Étude du transport des sucres dans les racines d`Arabidopsis
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THÈSE Pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS UFR des sciences fondamentales et appliquées Ecologie et biologie des interactions - EBI (Poitiers) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006) École doctorale : Sciences pour l'environnement - Gay Lussac Secteur de recherche : Biologie des organismes ; Biotechnologies animales, végétales et microbiennes Présentée par : Dany Mainson Étude du transport des sucres dans les racines d'Arabidopsis thaliana au cours de son cycle de développement et en réponse à un stress osmotique Directeur(s) de Thèse : Rémi Lemoine, Nathalie Pourtau Soutenue le 11 janvier 2013 devant le jury Jury : Président Soulaïman Sakr Professeur des Universités, Université de Angers Rapporteur Soulaïman Sakr Professeur des Universités, Université de Angers Rapporteur Alain Bouchereau Professeur des Universités, Université de Rennes 1 Membre Rémi Lemoine Directeur de recherche, CNRS, Université de Poitiers Membre Nathalie Pourtau Maître de conférences, Université de Poitiers Membre Jean-Louis Durand Chargé de recherche, INRA de Lusignan Membre Patrick Armengaud Assistant de recherche, INRA de Versailles Pour citer cette thèse : Dany Mainson. Étude du transport des sucres dans les racines d'Arabidopsis thaliana au cours de son cycle de développement et en réponse à un stress osmotique [En ligne]. Thèse Biologie des organismes ; Biotechnologies animales, végétales et microbiennes. Poitiers : Université de Poitiers, 2013. Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr> THESE Pour l’obtention du Grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS (Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme national – Arrêté du 7 août 2006) Ecole doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac Secteur de recherche : Biologie des organismes ; Biotechnologies Animales, Végétales et Microbiennes Présentée par : Dany MAINSON ********************** Etude du transport des sucres dans les racines d’Arabidopsis thaliana au cours de son cycle de développement et en réponse à un stress osmotique ********************** Travaux dirigés par Rémi LEMOINE et Nathalie POURTAU Soutenance prévue le 11 janvier 2013 à Poitiers devant la commission d’examen JURY Alain BOUCHEREAU Soulaiman SAKR Jean-Louis DURAND Patrick ARMENGAUD Rémi LEMOINE Nathalie POURTAU Professeur de l’Université de Rennes Professeur de l’Université d’Angers Chargé de recherche INRA, Lusignan Assistant de recherche INRA, Versailles Directeur de recherche de l’Université de Poitiers Maître de conférence de l’Université de Poitiers Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur THESE Pour l’obtention du Grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS (Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme national – Arrêté du 7 août 2006) Ecole doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac Secteur de recherche : Biologie des organismes ; Biotechnologies Animales, Végétales et Microbiennes Présentée par : Dany MAINSON ********************** Etude du transport des sucres dans les racines d’Arabidopsis thaliana au cours de son cycle de développement et en réponse à un stress osmotique ********************** Travaux dirigés par Rémi LEMOINE et Nathalie POURTAU Soutenance prévue le 11 janvier 2013 à Poitiers devant la commission d’examen JURY Alain BOUCHEREAU Soulaiman SAKR Jean-Louis DURAND Patrick ARMENGAUD Rémi LEMOINE Nathalie POURTAU Professeur de l’Université de Rennes Professeur de l’Université d’Angers Chargé de recherche INRA, Lusignan Assistant de recherche INRA, Versailles Directeur de recherche de l’Université de Poitiers Maître de conférence de l’Université de Poitiers Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur REMERCIEMENTS Je tiens tout d’abord à remercier la Région Poitou-Charentes pour m’avoir accordé la confiance nécessaire en finançant ces travaux. Je tiens à remercier Rossitza Atanasova pour m’avoir permis de rédiger ce manuscrit dans de bonnes conditions. J’adresse mes remerciements à Alain Bouchereau et Soulaiman Sakr pour m’avoir fait l’honneur de juger ce travail en qualité de rapporteurs. Je remercie également Jean-Louis Durand et Patrick Armengaud pour leur participation à mes comités de suivi de thèse, ainsi que pour avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse. Je présente aussi mes remerciements à Marie-Pascale Prud’Homme et Nathalie Noiraud pour avoir accepté de discuter de mon travail au cours de mes différents comités de thèse. Je remercie Rémi Lemoine pour m’avoir chaleureusement accueilli dans son laboratoire et pour m’avoir guidé dans mes travaux de thèse. Je remercie également Nathalie Pourtau pour m’avoir encadré pendant ces trois ans de thèse. Je garderai de très bon souvenir de notre cohabitation dans le bureau et de nos récoltes nocturnes ! Je tiens aussi à les remercier tous les deux pour la patience et la grande disponibilité dont ils ont fait preuve lors de la rédaction de ce manuscrit. Merci aussi à Laurence Maurousset pour ta gentillesse et pour tes conseils avisés sur l’interprétation de certains résultats, lors de l’écriture de ce manuscrit. Je remercie bien sur Benoît Porcheron et Cécile Gaillard pour leur aide précieuse pendant ces trois années de laboratoire. Beaucoup de mes manips auraient été très laborieuse sans votre participation ! Je remercie aussi Vincent Lebeure et Bruno Faure pour avoir porté un œil attentif sur mes plantes. Un merci à Maryse Laloi et Sylvain La Camera pour m’avoir initié aux techniques de macroarray et RT-qPCR. Mes remerciements s’adressent aussi à Christelle Roudaut pour tout le travail qu’elle a fourni derrière son spectromètre de flamme. Je remercie tous mes collègues thésards et ex-thésards du laboratoire (Damien, Anna, Audrey, Cyril, Pauline, Jonathan et Mickael). Je remercie tout particulièrement Pauline, pour tous les bons moments partagés ensemble dans le bureau, et pour toutes tes petites manies irrésistibles. Un très grand merci aussi à Jo et Lydia pour leur soutien infaillible et pour m’avoir fait profiter de leurs excellents dons de cuisiniers. Je remercie aussi tous mes autres collègues du laboratoire (chercheurs, techniciens et secrétaires) pour leur gentillesse et leur soutien au cours de mes 3 années de thèse. Une pensée particulière pour Andrée Bourbouloux, avec qui j’ai partagé le grand labo et de longues discussions … Merci aussi à Manuel Vaury, Arnaud Traineau et Florian Veillet, pour leur précieuse participation à mes travaux de recherche au cours de leur stage. Enfin, un énorme merci à ma famille et mes amis pour leur soutien indéfectible. Je remercie très affectueusement mes parents et Agnès, qui m’ont toujours encouragé et soutenus tout au long de ces trois ans de thèse. Je dédie l’ensemble de ce travail à JMS. ABREVIATIONS ABA Acide Abscissique Act Actine ADN Acide désoxyribonucléique (c : complémentaire) AOS Active Oxygen Species ARN Acide Ribonucléique ATP Adénosine Triphosphate BET Bromure d’Ethidium BSA Bovine Serum Albumin CNRS Centre National de la Recherche Scientifique Col-0 Accession Colombia 0 Ct Cycle Threshold dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DNase Désoxyribonucléase dNTP Desoxyribonucléotide dTTP Desoxythymidine triphosphate DO Densité Optique DST DiSaccharide Transporter EDTA Acide Ethylène Tétra Acétique EF1α Elongation Factor 1 alpha ERD Early Responsive to Dehydratation FAO Food and Agriculture Organization GAPDH Glyceraldéhyde 3-Phosphate Déhydrogenase His Histone HPLC High Performance Liquid Chromatography INRA Institut National de la Recherche Agronomique INT Inositol Transporter LEA Late Embryogenesis Abundant Ler Accession Landsberg erecta MES Acide 2-(n-Morpholino Ethanesulfonique MF Masse Fraiche MI Masse Imbibée MPa Méga Pascal MS Murashigue et Skoog MST Major Facilitator Superfamily NADP Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate Oligo (dT) Oligo-desoxythymine Osm Osmolarité PAR Photosynthetically Active Radiation pb Paire de bases PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyéthylène Glycol pGlcT Plastidic Glucose Transporter pH Potentiel Hydrogène RD Responsive Dehydratation REB RNA Extraction Buffer PLT Polyol Transporter PVPP Polyvinylpolypyrrolidone R/S Rapport Root/Shoot RT Reverse Transcription RT-qPCR Real-Time quantitative PCR RWC Relative Water Content SDS Sodium dodécylsulfate SIC Signal, Image et Communication SSC Standard Sodium Citrate STP Sugar Transporter Protein SUC Sucrose Carrier TM Température d’hybridation TMT Tonoplast Monosaccharide Transporter Tris Tri-(hydroxyméthyl)-amino méthane UMR Unité Mixte de Recherche UTR Untanslated Terminal Region UV Ultraviolet VGT Vacuolar Glucose Transporter TABLE DES MATIERES 1. INTRODUCTION 1 1.1 Le transport des sucres chez les végétaux supérieurs .................................................. 2 1.1.1 Production des sucres ........................................................................................... 2 1.1.2 Chargement dans le phloème ............................................................................... 3 1.1.3 Déchargement du phloème dans les organes puits ............................................... 4 1.2 Distribution des ressources carbonées dans la plante .................................................. 4 1.3 Les transporteurs de sucre chez Arabidopsis thaliana ................................................ 5 1.3.1 Les gènes de transporteurs de disaccharides (DSTs) : ......................................... 5 1.3.2 Les gènes de transporteurs de monosaccharides (MSTs) : .................................. 6 1.4 1.4.1 Stratégies adaptative des plantes en réponse au stress hydrique .......................... 9 1.4.2 Mécanismes de tolérance des plantes au déficit hydrique .................................. 10 1.4.3 Réponse des racines au déficit hydrique ............................................................ 13 1.4.4 Modification du transcriptome lors d’un stress hydrique................................... 14 1.5 2 Le déficit hydrique ....................................................................................................... 8 Objectifs de l’étude .................................................................................................... 15 MATERIEL ET METHODES .......................................................................................... 17 2.1 Matériel végétal ......................................................................................................... 18 2.2 Méthodes ................................................................................................................... 18 2.2.1 Mise en place du système de culture des plantes en hydroponie ....................... 18 2.2.2 Contrôle du développement des plantes cultivées en hydroponie ...................... 20 2.2.3 Etude du cycle complet de développement d’Arabidopsis thaliana (Col-0) cultivée en hydroponie et mesure de quelques paramètres reflétant son métabolisme carboné ............................................................................................................................ 21 2.2.4 Etude quelques paramètres reflétant le métabolisme carboné d’Arabidopsis thaliana au cours du cycle nycthémère ............................................................................. 21 2.2.5 Mise en place du stress osmotique sur Arabidopsis thaliana cultivée en hydroponie ........................................................................................................................ 22 2.2.6 Mise en place du système de culture d’Arabidopsis thaliana en rhizobox ........ 23 2.2.7 Suivi physiologique des plantes ......................................................................... 26 2.2.8 Méthodes d’analyse de l’expression des gènes .................................................. 31 2.2.9 Méthodes d’analyse biochimique ....................................................................... 35 2.2.10 Etude du transport de [U-14C]-saccharose .......................................................... 36 2.2.11 3 Analyses statistiques .......................................................................................... 38 RESULTATS ET DISCUSSION ..................................................................................... 39 3.1 Mise en place de la culture en hydroponie ................................................................ 