 24% respectivement pour les isolats
pathogène P80 et non pathogène P3A à la concentration de 16 g/l de NaCl.
2. Effet de la salinité sur l’activité carboxyméthylcellulase
L’activité carboxyméthylcellulase a été mise en évidence par la technique du cupplate. Les résultats sont estimés par la mesure de la zone d’activité (Planche 8) et
sont reportés sur la figure 33. En absence de sel, les deux isolats P80 et P3A de
Verticillium respectivement pathogène et non pathogène sur tomate Marmande
présentent une activité carboxyméthylcellulase similaire. Avec l’augmentation de
la salinité du milieu, l’activité de l’enzyme croît progressivement. Pour les
concentrations comprises entre 4 et 12g/l, l’isolat P3A montre une activité
carboxyméthylcellulase nettement plus élevée que celle de l’isolat P80. Sous ces
conditions salines, P3A semble plus efficient pour la production de l’enzyme in
vitro. A 16 g/l, l’activité cellulase se stabilise pour l’isolat P3A et continue
d’augmenter pour l’isolat pathogène P80 pour atteindre celle de P3A ; les deux
valeurs de l’activité sont semblables et dépassent de 4 fois celles de l’activité de
l’enzyme en absence de sel.
3. Effet de la salinité sur l’activité pectine méthyle estérase
Les résultats des tests ont tous été négatifs aussi bien en absence qu’en présence de
NaCl. Les deux isolats de Verticillium testés ne présentent pas d’activité pectinase
dans nos conditions de culture.
121
Figure 32. Effet de la salinité sur la croissance mycélienne de
deux isolats de Verticillium développés sur milieu CMC
après 12 jours d'incubation
Diamètre des cultures en mm
40
35
30
25
20
15
10
Isolat P80
5
Isolat P3A
0
0
4
8
12
16
Concentration en NaCl en g/l
Activité carboxyméthylcellulase (en
mm)
Figure 33. Effet de la salinité sur l'activité
carboxyméthylcellulase estimée par la mesure de la zone
d'activité en mm de deux isolats de Verticillium développés
sur milieu CMC
20
18
16
14
12
10
8
6
Isolat P80
4
Isolat P3A
2
0
0
4
8
12
Concentration en NaCl en g/l
16
122
Planche 8. Effet de la salinité du milieu CMC sur l’activité
carboxyméthylcellulase de l’isolat P80 de Verticillium estimée par
l’halo clair apparaissant autour de la colonie
0 : culture de Verticillium sur milieu dépouvu de NaCl
8 : culture de Verticillium sur milieu enrichi avec 8g/l de NaCl
123
C. Conclusion et discussion
Le rôle des enzymes cellulolytiques dans la détermination de l’agressivité des
isolats de Verticillium a fait l’objet de plusieurs études (Mussel, 1973 ; Russel,
1975 ; Balandina et al., 1976 ; El Aissami, 1998 ; Regragui et al., 2003). Nos
résultats sur l’activité cellulolytique du Verticillium montrent qu’en absence de
stress salin, les isolats P80 et P3A respectivement pathogène et non pathogène sur
tomate sont capables de produire in vitro la carboxyméthylcellulase dans le
milieu de culture CMC gélosé contenant la carboxyméthylcellulose comme seule
source de carbone. En présence de sel, une augmentation nette de l’activité
carboxyméthylcellulase est enregistrée avec les concentrations croissantes de NaCl
du milieu avec un maximum à 16 g/l. Notons toutefois que l’activité enzymatique
de l’isolat non pathogène P3A est supérieure à celle de l’isolat pathogène P80 pour
les concentrations moyennes de NaCl.
La salinité du milieu de culture semble donc stimuler la production de
carboxyméthylcellulases in vitro chez les deux isolats de Verticillium. L’isolat P3A
semble plus efficient pour la production de l’enzyme dans nos conditions
expérimentales.
La
salinité
peut
affecter
différemment
l’aptitude
des
champignons
phytopathogènes à produire les enzymes cellulolytiques in vitro (El Abyad et al.,
1992). Ainsi Sclerotium rolfsii et Rhizoctonia solani, deux champignons du sol
pathogènes sur la betterave, voient leur aptitude à dégrader les parois cellulaires
de leur hôte perturbée par le sel in vitro. Chez S. rolfsii, l’activité enzymatique
augmente avec l’augmentation de la salinité du milieu, ce qui concorde avec nos
résultats sur Verticillium, alors que celle de R. solani diminue.
L’activité enzymatique de Verticillium peut être également perturbée à la suite
d’un stress autre que la salinité. Ainsi, l’activité caséine kinase de Verticillium
dahliae, parasite du coton, peut disparaître sous l’effet d’un choc thermique
(Vasiliev et al., 1992).
L’augmentation des performances cellulolytiques des deux isolats de Verticillium
in vitro en présence de sel laisse prévoir une augmentation de la pathogénèse du
124
parasite in vivo en conditions salines. L’étude de l’effet du sel sur la variabilité du
pouvoir pathogène de Verticillium présentée au deuxième chapitre a bien révélé
une augmentation des pouvoirs parasitaire et pathogène de l’isolat P80 sur la
tomate mais aussi sur d’autres plantes qui ne lui sont pas spécifiques comme
l’aubergine et la luzerne. De même, cette étude a montré l’expression de nouvelles
aptitudes pathogènes par l’isolat P3A connu pour sa faible agressivité envers la
tomate. Ces variations dans l’expression du pouvoir pathogène induites par le sel
peuvent être expliquées, en partie, par l’augmentation des activités cellulolytiques
du parasite touchant aussi bien la souche virulente qu’avirulente. Cette aptitude
acquise favoriserait l’invasion et la colonisation des cellules hôtes par le parasite.
Cette interprétation peut être appuyée par les travaux de Mussel (1973). Cet auteur
a montré qu’il y a une corrélation positive entre l’activité enzymatique des isolats
de Verticillium et leur agressivité vis-à-vis du coton. Dans le même sens, Witney et
al., (1972) ont déduit que la carboxyméthylcellulase est d’autant produite par
Verticillium albo-atrum que l’infection de la luzerne est forte.
III. Influence de la salinité sur l’activité phénoloxydasique de
Verticillium albo-atrum
Introduction
Les phénoloxydases (Pox) sont des enzymes largement distribuées dans les
végétaux supérieurs et les micro-organismes (Bollag & Leonowicz, 1984). Elles
comprennent trois types d’enzymes ; les laccases, les péroxydases et les
tyrosinases. Elles jouent un rôle important dans la biodégradation de la lignine et
des composés phénoliques qui en dérivent (Eriksson et al., 1990), d’où l’intérêt de
leur utilisation dans la délignification des éléments du bois comme alternative aux
procédés physico-chimiques coûteux et polluants.
La lignine, composant des parois cellulaires des végétaux supérieurs est l’un des
polymères les plus importants à la surface de la terre. En comparaison avec la
cellulose, la lignine n’est dégradée que par un nombre réduit de microorganismes.
La biodégradation des lignines par les bactéries a été surtout étudiée chez les
Actinomycètes et principalement le genre Streptomyces (Crawford et al., 1982).
125
Concernant les champignons, ce sont les Basidiomycètes de la pourriture blanche
qui sont considérés comme les organismes lignilolytiques les plus performants et
le mieux exploités (Kirk & Shimada, 1985). Seulement, la biodégradation des
lignines par ces champignons reste un phénomène lent.
Rahouti et al., (1995) ont testé l’activité phénoloxydasique d’une collection de 1059
Micromycètes et ont rapporté que 57% des souches sont capables de produire des
Pox de différents types et à des taux variables. Selon les mêmes auteurs, la
production de Pox , très hétérogène à l’intérieur des groupes taxonomiques, est
commune aux Sphaeropsidales, Mélancoliales, Basidiomycètes, Demathiaceae,
Tuberulariales, Stilbellales et Agromycètes, alors que les levures et les Zygomycètes
ont une faible activité phénoloxydasique.
Les champignons du genre Verticillium
ont une activité phénoloxydasique
variable selon les espèces (Rahouti, 1995). Les espèces V. lamellicola et V. lecanii
seraient les plus performantes.
N’ayant pas de données sur l’activité phénoloxydasique de l’espèce V. albo-atrum
et vu l’importance de la biodégradation des lignines dans le cycle du carbone, on se
propose d’étudier d’une part l’activité phénoloxydasique de deux souches de
Verticillium d’origine tomate qui diffèrent par leur morphologie et par leur pouvoir
pathogène, et d’autre part, d’examiner l’impact de la salinité du milieu sur la
production de Pox.
A. Matériel et méthodes
1. Les souches fongiques
Deux souches de Verticillium ont été testées :
- La souche P80 de phénotype sauvage dont les caractéristiques sont
décrites au chapitre précédent
- La souche P1 ; souche hyaline obtenue après vieillissement d’un isolat
sauvage de Verticillium (Lahlou, 1983). Ce variant a perdu la capacité de produire
des microsclérotes mais aussi son pouvoir pathogène vis-à-vis de la tomate
Marmande sensible.
126
Les cultures sont conduites en boites de Pétri sur milieu gélosé à base d’extrait de
malt et sont incubées à l’obscurité et à 24±1°C.
2. Détection des phénoloxydases.
1.2. Les réactifs
La détection des Pox a été réalisée selon la méthode de Käärik, (1965), et de Ander
& Eriksson (1976) en utilisant des solutions alcooliques (0.1M dans l’éthanol à 95°)
de l’acide gallique AG, du gaïacol GUA et de l’alpha-naphtol (NPH) comme
substrat des Pox.
La production des laccases a été recherchée selon la technique de Harkin & Obst
(1973) et de Harkin et al., (1974) : la syringaldazine SYR , en solution à 0.1% dans
l’éthanol à 95° est utilisée pour révéler la présence de laccases. En absence de ces
dernières, l’addition d’une solution aqueuse de H2O2 à 0.03% permet la détection
des peroxydases.
2.2. Révélations
Des expériences préliminaires ont montré que la détection des Pox était meilleure
sur un étalement de spores que sur une colonie obtenue à partir d’une bouture.
Sur des étalements de spores des deux souches de Verticillium, âgés de 4 jours ou
de 12 jours selon le test, on dépose 4 gouttes d’un des réactifs à l’aide d’une pipette
Pasteur. La présence de Pox est révélée par l’apparition d’une coloration à l’endroit
du dépôt. La lecture est faite 24 heures après le dépôt sauf pour la syringaldazine
où la lecture est effectuée après 20 minutes. Des tests témoins sont réalisés afin de
vérifier qu’il n’y ait pas de fausses réactions positives. Ils consistent à déposer
quelques gouttes d’éthanol à 95° ou de la solution aqueuse de H2O2 sur la culture.
B. Résultats
1. Influence de la salinité sur la cinétique de la production des Pox
La détection des Pox a été répétée tous les jours et durant deux semaines. Les
réactions aux différents substrats sont reportées sur le tableau 7.
127
1.1. La souche sauvage P 80
L’activité phénoloxydase apparaît dès le 4ème jour de culture avec une réaction
faiblement positive avec l’acide gallique et le NPH. Ce n’est qu’au 7ème jour de
culture que la réaction au gaïacol devient positive (tableau 7A).
Au 11ème jour, tous les réactifs donnent des réactions colorées y compris la
syringaldazine.
En fin d’expérience, les résultats montrent que la souche P80 produit des Pox,
principalement des laccases.
1.2. La souche hyaline P1
Chez cette souche hyaline de Verticillium la production de Pox apparaît plutôt que
chez la souche sauvage et se manifeste dès le 3ème jour de culture (tableau 7B). De
même,
la
réaction
à
la
syringaldazine
devient
positive
le
8ème
jour
comparativement à celle de la souche P 80 qui apparaît le 11ème jour de culture. En
général, la production de laccases par la souche hyaline semble plus importante
que celle obtenue par la souche sauvage.
2. Influence de la salinité sur l’activité phénoloxydasique globale de
Verticillium
Les tests ont été réalisés selon le même protocole que précédemment. Les milieux
de culture ayant été enrichis avec NaCl aux concentrations suivantes: 0; 1 ; 2 ; 3 ; 4
g/l. Les résultats sont reportés sur le tableau 8. Ils montrent que l’activité
phénoloxydasique de la souche P80 dépend de la concentration saline du milieu.
En présence de 1g de NaCl par litre, la production de Pox est semblable à celle des
témoins. Dès que la concentration atteint 2g/l, l’activité Pox devient réduite ; elle
est faiblement positive avec l’AG et le GUA et négative pour les deux autres
réactifs. Pour les concentrations supérieures à 3g/l, toutes les réactions sont
négatives ; le champignon ne produit plus de laccases en comparaison avec le
témoin sans sel.
128
Tableau 7. Cinétique de la production des phénoloxydases par deux
souches de Verticillium albo-atrum.
7 A. Souche sauvage P80
Réactifs
AG
GUA
NPH
SYR
1 jour
-
-
-
-
2 jours
-
-
-
-
3 jours
-
-
-
-
4 jours
+
-
+
-
5 jours
++
+
+
-
Temps
6 jours
+++
++
++
-
d’incubation
7 jours
+++
++
++
-
8 jours
+++
++
++
-
9 jours
+++
++
++
-
10 jours
+++
++
++
-
11 jours
+++
++
++
+
12 jours
+++
++
++
+
13 jours
+++
++
++
+
14 jours
+++
++
++
+
(-) : réaction négative (+) : réaction positive
AG : Acide gallique
GUA : gaïacol
NPH: alpha-naphtol
SYR : syringaldazine
129
7 B. Souche hyaline P1.
Réactifs
AG
GUA
NPH
SYR
1 jour
-
-
-
-
2 jours
-
-
-
-
3 jours
++
+
-
-
4 jours
+++
+
++
-
5 jours
+++
+
++
-
Temps
6 jours
+++
++
++
-
d’incubation
7 jours
+++
++
+++
+
8 jours
+++
++
+++
+
9 jours
+++
++
+++
+
10 jours
+++
++
+++
++
11 jours
+++
+++
+++
++
12 jours
+++
+++
+++
++
13 jours
+++
+++
+++
++
14 jours
+++
+++
+++
++
(-) : réaction négative (+) : réaction positive
AG : Acide gallique
GUA : gaïacol
NPH: alpha-naphtol
SYR : syringaldazine
130
Tableau 8. Activité phenoloxydasique de l’isolat P80 de Verticillium en
fonction de la salinité du milieu
NaCl en g/l
Réactifs
AG
GUA
NPH
SYR
H2O2
0
+++
++
++
+
-
1
++
++
++
+
-
2
+
+
-
-
-
3
+
+
-
-
-
4
-
-
-
-
-
(-) : réaction négative (+) : réaction positive
AG : Acide gallique, GUA : gaïacol, NPH: alpha-naphtol, SYR : syringaldazine,
H2O2 : peroxyde d’hydrogène
C. Discussion et conclusion
La détection des Pox in vitro sur une culture de Verticillium albo-atrum a révélé la
capacité de cette espèce à produire ces enzymes. Cette aptitude semble plus
performante chez la souche hyaline hypovirulente par rapport à la souche sauvage
virulente. Ce résultat s’ajoute aux travaux de Rahouti et al., (1995) qui ont mis en
évidence une activité phénoloxydasique chez d’autres espèces de Verticillium.
La principale Pox produite étant la laccase. Ce type d’enzyme est spécifiquement
détecté par la syringaldazine mais aussi par le gaïacol et l’acide gallique considérés
comme des substrats très sensibles aux trois phénoloxydases.
En revanche, Verticillium albo-atrum ne produit pas de peroxydases ni de
tyrosinases.
L’activité phénoloxydasique de l’isolat P80 de Verticillium albo-atrum semble être
modifiée par la salinité du milieu. L’addition de très faibles quantités de sel dans le
milieu ne modifie pas la production de laccases, mais l’augmentation de la salinité
au-delà de 3g/l annule complètement l’activité de l’enzyme.
131
Le chlorure de sodium paraît avoir ainsi un effet négatif sur l’activité métabolique
de Verticillium albo-atrum vis-à-vis de la lignine. La sensibilité des Pox au sel
serait due à un effet direct des ions sur l’activité des laccases et/ou un effet du sel
sur l’induction de ces enzymes.
Les conséquences de l’inactivation des Pox en présence de sel peuvent se
manifester sur la vie saprophytique de Verticillium. En effet, ce champignon est un
parasite hemibiotrophe ou parasite « facultatif » qui passe successivement d’une
phase de vie parasitaire à une phase de vie saprophytique. Les débris végétaux
après récolte, les cellules et tissus tués par l’action du champignon sont dégradés et
servent de base nutritive que l’agent pathogène va exploiter au cours de sa vie
saprophytique et sur laquelle il va se multiplier en formant des conidies et des
microsclérotes (Lahlou, 1983). Si les conditions du milieu sont défavorables, la vie
saprophytique peut être réduite, seuls les microsclérotes résistent et permettent la
conservation du champignon dans le sol. Rien ne nous empêche de penser que
l’augmentation de la salinité du sol puisse ralentir la dégradation de la lignine des
parois cellulaires des débris végétaux par le champignon via une inhibition des
Pox et écourter par conséquent sa phase saprophytique. L’étude de l’influence du
sel sur la vie saprophytique du Verticilium dans le sol pourrait lever ce doute.
IV. Effet de la salinité du milieu sur le profil protéique de
l’isolat P80 de Verticillium albo-atrum.
Introduction
Les champignons du genre Verticillium sont des parasites vasculaires qui vivent et
se reproduisent à l’intérieur des vaisseaux du xylème de leurs plantes hôtes. Ils
sont donc soumis aux fluctuations de la composition chimique de la sève elle
même dépendante des variabilités du milieu nutritif extérieur. Nos précédents
travaux ont permis de mettre en évidence la tolérance de ces parasites à des
concentrations salines extrêmement élevées. La salinité stimule non seulement la
croissance et la sporulation de ces parasites mais aussi leurs capacités toxinogènes
et leurs performances cellulolytiques (Regragui et al., 2003). Ces deux fonctions
physiologiques déterminent une grande part de l’agressivité de l’agent pathogène.
132
L’influence du sel semble s’exercer sur la production de métabolites toxiques et
d’enzymes ayant une activité cellulolytique comme la carboxyméthylcellulase.
La salinité serait donc à l’origine de remaniements biochimiques qui touchent le
métabolisme des protéines chez cet agent pathogène. Pour contribuer à apporter
plus d’arguments aux modifications biochimiques des composantes de la
pathogénèse de Verticillium induites par la salinité, nous proposons de faire une
estimation des taux de protéines extracellulaires produites par l’agent pathogène
au cours de son incubation sur milieu salé et d’analyser leurs profils
électrophorétiques en fonction de la richesse du milieu en NaCl.
A. Matériel et méthodes
1. Concentration des protéines
Les filtrats de culture du champignon développé sur milieu Czapeck additionné de
o ; 2 ; 4 ; 6 et 8g/l de NaCl subissent une précipitation à l’éthanol. Cette opération
consiste à traiter un volume du filtrat avec deux volumes d’éthanol absolu. La
précipitation dure deux heures et le précipité est récupéré après centrifugation à
10000 rpm pendant 15 minutes. Le culot obtenu est rincé avec du tampon TrisEDTA, pH 7.4 (Tris 10mM, EDTA 1mM). Il va servir au dosage des protéines et à la
séparation par électrophorèse.
2. Dosage des protéines
Les protéines sont dosées par la technique de Bradford (1976). Cette méthode
permet de doser de faibles quantités de protéines. Une gamme étalon (20 ; 40 ;
60 ; 80 ; 100 et 120µg) est préparée à partir d’une solution d’albumine sérique
bovine (BSA, 0.1mg/ml). Chaque dilution est préparée en duplicata.
Dans un tube à essai contenant 200µl de protéine standard (BSA) ou
d’échantillon , 1.8ml du réactif de Bradford au bleu de Coomassie sont ajoutés et
l’ensemble est bien mélangé au vortex. La coloration apparaît en quelques
secondes et reste stable pendant une heure. L’absorbance est lue à 595 nm après
cinq minutes. La quantité de protéines présente dans l’échantillon est déterminée
par extrapolation dans la courbe étalon et est exprimée en µg/ml.
133
3. Analyse des protéines par électrophorèse
La séparation des protéines fongiques est effectuée par électrophorèse sur gel
dénaturant de polyacrylamide, en utilisant le système discontinu en présence du
SDS (sodium dodecyl sulfate). Ce dernier déroule complètement les protéines en
détruisant leurs structures secondaires et tertiaires. Les protéines se comportent
comme des anions. Leur mobilité sous l’action d’un champs électrique est fonction
de leur taille.
3.1. Préparation des gels
Nous avons utilisé un gel de séparation à 10% d’acrylamide et un gel de
concentration à 5%. ( voir annexes).
3.2. Préparation des échantillons
Les échantillons de protéines sont traités avec un tampon de traitement des
échantillons (annexes) puis chauffés à 95°C pendant cinq minutes. Après
refroidissement, 20µl d’échantillons sont déposés dans les puits du gel. Les
échantillons sont conservés en aliquots de 0.5ml et mis au congélateur.
3.3. Migration
Après avoir déposé les échantillons dans les puits, les deux chambres de la cuve à
électrophorèse sont remplies de tampon d’électrophorèse (annexes) et la cuve est
connectée au générateur. La migration est effectuée sous tension de 200V. Le front
de migration est visualisé grâce au bromophénol ajouté à l’extrait.
3.4. Révélation
Après avoir retiré délicatement le gel, la coloration se fait selon les étapes
suivantes :
- Fixation : fixer 30 minutes dans la solution de fixation. Rincer cinq
minutes dans la solution de décoloration (éthanol 250ml- acide acétique 20ml- eau
distillée 730ml). On peut laisser le gel la nuit dans le fixateur et au frigo pour
coloration le lendemain.
134
- Coloration : le gel est trempé dans la solution de coloration (bleu de
Coomassie R 250 (1.15g- éthanol 250ml- acide acétique 40ml- eau distillée 710ml).
Laisser le gel 10 minutes à 60°C ou 1h à 1h.30 à température ambiante.
- Rinçage : 5 minutes dans la solution de décoloration usée
- Décoloration : 3 bains successifs de 2heures dans la solution de
décoloration. La décoloration est arrêtée lorsque le fond du gel n’est pratiquement
plus bleu.
- Conservation : tremper dans la solution de conservation (éthanol 100mlacide acétique 40ml- glycérol 100ml- eau distillée 760ml). Laisser sécher à l’abri
de la poussière. Pour conserver le gel pour une longue durée, le mettre entre deux
feuilles en plastique à 4°C.
3.5. Lecture des résultats
Les poids moléculaires des différentes protéines sont déterminés à partir de la
courbe log
10
PM (standard de PM) qui est une fonction de la mobilité
électrophorétique.
B. Résultats
1. Effet de la salinité sur le taux des protéines secrétées dans les
filtrats de culture par Verticillium.
Les résultats du dosage des protéines extracellulaires libérées après trois semaines
par l’isolat P80 dans le milieu de culture additionné de sel sont consignés sur le
tableau 9.
L’analyse des résultats montre que les filtrats bruts issus des cultures enrichies en
sel (2 à 6g/l) renferment plus de protéines que le filtrat brut témoin sans sel.
L’augmentation des quantités de protéines est faible en présence de 2 et 4g/l. Le
taux de protéines le plus important est contenu dans le filtrat à 6g/l de NaCl et qui
montre une augmentation de 102.10% par rapport au filtrat de contrôle.
Cependant l’apport de 8g/l dans le milieu de culture provoque une baisse de la
quantité de protéines extracellulaires par rapport aux autres concentrations de sel.
Néanmoins, le taux de protéines se rapproche de celui du filtrat témoin sans sel.
135
Les quantités de protéines présentes dans les précipités à l’éthanol sont nettement
plus élevées que celles des filtrats bruts. Leur évolution en fonction de la salinité
suit celle des filtrats bruts. Toutefois, les quantités de protéines des précipités à 2 ;
4 et 6g/l, nettement plus élevées qu’en absence de sel, sont sensiblement les
mêmes. Le taux de protéines baisse ensuite à la concentration de 8g/l pour
rejoindre celui des précipités sans sel.
Tableau 9. Dosage des protéines de l’isolat P80 de Verticillium (µg/ml)
dans les filtrats de culture en fonction de la salinité du milieu.
Quantité de protéines en µg/ml
NaCl (g/l)
0
2
4
6
8
Filtrat brut
95
100
105
192
92
Précipité à l’éthanol
403
508
502
500
392
2. Effet de la salinité sur l’évolution du pH des filtrats de culture
Le pH initial des différents milieux de culture additionnés ou non de NaCl a été
ajusté à 5 au moment de l’ensemencement du pathogène. Après trois semaines de
culture, les valeurs du pH des filtrats de culture ont été notées et reportées sur le
tableau 10.
Il apparaît clairement que les valeurs du pH final montrent des modifications qui
dépendent de la concentration saline du milieu.
En absence de sel, le pH final du filtrat de culture du champignon a augmenté en
tendant vers la neutralité. Cependant, en présence de 2 et 4g/l de sel, le pH s’élève
et tend vers une légère alcalinité. Au delà de 4g/l de sel, la valeur du pH diminue
par rapport aux autres filtrats. A 8g/l, le pH final est peu différent du pH initial et
affiche une valeur inférieure à celle du filtrat témoin sans sel.
136
Tableau 10. Effet de la salinité sur le pH final des milieux de culture de
Verticillium après trois semaines d’incubation
Valeurs du pH des filtrats de culture
Concentration saline des milieux de culture en g/l de NaCl
0
2
4
6
8
pH initial
5
5
5
5
5
pH final
6.5
7.6
7.8
6.2
5.3
3. Effet de la salinité sur les profils protéiques de l’isolat P80
Les protéines préparées à partir des précipités éthanoliques des filtrats de culture
du champignon développé sur milieu enrichi en NaCl sont séparées par SDSPAGE.
Les différents extraits protéiques sont notés de F0 à F8 selon la concentration en sel
du milieu de culture allant de 0 à 8g/l.
3.1. Analyse des protéines sur gel de polyacrylamide
Le gel coloré au bleu de Coomassie (Planche 9) montre que le profil de l’isolat P80
varie en fonction de la concentration saline du milieu.
En absence de sel (F0), le profil de cet isolat contient des polypeptides dont les
poids moléculaires (PM) varient de 40 à 130 Kda. On remarque en effet deux
bandes de PM faible de 45 et 48 Kda et une bande de PM élevée correspondant à
130 Kda. Les trois autres polypeptides sont plus abondants et présentent des PM
de 63 ; 70 et 76 Kda.
Le profil protéique des extraits issus du filtrat de culture additionné avec 2 g/l de
sel (F2 ) est sensiblement le même que celui du filtrat F0. Cependant, le filtrat F4
montre une absence du polypeptide 45 Kda. Cette observation est valable
également pour F6 et F8. En revanche, chez ces derniers, apparaissent deux
polypeptides qui n’ont pas été détectés sur les autres filtrats. Il s’agit d’un
polypeptide de faible PM de 40Kda et un autre de PM élevé de 116 Kda.
137
3.2. Comparaison de l’expression des protéines
Les résultats de cette comparaison sont répertoriés sur le tableau 11. Ils montrent
des différences dans l’expression des trois protéines majeures de l’isolat P80 qui
correspondent aux bandes de PM de 63 ; 74 et 76Kda.
Le polypeptide 63 Kda apparaît sensiblement avec la même importance sur les
profils de tous les filtrats indépendamment de leur degré de salinité. Les
polypeptides de PM à 74 et 76 Kda sont nettement plus abondants sur les profils
des filtrats F6 et F8 par rapport à ceux exprimés sur les autres profils de plus faible
concentration saline. Il en est de même pour le polypeptide de haut PM de 130 Kda
qui est mieux exprimé chez F6 et F8.
Comparaison des compositions polypeptidiques des filtrats de culture
de l’isolat P80 de Verticillium sur gel de polyacrylamide à 10% en
fonction de la salinité du milieu.
Taille des
Protéines extraites des filtrats de culture
Polypeptides en Kda
F0*
F2
F4
F6
F8
40
-
-
+
+
+
45
+
+
+
-
-
48
+
+
+
+
+
63
+++
+++
+++
+++
+++
70
++
++
++
+++
+++
76
++
++
++
+++
+++
116
-
-
-
++
++
130
+
+
+
++
++
* 0 ; 2 ; 4 ; 6 ; 8 : concentration des milieux de culture en g/l de NaCl
(-): absence
(+): présence
(++) : abondance moyenne
(+++ ): grande abondance
138
Planche 9. Visualisation des protéines extracellulaires de l’isolat P80
de Verticillium sur gel de polyacrylamide (10%) colorée au bleu de
Coomassie.
De gauche à droite :
S : protéines standard de P.M.
F0 : protéines du filtrat de culture de Verticillium développé sur milieu
Czapeck dépouvu de NaCl
F2 ; F4 ; F6 et F8 : protéines des filtrats de culture de Verticillium
développé sur milieux enrichis respectivement avec 2 ; 4 ; 6 et 8g/l de NaCl
139
C. Discussion et conclusion
Cette étude biochimique nous a permis de constater l’effet de la salinité sur les
quantités de protéines extracellulaires produites in vitro par l’isolat P80 de
Verticillium dans le milieu de culture amendé de NaCl. Les taux des protéines
précipitées ont connu une augmentation en fonction de la concentration saline
avec un optimum pour les concentrations comprises entre 2 et 6g/l.
L’excrétion des protéines par Verticillium est donc influencée par la composition
saline du milieu de culture. Elle peut aussi dépendre de la nature de la substance
carbonée ou de la présence de substances de croissance (Chaib, 1987).
Les quantités de protéines extracellulaires sont corrélées avec la virulence du
champignon. En effet, Chaib, (1987), a montré des différences dans les taux de
protéines secrétées par des isolats de Verticillium albo-atrum selon leur pouvoir
pathogène vis-à-vis de la tomate. Les souches pathogènes produisant 10 fois plus
de protéines que les souches non pathogènes. Des résultats similaires ont été
décrits par Saksirirat & Hoppe (1991). Ces auteurs ont rapporté des différences
dans les niveaux des protéines synthétisées in vitro par Verticillium lecanii et
Verticillium psalliotea.
En se basant sur ces données, on peut supposer que l’augmentation de la quantité
de protéines excrétées par Verticillium en présence des concentrations de sel
favorables serait en rapport avec une plus grande virulence du champignon.
Parallèlement aux changements des teneurs en protéines, une variation du pH
final des filtrats de culture a été notée sensiblement aux mêmes concentrations
salines. Le pH, proche de la neutralité en absence de sel, a varié dans le sens d’une
légère alcalinité pour devenir assez acide en présence de 8g/l (Tableau 10).
Les changements du pH indiquent une diversité de la production métabolique de
Verticillium sous régime riche en NaCl. Cette suggestion a été confirmée par
l’analyse électrophorétique des extraits protéiques des filtrats de culture à
différentes concentrations de sel. L’effet du sel s’est manifesté sur les profils
d’électrophorèse des protéines extracellulaires par des changements qui ont
touché :
140
-
l’abondance des protéines majeures de l’isolat P80, de PM à 63 ; 73 et 76
Kda, présentes sur tous les profils et qui se sont mieux exprimées aux
concentrations élevées de l’expérimentation ;
-
l’apparition de novo de deux polypeptides de PM assez éloignés, l’un à
40 Kda et l’autre à 116 Kda ;
-
la disparition de la protéine 45 Kda des profils correspondants aux
concentrations de 4 ; 6 et 8g/l de NaCl.
Les modifications touchant aussi bien la quantité que la qualité des protéines
excrétées en cours de culture peuvent être rapprochées de nos observations
relatives à l’augmentation de la production de toxines et d’enzymes cellulolytiques
par Verticillium en présence de sel (Regragui et al., 2003). Il faut cependant être
prudent avant d’établir ce rapprochement. Une étude détaillée des profils
électrophorétiques des protéines toxiques purifiées s’avère nécessaire. De même,
l’isolement de la carboxyméthylcellulase dont l’augmentation de l’activité a été
rapportée précédemment, et la détermination de son PM est utile pour une
meilleure interprétation de ces résultats.
Les résultats de cette étude biochimique montrent que le facteur sel semble exercer
une pression sur l’agent pathogène qui se manifeste par une action sur le
métabolisme azoté du champignon, notamment la synthèse des protéines dont le
profil est modifié avec la disparition d’une protéine et l’apparition de novo de deux
autres.
Le rôle joué par ces nouvelles molécules dans l’augmentation de la pathogénèse du
champignon vis-à-vis de la tomate en conditions salines reste à déterminer. La
purification des bandes nouvelles et l’étude de leur action sur la plante pourrait
éclaircir ce point.
Devant l’effet promoteur de la salinité sur les mécanismes d’action du champignon
et ses conséquence sur le développement de la maladie, le choix d’une méthode de
lutte adéquate aux conditions de l’environnement s’avère nécessaire.
141
Chapitre 5 : Influence de la salinité sur l’antagonisme
microbien vis-à-vis de Verticillium albo-atrum et sur la
bioprotection des tomates contre la verticilliose
Introduction
Verticillium albo-atrum, forme à microsclérotes est le principal agent des
flétrissements vasculaires de différentes cultures au Maroc, notamment les cultures
d’intérêt économique comme la tomate, l’aubergine et l’olivier.