40 3.1.1 Mesure de paramètres physiques de la chambre de culture et du milieu de culture - 3 - ..................................................................................................................... 40 3.1.2 Etude du développement végétatif d’Arabidopsis thaliana (C24) en culture hydroponique .................................................................................................................... 46 3.2 Etude du cycle complet de développement d’Arabidopsis thaliana (Col-0) cultivée en hydroponie et mesure de quelques paramètres reflétant son métabolisme carboné ........ 56 3.2.1 Observation du phénotype .................................................................................. 57 3.2.2 Répartition de la biomasse ................................................................................. 57 3.2.3 Etude de la teneur en chlorophylles. .................................................................. 60 3.2.4 Discussion .......................................................................................................... 61 3.2.5 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre ................................ 67 3.2.6 Etude de la teneur en sucres solubles : saccharose, glucose et fructose ............. 79 3.2.7 Etude de la teneur en amidon au cours du développement. ............................... 89 3.2.8 Etude du flux de saccharose radiomarqué : ........................................................ 92 3.2.9 Bilan ................................................................................................................... 96 3.3 Etude de quelques paramètres liés au métabolisme et au transport du carbone au cours d’une période de 24h. .................................................................................................. 98 3.3.1 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre par macroarray ....... 98 3.3.2 Etude du contenu en sucre solubles (saccharose, glucose, fructose)................ 100 3.3.3 Etude de la teneur en amidon ........................................................................... 101 3.3.4 Discussion ........................................................................................................ 101 3.3.5 Bilan ................................................................................................................. 105 3.4 Mise en place d’un protocole de stress osmotique en hydroponie .......................... 106 3.4.1 Mise en place du stress osmotique sur l’écotype Col-0 (Essai stress Col-0) ... 106 3.4.2 Discussion : ...................................................................................................... 109 3.5 Etude d’une cinétique de stress osmotique (« Campagne stress ») ......................... 113 3.5.1 Observation phénotypique des plantes ............................................................. 114 3.5.2 Etude de l’état hydrique des plantes ................................................................. 114 3.5.3 Détermination des masses sèches et du rapport Root/Shoot (rapport R/S) ...... 115 3.5.4 Teneurs en chlorophylles au cours du stress .................................................... 116 3.5.5 Suivi du contenu en quelques éléments constitutifs de la plante ..................... 116 3.5.6 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre au cours d’une cinétique de stress osmotique.......................................................................................... 117 3.5.7 Etude de la teneur en sucres solubles au cours d’une cinétique de stress osmotique ........................................................................................................................ 119 3.5.8 Etude de la teneur en amidon au cours d’une cinétique de stress osmotique ... 120 3.5.9 Discussion ........................................................................................................ 120 3.6 Mise en place du stress osmotique suivi d’une réhydratation sur l’écotype Col-0 (« Essai réhydratation ») ..................................................................................................... 125 3.6.1 Observation phénotypique des plantes ............................................................. 126 3.6.2 Etude de l’état hydrique des plantes :............................................................... 127 3.6.3 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre par qRT-PCR ....... 129 3.6.4 Discussion ........................................................................................................ 131 3.7 3.7.1 Observation phénotypique des plantes ............................................................. 134 3.7.2 Suivi de la croissance des plantes .................................................................... 134 3.7.3 Suivi de la conductance stomatique au cours du stress hydrique ..................... 135 3.7.4 Etude de l’état hydrique des plantes ................................................................. 136 3.7.5 Evolution de la biomasse.................................................................................. 136 3.7.6 Suivi du contenu en chlorophylles ................................................................... 138 3.7.7 Suivi du contenu en quelques élément constitutif de la plante......................... 138 3.7.8 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre .............................. 139 3.7.9 Etude de la teneur en sucres solubles ............................................................... 139 3.7.10 Etude de la teneur en amidon ........................................................................... 140 3.7.11 Etude du flux de saccharose radiomarqué ........................................................ 141 3.7.12 Discussion ........................................................................................................ 142 3.8 5 Etude d’un stress hydrique suivi d’une réhydratation (Campagne réhydratation) .. 133 Etude du stress hydrique en culture rhizobox .......................................................... 148 3.8.1 Suivi du phénotype des plantes ........................................................................ 148 3.8.2 Suivi de la croissance du réseau racinaire ........................................................ 149 3.8.3 Suivi de l’état hydrique des plantes.................................................................. 151 3.8.4 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucres ............................ 152 3.8.5 Discussion ........................................................................................................ 152 CONCLUSION ............................................................................................................... 156 5.1 La culture en hydroponie ......................................................................................... 157 5.2 Le stress osmotique ................................................................................................. 159 5.3 Transporteurs de sucre et transport de saccharose ................................................... 164 5.4 Les sucres ................................................................................................................ 166 6 PERSPECTIVES ............................................................................................................ 168 7 BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................................... 171 INTRODUCTION 1 INTRODUCTION 1 INTRODUCTION 1.1 Le transport des sucres chez les végétaux supérieurs Chez les végétaux supérieurs, les organes qui composent la plante peuvent être divisés en deux catégories selon leur bilan carboné. D’un côté les organes sources, lieu de photosynthèse, où la quantité de sucres produite est supérieure à ce qui est nécessaire pour la croissance et développement. Ce sont essentiellement les feuilles matures des plantes qui entrent dans cette catégorie. De l’autre côté, les organes puits sont incapables d’effectuer la photosynthèse et, par conséquent, sont nourris par les organes sources. Les sucres représentent la principale source d’énergie des plantes mais sont aussi indispensables comme élément de base dans la formation des réserves (amidon), des parois (cellulose), comme squelette carboné dans la synthèse de métabolites (acides aminés ou métabolites secondaires), voire comme molécule signal (Lalonde et al. 2003). Ainsi, une partie des glucides produits par la photosynthèse est directement utilisée pour la croissance des organes sources, une partie y est stockée temporairement (amidon, saccharose vacuolaire) et le reste est exporté vers les organes puits. Parmi les organes puits on peut trouver les racines, mais aussi les tiges, fleurs, graines ou les feuilles en développement. Afin d’alimenter les organes puits en molécules carbonées, un transport constant des photoassimilats des feuilles sources vers ces derniers, via le phloème, est donc nécessaire tout au long du développement de la plante (Ho 1988). Ce transport peut être décomposé en 3 principales étapes : le transport latéral du lieu de synthèse des sucres jusqu’au phloème, le transport longitudinal dans les tissus conducteurs du phloème et enfin le transport latéral au niveau de l’organe puits receveur. 1.1.1 Production des sucres La photosynthèse a lieu majoritairement dans les cellules du mésophylle des feuilles matures (organes sources), et les produits de ce processus sont les trioses phosphate. Ces molécules sont soit directement utilisées pour la synthèse d’amidon dans les chloroplastes où ils ont été synthétisés, soit exportés vers le cytosol pour être convertis en saccharose (Frommer and Sonnewald 1995). Le saccharose constitue le sucre majoritairement transporté chez les végétaux supérieurs (Lemoine 2000). En effet, c’est un sucre assez inerte puisque non réducteur et relativement insensible au métabolisme (seules deux enzymes sont capables de dégrader le saccharose : les invertases et la saccharose synthase). Une fois synthétisé, le saccharose peut être transporté dans la vacuole, où il est stocké temporairement (Lemoine 2000). 2 Figure 1 : Chargement du saccharose dans le phloème (Conde et al. 2007). Le saccharose (S) produit dans les cellules du mésophylle peut être chargé dans le phloème par la voie symplastique ou par la voie apoplastique. Dans la voie symplastique le saccharose diffuse à travers les plasmodesmes jusqu’au complexe cellule compagne/tube criblé. Dans le chargement apoplastique, le saccharose relâché dans l’apoplaste des cellules du mésophylle est importé dans les cellules compagnes par transport actif. (1) Symport Saccharose/H+ (source) ; (2) ATPase H+ de la membrane plasmique. INTRODUCTION 1.1.2 Chargement dans le phloème A partir des cellules du mésophylle où il est synthétisé, le saccharose va dans un premier temps circuler par la voie symplastique vers les cellules parenchymateuses du phloème (Figure 1). Ce transport se fait via les plasmodesmes des cellules en suivant le gradient de concentration du saccharose (Lalonde et al. 2003). Le saccharose doit ensuite être chargé des cellules parenchymateuses dans le complexe conducteur (tube criblé-cellule compagne). Deux mécanismes peuvent intervenir dans le chargement du phloème : une voie symplastique et une voie apoplastique (Kühn et al. 1999, Truernit 2001). Dans le cas du chargement symplastique, le saccharose est transporté par le biais de plasmodesmes élargis entre les cellules du parenchyme et le complexe conducteur (cellules compagnes puis tubes criblés). Dans le cas d’un chargement apoplastique, le saccharose doit dans un premier temps être transféré des cellules parenchymateuses vers l’apoplaste. Ce transport à travers la membrane des cellules est facilité par la présence de protéines transmembranaires : les transporteurs d’efflux du saccharose. Chez Arabidopsis thaliana , deux transporteurs seraient impliqués : les protéines AtSWEET11 et AtSWEET12 (Chen et al. 2012). Ces deux transporteurs n’utilisent pas d’énergie pour transporter le saccharose et leur fonctionnement s’apparenterait plus à celui des canaux. Une fois dans l’apoplaste, le saccharose doit être chargé dans les cellules compagnes du phloème. La concentration en saccharose du phloème étant beaucoup plus importante que celle des cellules de l’apoplaste, un transport actif du saccharose est nécessaire. Ce transport est assuré par des protéines spécialisées présentes sur la membrane plasmique de ces cellules, les transporteurs de sucre. Ces protéines transportent le saccharose en utilisant la force protomotrice, permettant ainsi l’import du saccharose contre son gradient de concentration (Sauer 2007). Cette force protomotrice est fournie par une ATPase pompe à proton située sur la membrane plasmique et exportant les protons vers l’apoplaste (Poole 1978). Ce transport actif du saccharose contre son gradient de concentration permet ainsi d’accumuler de façon importante ce sucre dans les cellules compagnes. Le saccharose diffusera ensuite dans les tubes criblés via les nombreux plasmodesmes les reliant aux cellules compagnes. Le saccharose est alors transporté des organes sources aux organes puits dans les tubes criblés, selon la théorie du flux de masse proposée par Münch (1930). 