La verticilliose cause chez la tomate de grandes pertes. Une fois les symptômes
apparaissent sur la plante, il n’y a pas de traitement efficace pour contrôler l’agent
pathogène.
Plusieurs traitements préventifs sont préconisés pour lutter contre la maladie.
La lutte chimique contre Verticillium a connu beaucoup de succès. Les fongicides à
l’instar du benlate, du propiconazole et du paclobutrazol inhibent la croissance
mycélienne du parasite et réduisent significativement la sévérité de la maladie en
diminuant la population verticillienne à l’intérieur des tiges (Erwin, 1981 ; Al
Figuigui, 1992). Néanmoins, les traitements chimiques ne constituent pas le remède
idéal compte tenu des problèmes inhérents à l’environnement, à la toxicité des
produits chimiques vis-à-vis de l’Homme et des animaux (Benyacoub, 1993) et, à la
possibilité d’apparition de pathotypes résistants aux fongicides.
La lutte génétique est l’une des méthodes les plus efficaces pour lutter contre la
verticilliose. L’utilisation des variétés possédant le gène Ve de la résistance a pu
réduire l’incidence de la maladie due à la race 1 de Verticillium. Cependant,
l’apparition de la race 2 limite l’efficacité de cette méthode (Besri et al., 1984 ;
Tjamos, 1984).
Les rotations culturales avec des plantes non hôtes, essentiellement des céréales, ont
été souvent utilisées. Leur rôle dans la diminution des propagules dans le sol a été
rapporté par Pullman & Devay, (1981). Cependant, leur efficacité est très discutée en
raison du mode de conservation du champignon dans le sol sous forme de
microsclérotes. Ces derniers ont une longévité de plusieurs années et peuvent
contaminer les plantes adventices non hôtes, ce qui contribue à l’augmentation de
l’inoculum dans le sol.
142
La solarization des sols est une méthode efficace dans la réduction de l’inoculum de
Verticillium. Elle consiste à couvrir le sol avec des bâches en polyéthylène pendant la
période la plus chaude de l’année, de juin à août au Maroc. Ainsi, les organes de
conservation présents jusqu’à une profondeur de 30cm sont soumis à des
températures pouvant atteindre 50°C. Les travaux de Tjamos & Mabrynaki (1990) sur
la fusariose du melon et de Bourdos & Skoudridakis (1996) sur la verticilliose de la
tomate démontrent l’efficacité de la méthode dans la lutte contre ces champignons
vasculaires telluriques.
La lutte biologique des plantes contre la verticilliose a retenu l’attention de plusieurs
chercheurs durant les deux dernières décennies. Deux procédés de lutte ont été
utilisés ; la prémunition et l’application d’organismes antagonistes à Verticillium. La
prémunition correspond à l’état de protection que confère à la plante une souche
hypovirulente dite souche prémunisante ou « inductrice » contre l’infection
ultérieure par une seconde souche virulente dite souche « d’épreuve ». La résistance
acquise par prémunition contre Verticillium a été obtenue sur plusieurs cultures
susceptibles notamment le coton (Schnathorst & Mathre, 1966), la menthe (Mellouk
& Horner, 1975), l’aubergine (Marois, 1982), la tomate, (Matta & Garibaldi, 1977 ;
Regragui et al., 1989), le piment (Douira, 1989) et quelques plantes fourragères (El
Aissami, 1999). Bien que dans le cas de la verticilliose, la prémunition a donné des
résultats parfois spectaculaires, son utilisation dans la pratique agricole reste difficile.
Le recours aux microorganismes antagonistes reste une voie plus prometteuse et qui
connaît actuellement un grand développement.
Plusieurs travaux ont été entrepris pour la sélection des antagonistes au Verticillium
parmi la flore microbienne du sol afin de les utiliser comme agents potentiels du
contrôle biologique contre la verticilliose. Des résultats positifs ont été obtenus, sur
plusieurs binômes d’expérimentation, avec les champignons du genre Talaromyces,
Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Gliocladium, et les bactéries du genre Bacillus,
Sinorhizobium et Serratia. Ces microorganismes se sont révélés être les plus
performants à supprimer Verticillium (Matta & Garibaldi, 1977 ; Hall & Scheiber,
1984 ; Millar et al., 1984 ; Henni, 1987 ; Kim et al., 1988 ; Berg et al., 1999 ; El
Aissami, 1999 ; D’Ercole et al., 2000 ; Larena et al., 2003).
143
Les divers antagonistes semblent agir pour certains par hyperparasitisme et/ou par
compétition pour l’occupation des sites d’infection et pour d’autres par leur capacité à
produire des antibiotiques. Leur rôle dans l’induction de la résistance systémique a
été également mis en évidence (Howell et al., 2000).
La condition sine qua non pour que les organismes bénéfiques puissent exercer leur
pouvoir antagoniste attendu est leur adaptation rapide dans l’environnement dans
lequel ils sont incorporés. En effet, certains facteurs de l’environnement peuvent
inhiber le développement des organismes antagonistes et favoriser par conséquent la
prolifération des agents pathogènes (Cook, 1973 ; Lewis & Papavizas, 1987). Dans ce
sens, il a été établi que la suppression de plusieurs maladies par l’introduction
d’agents bénéfiques, auteurs du contrôle biologique, est influencée par de nombreux
facteurs abiotiques comme la température, l’humidité du sol et la contribution en
général de l’environnement dans l’expression de la maladie et des facteurs biotiques
comme la dose de l’agent appliqué, la densité de l’inoculum du pathogène et la
présence des nématodes (Harman et al., 1981 ; Bea & Knudsen, 2000 ; Blanca et al.,
2001 ; Blanca et al., 2001 ; Larkin & Fravel, 2002).
Il apparaît ainsi qu’il est essentiel de connaître comment le contrôle biologique peut
être affecté par les changements des conditions de l’environnement avant qu’il ne soit
appliqué dans la pratique agricole. En effet, aucun agent de la lutte biologique ne peut
être performant sans que les conditions physiques et biologiques de l’environnement
ne lui soient adéquates. Et dans la plupart des cas, ces conditions ne sont pas
suffisamment définies.
A la lumière de cet aperçu bibliographique et compte tenu de nos résultats
précédents, nous nous sommes demandés si la salinité des sols aurait des
conséquences sur l’antagonisme microbien à l’encontre de Verticillium d’autant plus
que la salinité semble propice au développement de ce parasite et à l’expression de
son pouvoir pathogène. Pour réponde à cette question, ce travail a eu pour
objectifs d’étudier successivement, l’effet de la salinité sur :
-
L’antagonisme in vitro de quelques microorganismes bénéfiques vis-à-vis
de l’isolat P80 de Verticillium
144
-
L’efficacité des modes d’action de Trichoderma harzianum choisi pour son
fort pouvoir antagoniste
-
la bioprotection des tomates contre la verticilliose par l’utilisation de
Trichoderma harzianum.
I. Effet de la salinité sur l’antagonisme in vitro de quelques
microorganismes bénéfiques du sol vis-à-vis de Verticillium
albo-atrum
Introduction
Durant ces dernières années, et dans le but de mettre au point un procédé de lutte
contre la verticilliose d’une manière économique et sans inconvénients pour
l’environnement, les phytopathologistes ont isolé de la rhizosphère un grand
nombre de champignons et de bactéries antagonistes au Verticillium.
Talaromyces flavus est parmi les microorganismes bénéfiques les plus utilisés
dans la bioprotection des plantes contre Verticillium. Cet antagoniste réduit
l’incidence de la maladie chez l’aubergine en affectant la survie ou la vigueur des
microsclérotes (Marois et al ; 1982). Il semble agir en secrétant une enzyme, la
glucose oxydase, qui serait responsable de l’inhibition de la germination des
microsclérotes (Fravel, 1996).
Les espèces de Trichoderma ont été également utilisées en tant qu’ antagonistes
contre plusieurs pathogènes telluriques parmi eux Verticillium. Leur action sur ce
champignon s’exerce aussi bien in vitro qu’in vivo (Henni, 1987 ; D’Ercole et al.,
2000).
Les souches non pathogènes de Fusarium oxysporum ont été utilisées avec succès
pour lutter contre les souches pathogènes du même champignon ou de
Verticillium (Matta & Garibaldi, 1977 ; Wymore & Baker, 1982 ). Leur rôle dans
l’induction de la résistance contre les souches pathogènes a été démontré par
Fuchs et al., (1997).
145
Parmi les bactéries isolées de la rhizosphère, les espèces du genre Bacillus et
Rhizobium sp ont été sélectionnées pour leur pouvoir antagoniste envers
Verticillium. L’évaluation in vitro de leur habilité à former des zones antagonistes
autour des colonies du pathogène démontre que ces bactéries agissent par
antibiose. Elles réussissent également à coloniser les tissus vasculaires de l’hôte en
assurant sa protection (Hall et al., 1986 ; El Aissami, 1999).
L’objectif de ce chapitre est d’examiner dans quelle mesure la salinité du milieu
peut-elle influencer l’activité antagoniste de quelques microorganismes à
l’encontre de Verticillium. Cette étude, menée in vitro, nous permettra de
sélectionner l’organisme antagoniste le plus performant en condition saline.
A. Matériel et méthodes
1. Choix des microorganismes antagonistes
Les antagonistes testés correspondent aux microorganismes bénéfiques cités
préférentiellement dans la bibliographie comme auxilliaires de la lutte biologique
contre Verticillium. Ils regroupent quatre champignons saprophytes et une
rhizobactérie.
1.1. Penicillium sp
La souche de Penicillium sp est issue de la mycothèque du laboratoire de
Botanique de Rabat. Elle a été isolée du raisin de table par Benkhemmar et al.,
1993).
1.2. Fusarium oxysporum
La souche non pathogène de F. oxysporum utilisée nous a été fournie par le
laboratoire de Biotechnologie et Pathologie de la Faculté des Sciences et
Techniques de Tanger. Elle a été isolée d’un sol de la région de Marchouch. Testée
dans notre laboratoire, cette souche ne montre aucun signe de pathogénie vis-à-vis
de la tomate Marmande. En culture pure sur milieu PDA, la culture présente un
mycélium ras avec des secteurs cotonneux, partiellement mauve.
146
1.3. Talaromyces flavus
Ce champignon antagoniste a été le plus utilisé dans le contrôle biologique contre
Verticillium. La souche testée a été isolée des eaux brutes de la retenue du Barrage
SMBA à Rabat dans le cadre du projet réalisé par l’équipe du laboratoire de
Botanique sur les champignons aquatiques (Publication en cours).
1.4. Trichoderma harzianum
Trichoderma harzianum est un puissant antagoniste qui a été largement utilisé
pour lutter contre plusieurs agents phytopathogènes. La souche testée nous a été
fournie par le Laboratoire de Pathologie Végétale de l’Université Pierre et Marie
Curie (Paris).
1.5. Bacillus sp
Au cours de nos expériences préliminaires sur la recherche d’antagonistes à
Verticillium, plusieurs souches de rhizobactéries ont été testées. Nous avons
retenu une seule souche qui a montré un développement favorable sur milieu PDA
en présence de NaCl. Elle a été purifiée et identifiée comme appartenant au genre
Bacillus sp.
2. Protocole des cultures en confrontation
Les essais de confrontation sont conduites en boîtes de Pétri sur milieu PDA
enrichi en NaCl aux concentrations de 0 ; 2 ; 4 ; 6 ; 8 ; et 10g/l. L’isolat P80 de
Verticillium et chacun des microorganismes antagonistes sont ensemencés en
même temps dans la même boîte. Les deux explants sont séparés de 4 cm.
L’incubation est faite à 24°C et à l’obscurité.
3. Estimation de l’effet antagoniste
L’activité antagoniste exercée par les différents champignons antagonistes testés
est évaluée, après 7 ou 12 jours de culture, par le pourcentage d’inhibition de la
croissance diamètrale (PICD) du pathogène confronté à l’antagoniste par rapport
147
aux témoins non confrontés soumis à la même concentration saline. Le
pourcentage d’inhibition est calculé selon la formule suivante :
PICD = Dt – Dc x 100
Dt
Dt: diamètre moyen des colonies témoins non confrontées
Dc : diamètre des colonies confrontées à l’antagoniste
Dans le cas des confrontations avec la bactérie, l’effet antagoniste est évalué par le
pourcentage d’inhibition de la croissance radiale (PICR) des colonies inspiré de la
méthode décrite Michael & Nelson (1972). Il est calculée comme suit :
PICR = Re – Rr x 100
Re
Re: rayon de la colonie le plus loin de la bactérie
Rr : rayon de la colonie le plus rapproché de la bactérie
Les résultats, moyennes de six répétitions par organismes antagonistes et par
concentration saline, sont comparés par l’analyse des variances selon le test de
Newman-Keuls.
B. Résultats
1. Effets de la salinité sur la compétitivité in vitro de quelques
microorganismes fongiques avec Verticillium
1.1. Confrontations Penicillium sp-Verticillium
Les résultats illustrés sur la figure 34A et la planche 10 montrent que la
confrontation des deux microorganismes dans la même boîte de Pétri contenant
du milieu PDA dépourvu de sel, a entraîné une réduction de la croissance
diamétrale de l’isolat P80 de Verticillium. Le pourcentage d’inhibition est de
l’ordre de 40.73% par rapport aux témoins non confrontés. Cette action
148
Figure 34. Effet de la salinité sur l’activité antagoniste de Penicillium
sp., de Fusarium oxysporum et de Talaromyces flavus sur la
croissance mycélienne de l’isolat P80 de Verticillium
inhibition de la croissance
mycélienne de
Verticillium en %
A, Penicillium sp
80
70
60
50
40
30
20
0
2
4
6
8
10
concentration du milieu en NaCl (g/l)
inhibition de la croissance
mycélienne de
Verticillium en %
B, Fusarium oxysporum
45
40
35
30
25
20
15
10
0
2
4
6
8
10
concentration du milieu de culture en NaCl (g/l)
Inhibition de la croissance
radiale de Verticillium en %
C, Talaromyces flavus
70
60
50
40
30
20
10
0
2
4
6
8
10
concentration du milieu de culture en NaCl (g/l)
149
antagoniste de Penicillium est également observée en présence de toutes les
concentrations salines de l’expérimentation. Sous 2 et 4g/l de NaCl, l’effet
inhibiteur de la croissance augmente et atteint respectivement 50.42% et 52.86%.
De 6 à 10g/l, l’inhibition de la croissance se stabilise pour atteindre des valeurs de
l’ordre de 60% .
1.2. Confrontation Fusarium oxysporum-Verticillium
La culture en duel des deux champignons sur un même milieu nutritif enrichi en
NaCl a entraîné après une semaine d’incubation une diminution de la croissance
mycélienne des colonies de Verticillium par rapport aux colonies témoins non
confrontées (figure 34B). L’inhibition de la croissance, relativement faible en absence
de sel est de l’ordre de 26.34%. Elle augmente avec la salinité du milieu pour
atteindre 36.22% et 41.75% respectivement en présence de 6 et 10g/l de NaCl. Sous
cette dernière concentration saline, le thalle de Verticillium est presque entièrement
envahi par le mycélium de Fusarium oxysporum (Planche 11).
1.3. Confrontation Talaromyces flavus-Verticillium
Après 12 jours d’incubation, les résultats de la confrontation de l’isolat P80 de
Verticillium avec la souche de Talaromyces flavus dans le même milieu de culture
ont été reportés sur la figure 34C. Ils montrent qu’en absence de sel, l’effet
antagoniste de Talaromyces a provoqué une inhibition de la croissance mycélienne
de 20.95%. Dès que le milieu de culture est additionné de sel, l’effet antagoniste
augmente. A 2g/l, le pourcentage d’inhibition représente le double de celui exercé en
absence de sel. L’action antagoniste sur la croissance est optimale à 4g/l et atteint
57.77% puis décline sous les concentrations salines élevées de l’expérience. Toutefois,
la réduction de la croissance de Verticillium sous ces concentrations est nettement
plus importante que celle des témoins confrontés à Talaromyces sur milieu dépourvu
de sel (planche 12).
1.4. Confrontation Trichoderma-Verticillium
La confrontation de la souche de Trichoderma avec Verticillium dans le même
milieu nutritif a provoqué, après une semaine de culture, une importante
150
Planche 10. Effet de la salinité sur les confrontations de l’isolat P80 de
Verticillium
albo-atrum
et
de
Penicillium
sp
après
d’incubation
Culture de Verticillium seul
[0 ; 4 ; 8] : concentrations du milieu de culture en NaCl (g/l)
Cultures de Verticillium confronté avec Penicillium sp
sur milieux enrichis avec 0 ; 2 ; 4 ; 6 ; 8 et 10g/l de NaCl.