3 Figure 2 : Déchargement du saccharose dans le phloème (Conde et al. 2007). Au niveau des organes puits, le saccharose peut diffuser à travers les plasmodesmes jusqu’aux cellules receveuses. Alternativement, le saccharose est relâché dans l’apoplaste et importé dans les cellules puits par transport actif. Le saccharose peut aussi être clivé par l’action des invertases pariétales, et les hexoses produits sont transportés activement dans les cellules receveuses. Le transport dans la vacuole serait possible grâce à des antiports Hexose/H+ et Saccharose/H+). Le gradient de pression de turgescence, déterminé par le chargement et le déchargement du phloème, permet le mouvement de la sève des organes source aux organes puits. (3) ATPase H+ vacuolaire ; (4) Pyrophosphatase ; (5) antiport saccharose/H+ ; (6) antiport hexose/H+ ; Symport Saccharose/H+ (puits) ; symport hexose/H+ ; invertase. INTRODUCTION 1.1.3 Déchargement du phloème dans les organes puits Au niveau de l’organe puits, le déchargement du phloème peut se faire par la voie apoplastique et/ou symplastique en fonction de l’organe receveur (Figure 2). Au niveau des racines par exemple, le déchargement symplastique est la voie principale (Patrick 1997). Le saccharose est alors transporté via les plasmodesmes selon son gradient de concentration. Il existe également un déchargement par voie apoplastique du saccharose. Il va alors devoir franchir les membranes plasmiques du complexe conducteur, ainsi que celles des cellules puits, impliquant la présence de transporteurs de saccharose spécifiques. Toutefois, arrivé dans l’apoplaste, le saccharose peut également être hydrolysé en hexoses (glucose + fructose) grâce à l’activité d’invertases pariétales (Tymowska-Lalanne and Kreis 1998). Le transport des hexoses produits s’effectue alors via des transporteurs d’hexose membranaires présents sur les cellules puits. Les sucres ainsi transportés sont directement utilisés dans le métabolisme de l’organe puits (croissance et développement des racines par exemple), stockés (canne à sucre, betterave à sucre) ou bien utilisés pour l’osmorégulation des tissus (Lemoine 2000). 1.2 Distribution des ressources carbonées dans la plante Le transport des sucres à longue distance permet une répartition du carbone dans tous les organes de la plante. Cette répartition est fortement dépendante de l’activité des organes puits de la plante (Ho 1988). En effet, une compétition vis-à-vis du prélèvement de saccharose dans le phloème va s’installer entre les différents organes puits de la plante. La capacité d’un organe puits à accumuler les assimilats carbonés est fonction de sa force de puits. La force de puits peut être déterminée par le produit de la taille du puits et de l’activité de ce dernier (Wolswinkel 1984). L'activité d'un puits se mesure par sa capacité à prélever les photoassimilats en provenance du phloème mais aussi à métaboliser ces derniers. De nombreux paramètres vont influencer la force de puits des organes comme le stade de développement ou bien les facteurs environnementaux auxquels la plante peut être soumise (Wardlaw 1990). La régulation de cette force de puits est un processus très complexe faisant intervenir les différentes voies hormonales et les teneurs en sucres des organes (Patrick 1997). Il est possible d’imaginer que cette régulation implique en partie les différents transporteurs de sucre présents. En effet, ces protéines vont réguler la quantité de sucres disponible dans le phloème au niveau des organes sources, mais aussi la capacité des organes puits à importer les photoassimilats (Kuhn and Grof 2010, Roitsch 1999). 4 INTRODUCTION 1.3 Les transporteurs de sucre chez Arabidopsis thaliana Le séquençage complet du génome de la plante modèle A. thaliana a permis de révéler l’existence de nombreux gènes de transporteurs de sucre. Ceux-ci sont classés en deux grandes familles : les gènes de transporteurs de disaccharides (DSTs) et les gènes de transporteurs de monosaccharides (MSTs) (Buttner 2007, Williams et al. 2000). 1.3.1 Les gènes de transporteurs de disaccharides (DSTs) : Les DSTs sont représentés chez A. thaliana par les transporteurs de saccharose appelés SUC pour SUcrose Carrier dont 9 gènes ont été identifiés, notés de AtSUC1 à AtSUC9 (Sauer 2007). Ces transporteurs, comme chez les autres espèces, sont capables de transporter le saccharose contre son gradient de concentration, en utilisant l’énergie de la force protonmotrice générée par une H+/ATPase membranaire. L’expression de ces gènes de transporteurs de saccharose peut être très variable entre les différents membres de cette famille. Le gène AtSUC1 est principalement exprimé dans le grain de pollen et dans le style où il serait impliqué dans la croissance du tube pollinique et dans la déhiscence des anthères (Stadler et al. 1999). Une expression forte de ce gène a aussi été montrée dans les racines par Sivitz et collaborateurs (2008), ainsi que dans les trichomes des feuilles (Stadler et al. 1999). Une répression importante de l’expression de ce gène a été mesurée en présence d’une forte concentration de saccharose et d’ABA (Hoth et al. 2010). Le gène AtSUC2 est principalement exprimé dans les cellules compagnes des fines nervures des feuilles, où il aurait un rôle majeur dans le chargement apoplastique du phloème (Chandran et al. 2003, Truernit and Sauer 1995). Ceci a été confirmé par le fait que chez les mutants n’exprimant pas AtSUC2, la croissance est très fortement réduite, avec parfois un phénotype létal chez les homozygotes (Gottwald et al. 2000, Srivastava et al. 2008). Ce gène est exprimé au niveau du complexe conducteur de tous les organes, y compris les racines. Le gène AtSUC3 semble fortement exprimé dans de nombreux tissus puits tels que la cellule de garde, la pointe racinaire ou encore le grain de pollen où il pourrait jouer un rôle dans l’approvisionnement en saccharose (Meyer et al. 2004b). Le gène AtSUC4, quant à lui, est le seul gène de transporteurs de saccharose localisé sur le tonoplaste (Endler et al. 2006). Il serait impliqué dans l’export de saccharose du compartiment vacuolaire vers le cytoplasme (Neuhaus 2007). L’expression du gène AtSUC5 a été mise en évidence par Baud et collaborateurs (2005) dans l’albumen, où il jouerait un rôle dans le développement des graines d’ A. thaliana . Ces 5 Figure 3 : Arbre phylogénétique des transporteurs de monosaccharides identifiés chez Arabidopsis thaliana (Büttner, 2007). Les 53 séquences protéiques sont regroupées en 7 sous-familles : les AtSTPs (Sugar Transport Proteins), les AtVGT-like (Vacuolar Glucose Transporters), les AtPLT (Polyols Transporters), les AtINTs (Inositol Transporters), les AtTMTs (Tonoplast Monosaccharide Transporters), les AtpGlcT/AtSGB1 (Plastidic Glucose Transporter/Suppressor of G protein B1) et les AtERD6-like (Early Responsive to Dehydratation). Figure 4 : Schéma de la distribution subcellulaire des monosaccharides et de la localisation des différentes sous-familles de transporteurs de la famille des MST (Büttner, 2007). INTRODUCTION études ont aussi pu montrer une faible expression de ce gène de transporteur de sucre dans les racines. Les gènes AtSUC6, AtSUC7 et AtSUC8 sont des gènes présentant une très forte homologie de séquence. Cependant, seul le gène AtSUC8 semble coder une protéine fonctionnelle (Sauer et al. 2004). Les études réalisées par Sauer et collaborateurs (2004) montrent que le gène AtSUC8 est co-exprimé avec le gène AtSUC9 dans les tissus floraux. Le gène AtSUC9 est aussi exprimé dans l’embryon, ainsi que dans les feuilles (Sivitz et al. 2007). Ce transporteur de sucre aurait un rôle à jouer dans la période de floraison des plantes. En effet, les travaux de Sivitz et collaborateurs (2007) ont montré que les plantes présentant une mutation sur le gène AtSUC9 présentent des phénotypes de floraison accélérée. 1.3.2 Les gènes de transporteurs de monosaccharides (MSTs) : Dans la famille des MSTs, une cinquantaine de gènes ont été identifiés chez A. thaliana (Figure 3). Ces transporteurs, catalysant le transport des hexoses mais aussi le transport de certains polyols, sont classés en 7 sous-familles : AtSTP (Sugar Transporter Protein), AtPLT (Polyol Transporter), AtVGT (Vacuolar Glucose Transporter), AtTMT (Tonoplast Monosaccharide Transporter), AtERD6-like (Early Responsive to Dehydratation), AtINT (Inositol Transporter) et AtpGlcT/AtSGB1 (Plastidic Glucose Transporter/Suppressor of G protein B1) (Buttner 2007). La localisation subcellulaire des différents transporteurs de monosaccharides est indiquée sur la Figure 4. 1.3.2.1 Sous-famille des AtSTPs (Sugar Transporter Protein) La famille des AtSTPs est la famille la plus étudiée et comprend 14 gènes notés d’AtSTP1 à AtSTP14. Ces transporteurs catalyseraient le transport des monosaccharides de l’apoplaste vers la cellule en symport avec un proton, comme les transporteurs de saccharose. Les études de spécificité indiquent que la plupart des transporteurs caractérisés transportent plus efficacement le glucose que le fructose. La plupart des AtSTPs sont exprimés exclusivement dans les organes puits comme le pollen, la graine ou les racines. Certains de ces gènes sont très spécifiques d’un organe donné. Par exemple, les gènes AtSTP2, 6, 9, 10 et 11 ne sont exprimés que dans les grains de pollen et le tube pollinique (Johnson et al. 2006, Schneidereit et al. 2003, Schneidereit et al. 2005, Scholz-Starke et al. 2003, Truernit et al. 1999). De même, l’expression des gènes AtSTP5, 8 et 12 n’a été montrée que dans les graines d’A. thaliana (Buttner 2010). 6 INTRODUCTION D’autres gènes comme AtSTP4, 7 et 13 peuvent être exprimés dans plusieurs organes puits en même temps. En effet, AtSTP4 est par exemple exprimé dans les racines et dans les grains de pollen (Fotopoulos et al. 2003, Truernit et al. 1996), AtSTP7 est exprimé dans les racines mais aussi dans les graines (Buttner 2010) et l’expression de AtSTP13 a été observée dans les racines et dans les fleurs (Norholm et al. 2006). Certains AtSTPs, exprimés dans des organes puits sont aussi exprimés dans les feuilles. C’est le cas de AtSTP1 par exemple dont l’expression est retrouvée dans les fleurs, les racines, les cellules de garde mais aussi dans les feuilles matures (Sherson et al. 2000, Stadler et al. 2003). De même, Poschet et collaborateurs (2010) ont montré une expression de AtSTP14 dans les fleurs, les siliques, les tiges et les graines, mais aussi dans les feuilles matures. En revanche, un seul gène d’AtSTPs a été retrouvé exclusivement exprimé dans les feuilles d’A. thaliana , le gène AtSTP3 où il serait impliqué dans la collecte des hexoses de l’apoplaste (Buttner et al. 2000). 1.3.2.2 Sous-famille des AtPLTs (Polyol Transporter) Les polyols sont des formes réduites d’aldoses et de cétose pouvant avoir une structure linéaire ou cyclique. Ces dérivés de sucres peuvent être utilisés pour le transport de carbone à longue distance bien que cette fonction n’ait pas été montrée chez A. thaliana (Klepek et al. 2005). Certains polyols peuvent aussi s’accumuler en réponse à des stress environnementaux, comme le stress salin (Noiraud et al. 2001b). Chez A. thaliana , 6 gènes de transporteurs de polyols ont été identifiés et sont notés d’AtPLT1 à AtPLT6. Ces transporteurs semblent avoir une spécificité de substrat assez large car ils transportent non seulement des polyols (mannitol, sorbitol, xylitol) mais aussi des hexoses. Leur rôle exact chez A. thaliana est donc loin d’être clair. Seuls les gènes AtPLT1, 2 et 5 ont été caractérisés. Les gènes AtPLT1 et AtPLT2 sont deux gènes présentant une forte homologie de séquence, qui sont co-exprimés dans les grains de pollen et les cellules jeunes du xylème (Klepek et al. 2010). Le gène AtPLT5 quant à lui montre une forte expression dans les pointes racinaires, dans les vaisseaux conducteurs des feuilles, ainsi que dans certains organes floraux (Klepek et al. 2005). L’expression des gènes AtPLT3, 4 et 6 n’a pas été étudiée à l’heure actuelle, cependant ces gènes sembleraient plus exprimés dans les organes puits (pollen, graines et racines) d’après les données Genenvestigator. 7 INTRODUCTION 1.3.2.3 Autres gènes de transporteurs de monosaccharides Les autres sous-familles de MSTs sont beaucoup moins étudiées que les AtSTP ou AtPLT. Trois de ces sous-familles de MSTs regroupent des gènes de transporteurs qui semblent être localisés sur le tonoplaste : les AtVGT (Vacuolar Glucose Transporter), les AtTMT (Tonoplaste Monosaccharide Transporter) et les AtERD6-like (Early-Responsive to Dehydratation) (Buttner 2007). Les AtVGTs regroupent 3 gènes, dont le gène AtVGT1 qui est fortement exprimé dans les grains de pollen et un peu moins dans les feuilles et les tiges (Aluri and Buttner 2007). Les 2 autres gènes AtVGT1 et AtVGT2 n’ont à l’heure actuelle pas été caractérisés. Dans la sous-classe des AtTMT, trois gènes ont pu être identifiés chez A. thaliana . Wormit et collaborateurs (2006) ont montré une expression de AtTMT1 dans les feuilles ainsi que dans les fleurs et une expression de AtTMT2 principalement dans les racines et la tige. Ces études ont aussi mis en évidence que ces deux AtTMTs jouent un rôle majeur dans la réponse à certains stress environnementaux (stress hydrique, froid ou salin). Le gène AtTMT3 quant à lui n’a pas pu être étudié en raison d’un très faible niveau d’expression. Les gènes de la sous-famille AtERD6-like sont au nombre de 19 chez A. thaliana . Le gène AtSFP2 est exprimé dans tous les organes testés (source et puits) et associé aux tissus conducteurs, alors que le gène AtSFP1 est exprimé dans la graine et induit lors de la sénescence foliaire (Quirino et al. 2001). Un troisième gène de cette sous-famille est le gène AtESL1, principalement exprimé dans le péricycle et les cellules du parenchyme xylémien, et induit en condition de stress hydrique et salin, ainsi qu’à l’application exogène d’acide abscissique (Yamada et al. 2009). Une autre sous-famille de MSTs regroupe les transporteurs d’inositol (AtINT). Ces gènes de MSTs semblent exprimés dans les grains de pollen et les tissus vasculaires des feuilles (Schneider et al. 2006, Schneider et al. 2007). Le rôle de ces transporteurs reste encore mal connu. La dernière sous-famille des MSTs regroupe les gènes de transporteurs plastidiaux (AtpGlcT). Ces transporteurs, au nombre de 3 chez A. thaliana seraient impliqués dans l’exportation du glucose des plastes vers le cytoplasme (Weber et al. 2000). 1.4 Le déficit hydrique Au cours du dernier siècle, l’utilisation mondiale de l’eau douce a augmenté deux fois plus vite que le taux de croissance démographique (FAO 2007). De ce fait, l’eau douce est devenue une ressource de plus en plus convoitée. Ce phénomène est accentué par le 8 Figure 5 : Augmentation de la sécheresse mondiale (Philippe Rekacewicz (Le Monde diplomatique), Février 2006). La diminution de la disponibilité en eau potable est la plus marquée dans les zones colorées en orange foncé. INTRODUCTION réchauffement climatique qui exacerbe la pénurie d’eau douce dans certaines régions de la planète (Figure 5). Le secteur agricole est le premier consommateur d’eau douce de la planète et la sécheresse constitue à l’heure actuelle l’un des principaux facteurs de la diminution des rendements de grandes cultures. Un nouveau challenge de la recherche actuelle en biologie végétale est de produire des variétés de plantes à intérêt agronomique présentant une tolérance vis-à-vis du stress hydrique. L’élaboration de telles variétés implique une bonne connaissance des mécanismes biologiques intervenant dans la signalisation et la réponse à la contrainte hydrique (Harb et al. 2010). Au niveau physiologique, le stress hydrique peut être généré par le manque d’eau au niveau des racines mais également par de fortes concentrations en sel dans le sol et les basses températures (Verslues et al. 2006). Ces trois stress ont en commun d’engendrer un stress osmotique qui va rompre l’homéostasie de l’eau de la plante. L’état hydrique des plantes est étroitement lié à celui du sol dans lequel leur système racinaire est installé. L’état hydrique du sol et de la plante peut être caractérisé par son potentiel hydrique. Le potentiel hydrique d’un compartiment est l’énergie qu’il faut appliquer à ce compartiment pour libérer 1g d’eau. Ce potentiel exprimé sous forme de pression est toujours négatif (potentiel hydrique de l’eau pure égal à 0) et est d’autant plus bas que la liaison entre l’eau et le compartiment est forte. Le mouvement de l’eau va du compartiment ayant le potentiel hydrique le moins négatif vers le compartiment avec le potentiel hydrique le plus négatif, et donc de la zone retenant le moins l’eau (la plus hydratée), à la zone retenant le plus l’eau (la moins hydratée). En condition de sécheresse, une diminution du potentiel hydrique du sol est donc constatée. Cette diminution du potentiel hydrique du sol est perçue au niveau de la plante par le compartiment racinaire. A partir de cette perception, la plante va mettre en place des modifications et réponses aux niveaux morphologique, physiologique, biochimique et moléculaire qui vont lui permettre de s’acclimater à la contrainte hydrique (Casal 2002, Davies and Zhang 1991). 1.4.1 Stratégies adaptative des plantes en réponse au stress hydrique On distingue classiquement deux principales stratégies en réponse au déficit hydrique : l’évitement et la tolérance. Néanmoins, ces deux stratégies ne sont pas mutuellement exclusives et en pratique, les plantes vont combiner toute une série de réponses vis-à-vis du stress (Chaves et al. 2003). 9 INTRODUCTION L’évitement est la stratégie conduisant les plantes à effectuer leur cycle de vie très rapidement avant une période de sécheresse importante et régulière. C’est typiquement la stratégie d’adaptation utilisé par les plantes désertiques. Ces plantes vont combiner un cycle de vie très court, une vitesse de croissance très élevée et une utilisation des ressources optimisée lorsque les conditions d’humidité de l’environnement sont bonnes. C’est l’une des stratégies d’adaptation les plus efficaces vis-à-vis du stress hydrique, cependant le rendement potentiel des plantes s’en trouve très diminué. La tolérance des plantes se traduit par le maintien des fonctions de la plante malgré le stress hydrique. Classiquement, la plante va mettre en place plusieurs mécanismes lui permettant de limiter ses pertes d’eau et d’augmenter son approvisionnement en eau, réduisant ainsi l’impact du stress hydrique sur sa physiologie. Pour ce faire, un ensemble de réponses au niveau morphologique, physiologique et moléculaire vont se mettre en place pour tenter de maintenir une certaine homéostasie de l’eau chez les plantes stressées (Bray 2004, Chaves et al. 2002). Nous ne prendrons pas en compte les adaptations morphologiques retrouvées chez de nombreuses espèces xérophytes. 1.4.2 Mécanismes de tolérance des plantes au déficit hydrique 1.4.2.1 Limitation des pertes d’eau Fermeture des stomates Les stomates, situés sur l’épiderme des feuilles, ont pour rôle de permettre l’entrée dans les tissus du CO2, indispensable à la photosynthèse, et de laisser sortir l’eau sous forme de vapeur (transpiration) et l’O2 produit par la photosynthèse. L’ouverture et la fermeture des stomates doivent être très finement régulées afin d’assurer un approvisionnement suffisant en CO2 tout en s’adaptant à la disponibilité en eau de la plante. Ainsi, très rapidement après l’application d’une contrainte hydrique, une fermeture des stomates va être observée (Chaves 1991, Schulze 1986). Elle va permettre de diminuer les pertes d’eau de la plante par transpiration, qui pourraient entrainer une déshydratation des cellules et des phénomènes de cavitation xylémienne. L’ouverture ou la fermeture des stomates résultent des changements de turgescence des cellules de garde par rapport aux cellules de l’épiderme. Cette réponse des plantes peut être déclenchée après une déshydratation perçue au niveau des feuilles ou des racines. Plusieurs auteurs ont en effet montré qu’un signal hormonal (acide abscissique) provenant des racines et transporté à longue distance jusqu’aux feuilles permettait la fermeture 10 INTRODUCTION des stomates (Davies and Zhang 1991, Gollan et al. 1992, Gowing et al. 1990) lors du déficit hydrique. Limitation de la croissance des organes La limitation de la croissance foliaire est un mécanisme adaptatif qui permet de réduire la surface de transpiration de la plante (Boyer 1970). La réduction de la vitesse de croissance fait intervenir plusieurs mécanismes : la division cellulaire va fortement décroitre (Tardieu et al. 2000), les parois cellulaires deviennent plus rigides, empêchant l’élongation cellulaire (Cosgrove 2005) et la turgescence cellulaire décroit (Bouchabké et al. 2006). Chacun de ces mécanismes met en jeu plusieurs familles de gènes dont la régulation est encore mal connue. Par conséquent, la compréhension de la signalétique des modifications de la croissance est complexe. Il est tout de même admis que la diminution de la croissance foliaire n’est pas que la conséquence d’un manque d’eau au niveau cellulaire, mais aussi la résultante de l’inhibition d’un certain nombre de gênes. Cette réponse rapide des plantes va permettre à plus ou moins long terme le maintien d’une certaine turgescence cellulaire (Tardieu et al. 2000). 1.4.2.2 Ralentissement de la photosynthèse et détoxication des AOS (Active Oxygen species) L’un des résultats de la fermeture des stomates est la réduction de la disponibilité en CO 2 pour la photosynthèse (Cornic 2000), conduisant à une diminution de la production d’assimilats. En fonction de l’intensité du stress hydrique, la production de sucres pourra ainsi être maintenue ou fortement diminuée. Parallèlement, l’arrêt de la croissance foliaire va, de facto, engendrer un arrêt de la consommation de ces derniers (Muller et al. 2011). Ces sucres vont alors s’accumuler dans les tissus où ils sont très probablement stockés dans les vacuoles ou sous forme d’amidon. L’accumulation de ces sucres solubles pourrait par ailleurs participer à l’ajustement osmotique des cellules (Clifford et al. 1998). Le ralentissement de la photosynthèse va tout de même entrainer un déséquilibre entre la capture de l’énergie lumineuse et son utilisation et induire la production et l’accumulation d’espèces actives de l’oxygène (AOS), conduisant ainsi à un stress oxydatif. Dans le but de limiter le stress oxydatif plusieurs mécanismes de détoxication enzymatique et nonenzymatique des AOS vont être mis en place. Ainsi chez A. thaliana une induction de l’expression d’enzymes de détoxication des AOS comme la péroxidase, la superoxide dismutase, la catalase ou bien la glutathion réductase, a été mise en évidence en réponse à un 11 INTRODUCTION stress hydrique (Jung 2004). En parallèle, l’accumulation de pigments antioxydants tels que les anthocyanes va être observée (Chalker-Scott 1999). 1.4.2.3 Ajustement osmotique L’ajustement osmotique est considéré comme l’un des processus cruciaux lors de l’acclimatation des plantes à la sécheresse (Morgan 1984). Il permet, lors d’un stress hydrique de faible intensité, de maintenir le potentiel hydrique des feuilles grâce à l’accumulation de solutés compatibles (sucres, acides aminés, ions). Cette accumulation va alors augmenter le potentiel osmotique des cellules afin de créer un influx d’eau, ou tout du moins éviter un efflux. Ceci permet un certain maintien de la quantité d’eau dans les cellules. Il semblerait aussi que l’accumulation d’osmolites permet la protection de l’intégrité des protéines et des membranes (Crowe et al. 1983, Rathinasabapathi 2000). Parmi les molécules organiques pour lesquelles il a clairement été établi un rôle d’osmoprotection en condition de stress hydrique, on peut citer la proline, la glycine-bétaïne et certains sucres comme les polyols, le saccharose et certains hexoses (Chaves et al. 2003 ; Taji et al. 2002). De nombreuses études ont en effet mis en évidence l’implication des sucres comme osmoprotectants, la nature des sucres pouvant varier selon les espèces étudiées. Les travaux de Garcia et collaborateurs (1997) ont par exemple montré une accumulation de tréhalose en réponse à un stress salin chez le riz. D’autres études ont montré une accumulation de polyols comme le galactinol chez A. thaliana en réponse au déficit hydrique (Taji et al. 2002) ou bien le mannitol chez le céleri en réponse à un stress salin (Noiraud et al. 2001a). En ce qui concerne le saccharose, une forte accumulation de ce sucre a été mesurée chez Craterostigma plantagineum en réponse à un déficit hydrique (Bianchi et al. 1991). Cette accumulation serait d’ailleurs stimulée au niveau transcriptionnel par l’induction d’un gène codant une sucrose synthase (Kleines et al. 1999). La surexpression d’une sucrose synthase a aussi été montrée chez A. thaliana en réponse au déficit hydrique par Déjardin et collaborateurs (1999).Toujours chez A. thaliana , les travaux d’Hummel et collaborateurs (2010) ont montré l’accumulation de saccharose mais aussi d’hexoses dans les feuilles d’A. thaliana (écotype Col-0) en réponse à la contrainte hydrique. Ceci a également été confirmé par les travaux de Sperdouli et Moustakas (2012) qui montrent également une augmentation de proline. 