12
jours
151
Planche 11. Effet de la salinité du milieu sur les confrontations de
l’isolat P80 de Verticillium albo-atrum et d’une souche non pathogène
de Fusarium oxysporum après 12 jours d’incubation
- En haut : isolat de Verticillium cultivé seul en présence de 0 et 10g/l
de NaCl
- En bas : isolat de Verticillium confronté avec Fusarium oxysporum
sur milieu enrichi avec 0 et 10g/l de NaCl
152
Planche 12. Effet de la salinité sur les confrontations de l’isolat P80 de
Verticillium albo-atrum et d’une souche de Talaromyces flavus apès
12 jours d’incubation
A. Absence de NaCl dans le milieu de culture
B. Présence de 4g/l de NaCl
A gauche : culture de Verticillium seul
A droite, culture de Verticillium confronté avec Talaromyces flavus
153
inhibition de la croissance diamétrale du pathogène aussi bien en absence de sel
qu’en présence des concentrations de 2 et 4 g/l de NaCl (Figure 35). Le
pourcentage d’inhibition étant de l’ordre de 65.57% pour les confrontations
témoins sans sel. Lorsque la concentration saline du milieu augmente au delà de
6g/l, on note une diminution significative de l’action compétitive exercée par la
présence de Trichoderma ; le pourcentage d’inhibition de la croissance, quoique
plus faible que celui provoqué par les autres concentrations de sel, est encore très
appréciable et atteint 47.83% à 10g/l.
2. Effet de la salinité sur l’antagonisme de Bacillus sp avec
Verticillium
La souche de Bacillus a été repiquée 4 jours avant Verticillium. Après l’exposition du
champignon à l’action de la bactérie, une inhibition de la croissance radiale du
champignon a été constatée. Elle s’est manifestée par la réduction du rayon de la
colonie se trouvant du coté de la bactérie par rapport au rayon éloigné. L’estimation
de cette inhibition en fonction de la salinité est reportée sur la figure 36. En absence
de NaCl dans le milieu de culture, l’inhibition de la croissance radiale est de 22.53%.
En présence de 2g/l de sel, le pourcentage d’inhibition de la croissance ne diffère pas
de celui des témoins sans sel. Cependant, à partir de 4g/l de NaCl, l’effet antagoniste
de Bacillus sp augmente et provoque à titre d’exemple une inhibition de la croissance
de 31.33% et 41.80% respectivement sous les concentrations salines de 6 et 10g/l
(planche13).
C. Discussion et conclusion
A l’issue de cette étude in vitro, il ressort que les cinq microorganismes bénéfiques
testés montrent tous une activité antagoniste vis-à-vis de l’isolat P80 de
Verticillium. La confrontation de chacun d’eux avec cet isolat a provoqué une
inhibition de la croissance mycélienne de cet agent pathogène. La réduction de la
croissance reste un caractère fiable pour estimer l’antagonisme microbien envers
les organismes fongiques (Hall & Schreiber, 1984, El Abyad et al., 1996). Les
résultats obtenus correspondent aux diverses observations d’autres auteurs qui ont
154
Inhibition de la croissance mycélienne
de Verticillium en %
Figure 35. Influence de la salinité sur l'activité antagoniste
de Trichoderma harzianum en confrontation directe avec
l'isolat P80 de Verticillium
80
70
60
50
40
30
20
0
2
4
6
8
10
Concentrations du milieu de culture en NaCl (g/l)
Inhibition de la croissance radiale de
Verticillium en %
Figure 36. Influence de la salinité sur l'activité antagoniste
de Bacillus sp. sur la croissance radiale de l'isolat P80 de
Verticillium
60
50
40
30
20
0
2
4
6
8
10
Concentrations du milieu de culture en NaCl (g/l)
155
Planche 13. Effet de la salinité sur les confrontations de l’isolat P80 de
Verticillium albo-atrum et d’une souche de Bacillus sp après 12 jours
d’incubation
A. Cuture de Verticillium albo-atrum seul sur milieu sans sel
B. Culture de Verticillium albo-atrum confronté avec Bacillus sp sur
milieux enrichis avec 0 ; 2 ; 4 ; 6 ; 8 et 10g/l de NaCl.
156
mis en évidence l’effet antagoniste positif de ces microorganismes bénéfiques dans
la suppression du Verticillium, principalement avec Talaromyces flavus (Kim et
al., 1988 ; Fravel, 1996 ), Trichoderma harzianum (Henni, 1987 ; D’Ercole et al.,
2000), Penicillium oxalicum (Larena et al., 2003) et Bacillus subtilis (Hall et al.,
1986). L’addition de chlorure de sodium dans le milieu de culture a entraîné une
modification dans l’expression de l’action inhibitrice des différentes souches
antagonistes utilisées. Ainsi, pour les souches de Fusarium oxysporum,
Penicillium sp et Bacillus sp, le sel semble favoriser leur pouvoir antagoniste à
l’encontre de Verticillium puisque les pourcentages d’inhibition de la croissance du
pathogène ont montré une hausse progressive en fonction de la salinité. En
revanche, l’action antagoniste de la souche de Talaromyces flavus augmente avec
la salinité jusqu'à la concentration 4g/l pour laquelle son effet inhibiteur est
optimal puis elle décline. L’action inhibitrice de la souche de Trichoderma
harzianum , déjà très importante en absence de sel, n’a pas été stimulée par le sel
comme c’est le cas pour les autres microorganismes antagonistes. Néanmoins,
l’effet compétitif obtenu en absence de sel reste stable jusqu’à la concentration de
6g/l pour laquelle le pourcentage d’inhibition baisse significativement.
Ces résultats obtenus in vitro laissent prévoir une influence positive de la salinité
sur l’antagonisme microbien vis-à-vis de Verticillium in vivo.
D’autres facteurs abiotiques sont capables d’influencer l’efficacité des agents
antagonistes protecteurs comme la température et l’humidité qui constituent
plutôt des facteurs limitant l’expression de l’activité antagoniste. Blanca et al.,
(2001) ont montré en effet, que la suppression de la fusariose du pois-chiche par
Pseudomonas fluorescens est observée seulement à 20°C et 30°C mais pas à 25°C,
température optimale du développement de la maladie. De même, Köhl &
Molhoeck, (2001) ont montré que le succès du contrôle biologique de Botrytis
cinera par l’antagoniste Ulocladium atrum est conditionné par le potentiel
hydrique ; l’effet compétitif de cet antagoniste avec Botrytis est maximal à –7PMa
et diminue avec l’augmentation du potentiel hydrique.
L’intérêt de ce travail est de montrer que la présence de sel, dans le milieu aux
concentrations rappelant le degré de salinité des sols marocains, n’affecte pas
157
l’activité des souches antagonistes de Verticillium. Les concentrations de 2 et 4g/l
semblent même la stimuler. Cette action favorable du sel serait liée à la bonne
tolérance à la salinité des microorganismes bénéfiques testés. Cette suggestion est
réconfortée par les travaux récemment conduits par Rangarajan et al. (2003). Ces
auteurs ont montré que l’action antagoniste de trois souches de Pseudomonas sp
vis-à-vis de deux pathogènes du riz, Xanthomonas oryzae et Rhizoctonia solani,
est très efficace en présence de NaCl dans les rhizières .
Dans notre contexte expérimental, l’action antagoniste la plus importante à
l’encontre de Verticillium correspond à celle exercée par Trichoderma harzianum.
Ce dernier s’est montré très compétitif vis-à-vis de Verticillium. Il pourrait être
utilisé comme agent de contrôle biologique capable de réduire la sévérité de la
verticilliose aussi bien en absence qu’en présence des concentrations modérées de
sel rappelant celles des sols salins marocains. Néanmoins, une bonne connaissance
de l’influence de la salinité sur le développement de cet antagoniste et sur ses
différents modes d’action est nécessaire pour définir une bonne stratégie de lutte.
II. Influence de la salinité sur l’antagonisme in vitro de
Trichoderma
harzianum
vis-à-vis
de
l’isolat
P80
de
Verticillium
Introduction
Le champignon Trichoderma harzianum est un puissant antagoniste qui a été
largement utilisé dans les programmes de lutte biologique contre les champignons
phytopathogènes du sol. Effectivement, cet antagoniste s’est montré très efficace
dans la lutte contre Rhizoctonia solani (Elad et al., 1981 et Camporota, 1985),
Botrytis (Eden et al., 1996 ; Harman et al., 1996), Pythium (Lifshitz et al., 1986 ;
Besnard & Davet, 1993 ; Howell, 2002), Fusarium (Datnoff et al., 1995 ; Haggag &
Amin, 2001, Essalmani & Lahlou, 2002 ), Phytophthora nicotianae (Stefanova et
al., 1999), et Verticillium (D’Ercole et al., 2000 ; Regragui & Lahlou, 2005) et
autres.
Les modes d’action antagoniste de Trichoderma harzianum sont bien connus;
compétition, mycoparasitisme, production de métabolites antifongiques, (Denis &
158
Webster 1971 a et b ; Claydon et al., 1987) et d’enzymes cellulolytiques et
chinolytiques (Lorito et al., 1993). Par ailleurs, certaines souches de Trichoderma
semblent exercer une action stimulatrice de la croissance des plantes en l’absence
de tout agent pathogène (Windham et al., 1986 ; Ozbay & Newman, 2004).
Cependant, Eastburn & Butler, (1991) ont montré que les capacités saprophytiques
de Trichoderma harzianum peuvent être affectées par des facteurs de
l’environnement comme la température, l’humidité et le pH du sol. A titre
d’exemple, il a été établi que les températures froides (10°C) ou chaudes (37°C)
suppriment l’efficacité de Trichoderma hamatum contre Pythium alors que le pH
acide favorise l’activité antagoniste de Trichoderma sp dans la protection des
semences contre R. solani (Harman et al., 1981).
L’objectif de ce chapitre est d’examiner l’influence de la salinité du milieu sur les
capacités antagonistes d’une souche de Trichoderma harzianum vis-à-vis de
Verticillium de la tomate. Dans cette optique, nous proposons d’étudier in vitro la
tolérance au sel de cet antagoniste et d’examiner l’impact de la salinité sur
l’efficacité de ses différents modes d’action en vue de son utilisation in vivo dans le
contrôle biologique de la verticilliose de la tomate dans des conditions salines de
culture.
A. Matériel et méthodes
1. Le matériel fongique
1.1. Le pathogène
Il s’agit de l’isolat P80 de Verticillium albo-atrum, race 2, sélectionné pour son
fort pouvoir pathogène vis-à-vis de la tomate var Marmande (Lahlou & Boisson,
1981). Les cultures sont conduites sur milieu PDA (Difco) enrichi en NaCl à
différentes concentrations allant de 0 à 8g/l ou de 0 à 16g/l selon l’expérience.
1.2. L’antagoniste
L’origine et les caractéristiques de la souche de Trichoderma harzianum testée ont
été décrites au chapitre précédent. Les cultures en boîtes de Pétri sont conduites
159
sur milieu PDA et les cultures liquides sur milieu Malt à 2%. Les deux milieux sont
enrichis des mêmes concentrations en sel pré-citées.
L’effet du sel sur le développement de T. harzianum est évalué par :
-
La croissance pondérale estimée par le poids sec du mycélium. Ce
dernier est recueilli après filtration sur mousseline des cultures liquides
âgées de deux semaines, puis lavé deux fois avant d’être mis à sécher à
80°C pendant une nuit.
-
Le taux de sporulation déterminé après comptage des spores contenues
dans les filtrats de cultures sur cellule de Malassez.
Toutes les cultures sont incubées à l’obscurité et à 25 + 1°C.
2. Mesure du phénomène d’antagonisme
2.1. Capacité de colonisation
Dans des boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre contenant 25ml de milieu, on place
deux explants séparés de 40 mm, provenant de cultures jeunes des deux
champignons. La capacité de colonisation de Trichoderma est déterminée par le
rapport C défini par Camporota (1985) comme suit :
C = DT/DE x 100
DT : distance en mm parcourue par le front de croissance de Trichoderma sur l’axe
reliant les deux explants au bout de trois jours
DE : distance séparant les deux explants.
2.2. Antagonisme par antibiose
2.2.1. Action des substances volatiles
Des boîtes de Pétri contenant du milieu PDA additionné de sel à différentes
concentrations sont ensemencées par une bouture de 3mm de diamètre provenant
d’une culture jeune de Trichoderma harzianum. Après quatre jours d’incubation,
le couvercle des boîtes est rapidement retiré et remplacé par un fond de boîte
contenant du milieu PDA portant un explant d’une préculture de Verticillium. Les
fonds sont rassemblés et entourés avec une bande de parafilm de manière à
160
constituer une enceinte étanche. Le pathogène est ainsi exposé aux gaz émis par
Trichoderma. Les cultures témoins ne sont pas confrontées à Trichoderma.
L’action antagoniste des gaz est estimée par l’inhibition de la croissance diamétrale
en % des thalles exposés par rapport aux témoins selon la formule suivante :
I = Dt –Di x 100
Dt
où Dt est le diamètre moyen des cultures témoins non confrontés et Di le diamètre
du thalle exposé aux gaz émis par Trichoderma.
2.2.2. Action des substances non volatiles
* Action sur la croissance mycélienne
Des cultures de Trichoderma sont réalisées sur milieu enrichi en NaCl et recouvert
24 heures au préalable d’une feuille de cellophane stérile. Après six jours de
culture, le thalle de Trichoderma est récupéré en prélevant la cellophane sousjacente. Des explants d’une culture jeune de Verticillium sont alors déposés sur la
surface des milieux ayant porté Trichoderma. L’effet antagoniste des substances
non volatiles est estimé par l’inhibition de la croissance diamétrale des colonies du
pathogène par rapport aux témoins non exposés.
* Action sur la sclérogénèse
L’abondance des microsclérotes est évaluée sur le revers des cultures par
l’estimation du diamètre moyen de la zone pigmentée au bout de quatre semaines
de culture.
Les résultats de chaque test, moyennes de huit répétitions, sont comparés par
l’analyse des variances au seuil de probabilité de 5% selon le test de NewmanKeuls.
161
B. Résultats
1. Influence de la salinité du milieu sur le développement de T.
harzianum
1.1. Morphologie des cultures
Les cultures âgées de 7 jours conduites sur milieu sans sel montrent un thalle
hyalin plus ou moins floconneux avec une zone sporogène de couleur verte,
localisée vers la périphérie de la boîte de Pétri.
Sur les milieux enrichis en sel, la zone verte sporogène devient moins dense en
corrélation avec les concentrations croissantes de sel. A 8g/l, on note l’absence
totale de la zone sporogène verte; les boîtes sont envahies par un mycélium
blanchâtre (Planche 14).
1.2. Poids sec du mycélium
La croissance mycélienne des cultures de T. harzianum développées sur milieu
enrichi en sel ne diffère pas de celle des témoins sans sel et ceci pour les
concentrations comprises entre 2 et 6g/l (Figure 37). Une baisse légère mais
significative du poids sec du mycélium est enregistrée à 8g/l.
1.3. Taux de sporulation
Les filtrats des cultures ayant servi pour l’estimation pondérale du mycélium de
Trichoderma ont été utilisés pour calculer le taux de sporulation en fonction de la
salinité du milieu. Les résultats (Figure 38) montrent que la densité en spores
diminue progressivement avec l’augmentation de la salinité. La sporulation est très
faible à 8g/l; elle est de l’ordre de 0.7 x106 spores ml.-1 soit une inhibition de 95 %
par rapport aux cultures témoins sans sel.
2. Influence de la salinité sur l’expression de l’activité antagoniste
de T. harzianum vis-à-vis de Verticillium.
2.1. Antagonisme par compétition
162
Planche 14. Effet de la salinité sur la morphologie des cultures de
Trichoderma harzianum après sept jours d’incubation
[0 ; 8 ;] : concentration saline du milieu de culture en g/l de NaCl
163
Figure 37. Effet de la salinité sur la croissance pondérale de
Trichoderma harzianum après 15 jours de culture
Poids sec du mycélium
deT.harzianum ( mg)
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
Concentrations du milieu de culture en NaCl (g/l)
18
16
14
12
6
Densité de spores x10 spores ml/ de
T. harzianum
Figure 38. Effet de la salinité sur l'intensité de la sporulation
de T. harzianum après 15 jours de culture
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
Concentrations du milieu de culture en NaCl (g/l)
164
La capacité de colonisation C, exprimée en %, est la résultante de la compétitivité
entre Trichoderma et Verticillium pour l’occupation de l’espace.