12 Figure 6 : Vitesse d’élongation de la racine principale (ronds pleins) et des feuilles (triangles vides) sur des plantules de quatre espèces cultivées à plusieurs potentiels hydriques (Sharp et al. 2004). INTRODUCTION 1.4.2.4 Augmentation de l’approvisionnement en eau En condition de stress hydrique, une des premières réponses des plantes est, comme nous avons pu le voir, de diminuer les pertes d’eau et de limiter les dommages engendrés au niveau cellulaire. Sur une longue période, d’autres mécanismes d’acclimatation vont permettre de maintenir l’approvisionnement de la plante en eau. Ces mécanismes vont être mis en place dans les racines. Dans un premier temps, un ajustement osmotique permettra de diminuer le potentiel hydrique des cellules, et ainsi d’attirer plus d’eau dans les tissus. Ce processus d’acclimatation a été mis en évidence dans les racines d’olivier par les travaux de Dichio et collaborateurs (2006). Leur étude a montré une diminution du potentiel osmotique de l’ordre de 0,54 MPa dans les racines des plantes soumises à un faible stress hydrique et une diminution de 1,67 MPa dans les racines des plantes soumises à un stress hydrique drastique. Cet ajustement osmotique serait en grande partie dû à l’accumulation de sucres solubles comme le sorbitol, le glucose ou le fructose (Ranney et al. 1991). 1.4.3 Réponse des racines au déficit hydrique L’optimisation de l’absorption d’eau par les racines lors de la contrainte hydrique serait un paramètre majeur de la tolérance des plantes à la contrainte hydrique. De nombreuses plantes adaptées aux zones arides possèdent d’ailleurs un enracinement très profond leur permettant de prospecter les couches les plus profondes du sol. Il est souvent admis qu’au cours d’un déficit hydrique, la croissance racinaire est beaucoup moins affectée que celle des parties aériennes (Saab et al. 1990, Sharp and Davies 1979). La Figure 6 montre en effet que la croissance de la racine principale de plusieurs espèce à intérêt agronomique continue à des potentiels hydriques du sol inférieurs à -1,5 MPa, alors que la croissance des feuilles est déjà complétement inhibée. Les études réalisées par Van de Weele et collaborateurs (2000) montrent même une stimulation de la croissance de la racine principale d’A. thaliana en réponse à un stress osmotique appliquée avec le PEG. Le maintien de la croissance racinaire permet l’absorption de l’eau dans de nouvelles zones du sol alors même que la transpiration au niveau des feuilles est stoppée. Ce phénomène permettrait de rétablir une certaine turgescence au niveau des cellules des racines et des feuilles permettant la conservation de leur fonction (Spollen and Sharp 1991). Il semblerait toutefois que le déficit hydrique n’affecte pas toutes les zones de la racine de la même façon. Chez le maïs, dans de bonnes conditions d’irrigation, les cellules se divisent au niveau du méristème, et la zone d’’expansion maximale se situe vers 4,5 mm de l’apex et s’étend ensuite jusqu’à 12 mm de l’apex. En conditions de stress hydrique, la zone d’élongation 13 INTRODUCTION des cellules est limitée aux premiers mm au-dessus de l’apex (Sharp et al. 1988). De plus, la croissance radiale de ces cellules est également diminuée, conduisant à des racines plus fines en cas de stress hydrique. L’inhibition de la croissance au niveau de la zone d’élongation de la racine serait due à l’augmentation de la lignification des parois cellulaires diminuant ainsi l’extensibilité de ces dernières (Fan et al. 2006). Le développement de la racine principale n’est pas le seul impacté par la contrainte hydrique. Une étude réalisée par Deak et Malamy (2005) sur les racines d’A. thaliana a mis en évidence une réduction du nombre de racines latérales sur des plantules soumises à un stress osmotique. Leurs travaux ont permis de montrer que le stress osmotique réprime de façon très importante le développement des racines latérales à partir des primordiaux racinaires, pourtant bien présents sur la racine principale. Ces observations laissent penser que les plantules vont optimiser le développement de leur système racinaire en inhibant la prolifération des racines dans les régions du substrat ou la disponibilité est limitée. En revanche, le développement des primordium racinaires est maintenu permettant aux plantes de mettre en place rapidement de nouvelles racines latérales si l’eau redevient disponible. Ces éléments indiquent donc que les plantes possèdent une grande capacité adaptative via l’architecture de leur système racinaire. Ce caractère est d’ailleurs un critère de sélection de choix en vue d’améliorer la productivité des plantes en conditions d’approvisionnement limité en eau ou en éléments minéraux, et certains n’hésitant pas à y voir la possibilité d’une seconde révolution verte (Gewin 2010). 1.4.4 Modification du transcriptome lors d’un stress hydrique Le déficit hydrique va déclencher de nombreuses modifications dans l’expression des gènes contrôlant la mise en place des réponses adaptatives en partie décrites précédemment. L’étude de l’expression de ces gènes est nécessaire non seulement pour comprendre les voies de régulation de ces gènes, mais aussi pour mettre en évidence la fonction de ces gènes et les mécanismes de tolérance dans lesquelles ils peuvent être impliqués. Les études transcriptomiques réalisées par les techniques de microarray ont permis de classer les gènes dont l’expression est augmentée en deux catégories : ceux qui codent des protéines permettant de lutter contre les effets du stress (mise en place de l’ajustement osmotique, protection des protéines et structures cellulaires, détoxification) et ceux codant des protéines impliquées dans la régulation (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006). 14 INTRODUCTION Parmi les gènes permettant de limiter les dommages engendrés par le stress hydrique il est possible de trouver ceux codant des LEA (Late Embryogenesis Abundant). Ces protéines sont normalement exprimées dans les graines pendant les derniers stades de développement de ces dernières et permettant la tolérance à la dessiccation. Elles sont généralement de faible poids moléculaire et hydrophiles (Hundertmark and Hincha 2008). Bien que leurs fonctions physiologiques et biochimiques soient largement inconnues, il est couramment admis que ces protéines jouent un rôle crucial dans la tolérance des cellules à la déshydratation. Une autre famille de gènes dont l’expression est très modifiée en condition de stress hydrique est celle codant des aquaporines. Ces protéines sont des canaux que l’on retrouve dans les membranes plasmiques des cellules et qui permettent de faire varier la perméabilité hydraulique de cette dernière (Kjellbom et al. 1999). Ces protéines ont sans aucun doute un rôle important dans l’homéostasie de l’eau dans la plante en condition de stress, (Alexandersson et al. 2005). 1.5 Objectifs de l’étude Afin de mieux comprendre les flux de sucres chez A. thaliana , le laboratoire s’intéresse au rôle des transporteurs de sucre dans les transferts de sucre entre organes de la plante, notamment lors de la contrainte hydrique. Des travaux préliminaires se sont principalement orientés sur l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles par la modification de leur expression lors d’un stress hydrique effectué par arrêt d’arrosage. Afin d’intégrer ces résultats au niveau de la plante entière, l’objectif de mes travaux de thèse est d’identifier les gènes de transporteurs de sucre exprimés dans la racine d’A. thaliana et de déterminer si leur expression est modifiée en réponse à la contrainte hydrique. Le compartiment racinaire est par nature difficile à étudier. C’est pourtant un compartiment essentiel de la plante assurant l’approvisionnement en eau et en sels minéraux. Ces deux ressources sont d’ailleurs souvent les facteurs limitant de la productivité des plantes. Afin de pallier ces carences, l’agriculture fait aujourd’hui appel à l’utilisation massive d’intrants et une irrigation importante des plantes. Pourtant il est possible d’imaginer qu’une partie de ces carences pourrait être limitée en optimisant l’absorption de ces deux ressources par le système racinaire. 15 INTRODUCTION Les analyses de biochimie ou biologie moléculaire effectuées sur le compartiment racinaire nécessitent l’obtention de matériel végétal propre, complet (tous les types de racines doivent être présents) et, si possible, exempt de blessures liées à la récolte. La culture des plantes en terre ne répond pas à ces différents critères. Dans le but d’étudier les racines d’A. thaliana au laboratoire, il a été décidé de travailler sur des plantes cultivées en hydroponie. En effet, ce système de culture permet de s’affranchir de la terre : les racines récoltées sont propres et nécessitent un nombre minimal de manipulations pour leur récolte en vue d’analyses biochimique et moléculaire. Le matériel végétal peut être récolté en quantités relativement larges, contrairement à la culture en boite de Pétri sur milieu gélosé. La première partie de mon travail de thèse a été de mettre en place un système de culture hydroponique. Une première analyse de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines dans nos conditions de culture sera alors effectuée tout au long du développement de plantes et au cours d’un cycle de 24h. Le fait d’avoir accès à tous les organes de la plante nous a aussi permis d’effectuer une étude du transport à longue distance de saccharose radiomarqué des feuilles sources où il est produit vers les autres organes de la plante. Dans un second temps, un protocole d’étude de la contrainte hydrique a été élaboré. Afin de mimer un stress hydrique en culture hydroponique, il est nécessaire d’utiliser un agent osmotique. Plusieurs agents osmotiques sont classiquement utilisés dans la littérature comme le mannitol, le sorbitol ou le polyéthylène glycol. Le PEG de haut poids moléculaire présente l’avantage de ne pas être absorbé par les tissus de la plante contrairement au mannitol et au sorbitol. De plus ces deux derniers agents osmotiques étant des sucres, ils peuvent influencer le métabolisme carboné de la plante et ainsi biaiser les études de transport de sucres à longue distance ainsi que les études d’expression des gènes de transporteurs de sucre. De plus, le stress osmotique induit par le PEG serait plus proche d’un stress hydrique obtenu par arrêt d’arrosage dans la terre (Verslues et al. 2006). Ces arguments nous ont donc conduit à utiliser le PEG 6000 dans nos expériences. La mise au point de ce protocole l’application du stress a été réalisée en vue de déterminer l’impact d’une contrainte osmotique sur la croissance des racines et des feuilles, sur l’expression des gènes de transporteurs de sucre, la répartition des sucres entre les feuilles et les racines et aussi sur le transport du saccharose dans la plante. Le but est de mieux comprendre comment la plante redistribue les sucres en cas de stress osmotique et d’identifier certains des acteurs moléculaires impliqués. 