Après trois jours de culture, Trichoderma montre un fort pouvoir de colonisation
de l’espace aussi bien en absence qu’ en présence de sel (Figure 39). Notons
néanmoins une baisse significative du pourcentage de colonisation à partir de 6g/l
de NaCl, mais les valeurs de C demeurent élevées, de l’ordre de 80%, témoignant
d’une importante capacité de l’antagoniste à coloniser les thalles de Verticillium en
présence des concentrations élevées de sel utilisées dans cet essai.
Les confrontations ont été ensuite examinées pour une description morphologique
des cultures alors âgées de 10 jours. En absence de sel, le thalle de Verticillium est
entièrement envahi par le mycélium de Trichoderma. Les spores de couleur verte
recouvrent la presque totalité de la boite de Pétri. En présence de sel, la coloration
verte n’est visible que sur la moitié de la boite portant la bouture de Trichoderma.
Ce recul de la zone sporogène, loin de la colonie du pathogène, est d’autant plus
marqué que la concentration en sel augmente. Rappelons que, pour toutes les
concentrations salines de l’expérience, la colonie de Verticillium est entièrement
recouverte par le mycélium de l’antagoniste (planche 15).
2.2. Antagonisme par antibiose
Les modes d’action biochimique agissant par antibiose concernent l’aptitude de T.
harzianum à produire des substances volatiles et des substances non volatiles
diffusant dans le milieu de culture. La nature de ces substances a été déterminée
par Denis & Webster, (1971 a et b).
2.2.1. Action des substances volatiles
La croissance de Verticillium soumis aux gaz libérés par T. harzianum est estimée
après cinq jours de culture. Cette contrainte de temps est due à l’envahissement
rapide du couvercle portant l’explant de Verticillium par le mycélium de
l’antagoniste.
En absence de sel, l’effet des substances volatiles se manifeste par une inhibition
de la croissance du pathogène de 40 % par rapport aux témoins non exposés
(Figure 40). Cette inhibition est maintenue en présence de faibles concentrations
165
Figure 39. Influence de la salinité sur la capacité de
colonisation de Trichoderma harzianum confronté à
Verticillium au bout de trois jours.
Capacité de colonisation de T.
harzianum C (%)
100
95
90
85
80
75
70
0
2
4
6
8
Concentrations du milieu de culture en NaCl (g/l)
Figure 40. Influence de la salinité sur l'action antagoniste des
substances volatiles de Trichoderma harzianum sur la
croissance diamétrale de Verticillium
Inhibition de la croissance de
Verticillium (%)
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
Concentrations du milieu de culture en NaCl ( g/l)
8
166
Planche 15. Morphologie des confrontations de Verticillium avec
Trichoderma harzianum en fonction de la salinité du milieu de culture
après 10 jours d’incubation.
N.B. Dans chaque boite, l’explant de gauche correspond à Trichoderma et l’explant
de droite à celui de Verticillium. Les deux explants étant séparés par 4cm.
[0 ; 2 ; 4 ; 6 ; 8 ] : concentrations salines du milieu de culture en g/l de NaCl
167
de NaCl allant de 0 à 6g/l. Au delà, l’effet inhibiteur des substances volatiles
diminue de manière significative. Il est de 24,4% à 8g/l.
2.2.2. Action des substances non volatiles
- Action sur la croissance mycélienne de Verticillium
Les cultures du pathogène conduites sur milieu enrichi en sel, et ayant porté
auparavant une culture de Trichoderma, montrent une réduction importante de
leur croissance par rapport à leurs témoins respectifs, de même salinité,
développés sur milieu sans Trichoderma, et ceci pour toutes les concentrations en
sel de l’expérience (figure 41). En absence de sel, l’inhibition de la croissance du
pathogène est de l’ordre de 62%. La présence de sel entraîne une baisse
progressive de l’activité inhibitrice exercée par les métabolites de Trichoderma.
Cependant, l’action antagoniste sur la croissance du pathogène, très significative,
est de 37 % à 8g/l et elle persiste pour les concentrations élevées de NaCl allant
jusqu’à 16g/l (planche 16).
- Action sur la sclérogénèse
Les microsclérotes apparaissent sur les cultures témoins dès la deuxième semaine
de culture pour toutes les concentrations de l’expérience. Par contre, on remarque
l’absence des organes de conservation sur les thalles développés en présence des
métabolites de Trichoderma.
Après quatre semaines, la sclérogénèse s’accentue sur les cultures témoins à toutes
les concentrations de sel et apparaît tardivement sur les cultures soumises aux
métabolites de Trichoderma avec une moindre importance. Ainsi, en absence de
sel, l’action antagoniste des substances non volatiles de Trichoderma entraîne un
retard dans l’apparition des microsclérotes et une réduction de leur abondance
(figure 42). En présence de sel, l’action inhibitrice des métabolites libérées par
Trichoderma sur la sclérogénèse du pathogène diminue avec l’augmentation de la
salinité et disparaît complètement pour les concentrations supérieures à 8g/l. On
remarque même, pour ces concentrations, une augmentation significative de
l’abondance des microsclérotes par rapport aux témoins de même salinité
développés en absence des substances antagonistes de Trichoderma.
168
Figure 41. Effet de la salinité sur l'action antagoniste des
substances non volatiles de Trichoderma harzianum sur
la croissance diamétrale de Verticillium
Inhibition de la croissance de
Verticillium (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
12
16
Concentrations du milieu de culture en NaCl ( g/l)
Diametètre de la zone pigmentée des
colonies de Verticillium ( mm)
Figure 42. Influence de la salinité sur l'action antagoniste
des substances non volatiles de Trichoderma harzianum
sur l'abondance des microsclérotes de Verticillium
Absence de Trichoderma
Presence de Trichoderma
70
60
50
40
30
20
10
0
0
4
8
12
Concentrations en NaCl (g/l)
16
169
Planche 16. Effet antifongique des substances non volatiles de
Trichoderma harzianum excrétées dans le milieu de culture sur la
croissance diamètrale de Verticillium albo-atrum après 20 jours
d’incubation (Technique de la cellophane).
1. En absence de sel
A gauche : culture de Verticillium témoin
A droite : culture de Verticillium sur milieu contenant les substances non
volatiles de Trichoderma harzianum
2. En présence de sel
Cultures de Verticillium sur milieux contenant les substances non volatiles de
Trichoderma harzianum
[0 ; 4 ; 8 ; 12 ; 16] : concentrations salines du milieu de culture en g/l de NaCl
170
C. Discussion et conclusion
Les résultats présentés dans cette étude montrent que l’apport de sel dans le milieu
de culture modifie l’aspect cultural de T. harzianum et affecte légèrement ses
capacités antagonistes vis-à-vis d’un isolat P80 de Verticillium d’origine tomate.
En absence de sel, l’antagonisme de T. harzianum s’est traduit par une inhibition
de la croissance mycélienne de Verticillium et une réduction de l’intensité de la
sclérogénèse via la production de métabolites antifongiques volatiles et non
volatiles produits par la souche de Trichoderma harzianum testée. Nos résultats
sont de même nature que d’autres travaux qui ont mis en évidence l’antagonisme
de Trichoderma spp vis-à-vis des champignons vasculaires, notamment Fusarium
sp (Datnoff et al., 1995 ; Essalmani & Lahlou, 2002) et Verticillium (Henni, 1987 ;
D’Ercole et al., 2000).
En effet, cet antagoniste potentiel est capable de produire des substances volatiles
ayant un effet soit fongistatique tel que l’acétaldéhyde (Denis & Webster, 1971b)
soit fongicide comme les alkyles pyrones (Claydon et al., 1987 ; Graeme-Cook et
al., 1991). De même, ce champignon produit des antibiotiques tels que la
dermadine, la penicilline, la trichothicine et les trichorzianines (Vial, 1989) et des
enzymes, cellulases et chinases, qui dégradent les parois cellulaires des agents
pathogènes (Lorito et al., 1993).
La salinité du milieu a eu des impacts différents sur les modes d’action de T.
harzianum. Ainsi, la compétition pour l’espace est peu affectée par l’apport de sel ;
l’antagoniste envahit en moins de 4 jours la colonie de Verticillium par rapport à
celle observée sur les confrontations témoins sans sel. L’altération de la
sporulation du coté de l’adversaire serait due d’une part à l’effet de la salinité sur le
champignon antagoniste et d’autre part, à l’opposition que manifeste Verticillium
à la colonisation par Trichoderma.
L’influence de la salinité sur l’action antagoniste des substances volatiles de T.
harzianum ne se fait sentir que pour les concentrations en sel supérieures à 6g/l
pour lesquelles l’effet antagoniste sur la croissance du pathogène diminue. On peut
penser qu’un seuil de salinité est nécessaire pour perturber les mécanismes de la
171
libération des substances volatiles par Trichoderma et/ou diminuer leur efficacité
sur Verticillium.
Quant aux métabolites antifongiques non volatiles émis par T. harzianum, l’apport
de sel entraîne une diminution progressive de leur action inhibitrice sur la
croissance du pathogène. Toutefois, leur niveau antagoniste est tout de même non
négligeable aux fortes concentrations de NaCl.
En revanche, l’action inhibitrice des substances non volatiles sur la sclérogénèse
diminue avec la salinité et tend à disparaître pour les concentrations dépassant
8g/l. Ce résultat laisse supposer que le sel ralentit le métabolisme de la libération
des substances antifongiques, toutefois les quantités produites s’avèreraient
suffisantes pour assurer une inhibition appréciable de la croissance du pathogène.
L’inhibition de la sclérogénèse semble exiger des quantités plus importantes en ces
substances antifongiques pour réduire la formation des microsclérotes, ce qui
expliquerait l’absence de l’action inhibitrice de Trichoderma sur la sclérogénèse
pour les concentrations en sel supérieures à 8g/l.
La salinité peut ainsi constituer un facteur environnemental qui risque de modérer
certaines capacités antagonistes de T. harzianum. Il faudrait en tenir compte dans
les programmes de lutte biologique contre les champignons phytopathogènes.
Les résultats de l’antagonisme in vitro de T. harzianum obtenus aux
concentrations modérées de sel à l’encontre de Verticillium constituent une
première étape d’un programme de lutte biologique qui vise à long terme de lutter
contre la verticilliose de la tomate par l’intermédiaire de Trichoderma. On notera
de plus que les concentrations de sel favorables à l’expression maximale du
phénomène antagoniste se rapprochent des taux de salinité des sols du littoral
atlantique marocain (0,2 à 5g/l) où sévit la verticilliose (Besri, 1981). La recherche
de nouvelles souches de Trichoderma plus tolérantes au sel, permettra de
sélectionner des souches plus performantes pouvant être utilisées comme agent de
contrôle biologique dans les régions où la salinité des sols constitue un facteur
aggravant les maladies fongiques telles que les trachéomycoses. Une étude de
l’adaptation des ces souches antagonistes aux sols salins et de leur interaction avec
172
les autres microorganismes du sol est nécessaire avant leur introduction dans
notre environnement.
III. Influence de la salinité sur l’expression de l’antagonisme
in vivo de Trichoderma harzianum vis-à-vis de Verticillium
albo-atrum de la tomate
Introduction
L’utilisation des microorganismes bénéfiques sous formes de « biopesticides » non
polluants pour l’environnement constitue une bonne alternative à l’utilisation des
pesticides chimiques pour résoudre les problèmes phytosanitaires.
Le microorganisme bénéfique clé des programmes de lutte biologique contre les
agents phytopathogènes est Trichoderma harzianum. Son utilisation avec succès
sur plusieurs pathotypes certifie qu’il possède un pouvoir antagoniste à large
spectre d’action. Ce champignon saprophyte du sol semble agir directement sur la
population pathogène de la rhizosphère en libérant des antibiotiques qui affectent
sa croissance et des enzymes extracellulaires capables de détériorer la paroi du
pathogène, ce qui diminue les chances d’infection.
Outre ses activités antifongiques, Trichoderma harzianum est capable d’induire,
même à distance du pathogène, la résistance des plantes aux maladies. En effet,
des études récentes ont montré que l’application de Trichoderma harzianum sur
les racines ou dans le sol peut induire la résistance des plantes aux agents
pathogènes qui leur sont spécifiques (De Meyer et al, 1998 ; Howell et al., 2000;
Essalmani, 2004).
Il apparaît ainsi que Trichoderma harzianum possède des potentialités très
importantes pour lutter contre les maladies des plantes en diminuant le taux des
pathogènes dans le sol et en renforçant les stratégies de défense propres à la
plante.
Une des plus importantes caractéristiques nécessaires à l’efficacité des agents du
contrôle biologique est leur capacité à survivre dans des environnements autres
173
que ceux d’origine et à coloniser les racines des plantes pendant une certaine
période pour contrôler les agents pathogènes. Si les recherches abordant
l’influence de quelques facteurs de l’environnement sur l’aptitude de Trichoderma
harzianum à supprimer les agents phytopathogènes sont nombreuses, peu de
travaux ont abordé le problème de la salinité des sols comme une contrainte
possible à l’application des agents du contrôle biologique. Cette lacune est
amplifiée par le fait que la salinité constitue un facteur qui aggrave certaines
maladies d’origine fongique comme les pourritures dues à Phytophthora sp et les
trachéomycoses dues à Fusarium oxysporum et Verticillium albo-atrum.
Dans une étude précédente, nous avons montré in vitro que Trichoderma
harzianum possède une activité antagoniste élevée vis-à-vis du Verticillium de la
tomate. Celle ci étant très faiblement diminuée par NaCl aux doses usuelles des
sols salins marocains (Regragui & Lahlou, 2005). Or, le succès du phénomène
d’antagonisme bien manifesté in vitro peut ou non être obtenu in vivo. En fonction
de toutes ces données et dans l’objectif d’établir une stratégie de lutte biologique
contre la verticilliose de la tomate en présence de NaCl, on s’est proposé de tester,
dans un premier temps, l’antagonisme in vivo de Trichoderma à l’encontre de
Verticillium en présence de la plante hôte et dans un deuxième temps, de vérifier si
la salinité des eaux d’arrosage pourrait affecter les capacités de l’antagoniste à
induire la résistance des tomates stressées.
A. Matériel et méthodes
1. Protocole de bioprotection des plantes
1.1. Préinoculation avec Trichoderma
Les plantes de tomate (Marmande Claudia) ayant atteint le stade premières vraies
feuilles sont arrachées de la pépinière. Les racines légèrement blessées
sont
trempées pendant trente minutes dans une suspension de spores de l’antagoniste.
Celle ci est obtenue après grattage de la surface des cultures mycéliennes d’une
souche de Trichoderma développée sur milieu PDA et âgées de 15 jours. Le
mycélium recueilli est mélangé avec de l’eau stérile. Après agitation le mélange est
174
filtrée sur papier Watman n°1. La densité de la suspension est ajustée à 2.106
spores/ml après estimation de la densité initiale sur cellule de Malassez puis
dilution. Les plantes sont ensuite repiquées en pots de 450ml et arrosées chacune
au niveau du collet avec 3ml de la même suspension. Des lots témoins subissent le
même traitement, mais de l’eau stérile remplace la suspension de spores.
1.2. Inoculation avec la souche pathogène
Après un temps variable, les plantes pré-inoculées sont délicatement déterrées de
leur pot et trempées pendant 15 minutes dans l’inoculum pathogène préparé à
partir de la souche P80 de Verticillium (Cf chapitre 2). Des plantes pré-inoculées
témoins reçoivent de l’eau stérile. Des plantes témoins non traitées par
l’antagoniste sont trempées dans l’inoculum pathogène. Les plantes sont repiquées
dans leur pot et arrosées selon le traitement avec 3ml de l’inoculum agressive ou
d’eau stérile. Toutes les plantes sont arrosées tous les deux jours avec la solution
nutritive complète. Les conditions de cultures et le nombre de répétitions ont été
décrites précédemment.
2. Evaluation des manifestations de la maladie
La verticilliose se traduit par des manifestations diverses qui touchent la
croissance des plantes et les altérations foliaires.
2.1. Croissance des plantes
Elle est appréciée par la mesure de la longueur de l’épicotyle après six semaines
d’observation.
2.2. Altérations foliaires
La verticilliose se manifeste par d’importants dégâts foliaires. L’indice d’altération
foliaires exprime leur intensité (Beye & Lafay, 1985). Il est calculé comme suit :
Au moment du relevé, une note est attribuée à chaque feuille ;
0 : feuille saine
1 : feuille flétrie sans chlorose
2 : plages légèrement chlorotiques sur un ou plusieurs folioles
175
3 : plages chlorotiques sur toute la surface d’un ou plusieurs folioles ou plages
chlorotiques à centre nécrosé.
4 : nécrose totale ou feuille morte.
Un indice est établi pour chaque plante
IAF = somme des notes x 100
Maximum possible
Le maximum est égal à 4 fois le nombre total des feuilles bien développées portées
par la plante.