16 MATERIEL ET METHODES 2 MATERIEL ET METHODES 17 Figure 7 : Photographies du système de culture de plantes en hydroponie : (A) : photographie du système de culture en hydroponie composé d’un bloc et d’un bac-réservoir ; (B) : Photographie d’un bloc composé de 4 bacs Araponics reliés entre eux en série et notés I, II, III et IV. MATERIEL ET METHODES 2.1 Matériel végétal L’ensemble des expérimentations a été réalisé sur la plante modèle Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (Brassicacées, Dicotylédone). Deux écotypes d’A. thaliana ont été utilisés, les écotypes Col-0 et C24. Deux expérimentations ont été réalisées sur l’écotype C24. Cependant ces études devaient à l’origine être menées sur l’écotype Col-0. Une mauvaise annotation des tubes de graines stock a entraîné une inversion entre l’utilisation des graines de l’écotype Col-0 et les graines de l’écotype C24. Ces premières expérimentations ont tout de même permis la mise en place du système de culture des plantes en hydroponie (« Campagne mise en place hydroponie») ainsi qu’un premier essai d’application du stress osmotique sur cet écotype (« Essai stress C24 »). Par la suite, toutes les expérimentations portant sur l’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines d’A. thaliana , ont été réalisées sur l’écotype Col-0. Les graines de l’écotype C24, Col-0 ont été fournies par le centre de ressources biologiques de l’INRA de Versailles. 2.2 Méthodes L’étude du réseau racinaire et notamment les approches de physiologie moléculaire nécessitent de pouvoir travailler sur du matériel végétal non contaminé par la terre. Nous avons testé deux systèmes de cultures qui permettent de récolter les racines propres et intègres en grosse quantité : la culture hydroponique et la culture en rhizobox. La culture en hydroponie présente l’avantage de pouvoir obtenir une grande quantité de matériel végétal non souillé par la terre. La culture en rhizobox que nous avons mis en place au laboratoire, permet quant à elle, de cultiver les plantes en terre, de suivre le développement des racines sur 3 semaines, mais la production de matériel végétal (feuilles et racines) est plus limitée que pour la culture en hydroponie. 2.2.1 Mise en place du système de culture des plantes en hydroponie Afin de mettre en place la culture hydroponique au laboratoire, nous avons choisi le système Araponics (Gardena micro-drie-system AP620A) développé par la société Araponics (Araponics SA, Liège). Nous disposons de 4 systèmes d’hydroponie, chacun étant composé d’un bloc relié à un bac-réservoir. Un bloc est composé de 4 bacs Araponics reliés entre eux en série. Les blocs sont reliés à des bac-réservoir contenant 15 litres de milieu de culture (Figure 7). 18 Figure 8 : Schéma représentant le circuit du milieu de culture réalisé dans le système d’hydroponie (bloc composé de 4 bacs hydroponie). Tableau 1 : Composition du milieu de culture hydroponique utilisé, d’après Gibeaut et collaborateurs (1997). Concentration Macronutriments dans le milieu de culture (mM) Micronutriments Concentration dans le milieu de culture (µM) Ca(NO3)2, 4 H2O 1,5 KCl 50 KNO3 1, 25 MnSO4, H2O 10 MgSO4, 7 H2O 0,75 CuSO4, 5 H2O 1,5 KH2PO4 0,5 ZnSO4, 7 H2O 2 FeNa-EDTA 7,2 x10-5 H3BO3 50 (NH4)6Mo7O24 75 x 10-3 Figure 9 : Schéma d'un porte graine du système Araponics utilisé pour semer les graines d'Arabidopsis thaliana dans le système de culture en hydroponie. MATERIEL ET METHODES Chaque bac Araponics contient environ 1,8 L de milieu de culture. Le milieu de culture est propulsé depuis le bac réservoir de 15 litres vers les 4 bacs Araponics (= 1 bloc) grâce à un système de pompe électrique (New-Jet 400 l/h, jusqu’à 70 cm de hauteur). La pompe d’aquarium propulse le milieu de culture contenu dans le bac réservoir posé au sol vers le premier bac (I) disposé sur une étagère du phytotron à une hauteur de 76 cm au-dessus du bac réservoir. Le milieu de culture s’écoule ensuite dans les trois autres bacs dans l’ordre II, III et IV puis il est, à la sortie du bac IV, à nouveau déversé dans le bac-réservoir (Figure 8). La circulation du milieu de culture dans le système de culture en hydroponie (bac-réservoir + bacs Araponics) permet une oxygénation de ce milieu. Certains auteurs ont montré que cette oxygénation pouvait être suffisante (Artéca et Artéca 2000). D’autres considèrent que pour éviter une trop grande hypoxie au niveau des racines, il est préférable de renforcer cette oxygénation du milieu de culture en ajoutant un bulleur d’aquarium dans le bac-réservoir (Gibeault, 1997). De plus, cette recommandation nous a été suggérée lors du premier comité de thèse aussi, pour l’expérimentation « Campagne réhydratation », nous avons ajouté dans les bac-réservoirs des bulleurs (Rena Air 100, 120 L/heure). Les systèmes de culture hydroponie ont été disposés dans un phytotron (PLASTEUROP SERRE.S-S.00.01). Le milieu nutritif utilisé pour la culture des plantes est le milieu de culture utilisé par pour la culture d’A. thaliana par Gibeaut et collaborateurs (1997). La composition en macroélément et microéléments de ce milieu est reporté sur le Tableau 1. Le changement de milieu nutritif dans les bacs réservoirs est réalisé une fois par semaine afin d’éviter le développement de micro-organismes et l’épuisement de certains éléments du milieu, qui pourrait entrainer des carences. Les plantes sont placées dans le phytotron dans lequel les conditions de cultures sont contrôlées (photopériode 10h de jour/14h de nuit ; température de 23°C le jour et 18°C la nuit ; humidité relative de 50% le jour et 70% la nuit). Chaque système d’hydroponie permet la culture de 72 plantes dont les graines sont semées individuellement (18 plantes x 4 bacs). Les graines sont déposées dans une goutte de milieu MS 1X (Murashige and Skoog 1962) gélosé (Agar 0,65%), elle-même déposée sur le porte graine rempli de laine de roche stérile (Figure 9). Après deux semaines de culture, les racines des plantes placées les unes à côté des autres ont atteint une taille de 3 à 4 cm et peuvent commencer à se mêler. Afin de pouvoir récolter chaque plante individuellement, les racines sont séparées les unes des autres tous les jours dès qu’elles commencent à s’entremêler, en soulevant délicatement chaque plateau d’un bac 19 Figure 10 : Schéma du protocole expérimental appliqué pour la culture des plantes au cours de l’expérimentation « Campagne mise en place hydroponie ». Les 288 plantes de l’écotype C24 sont cultivées dans 4 systèmes d’hydroponie contenant du milieu nutritif pendant 39 jours. Une première récolte des plantes au stade jeune est réalisée après 20 jours de culture. Une seconde récolte est réalisée à la fin de l’expérimentation. MATERIEL ET METHODES Araponics au-dessus du bac sans les sortir du milieu. En effet, les racines des plantes (18 plantes) portées par se plateau sont alors séparées grâce à des mouvements de va et vient dans l’eau. En réalisant ce geste tous les jours, il est possible de prévenir l’enroulement des racines les unes aux autres. Nous disposons au laboratoire de 4 systèmes d’hydroponie indépendants, permettant la culture de 288 plantes (72 plantes x4). Les expérimentations appelées « Campagne » ont été réalisées sur ces systèmes. Des expérimentations ont aussi été réalisées sur bac individuel, composé d’un bac Araponics relié à un bac-réservoir (7L). Chaque bac individuel permet la culture de 18 plantes et a été utilisé pour effectuer les expérimentations nommées « Essais ». 2.2.2 Contrôle du développement des plantes cultivées en hydroponie La première expérimentation réalisée sur le système de culture en hydroponie mis en place au laboratoire (« Campagne mise en place hydroponie », Figure 10) a été menée afin de contrôler les conditions de culture des plantes au cours de leur développement. Ce contrôle était nécessaire aussi bien au niveau du phytotron, remis en fonctionnement après une longue période d’inactivité, qu’au niveau du système de culture hydroponique nouvellement mis en place au laboratoire. En effet, au niveau des conditions de culture appliquées dans le phytotron, un suivi de la température de l’humidité et du PAR a été réalisé. Au niveau du système de culture en hydroponie, la température le pH ainsi que le potentiel hydrique du milieu de culture ont été vérifiés dans le bac-réservoir et dans chacun des bacs constituant un système hydroponie. Le développement des plantes dans ce nouveau système de culture a été étudié en réalisant un suivi du nombre de feuilles par plantes tout au long de leur développement, en mesurant leur biomasse et leur rapport root/shoot (masse de partie racinaire/masse de la partie aérienne). En vue de réalisé un stress hydrique par ajout d’un agent osmotique dans le milieu de culture, l’étude de l’état hydrique des plantes par mesure du contenu relative en eau (RWC pour Relative Water Content) des feuilles et des racines, ainsi que la mesure du potentiel osmotique dans ces deux compartiments a été mis en place au cours de la première expérimentation. Cette expérimentation a été réalisée sur 4 systèmes de culture (288 plantes). Une première récolte est réalisée après 20 jours de culture, correspondant au stade jeunes feuilles, et une seconde récolte est réalisée à la fin de l’expérimentation (J39), correspondant au stade feuilles adultes. 20 Figure 11 : Schéma du protocole expérimental de culture des plantes appliqué au cours de l’étude des différents stades de développement d’Arabidopsis thaliana. Les 144 plantes de l’écotype Col-0 sont cultivées dans 2 systèmes d’hydroponie contenant du milieu nutritif pendant tout le cycle de vie d’Arabidopsis thaliana . Six récoltes ont été effectuées correspondant aux stades : jeunes feuilles (J, J20), feuilles adultes (A, J40), émergence de la hampe florale (E, J53), fleurs (F, J67), siliques vertes (SV, J95) et graines (G, J114). MATERIEL ET METHODES 2.2.3 Etude du cycle complet de développement d’Arabidopsis thaliana (Col-0) cultivée en hydroponie et mesure de quelques paramètres reflétant son métabolisme carboné Une fois avoir établi les conditions de culture des plantes en hydroponie, l’étude du cycle complet de développement d’A. thaliana a été menée en hydroponie afin de suivre le métabolisme carboné dans les feuilles, les racines, la hampe florale et les siliques à des stades importants du cycle de développement des plantes. Pour ce faire, des mesures de biomasse, de teneurs en chlorophylles, d’expressions de transporteurs de sucre, de dosages de sucres solubles, d’amidon ainsi que de transport à longue distance de saccharose radiomarqué ont été réalisées. Ainsi, 144 plantes ont été mises en culture hydroponique (2 systèmes). Les 6 principaux stades de développement d’A. thaliana décrit par Boyes et collaborateurs (2001) ont été étudiés au cours de cette expérimentation. Ainsi, comme représenté sur la Figure 11, 23 plantes sont récoltées pour chaque stade de développement : le stade jeunes feuilles (J20), le stade feuilles adultes (J40), le stade émergence de la hampe florale (J53), le stade fleurs (J67), le stade siliques vertes (J95) et le stade graines (J114). Les hampes florales sont récoltées à partie du stade fleurs à J67. Les organes ayant permis de mesurer la biomasse sèche ont été lyophilisées 72h à -20°C, ainsi que les feuilles destinées aux dosages des chlorophylles. Les organes destinées aux analyses d’expression de gènes et au dosage des sucres solubles et d’amidon sont congelées dans l’azote liquide et stockées à -80°C juste après la récolte. Les plantes entières destinées à l’étude du transport à longue distance du saccharose radiomarqué sont directement placées dans l’enceinte de culture de la zone radioactive du laboratoire. 2.2.4 Etude quelques paramètres reflétant le métabolisme carboné d’Arabidopsis thaliana au cours du cycle nycthémère Après avoir étudié l’allocation du carbone dans la plante au cours de son cycle de développement complet, nous avons souhaité étudier les variations du statut carboné de la plante au cours d’une journée de 24h. Pour ce faire 144 plantes (2 systèmes) ont été mises en culture hydroponique. Après 20 jours de culture des plantes, 20 plantes, correspondant au stade jeunes feuilles de l’étude précédente (cf 2.2.3), ont été récoltées toutes les 4 heures pendant 24h. La première récolte a eu lieu à 5h du matin puis 9h, 13h, 17h, 21h, et 1h. Afin de 21 MATERIEL ET METHODES ne pas perturber le métabolisme des plantes, les récoltes nocturnes ont été effectuées à l’aide d’un éclairage vert (Kircher et al. 1999). Le suivi du métabolisme carboné a été réalisé dans les feuilles et les racines, les seuls organes présents à ce stade de l’étude (20 jours après semis) en mesurant l’expression de transporteurs de sucre, le dosage de sucres solubles ainsi que l’amidon. Les plantes destinées aux analyses d’expression de gènes ou de dosage de sucres sont congelées dans l’azote liquide et stockées à -80°C juste après la récolte. 2.2.5 Mise en place du stress osmotique sur Arabidopsis thaliana cultivée en hydroponie Après avoir réussi la culture de plantes homogènes en hydroponie, nous avons mis en place un protocole de stress osmotique dans ce système culture, afin d’étudier l’allocation du carbone dans les plantes en réponse à cette contrainte. Pour mimer le stress hydrique en culture hydroponique, un agent osmotique, le PEG (Polyéthylène glycol) de poids moléculaire moyen 6000 (min 5000 et max 7000, SIGMA) est utilisé. Il a été montré que, le degré de polymérisation du polymère choisi dans notre étude, limite l’absorption du PEG par les racines des plantes, sans pour autant augmenter de façon importante la viscosité du milieu et permettant ainsi, de maintenir une bonne circulation du milieu dans le système en présence de PEG (van der Weele et al. 2000). Des expérimentations préalablement réalisées au laboratoire (notamment par Andrée Bourbouloux, CR CNRS) consistaient en l’application directe d’une concentration importante de PEG (5% et 10%) dans le milieu de culture. L’application de ce protocole a engendré un stress osmotique drastique, rapidement létal pour les plantes. Pour notre étude, nous souhaitons étudier l’allocation du carbone dans la plante en réponse à un stress osmotique Aussi, il est nécessaire que les plantes puissent continuer à se développer pendant une certaine période du stress. Pour cela, il est nécessaire d’appliquer un stress modéré qui permet de maintenir les plantes en stress sur une assez longue période (Dubos et al. 2003). Nous avons ainsi choisi d’appliquer sur plusieurs jours des concentrations croissantes de PEG de façon progressive dans le milieu de culture. Plusieurs expérimentations de types « essai stress » et « essai réhydratation » ont été menées pour déterminer le protocole final. Les analyses réalisées pour chacune de ces expérimentations seront précisées dans chacune des parties résultats qui s’y rapportent. Aussi, des expérimentations Campagne « mise en place hydroponie », « stress » et « réhydratation », 22 Figure 12 : Schéma représentant le protocole expérimental appliqué pour l’étude d’un stress osmotique suivi d’une période de réhydratation. Les 288 plantes de l’écotype Col-0 sont cultivées dans 16 bacs Araponics (8 bacs témoins et 8 bacs stressés; 72 plantes par condition) pendant 24 jours dans le milieu nutritif. Après 20 jours de culture, 176 plantes sont retirées afin d’éviter le chevauchement des feuilles des rosettes des différentes plantes entre elles. Une première dose de PEG est ajoutée au milieu nutritif des bacs-réservoir « Stress » après cette date, permettant d’atteindre une concentration de 0,5%. Par la suite 0.5% de PEG est ajouté au milieu de culture tous les 2 jours jusqu’à l’obtention d’une concentration de 2,5% de PEG. Trois jours après l’application de 2,5% de PEG le milieu de culture des bacsréservoirs « Stress » a été changé par du milieu nutritif frais et les plantes ont subi la phase de réhydratation pendant une semaine. Tableau 2 : Masses de PEG à ajouter au milieu nutritif pour chaque palier d’augmentation de la concentration en PEG dans le bac réservoir « stress ». Concentration finale en PEG (%) 0,5 Concentration en PEG (g/l) 5 Masse de PEG dans milieu (15L) en g 75 Masse de PEG a ajouter en enlevant 1L 75 Masse de PEG dans 1L (g) 5 1 10 150 80 10 1,5 15 225 85 15 2 20 300 90 20 2,5 25 375 375 Figure 13 : Schéma représentant une rhizobox permettant la culture en terre d’Arabidopsis thaliana. MATERIEL ET METHODES réalisées sur les 4 systèmes hydroponie et représentant une étude complète sur un grand nombre de plantes, seront aussi présentées en détail dans la partie résultats. Ces différentes expérimentations ont ainsi permis de mettre au point un protocole définitif d’application du stress osmotique qui est utilisé pour l’expérimentation « Campagne réhydratation ». Ce dernier protocole est représenté Figure 12. Après 24 jours de culture, une première dose de 0,5% de PEG a été ajoutée au milieu de culture. Ensuite, une dose équivalente à 0,5% de PEG a été ajoutée tous les 2 jours dans le milieu nutritif. L’ajout de cette dose est effectué en retirant 1L de milieu nutritif aux 15L en circulation dans le système, et en remettant 1L de milieu de culture contenant la quantité de PEG nécessaire à l’obtention de la concentration voulue. Les quantités de PEG à ajouter pour chaque pas d’augmentation de concentration sont présentées sur le Tableau 2. L’ajout de PEG a été poursuivi jusqu’à l’obtention d’une dose de 2,5% de PEG final. Pour cette dose de PEG, correspondant à 8 jours après le début d’application du stress, le milieu de culture est changé et la dose de PEG nécessaire est ajoutée directement au milieu nutritif préparé. Trois jours après l’application de 2,5% de PEG, une première récolte des plantes est réalisée. Au moment de cette récolte, le milieu de culture des bacs réservoirs contenant le PEG a été changé par du milieu nutritif frais dans le but de réaliser une phase de réhydratation. Après une semaine de réhydratation une seconde récolte est réalisée. 2.2.6 Mise en place du système de culture d’Arabidopsis thaliana en rhizobox Afin de vérifier si notre modèle d’étude du compartiment racinaire par culture hydroponique et l’application d’un stress osmotique par ajout de PEG se rapprochent des conditions retrouvées en terre, un nouveau système de culture permettant d’étudier le compartiment racinaire dans son intégralité a été confectionné au laboratoire. La réalisation de ce système de culture appelé rhizobox s’est inspirée de travaux réalisés dans d’autres laboratoires (Wenzel et al. 2001, Xiong et al. 2006). La rhizobox permet la culture des plantes entre une plaque de plexiglas et une membrane de nylon (diamètre des mailles 7 µm, SefarNitex 03-7/2, Buisine), elle-même placée contre la terre (Figure 13). Celle-ci permet ainsi les échanges d’eau et d’éléments nutritifs entre les racines et la terre. La composition du système en plexiglas permet aussi de visualiser et de suivre la croissance des racines toute au long de l’expérimentation. De plus, ce système permet de récolter des racines propres et non souillées par la terre pour les analyses de biochimie et biologie moléculaire. Ce système a été mis en place 23 Figure 14 : Photographie d’une rhizobox entourée d’un sac noir, maintenue fermée par ses pinces. Figure 15 : Photographie d’une rhizobox après son identification par pyrogravure. Figure 16 : Photographie d’une rhizobox où la membrane de nylon présente de nombreux des plis. MATERIEL ET METHODES afin de pouvoir comparer les résultats d’expression des gènes de transporteurs de sucre en condition normale et en condition de stress osmotique obtenus par culture hydroponique, à ceux retrouvés en rhizobox sur des plantes ayant subi en stress hydrique. 2.2.6.1 Description de la rhizobox - Matériel : La rhizobox est constitué de 2 plaques de plexiglas de 20x20 cm, séparées par deux espaceurs en plexiglass (1 cm de longueur et de largeur). La rhizobox est maintenue fermée à l’aide de 2 pinces (wolfcraft, Leroy-Merlin). Afin de maintenir l’obscurité au niveau du compartiment racinaire, un sac noir (20x20 cm) recouvre la rhizobox (Figure 14). De la même façon, des bandes de scotch noir de 1 cm de large ont été placées sur la tranche supérieure des plaques de plexiglas de chaque rhizobox (Figure 15). En effet, il avait été montré dans des expérimentations préliminaires le développement d’algues sur la terre localisé dans la partie haute de la rhizobox. Nous disposons au laboratoire de 13 rhizobox, chacune numérotée afin de pouvoir les identifier au cours de l’expérimentation (Figure 15). - Remplissage des rhizobox : Le terreau utilisé pour le remplissage des rhizobox (EGO de la société Tref) est tamisé avec un tamis de 0,5 mm juste après l’ouverture du sac afin d’éliminer les particules des plus grossières. Ce tamisage permet d’obtenir un substrat homogène qui limitera la formation de plis au niveau la membrane de nylon appliquée entre la terre de la rhizobox et la plaque de plexiglas amovible. Ces plis peuvent se former au moment du rabat de la laque de plexiglas amovible sur la terre, lors de la fermeture de la rhizobox (Figure 16). Afin d’éviter toute contamination, la terre ainsi tamisée est autoclavée 1h à 120°C. Par la suite, une quantité de terre (provenant d’un sac de terreau fraichement ouvert) correspondant à un volume d’un litre est prélevé et pesé, puis 200 mL d’eau du robinet sont ajoutés. Le mélange est homogénéisé en malaxant la terre et l’eau afin d’obtenir une terre totalement humide. Cet état d’humidification de la terre permet d’éviter la formation de fissures lors du remplissage de la rhizobox, causées par une terre trop sèche ou trop humide. Un volume de 500 mL de terreau ainsi préparé est pesé, puis étalé sur la surface de la rhizobox, et son niveau est égalisé à l’aide d’une taloche. Ceci permet d’obtenir un remplissage homogène de la rhizobox, afin de limiter la formation de plis ou de bulles d’air entre la membrane et la terre. En effet, ces plis ou bulles biaiseraient le développement naturel des racines. 24 Figure 17 : Schéma représentant les emplacements des gouttes d’agarose dans lesquelles seront semées les graines. MATERIEL ET METHODES - Semis dans les rhizobox : Afin d’assurer un meilleur taux de germination des graines d’A. thaliana , celles-ci sont déposées dans une goutte d’agarose 0,25% contenant du milieu MS 1X (Murashige et Skoog). Pour chaque rhizobox, 4 gouttes de milieu agarose 0,25% + MS 1X sont déposées le long de la rhizobox à une distance de 4 cm les unes des autres (Figure 17). Dans chacune des gouttes et afin de maximiser le succès de germination, 3 graines ont été semées. Pour la culture des plantes, les dix rhizobox sont placées dans un phytotron dans lequel les conditions de culture sont contrôlées (photopériode 10 h de jour / 14 h de nuit ; température de 23°C le jour et de 18°C la nuit ; humidité relative de 50% le jour et 70% la nuit). Cinq jours après le semis, une seule plante est conservée par goutte d’agarose. Les graines qui n’ont pas germé sont retirées ainsi que les plantules surnuméraires et/ou présentant un développement anormal (présence d’un seul cotylédon). 2.2.6.2 Mise en place du stress hydrique Dans le cas de la culture en rhizobox, deux régimes hydriques sont appliqués afin d’étudier l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines d’A. thaliana . Un premier régime hydrique est appliqué sur 5 rhizobox témoins et correspond à l’humidification de la terre obtenue après remplissage des rhizobox. Ce taux d’humidité de la terre est considéré dans notre étude comme étant une terre avec un taux d’humidité de 100% (différent du 100% de la capacité en eau de la terre). Afin de maintenir une humidité de 100% dans ces rhizobox, ces dernières sont pesées tous les jours afin de déterminer la masse d’eau évaporée en 24h. Le volume d’eau correspondant à la masse d’eau évaporée est alors ajouté dans la rhizobox. Un autre régime hydrique est appliqué sur 5 autres rhizobox afin de mimer un déficit hydrique. Pour cela, ces rhizobox sont remplies comme les rhizobox témoins, pesées et placées sous une hotte à flux laminaire quelques heures. Le flux d’air de la hotte permet d’évaporer l’eau jusqu’à obtenir des rhizobox avec une terre correspondant à 75% de l’humidité des rhizobox témoin. Afin de maintenir ce taux d’humidité dans la terre, les rhizobox sont pesées tous les jours afin de déterminer la masse d’eau évaporée et ainsi, ajouter cette quantité dans la rhizobox par arrosage. 