2.3. Ré-isolement du champignon
Le champignon pathogène est recherché dans l’hypocotyle et dans l’apex de la tige
1 ; 2 ; 4 ; 7 et 14 jours après inoculation. Il n’est pas recherché dans la racine en
raison du traitement préalable de celles ci par Trichoderma et dont les spores
adhérentes aux parois corticales peuvent germer au cours de l’opération de réisolement. La technique de ré-isolement a été déjà décrite.
B. Résultats
1. Recherches des conditions optimales pour l’expression de
l’antagonisme in vivo de Trichoderma harzianum vis-à-vis de
Verticillium albo-atrum.
1.1. Effet de l’inoculation simultanée par le mélange de
spores des deux champignons
Les plantules de tomate âgées de trois semaines sont inoculées avec le mélange
constitué de 50ml d’une suspension de spores à 2.106 spores/ml préparée à partir
de la souche de Trichoderma harzianum et de 50ml d’une suspension de spores à
106 spores/ml issue de l’isolat pathogène de Verticillium. Des plantules de contrôle
sont inoculées pour certains avec l’inoculum bénéfique et pour d’autres avec
l’inoculum agressif. Des plantules témoins reçoivent uniquement de l’eau stérile.
176
1.1.1.
Effet sur la croissance des plantes
La croissance des axes aériens a été estimée six semaines après inoculation. Les
résultats sont reportés sur la figure 43 A.
Les plantes inoculées avec les spores de Trichoderma montrent une croissance
semblable à celles des témoins blancs. L’inoculation des plantes avec l’isolat
agressif a provoqué une réduction de la taille par rapport aux témoins sains
d’environ 60.86%. Les plantes inoculées avec le mélange des spores des deux
champignons antagoniste et challenger dans les proportions 1/1 ont manifesté un
déficit de la croissance aussi important que celui des plantes malades de contrôle
inoculées avec l’isolat agressif seul.
1.1.2.
Effet sur les symptômes foliaires
En fin de la période d’observation, les altérations foliaires ont été également
appréciées. Leur variation en fonction des différents traitements va dans le même
sens que la réduction de la taille (figure 43B). En effet, l’inoculation des plantes par
le mélange des spores des deux champignons a fait apparaître des altérations
foliaires de même importance que celles induites par l’inoculation avec l’isolat
pathogène seul.
1.1.3.
Discussion et conclusion
Il apparaît ainsi que l’inoculation des plantes de tomate par le mélange
Trichoderma-Verticillium, dans la proportion 1/1, ne leur confère aucune
protection. Bien que renfermant la même densité en spores des deux
microorganismes, le mélange a provoqué les mêmes symptômes caractéristiques
de la verticilliose que ceux induits par les spores du champignon pathogène seul.
L’échec de l’antagoniste à protéger la plante contre l’invasion par Verticillium peut
être dû à une sélection exercée par l’hôte pour favoriser l’installation rapide du
pathogène. En effet, au contact des racines de la plante favorable, les spores de
Verticillium germent en moins de 24heures et traversent les tissus corticaux, puis
atteignent l’endoderme pour se localiser dans les vaisseaux du xylème (Lahlou,
1983). Une fois à l’intérieur de la plante, les microconidies de Verticillium formées
à partir des filaments mycéliens sont transportées par la sève ascendante assurant
177
Figure 43 A. Effet de l'inoculation des tomates par le
mélange de spores de T. harzianum (Th) et de V. alboatrum (P80) sur la croissance des plantes
Longueur des épicotyles en cm
30
25
20
15
10
5
0
Te
Th
Th+P80
P80
Traitements des plantes
Figure 43 B. Effet de l'inoculation des tomates par le
mélange de spores de T. harzianum (Th) et de V. alboatrum (P80) sur l'intensité des altérations foliaires
7
Indice d'altération foliaire
6
5
4
3
2
1
0
Te
Th
Th+P80
Traitements des plantes
P80
178
une colonisation totale de la plante et induisant l’apparition des symptômes de
flétrissement.
Bien que la vitesse de germination des spores de Trichoderma soit également très
rapide, ce champignon arrive à coloniser les racines sans jamais atteindre les tissus
conducteurs. L’observation en microscopie électronique des coupes de racines
traitées avec Trichoderma harzianum a mis en évidence la pénétration de cet
antagoniste dans la racine tout en restant confiné dans l’épiderme et le cortex
(Yédida et al., 1999).
La confrontation simultanée des deux microorganismes « in vitro » s’est traduite
par une inhibition de la croissance du pathogène grâce à la grande capacité de
colonisation de l’espace de l’antagoniste et au phénomène d’antibiose (Regragui &
Lahlou, 2005). Ce résultat in vitro ne s’est pas concrétisé in vivo en présence de la
plante hôte dans nos conditions expérimentales. Trichoderma semble avoir
d’autres exigences pour exercer son antagonisme notamment une période
suffisante pour induire la résistance des plantes à l’attaque par le pathogène d’où la
nécessité de décaler la pré-inoculation par l’agent bénéfique et l’infection agressive
pour viser une meilleure bioprotection.
1.2. Effet du délai de pré-inoculation par Trichoderma sur
l’expression de la bioprotection
Nous avons fait varier la durée de la période séparant la pré-inoculation avec les
spores de Trichoderma et l’inoculation du pathogène. Ces délais sont de 0 ; 1 ; 2 et
4 jours. Les manifestations de la maladie ont été estimées 7 semaines après
inoculation.
1.1.1.
Effet sur la croissance des plantes
Les résultats des différents traitements sont reportés sur le graphique 44.
L’analyse des résultas permet de distinguer trois groupes de plantes :
•
Le premier est constitué par les plantes inoculées avec la souche
pathogène immédiatement après le contact des racines avec les spores
de l’antagoniste. Ces plantes ont montré une réduction de la croissance
179
de leur axe aérien aussi marquée que celle des plantes malades de
contrôle.
•
Le second groupe correspond aux plantes prétraitées avec Trichoderma
1 jour et 4 jours avant l’inoculation agressive. Ces plantes ont manifesté
une réduction de la taille de moindre importance par rapport aux
plantes du premier groupe.
•
Le troisième groupe étant constitué par les plantes pré-inoculées 2 jours
avant l’infection par Verticillium. Ces plantes ont montré une croissance
semblable à celle des témoins sains ou des plantes traitées avec
Trichoderma seul.
1.1.2.
Effet sur les symptômes foliaires
La pré-inoculation avec les spores de Trichoderma deux jours avant la surinfection
agressive a protégé les plantes des symptômes foliaires caractéristiques de
l’infection avec Verticillium (figure 45). Les plantes de ce traitement ont montré
l’indice d’altération foliaire le plus faible par rapport aux plantes des autres
traitements. Les plantes pré-inoculées 1 et 4 jours avant l’inoculation par le
pathogène affichent des indices d’altération foliaire significativement plus élevés
que ceux des plantes du délai de 2 jours et plus faibles que ceux des plantes
malades témoins.
1.1.3.
Effet
sur
la
colonisation
des
tiges
par
le
pathogène
Nous avons réservé des plantes pré-inoculées avec Trichoderma pour tester l’effet
des primo-infections sur le pouvoir parasitaire de l’isolat P80 de Verticillium vis-àvis des tomates différemment traitées. Des plantes n’ayant reçu que l’isolat
pathogène seul servent de témoins en guise de comparaison. Les résultats des réisolements du parasite de la tige des plantes sont reportés sur le tableau 12.
L’isolat P80 inoculé seul atteint l’hypocotyle deux jours après l’inoculation et
colonise la totalité des jeunes plantules en moins de 7 jours. Par contre il n’atteint
l’hypocotyle des plantes prétraitées avec Trichoderma 0 ; 1 et 4 jours avant
l’infection agressive qu’une semaine plus loin. Cependant une différence existe
entre les plantes de ces trois délais de pré-inoculation, c’est le ré-isolement du
180
Figure 44. Influence du délai de pré-inoculation avec
Trichoderma harzianum sur la croissance des plantes de
tomate inoculées après avec l'isolat P80 de Verticillium
Longueur de l'épicotyle en cm
30
25
20
15
10
5
4
2
1
0
P8
0
Tr
ic
ho
de
r
m
a
0
Délai de préinoculation en jours
Délai de préinoculation en jours
P8
0
4
2
1
0
ho
de
rm
a
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Tr
ic
Indice d'altération foliaire
Figure 45. Influence du délai de pré-inoculation avec
Trichoderma harzianum s ur les symptômes foliaires des
plantes de tomate inoculées après avec l'isolat P80 de
Verticillium
181
parasite de l’épicotyle 14 jours après l’inoculation et qui est positif chez les plantes
des délais de 0 et 1 jour et négatif pour le délai de 4 jours.
Chez les plantes pré-inoculées 2jours avant l’inoculation d’attaque, le parasite n’a
été ré-isolé que de l’hypocotyle de quelques plantes (1/5) sans jamais atteindre
l’épicotyle à la même période d’observation.
Tableau 12. Effet du délai de pré-inoculation sur la colonisation des
tiges par l’isolat P80 de Verticillium des plantes de tomates
différemment traitées
Ré-isolement de l’isolat P80 de Verticillium
Délai de pré-inoculation
Temps après
inoculation en
P80 seul
0 jour
1 jour
2 jours
4 jours
1
-
-
-
-
-
2
RH
-
-
-
-
4
RH
-
-
-
-
7
RHE
RH
RH
-
RH
14
RHE
RHE
RHE
RH
RH
jours
-
: ré-isolement négatif
RH : ré-isolement positif au niveau de l’hypocotyle
RHE : ré-isolement positif au niveau de l’hypocotyle et de l’épicotyle
1.3. Discussion et conclusion
La protection des tomates contre l’action agressive de l’isolat P80 de Verticillium a
été obtenue à la suite du traitement préalable des racines par une suspension de
spores de l’antagoniste Trichoderma harzianum. Le succès d’une telle protection
dépend du moment de l’application de l’organisme bénéfique. Ainsi, un délai est
nécessaire entre le traitement protecteur et la survenue de l’infection ultérieure. La
durée de cet intervalle de temps dépend de la nature du couple Verticillium-plante
182
hôte et du type d’agent protecteur. Ce délai peut être très court pour la protection
de la luzerne par Gliocladium roseum et du coton par Talaromyces flavus (Millar
et al ; 1984 ; Murray et al., 1997). Par contre la protection de l’érable par Bacillus
subtilis exige un délai de trois jours ( Hall et al., 1986) alors que l’application de
Trichoderma doit avoir lieu sept jours avant l’infection agressive des aubergines
(Henni, 1987).
Dans nos conditions expérimentales, le délai de 2 jours a conféré aux plantes une
protection positive et durable. Des délais plus courts ou plus long n’occasionnent
qu’une protection partielle. Ce résultat concorde avec nos travaux sur la protection
des tomates contre Verticillium par prémunition grâce à des primo-infections avec
des souches avirulentes du même champignon 2jours avant la surinfection
agressive (Regragui et al., 1989). Des résultats similaires ont été obtenus par
Wymore & Baker, (1983) dans des tentatives de lutte biologique contre la fusariose
de la tomate et par El Aissami, (1999) pour la bioprotection des luzernes contre la
verticilliose avec une rhizobactérie.
La recherche du parasite dans les plantes pré-inoculées avec Trichoderma a
montré clairement que le champignon pathogène réussit à coloniser la totalité de
la plante s’il est inoculé seul ou après un délai de 0 et 1 jour de la primo-infection.
En revanche, il reste localisé dans l’hypocotyle des plantes pré-inoculées 2 et 4
jours avant l’arrivée de l’inoculum pathogène sans atteindre le sommet de
l’épicotyle comme c’est le cas des autres traitements.
L’application de Trichoderma sur les racines des tomates n’empêche pas la
pénétration du parasite mais semble contribuer à retarder sa prolifération à
l’intérieur des tissus par des mécanismes autres que l’action directe avec le
pathogène.
La protection très positive induite par la présence de Trichoderma sur les racines
de tomate pendant 48 heures semble être due à une stimulation des mécanismes
de défense de la plante hôte. Leur efficacité exigerait un délai entre leur mise en
route et l’arrivée de l’agent pathogène. Dans une étude récente, Howell et al.,
(2000) ont montré que le traitement des semences de coton avec Trichoderma
virens 2 jours avant l’infection avec Rhizoctonia solani réduit la gravité de la
183
maladie. Ces auteurs ont souligné que l’induction de la résistance du coton
observée n’est pas due seulement au mycoparasitisme et au phénomène
d’antibiose exercés normalement par le champignon antagoniste, mais plutôt à une
stimulation des réactions de défense des plantes comme la synthèse de
terpénoïdes. Ces phytoalexines ont été extraites des racines de coton traitées par T.
virens et ont montré une action toxique envers Rhizoctonia solani. Les mêmes
auteurs ont montré que le traitement avec T. virens stimule également l’activité
des peroxydases, enzymes impliquées dans les processus de défenses des plantes.
Martinez et al. (1999) ont rapporté à leur tour que les cellulases produites par T.
harzianum déclenche chez les plantes de melon une résistance systémique ayant
pour conséquence une augmentation des activités des peroxydases et des
chitinases. Essalmani (2004) suggère que la bioprotection de la lentille contre la
fusariose par le moyen de T. harzianum est basée aussi bien sur l’antibiose que sur
l’induction de la résistance.
L’induction de la résistance des plantes par Trichoderma harzianum représente
une nouvelle voie très prometteuse pour lutter efficacement contre les maladies
des plantes cultivées et qui permettra de réduire considérablement les doses
massives de pesticides couramment utilisées et qui polluent notre environnement.
Peu de travaux traitent de l’induction de la résistance des tomates contre la
verticilliose par le moyen de Trichoderma d’où l’intérêt de ce travail.
Cette étude, conduite en chambre de culture, n’est qu’une étape préliminaire pour
la mise en évidence de la possibilité de l’induction de la résistance au Verticillium
chez la tomate par une souche de T. harzianum. Elle doit être développée pour une
éventuelle application au champ avec l’incorporation de souches de Trichoderma
capables de coloniser le sol naturellement infesté mais aussi les racines des plantes
susceptibles. Néanmoins, une bonne connaissance de l’organisme antagoniste et
de ses interactions avec la microflore autochtone est nécessaire avant
l’introduction de ce champignon dans notre environnement.
Il faut rappeler que la verticilliose de la tomate est très fréquente le long du littoral
atlantique marocain où les sols sont soumis à l’action des embruns et où les eaux
d’irrigation, chargées de chlorure de sodium, ont un taux de salinité important
184
(Besri, 1981). Aussi, avant d’envisager une stratégie de lutte biologique contre cette
maladie, il faudrait s’assurer de la capacité de l’agent bioprotecteur à supprimer la
maladie dans les conditions salines des sols marocains. Pour ce faire, la suite du
travail vise à tester, en chambre de culture, les capacités de Trichoderma
harzianum à induire la résistance des tomates soumises au stress salin.
2. Impact de la salinité sur le succès de la bioprotection des tomates
contre la verticilliose par Trichoderma harzianum
2.1. Réponses des plantes prétraitées avec Trichoderma à la
surinfection par Verticillium en fonction de la salinité du
milieu
Les plantes observées ont été pré-inoculées par trempage de leurs racines dans une
suspension de spores de Trichoderma 48 heures avant l’infection par Verticillium.
Ces conditions ont permis d’avoir une protection positive des tomates contre
l’action agressive de l’agent pathogène. Les plantes ainsi traitées et les témoins non
pré-inoculées ou les témoins pré-inoculés et non infectés sont répartis en quatre
lots et sont arrosés régulièrement durant six semaines avec la solution nutritive
complète enrichie en NaCl aux concentrations de 0 ; 30 ; 60 et 90mM. Chaque lot
constitué de 4 séries de 15 plantes reçoit un des traitement salin prévus. L’effet de
la salinité sur l’expression de la bioprotection assurée par Trichoderma est évalué
par la croissance des plantes et le pouvoir parasitaire de l’agent pathogène. Nous
n’avons pas estimé la maladie dans cet essai par les altérations foliaires en raison
du jaunissement induit par la présence de sel.
Des résultats reportés sur le graphique 46, il ressort que l’effet de sel se manifeste
par une réduction de la croissance aussi bien des plantes saines que des plantes
protégées ou les plantes malades de contrôle par rapport aux plantes non soumises
au régime salin.
L’effet bénéfique de la pré-inoculation avec Trichoderma s’est bien exprimé chez les
plantes arrosées avec la solution nutritive normale sans NaCl. En effet, la taille des
plantes protégées est significativement similaire à celle des plantes témoins saines
185
Figure 46. Influence de la salinité sur l'expression de la
bioprotection des tomates contre la verticilliose par
Trichoderma harzianum estimée par la taille des plantes
Longueur de l'épicotyle en cm
25
Témoins sains
Trichoderma
Trichoderma + P80
P80 seul
20
15
10
5
0
0
30
60
90
Concentration des solutions d'arrosage en NaCl en mM
186
ou inoculées avec Trichoderma seul et s’écarte nettement de celle des plantes
infectées avec l’agent pathogène.
En présence de sel, trois constations sont à signaler :
-
En présence des faibles concentrations de sel dans la solution
d’arrosage, soit 30mM de NaCl, la taille des plantes est certes plus faible
que celle des plantes développées sans sel, cependant, la protection
conférée par le traitement avec Trichoderma est bien exprimée
puisqu’on ne remarque pas de différence significative entre la hauteur
des tiges des plantes saines et des plantes protégées.
-
En présence des concentrations modérées de sel (60mM de NaCl), on
remarque chez les plantes pré-traitées avec Trichoderma avant
l’infection agressive, une réduction de la taille par rapport à celle des
plantes témoins saines ou inoculées par Trichoderma seul. Toutefois, il
faut noter que ces plantes montrent tout de même, une protection
partielle puisque leur taille est toujours significativement plus élevée
que celle des plantes malades de contrôle.
-
En présence des fortes concentrations de sel, (90mM), toutes les plantes
répondent à ce régime salin par un rabougrissement très prononcé par
rapport aux autres régimes moins concentrés. L’évolution de la taille des
plantes différemment pré-inoculées suit le même schéma que celui
observé à 60mM. La pré-inoculation avec l’agent protecteur a assuré aux
plantes ainsi traitées une légère protection contre Verticillium. En effet,
la taille de ces plantes est intermédiaire entre celle des plantes saines et
des plantes malades témoins.
2.2. Discussion et conclusion
Les résultats obtenus montrent que la pré-inoculation des plantes avec les spores
de Trichoderma harzianum a conféré aux plantes une protection positive contre
l’isolat pathogène de Verticillium aussi bien en absence de sel qu’en présence de
faibles concentrations de NaCl de la solution d’arrosage. Sous les concentrations
modérées ou élevées de nos conditions expérimentales, la protection conférée aux
187
plantes, quoique significative, n’est que partielle par rapport à la protection totale
assurée en conditions normales de culture.
Il est connu que l’efficacité de Trichoderma à protéger les plantes contre les maladies
est sous la dépendance des facteurs de l’environnement (Harman et al., 1981 ; Bea &
Knudsen, 2000 ; Blanca et al., 2001 ; Larkin & Fravel, 2002).
Les facteurs qui ont le plus retenus l’attention des chercheurs sont surtout la
température, l’humidité du sol, le pH et les nématodes. L’originalité de ce travail
est de montrer que la salinité des eaux d’arrosage aux concentrations de 60 et
90mM de NaCl affecte partiellement les capacités de Trichoderma à supprimer la
verticilliose chez la tomate.
Deux hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la protection partielle des
tomates conférée par Trichoderma en présence de sel:
-
La première hypothèse concerne l’action antagoniste directe de
Trichoderma à l’encontre de Verticillium. Nos essais in vitro ont bien
démontré que l’efficacité des différents modes d’action de Trichoderma
n’est diminuée que par les concentrations salines supérieures à 6g/l,
concentrations dépassant les doses de salinité des solutions d’arrosage
utilisées. La faible action de Trichoderma in vivo semble ainsi être liée à
l’intervention de facteurs autres que l’interaction directe des deux
microorganismes.
-
La seconde hypothèse se rapporte au rôle joué par la plante hôte dans
l’expression de la bioprotection. Il a été établi que Trichoderma est
capable d’induire la résistance des plantes en activant ses réponses de
défense. En plus des barrières physiques que l’hôte développe pour
s’opposer à l’invasion par le pathogène, la plante synthétise des
substances ayant pour rôle d’inhiber ou même éliminer l’agent
pathogène. Ces réactions de défense dépendant de l’état physiologique
de la plante ne seraient pas optimales en présence d’un certain degré de
salinité dans le milieu.
Nous avons montré précédemment que la salinité entraîne des perturbations
physiologiques et métaboliques chez la tomate et que certains paramètres
188
physiologiques liés à la salinité peuvent être modifiés par l’addition de l’infection
avec Verticillium. Ces modifications touchent entre autres l’activité de certaines
enzymes comme la nitrate réductase impliquée dans la synthèse des protéines et
les peroxydases qui interviennent dans les processus de résistance des plantes aux
stress abiotiques et biotiques. En fait, nos résultats ont démontré que la
combinaison salinité-Verticillium entraîne une importante chute de l’activité de
ces deux enzymes. Ces données laissent supposer que la diminution de l’effet
protecteur de Trichoderma chez les tomates infectées par Verticillium, en
présence de sel, serait liée à une synthèse insuffisante des protéines PR
(pathogenesis-Related) dont la peroxydase. Ne possédant pas le pool suffisant de
protéines nécessaires à la défense contre les outils pathogéniques de Verticillium,
les plantes n’ont exprimé qu’une protection partielle.
Il apparaît ainsi que l’arrosage des plantes avec des solutions salines assez
concentrées affaiblit les mécanismes de défenses des plantes et qui pourraient se
traduire par une synthèse insuffisante des protéines PR et des substances
antifongiques comme les phytoalexines (Howell et al., 2000). Les travaux de
Sulistyowati & Keane, (1992) ayant mis en évidence une diminution de la synthèse
de phytoalexines dans les rhizomes du Citrus soumis à la salinité viennent appuyer
cette hypothèse.
Il ressort de cette étude que la bioprotection des tomates contre la verticilliose par
Trichoderma peut être appliquée efficacement si les eaux d’arrosage renferment
des taux de salinité de l’ordre de 30mM de NaCl soit une salinité de 1.74g/l. Cette
concentration se rapproche des concentrations salines des eaux utilisées pour
l’irrigation dans les régions du littoral atlantique marocain et qui appartiennent
aux classes C3 (0.48g/l – 1.44g/l) et C4 (1.4g/l – 3.2) définies par Richard (1969).
Ce résultat, obtenu en serre de culture, ouvre une voie encourageante pour
l’établissement d’une stratégie de lutte biologique contre la verticilliose dans les
conditions salines des sols du littoral atlantique où la verticilliose est fréquente.
189
Conclusion générale
La salinité des sols constitue un problème majeur dans les zones où les cultures
irriguées sont pratiquées. Elle est souvent associée à l’augmentation de la sévérité
des maladies causées par les champignons phytopathogènes du sol. Les études
menées pour expliquer les mécanismes par lesquels intervient la salinité dans
l’augmentation de la sensibilité des plantes aux maladies ont surtout mis l’accent
sur une plus grande prédisposition des plantes à l’infection fongique et une
meilleure tolérance au sel de l’agent pathogène. La physiologie de l’interaction
salinité-infection a été peu étudiée dans le cadre de la verticilliose de la tomate.
C’est pour contribuer à développer cet aspect que nous avons mené cette étude.
Elle a débuté par l’évaluation du niveau de tolérance au sel de la plante hôte et de
l’agent pathogène et s’est poursuivie par l’étude de l’interaction salinitéVerticillium sur la relation hôte-parasite, jusqu’à l’étude des modifications
physiologiques et biochimiques induites par cette interaction chez les plantes
doublement stressées et l’évaluation de l’impact de la salinité sur les composantes
biochimiques de l’agressivité du champignon.
Dans un premier temps, nous avons montré que le chlorure de sodium, aux
concentrations voisines de celles des sols du littoral atlantique, affecte la
germination des graines des variétés de tomate Marmande Claudia et VR. et
réprime le développement végétatif des plantules d’environ 50%. Ces deux variétés
présentent une même et moyenne tolérance à la salinité et constituent ainsi un
matériel de choix pour l’étude des effets de l’interaction salinité-Verticillium
d’autant plus qu’elles présentent une forte sensibilité à la verticilliose.
Le comportement de l’isolat P80 de Verticillium d’origine tomate, vis-à-vis de la
salinité, a été étudié in vitro. Plusieurs paramètres de la biologie du champignon
ont été examinés. Nous avons mis en évidence un effet stimulateur du sel sur la
croissance mycélienne et la reproduction de cet isolat, notamment son aptitude à
190
la sporulation et le pouvoir germinatif de ses conidies. Par ailleurs, ce champignon
tolère pour sa croissance des concentrations fort élevées de NaCl de l’ordre de
60g/l.
La capacité du champignon à former les organes de conservation n’est pas stimulée
par la salinité. L’abondance des microsclérotes est optimale pour les
concentrations salines inférieures à 5g/l puis décline. Néanmoins, cette fonction
reste encore appréciable aux très fortes concentrations de NaCl sur les cultures
âgées.
En associant la température comme autre facteur de l’environnement à la salinité,
il s’est avéré que la présence de sel permet au champignon de mieux résister à une
température de 36°C, température sous laquelle la croissance mycélienne est
fortement inhibée dans un milieu dépourvu de sel. La salinité pourrait favoriser
l’adaptation du parasite à des climats chauds et arides.
Pour tenter d’expliquer l’effet du sel sur le développement in vivo du parasite, les
plantes de tomate ont été exposées à la salinité des eaux d’arrosage et à l’infection
par Verticillium. L’effet de cette combinaison s’est manifesté par une action
dépressive de la croissance des plantes. Le rabougrissement exagéré de celles- ci
est le reflet de l’effet additif des deux stress, abiotique et biotique, sur le
développement de l’axe aérien des tomates hôtes sans qu’un effet synergique ne
soit apparent. En revanche, l’interaction salinité-Verticillium a perturbé le
développement de l’appareil foliaire en retardant le déploiement des feuilles par
les tomates sachant que l’émission des feuilles n’est pas altérée par l’infection seule
ou par la salinité seule. Cette perturbation du développement pourrait être
expliquée par une plus grande sensibilité des plantes à la maladie.
L’étude du pouvoir parasitaire du Verticillium en présence de sel a apporté une
confirmation expérimentale à cette hypothèse. En effet, une plus grande
colonisation des tomates par le pathogène a été mise en évidence en conditions
salines de culture.
L’effet stimulateur de la salinité sur la reproduction de Verticillium obtenu in vitro
s’est donc concrétisé in vivo. La composition chimique de la sève qui est le reflet de
191
celle du milieu nutritif pourrait constituer un milieu favorable à la sporulation du
champignon installé dans les racines et permettrait un meilleur envahissement des
tissus par le parasite. La stimulation de la colonisation qui en découlerait serait en
rapport avec une plus grande sensibilité de la plante à l’agent pathogène et une
meilleure expression du pouvoir pathogène du parasite.
Le rapport entre la sensibilité des plantes au Verticillium et l’importance de la
colonisation a été établi par Brand et al. (1984) sur la menthe et par Garas et al.
(1986) sur le coton.
Le pouvoir pathogène de Verticillium est sujet à une grande variabilité qui peut
être expliquée par les variations des composantes de l’agressivité. Ces variations
peuvent être spontanées ou être amorcées par des facteurs de l’environnement du
pathogène. La salinité aurait-elle un effet sur l’expression du pouvoir pathogène du
parasite ?
La réponse à cette question a été recherchée à travers les résultats d’essais
expérimentaux distincts associant le facteur sel à des facteurs susceptibles de
provoquer des variations du pouvoir pathogène, parmi eux la densité de l’inoculum
et le contact avec un hôte inhabituel.
L’analyse des résultats a permis de montrer que l’augmentation des concentrations
salines du milieu nutritif prédispose les plantes de tomate à l’attaque par un
inoculum de faible densité de spores alors qu’un taux d’inoculum suffisant est
nécessaire à la manifestation de la maladie. Ce constat peut être expliqué par nos
résultats sur l’effet stimulateur du sel sur le pouvoir germinatif des conidies de
Verticillium. Cette action du sel peut s’exercer au contact de la plante hôte et
multiplier les points d’attaque permettant ainsi le succès de l’infection et
l’apparition de la maladie.
Des tests de pathogénécité d’un isolat de Verticillium peu virulent sur tomate,
conduits en présence de sel, ont montré que la salinité favorise l’attaque des
plantes par cet isolat initialement non pathogène. Cette cassure de la résistance
des tomates à cet isolat peut être expliquée par une action directe des ions Na+ sur
la saturation en ions Ca++ des constituants des parois cellulaires racinaires suite à
un antagonisme avec les ions Ca++ (Standaert, 1975). Celles ci seraient plus
192
facilement dégradables par les enzymes fongiques. D’autre part, le facteur sel
pourrait agir en inhibant les mécanismes de défense élaborés par la plante pour
faire échouer l’attaque par le parasite.
L’impact de la salinité s’est également manifesté sur la spécificité parasitaire de
Verticillium. Cette notion est en effet sujette à des variations. Ce travail a montré
qu’un isolat d’origine tomate, non pathogène sur luzerne, peut acquérir de
nouvelles capacités pathogènes vis-à-vis de ce nouvel hôte dès le premier contact si
le milieu nutritif est enrichi en sel. Une telle variation du pouvoir pathogène n’est
possible, dans les conditions normales de culture qu’après un contact prolongé de
l’isolat initial avec l’hôte inhabituel (El Aissami & Lahlou, 1999). La résistance des
luzernes semble ainsi être brisée par la salinité. Celle ci constitue donc un danger
dans les sols où la maladie de certains cultivars n’est pas connue et qui hébergent
des génotypes de Verticillium, vu le risque de l’adaptation rapide de ces derniers à
des plantes non spécifiques.
Les causes du changement de la sensibilité des plantes au Verticillium sous stress
salin ont été recherchées d’une part au niveau de la physiologie nouvelle de la
plante hôte doublement stressée et d’autre part, au niveau des mécanismes
d’action du pathogène.
Les réactions physiologiques et biochimiques de la tomate face au stress salin
touchent plusieurs composantes notamment la balance minérale, les taux des
composés osmorégulateurs ; les sucres solubles totaux et la proline, et certaines
activités
enzymatiques
comme
l’activité
nitrate
réductase
et
l’activité
peroxydasique. L’analyse de ces composantes permet de comprendre le
comportement du végétal dans les conditions salines et définir les critères
physiologiques de la tolérance au sel.
L’addition de l’infection au facteur salinité perturbe les caractéristiques
physiologiques et biochimiques liées au stress salin. Ces perturbations se
manifestent par :
193
1. Une altération de la nutrition minérale.
Les plantes de tomate réagissent à la salinité par un déficit en ions K+ compensé
par une accumulation en ions Na+ dans les feuilles. Une réaction analogue est
constatée à la suite de l’infection par Verticillium. La modification des teneurs en
ces ions monovalents est fort accentuée par le cumul des deux stress
particulièrement aux concentrations modérées de sel. L’excès de l’accumulation
des ions Na+ dans les feuilles peut créer un état de toxicité qui nuirait à la
croissance de la plante. Néanmoins, aux fortes concentrations de NaCl, l’effet
additif des deux contraintes sur l’accumulation de ces ions n’est pas observé.
D’autres facteurs doivent intervenir pour ralentir le transport des ions sodium vers
les feuilles.
-
2. Une chute des teneurs en sucres solubles totaux.
La salinité induit une baisse des teneurs en sucres solubles foliaires
particulièrement aux fortes concentrations de sel. Associée à la salinité, l’infection
semble accentuer l’effet néfaste du sel sur ces composés organiques ; les teneurs en
sucres solubles baissent au delà des valeurs normales enregistrées chez les plantes
saines soumises au stress salin. Ce résultat traduit une moindre tolérance des
tomates infectées à la salinité. En effet, les teneurs en sucres solubles totaux sont
de bons indicateurs de tolérance à la salinité chez plusieurs espèces (Rathert,
1984 ; Misra & Dwivedi, 1995).
-
3. Une augmentation des teneurs en proline.
Les teneurs en proline foliaires augmentent avec l’augmentation de la salinité du
milieu nutritif mais aussi avec l’infection verticillienne. Cette augmentation serait
le reflet du degré du déficit hydrique conséquent à l’augmentation du potentiel
osmotique du milieu nutritif et à l’obstruction des vaisseaux du xylème par la
présence du champignon. L’accumulation de cet acide aminé est en effet
considérée comme un indicateur quantitatif des stress qui affectent le statut
hydrique des plantes (Grote & Claussen, 2001). Le déficit hydrique peut à lui seul
expliquer la gravité des symptômes de rabougrissement des plantes doublement
stressées.
194
-
4. Une dépression de l’activité nitrate réductase
Cette enzyme limitante du processus de l’assimilation de l’azote, est légèrement
affectée, dans nos conditions expérimentales par l’infection ou par les
concentrations modérées de NaCl. Seules les fortes concentrations inhibent
l’activité de l’enzyme. L’inhibition de l’enzyme par la combinaison des deux stress
ne peut être écartée comme une cause possible de l’altération sévère de la
croissance des plantes vue l’importance de cette enzyme dans la synthèse des
acides aminés et des protéines.
-
5. Une baisse de l’activité peroxydasique .
L’activité de la peroxydase des racines est stimulée par la salinité ou par l’infection
avec Verticillium. Les niveaux d’activité étant plus élevés dans le cas de l’infection.
L’interaction salinité-Verticillium se manifeste par un effet tout à fait inverse Les
niveaux d’activité de la peroxydase sont souvent corrélés à la résistance des plantes
aux infections (Pegg, 1981 ; Hammerschmidt et al., 1982). La baisse de l’activité
peroxydasique à la suite de l’interaction salinité-infection suppose une action sur
les mécanismes de défense des plantes qui pourrait se traduire par une baisse des
teneurs en produits phénoliques ; facteurs importants dans la résistance des
plantes contre les champignons vasculaires (Pegg, 1981 ; Candela et al., 1995).
Une grande analogie existe donc entre les effets physiologiques de la salinité et
ceux de l’infection avec Verticillium chez la tomate. Certains paramètres
physiologiques modifiés sont corrélés avec la notion de résistance/sensibilité à la
salinité. Ces modifications, accentuées ou déprimées par l’interaction salinitéVerticillium seraient à l’origine des changements dans l’expression des symptômes
communs aux deux stress tel le déficit de la croissance. Ces changements peuvent
correspondre à une moindre tolérance de la plante à la salinité et/ou à la
verticilliose.
Les symptômes de la maladie sont en fait le reflet de l’action des métabolites
toxiques libérés par le parasite dans les tissus infectés. En effet, les mécanismes
physiologiques qui déterminent l’agressivité du Verticillium intéressent la
195
production de toxines (Meyer et al., 1994 ; Nachmiais et al., 1982-1985) et
d’enzymes (Russel,1975 ; Balandina et al., 1976 ; El Aissami & Lahlou, 1998).
Aussi, une influence du sel sur les mécanismes d’action du Verticillium est une
éventualité qui ne peut être écartée. Cette suggestion a été vérifiée par des tests in
vitro visant à montrer l’influence du sel sur les composantes du pouvoir pathogène
de l’isolat de Verticillium.
L’évaluation de l’effet du sel sur le pouvoir toxinogène du Verticillium, à l’aide de
biotests, a montré une augmentation de la phytotoxicité des filtrats de culture avec
l’élévation des concentrations en sel du milieu de culture. Cette modification de la
phytotoxicité in vitro laissent supposer une action positive de la salinité de la sève
des plantes soumises au stress salin sur les capacités toxinogènes de Verticillium
in vivo en touchant entre autres la qualité et/ou la quantité de toxines produites à
l’intérieur des vaisseaux de la plante hôte favorisant ainsi l’apparition des
symptômes (Keen et al., 1972 ; Chaib, 1987).
Nos
résultats
ont
également
montré
une
stimulation
de
l’activité
carboxyméthylcellulase en fonction de la salinité croissante du milieu CMC
approprié à la production de l’enzyme (Regragui et al., 2003). La production des
polysaccharidases par Verticillium peut varier avec la nature de la source de
carbone (Gupta & Heale, 1971 ; Bakhali, 1995). Cette étude a mis en évidence, pour
la première fois, l’effet du chlorure de sodium sur l’activité cellulolytique de
Verticillium rejoingnant les travaux de El Abyad et al. (1992) sur l’impact de la
salinité du milieu sur les activités enzymatiques de Sclerotium. rolfsii et de
Rhizoctonia. Solani.
En revanche, le sel semble avoir un effet négatif sur l’activité des phénoloxydases,
produites par le champignon, principalement les laccases. En effet, l’activité de ces
enzymes diminue dès que le milieu s’enrichit en NaCl. Ces enzymes ne sont pas
liées directement à la pathogénèse du champignon mais peuventt intervenir dans
sa phase saprophytique en dehors de la plante hôte ; le champignon vit, en effet,
sur les débris végétaux qu’il dégrade en tant que saprophyte (Lahlou, 1983).
La modification des activités enzymatiques serait associée à une action plus
profonde du sel sur la synthèse des protéines extracellulaires par Verticillium.
196
L’analyse biochimique des filtrats de culture a révélé une augmentation de la
quantité de protéines excrétées dans les milieux de culture lorsque ces derniers
sont amendés avec NaCl (2-6g/l). Cette hausse des taux de protéines a été
accompagnée d’une variation du pH final des filtrats qui est passé de la neutralité à
une légère alcalinité aux concentrations inductrices. Les variations du pH
traduisent une diversité dans la production métabolique du parasite soumis au
régime salin.
L’analyse électrophorétique des protéines, excrétées dans les filtrats de culture, a
permis de rendre compte de cette diversité. Elle a mis en évidence d’une part, une
action positive du sel sur l’expression des protéines majeures de PM 63 ; 73 et 76
Kda et d’autre part, l’absence de la protéine 45 Kda à partir de 4g/l et la synthèse
de novo de deux nouvelles protéines.
Les changements dans la quantité et la qualité des protéines secrétées seraient
corrélés à une plus grande virulence de l’agent pathogène en présence de sel. Cette
suggestion va dans le sens des observations d’autres travaux ayant mis en rapport
la quantité de protéines excrétées et la pathogénécité des isolats de Verticillium
(Chaib, 1987 ; Saksirirat & Hoppe, 1991 ; Nachmias et al., 1992).
Dans l’objectif de lutter efficacement contre la verticilliose par un moyen non
polluant et sans inconvénients pour l’environnement, la bioprotection des tomates
contre la verticilliose a été tentée en conditions salines de culture.
Une étude préliminaire conduite in vitro a mis en évidence que l’antagonisme
microbien de plusieurs microorganismes bénéfiques du sol (Penicillium sp,
Talaromyces flavus, Trichoderma harzianum, Fusarium oxysporum non
pathogène et Bacillus sp) vis-à-vis du Verticillium est stimulé par la salinité du
milieu de culture. L’action favorable du sel serait due à la bonne tolérance à la
salinité de ces différents antagonistes. Parmi ces derniers, Trichoderma
harzianum a été retenu pour des essais in vivo en raison de son action antagoniste
très performante à l’égard de l’isolat P80 de Verticillium.
197
L’analyse des effets du sel sur l’efficacité des différents modes d’action de T.
harzianum in vitro a montré que l’action antagoniste, exercée par compétition et
par antibiose, n’est affaiblit que par des concentrations de NaCl élevées dépassant
celles des sols salins marocains.
L’antagonisme de T. harzianum, bien exprimé in vitro, a été testé in vivo au
contact de la plante hôte. Dans les conditions normales de culture, le traitement
préalable des racines de tomate par les spores de l’antagoniste a conféré aux
plantes une protection positive qui s’est exprimée par la réduction de l’action
dépressive du parasite sur la croissance des plantes.
Le succès de cette protection dépend du délai séparant la pré-inoculation de
l’inoculation agressive. Un délai de 48heures a assuré une protection positive des
tomates contre la verticilliose. Cet intervalle de temps semble nécessaire pour le
déclenchement des réponses de défense de la plante à la suite de la primoinfection.
Les mécanismes de défense des plantes sont complexes et font appel à des
mécanismes cellulaires, biochimiques et moléculaires. Plusieurs travaux ont mis
en évidence la synthèse des protéines PR (Pathogenesis related) et des
phytoalexines. Howell et al. (2000) ont pu isolé des terpénoides des racines de
coton inoculées avec Trichoderma virens. Ces molécules possèdent des propriétés
antifongiques contre R. solani. D’autres phytoalexines extraites des feuilles de
luzerne à la suite d’inoculation incompatible inhibent la germination des spores de
V. albo-atrum et freine la progression du champignon dans la totalité de la plante
(Flood & Milton, 1982). Ce dernier point vient réconforter notre résultat
concernant le retard de la colonisation des tiges par l’agent pathogène chez les
plantes de tomate protégées par T. harzianum.
En fait, la présence de l’antagoniste sur les racines de tomate 48 heures avant
l’infection par le pathogène ne s’oppose pas à l’invasion de la racine par le parasite,
mais semble retarder l’avancée mycélienne dans la totalité des tissus du xylème
grâce à des mécanismes qui reste à élucider.
198
Dans la nature, l’efficacité de cet antagoniste dépend des facteurs de
l’environnement. Aussi, sa capacité à induire la résistance des tomates à
Verticillium a été examinée en conditions salines de culture. Les résultats de cette
étude a dévoilé que la bioprotection des tomates arrosées avec des solutions salines
à 30mM de NaCl est aussi satisfaisante que celle conférée en absence de sel. Des
concentrations salines plus élevées ne permettent qu’une protection partielle alors
qu’elles ne semblent pas réduire l’action antagoniste de T. harzianum in vitro.
Cette constatation souligne le rôle joué par la plante dans l’expression de la
bioprotection. Le degré de protection acquise dépendrait donc de l’efficacité des
mécanismes de défense mis en jeu avant le processus de la pathogénèse. La
performance de ces derniers serait affaiblie en présence d’un certain degré de
salinité.
Il faut toutefois signaler que les concentrations salines favorables à l’expression de
l’antagonisme in vivo de T. harzianum s’alignent avec les taux de salinité des eaux
d’irrigation utilisées dans les régions du littoral atlantique.
Grâce aux résultats obtenus, le contrôle biologique de Verticillium par T.
harzianum peut être suggéré pour éliminer la maladie dans les sols salins comme
alternative à l’utilisation des traitements chimiques actuellement fort contestés.
Certes, la protection conférée aux plantes a été obtenue dans des conditions
contrôlées de culture et d’inoculation. L’agent inducteur de la résistance a été
effectivement appliqué directement sur les racines pour assurer une colonisation
efficace de celles-ci par le microorganisme bénéfique. Pour compléter cette étude,
des essais au champ sont nécessaires pour tester la capacité de Trichoderma
harzianum à coloniser les sols salins et à empêcher la réussite de l’infection avec
Verticillium en agissant par antagonisme ou par induction de la résistance.
L’étude préalable de son interaction avec les autres microorganismes du sol est
primordiale avant son incorporation dans notre environnement.
En perspective, les résultats de cette étude ouvrent des voies de recherche
intéressantes.
199
Nos tests se sont limités à l’analyse des paramètres physiologiques liés à la
combinaison salinité-Verticillium. D’autres études doivent se pencher sur la
caractérisation biochimique des protéines extracellulaires synthétisées de novo par
le champignon sous régime salin et leur effet sur la plante.
Les recherches sur la bioprotection des tomates pourront se poursuivre par l’étude
de l’impact de la salinité sur les mécanismes de défense, physiques et
biochimiques, impliqués dans l’induction de la résistance au Verticillium par T.
harzianum.
Elles porteront d’une part, sur les modifications structurales des cellules
provoquées par le traitement avec les spores de T. harzianum et d’autre part, sur la
caractérisation biochimique des molécules défensives et l’évaluation de leur
pouvoir antifongique.
Il se trouve par ailleurs que certaines souches de Trichoderma sp semblent exercer
une action stimulatrice de la croissance des plantes. La recherche de souches de
Trichoderma sp à la fois tolérantes au sel, stimulatrices de la croissance et
antagonistes à Verticillium pourrait ouvrir de nouveaux horizons visant
l’amélioration et la protection des plantes dans les zones où le problème de la
salinité est posé.
200
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216
ANNEXES
ANNEXE 1 : Milieux de culture et solution d’arrosage
- Milieu PDA :
*PDA (Difco)
40g
*Gélose
5g
*Eau distillée
1L
Autoclaver à 110°c pendant 30 minutes
- Milieu Malt
*Extrait de malt
20g
*Gélose
20g
*Eau distillée
1L
Autoclaver à 110°c pendant 30 minutes
- Milieu Czapeck liquide
*NaNO3
2g
*KH2 PO4
1g
*MgSO4 7H2O
0.5g
*KCL
0.5g
*FeSO4 7H2O
0.01g
*Saccharose
30g
*Eau distillée
1L
Autoclaver à 120°C pendant 30 minutes
-Solution nutritive d’arrosage
*Ca(NO3)2 4H2O
*Mg SO4 7H2O
*KH2PO4
*K2H PO4
*KNO3
*NH4 NO
*(NH4)2 SO4
*Oligo-élément (a)
*Complexe ferrique(b)
*Eau distillée
0.935g
0.544g
0.181g
0.058g
0.353g
0.023g
0.086g
0.05ml
0.5ml
1000ml
(a) ZnSO4 7H2o : 100mg - MmnCl2 4H2O:100mg - H3BO3 :100mg
FeCl3 6H2O :50mg – CuSO4 5H2O64mg – KI:10mg
NH4 MoO4 :10mg – Eau distillée qsp :1000ml
(b) Dissoudre 21g de complexon II (EDTA) dans 286ml de KOH N et
ajouter 24.9mg FeSO4 7H2O. Ajuster à environ 950ml avec de l’eau distillée
puis agiter le tout à l’air pendant une nuit.Ajuster le pH à 5.5 avec de la
potasse. Compléter à 1000ml.
217
ANNEXE 2 : Electrophorèse SDS-PAGE
A. Solutions stocks
Utiliser de l’eau bidistillée fraiche. Toutes les solutions doivent être filtrées sur
papier Wattman n°1 après dissolution. Les pH des solutions doivent être vérifiés
avant chaque utilisation
1. Solution d’acrylamide-bis : protogel
*Acrylamide
30g
*Bis-acrylamide
0.8g
*H2O
1000ml
Conserver à l’obscurité à 4°C (1 à 2 mois)
2. Tampon pour gel de séparation (resolving gel buffer)
*Tris-Cl (1.5M)
*H2O qsp
36.3g
200ml
Ajuster le pH à 8.8 avec HCl. A conserver deux mois à 4°C
3. Tampon pour gel de concentration (Staking gel buffer)
*Tris-Cl 1M
6g
*H2O qsp
50ml
Ajuster le pH à 6.8 avec HCl
4. Solution de SDS à 10% (Sodium dodecyl sulfate)
*SDS
*H2O
10g
100ml
Conserver à la température ambiante plusieurs semaines.
5. tampon de migration x 5
*Tris-base
15.1g
*Glycine
94g
*SDS
50ml de la solution SDS à 10%. A ajouter
au dernier moment.
6. Solution de persulfate d’ammonium à 10%
A préparer au dernier moment
*Persulfate
*H2O
100mg
1ml
218
B. Préparation des gels
1. Gel de séparation à 10% d’acrylamide
Mélanger dans une fiole à vide de 500ml :
Protogel
16.7ml
Tris-Cl 1.5M
12.5ml
SDS
0.5ml
H2O
19.5ml
Ajouter goutte à goutte
Persulfate d’ammonium
TEMMED
500µl
20µl
Dégazer sous vide jusqu’à disparition complète des bulles. Couler immédiatement
le gel avec une pipette de 5ml. Mettre un mince filet d’eau à la surface du gel pour
éviter toute évaporation
2. Gel de concentration (Staking) à 5%
Mélanger dans une fiole à vide de 250ml
Protogel
Tris-HCl 1M
1.7ml
1.25ml
SDS
0.1ml
H2O
6.8ml
Mélanger et dégazer sous vide comme précédemment. Pendant ce temps, éliminer
l’eau à la surface du gel de séparation. Rincer trois fois avec le tampon Tris-HCl 1M
dilué au ¼. Eliminer le maximum de tampon avec du papier Joseph.
Après dégazage, ajouter
Persulfate d’ammonium
TEMED
100µl
10µl
Couler sur le gel précédent avec une pipette de 1ml. S’assurer de la polymérisation
du gel dans le liquide qui reste dans la fiole.
Placer le peigne entre les deux plaques de verre pour former les puits. Après
polymération du gel, le peigne est enlevé et les puits sont rincés.
C. Préparation des extraits avant dépôt
1. Solution de traitement des échantillons
*Tampon TrisHCl 0.5M
1.25ml
219
*SDS à 10%
2ml
*Glycérol
1ml
*mercaptoéthanol
0.5ml
*Bleu de bromophénol à 1%
2.
0.20ml
traitement des échantillons
Mélanger l’échantillon à analyser volume à volume (ex 50µl + 50) dans la solution
de traitement.
Chauffer 5 minutes à 100°C en faisant un trou dans l’eppendorf. Les échantillons
peuvent être conservés à –20°C et réchauffés avant utilisation.
D. Courbe étalon des protéines standards
2,4
2,3
2,2
Log PM
2,1
2
1,9
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
0,02
0,14
0,28
0,35
0,79
mobilité relative
Les zymogrammes sont établis après chaque révélation. Le rapport frontal est
calculé par la suite comme suit :
RF=
distance parcourue par la bande
Distance parcourue par le front de migration
Les PM des différentes bandes sont déterminés par extrapolation de la courbe
étalon des protéines standards.