25 Figure 18 : Images correspondant à des captures d’écran effectuées lors de la mesure des surfaces foliaires projetées à l’aide du logiciel ImageJ. MATERIEL ET METHODES 2.2.7 Suivi physiologique des plantes 2.2.7.1 Suivi de la croissance des plantes - Suivi du nombre de feuilles au cours du temps. Les feuilles de toutes les plantes ont été comptées une fois par semaine après le jour de semis. A partir du nombre moyen de feuilles par plante calculé chaque semaine, la vitesse moyenne d’émergence des feuilles a été établie. Ce suivi a été effectué pendant les 6 premières semaines de culture des plantes de la « Campagne mise en place hydroponie » et sur les 4 premières semaines de culture des plantes en rhizobox. - Suivi de la surface foliaire projetée : La croissance des plantes a été estimée en mesurant la surface foliaire projetée des rosettes pour les expérimentations « Campagne réhydratation » et rhizobox. Pour les plantes en conditions témoins et les plantes en conditions stressées, une photographie des rosettes est effectuée pour chaque point du suivie des plantes. Ces photographies sont ensuite utilisées pour calculer l’aire des rosettes à l’aide du logiciel ImageJ (version 1.43, Wayne Rasband National Institutes of Health, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Avant d’effectuer l’analyse d’image proprement dite, il faut définir une échelle qui permettra au logiciel de calculer la surface foliaire. Sur chaque photographie de rosette, une référence de 1 cm (une règle pour les expérimentations en hydroponie et le bord du plexiglas pour les rhizobox) est déposée. Un trait correspondant à 1 cm de longueur réel est tracé sur l’image ce qui va permettre de définir le nombre de pixel que recouvre le trait de 1 cm. La fonction « Analyze » → « Set scale » permet de faire correspondre la quantité de pixel déterminée à une valeur réelle en mm. Une fois la calibration effectuée, la fonction « Plugins » → « Treshold color » de la barre d’outils est utilisée pour isoler les rosettes du reste de l’image. En effet, ce plugin permet de séparer l’image de la rosette du fond de la photo selon 3 paramètres : la teinte, la saturation et la luminosité. Ces trois paramètres vont être modifiés de façon à obtenir une image ne laissant apparaitre que la couleur verte sur la photographie, permettant ainsi de délimiter l’image des rosettes du reste de la photographie. La fonction « Threshold » va ensuite permettre de convertir l’image en noir et blanc. L’outil « Wand tool » va enfin permettre de sélectionner le contour de la rosette pour définir la surface foliaire à calculer. L’aire de la surface foliaire est calculée à partir de la commande « Analyze » → « Measure ». Cette dernière étape permet l’ouverture d’une nouvelle fenêtre contenant le résultat de la surface foliaire donné en mm² (Figure 18). 26 Figure 19 : Images représentant les captures d’écran après seuillage, utilisation de la commande « comp.connexes » et ouverture de la page de résultat lors de l’utilisation du logiciel « Réseau_racinaire ». MATERIEL ET METHODES - Suivi du réseau racinaire pour les plantes cultivées en rhizobox : La croissance des racines n’a pu être étudiée que pour les plantes cultivées dans le système rhizobox, car la transparence du plexiglas permet le suivi de ces dernières. Pour estimer cette croissance, la longueur des racines principales est mesurée tous les jours entre J8 et J26 dans les 2 conditions de culture, témoins et stressées. Pour les racines latérales, ces mesures sont effectuées lors de leur apparition à J17 et jusqu’à J26. Après 26 jours de culture, les racines de certaines plantes atteignent le bas des systèmes de culture, empêchant le suivi de la longueur des racines principales. De plus, la contrainte mécanique engendrée pouvant entrainer un biais dans la croissance et le développement des racines, la mesure des racines latérales est aussi arrêtée ce jour-là. Afin de calculer la longueur des racines principales, le logiciel d’analyse d’images « Réseau_racinaire », développé au laboratoire en fonction des paramètres que nous désirons mesurer (stage de licence en informatique effectué par Manuel Vaury, 2010) est utilisé. Ce logiciel a dans un premier temps été mis en place sur des scans de plantes cultivées en boite de Pétri. Comme il n’était pas possible de scanner les rhizobox, nous avions pensé utiliser des photographies du système racinaire prises au travers du plexiglas. Cependant, l’analyse des photographies du réseau racinaire des plantes cultivées en rhizobox par le logiciel s’est avérée impossible. En effet, le contraste entre les racines et la membrane de nylon est très faible, ce qui empêche la détection des racines par le logiciel. Pour pallier ce problème, les racines sont calquées tous les jours sur un transparent avec un stylo blanc. Les transparents sont ensuite scannés et les images obtenues analysées par le logiciel d’analyse d’images « Réseau_racinaire ». Dès l’ouverture du scan, le logiciel va transformer l’image couleur en une image en niveaux de gris. Cette étape va permettre de sélectionner le seuil de gris permettant de n’obtenir une image ne montrant que les racines blanches sur un fond noir. Une fois cette étape effectuée, il est possible via la fonction « Comp.connexes » de sélectionner individuellement les racines de chaque plante d’une rhizobox. La fonction « Traitement » permet enfin de déterminer la longueur de la racine principale, le nombre de racines latérales ainsi que leur longueur, pour chaque plante de l’image (Figure 19). 27 MATERIEL ET METHODES 2.2.7.2 Suivi de paramètres liés à l’état hydrique des plantes Deux paramètres nous permettent de suivre l’état hydrique des plantes : le contenu relatif en eau (RWC = relative water content) et le potentiel osmotique des tissus. Ces paramètres sont calculés sur 3 ou 5 plantes par condition selon les expériences. - Mesure du RWC (Relative Water Content ou contenu relatif en eau) : La mesure du RWC permet de connaitre le contenu relatif en eau de la plante. Le calcul de cette valeur nécessite la mesure de 3 paramètres : la masse fraiche (MF), la masse imbibée (MI) et la masse sèche (MS). La masse fraîche est pesée immédiatement après la récolte, la masse imbibée est mesurée après 24h d’immersion dans de l’eau distillée à 4°C et la masse sèche (MS) est déterminée après 24h de séchage des rosettes dans un four à 80°C. Le RWC se calcule en appliquant l’équation suivante RWC= 100 * (MF-MS)/(MI-MS). Ce paramètre a été mesuré dans toutes les expérimentations réalisées. Cependant, le nombre de plantes utilisées pour le déterminer peut varier en fonction de ces dernières. Il sera donc précisé pour chaque expérimentation dans la partie résultat. Détermination du Potentiel osmotique des plantes (π) et du Potentiel hydrique du milieu de culture (Ψ). Afin de déterminer le potentiel osmotique des feuilles, l’osmolalité du contenu cellulaire - est mesurée par un osmomètre (VAPRO 5520, Wescor). Pour chaque rosette, les liquides physiologiques de 3 feuilles adultes ont été extraits sur des plantes récoltées en début d’aprèsmidi (15h). Pour ce faire, les tissus sont placés directement après récolte dans des seringues en plastique de 2 mL et subissent 3 étapes successives de congélation/décongélation dans l’azote liquide. Cette étape permet de casser les parois et les membranes cellulaires afin de libérer les liquides cellulaires. Les seringues sont ensuite placées dans des tubes de 15 mL. Les tubes et seringues sont centrifugés 10 min à 8000 rpm à 4°C, afin de récupérer le liquide physiologique contenu dans les 3 feuilles. L’osmolalité de l’extrait est aussitôt mesurée à l’aide de l’osmomètre. Le solvant de l’échantillon étant l’eau, l’osmolalité mesurée est égale à l’osmolarité de l’échantillon. Le potentiel osmotique est déterminé à partir de l’osmolarité grâce à l’équation de Van’t Hoff. π = - R.T.(Osm) où : R = 8,314 (Constante des gaz parfait) T = température en °K (20°C = 293,15°K) Osm = Osmolarité (mosm.L-1) 28 MATERIEL ET METHODES Ce paramètre a été mesuré dans toutes les expérimentations réalisées. Cependant, le nombre de plantes utilisées pour le déterminer peut varier en fonction de ces dernières. Il sera donc précisé pour chaque expérimentation dans la partie résultat. Afin de déterminer le potentiel hydrique du milieu nutritif, un prélèvement de 15 mL est effectué et l’osmolarité de l’échantillon est aussitôt mesurée à l’aide de l’osmomètre. L’équation de Van’t Hoff ci-dessus est aussi utilisée pour calculer le potentiel hydrique de la solution. En effet, le potentiel hydrique d’une solution est égal au potentiel osmotique de cette dernière. 2.2.7.1 Suivi de l’allocation de la biomasse (rapport Root/Shoot) Afin de déterminer la répartition de la biomasse entre le compartiment racinaire et le compartiment aérien de la plante, le rapport R/S (Root/Shoot ou partie racinaire sur partie aérienne) a été déterminée. Le calcul de ce rapport nécessite la détermination des masses de matière sèche (après 24h à 80°C) des racines et des feuilles. Le rapport de la masse sèche des parties racinaires sur la masse sèche des parties aériennes est ensuite calculé à partir des mesures effectuées sur 5 plantes. Ce paramètre a été mesuré dans les expérimentations « Campagne » et lors de l’étude du développement de la plante. Cependant, le nombre de plantes utilisées pour le déterminer peut varier en fonction de ces dernières. Il sera donc précisé pour chaque expérimentation dans la partie résultat. 2.2.7.2 Dosage des chlorophylles Les chlorophylles sont extraites à partir d’un mélange de 3 feuilles jeunes et 3 feuilles adultes par plantes. Les tissus sont dans un premier temps broyés dans l’azote liquide, puis déshydratés par lyophilisation (48h à -30°C). La poudre obtenue est pesée et 3 mL d’acétone 80% sont ajoutés. L’extraction est réalisée toute une nuit à 4°C sous agitation douce. Les débris cellulaires sont ensuite éliminés après une centrifugation de 7 min à 12000g à température ambiante. L’absorbance de l’extrait est déterminée au spectrophotomètre à 663 et 645 nm qui sont les longueurs d’ondes les plus absorbées par la chlorophylle a (663 nm) et la chlorophylle b (645 nm). La concentration en chlorophylles totales est calculée selon la relation de Mackinney (Mackinney 1941). Cchl. tot = (0,0127.DO663-0,00269.DO645) + (0,0229.DO645-0,00468.DO663) Ce paramètre a été mesuré dans les expérimentations « Campagne » et lors de l’étude du développement de la plante. Cependant, le nombre de plantes utilisées pour le déterminer peut varier en fonction de ces dernières. Il sera donc précisé pour chaque expérimentation dans la partie résultat. 29 MATERIEL ET METHODES 2.2.7.3 Dosage de quelques éléments minéraux de la plante Le dosage de certains éléments minéraux permet de déterminer leur allocation dans les parties aériennes ou dans la partie racinaire. Il renseigne également sur la capacité d’absorption des racines selon les conditions de culture (présence d’un stress ou pas). Ainsi, la teneur en ions calcium (Ca2+), magnésium (Mg2+), potassium (K+), fer (Fe2+, Fe3+) a été évaluée par absorption atomique de flamme (modèle AA200, Perkin Elmer). Le dosage du phosphore (P), lui, a été réalisé par ICP-OES (induced coupled plasma – optical emission spectrometer) (modèle OPTIMA 2000 DV, Perkin Elmer). L’expérience a été menée sur les plantes des Campagnes « stress » et « réhydratation ». Pour chaque condition, 5 échantillons sont testés. Pour chaque échantillon, 3 mesures sont effectuées, chaque mesure étant la moyenne de 50 mesures instantanées. Les plantes utilisées sont séchées 24h à 80°C juste après récolte, puis broyées dans une solution de HCl 0,5%. Le broyat est ensuite centrifugé 15 minutes à 8000g. Le surnageant est filtré sur un filtre de 0,45 µm. C’est ce filtrat qui est utilisé pour le dosage. En fonction de la quantité d’éléments présents dans le filtrat des différents échantillons, des dilutions peuvent être effectuées afin de rester dans la gamme de sensibilité des appareils. 2.2.7.4 Dosage du nitrate de la plante Cette expérience est effectuée sur le filtrat préparé pour le dosage des éléments (cf. 2.2.7.3). Elle est basée sur la réaction entre le nitrate et le salicylate de sodium qui produit du paranitrosalicylate de sodium coloré en jaune pouvant être dosé en spectrophotocolorimétrie. Dix mL de filtrat convenablement dilués sont alcalinisés avec 0,5 mL de solution S (hydroxyde de sodium 40 % et tartrate double de sodium et potassium 6 %). Un mL de salicylate de sodium 0,5 % est rajouté. L’ensemble est mis à 65°C pendant environ 15h, de façon à évaporer la solution. Après refroidissement, le résidu est repris par 2 mL d’acide sulfurique. Après 10 min, 15 mL d’eau ultrapure et 15 mL de solution S sont ajoutés, permettant le développement de la couleur jaune. L’absorbance est mesurée au spectrophotocolorimètre à 415 nm et la concentration en nitrate est estimée à l’aide d’une droite d’étalonnage. 30 Tableau 3 : Liste des sondes utilisées pour l’élaboration des macroarrays avec leurs annotations respectives dans genbank. AtSTPs Nom Locus AtSUCs Nom Locus AtPLTs Nom Locus AtSTP1 AT1G11260 AtSUC1 AT1G71880 AtPLT1 AT2G16120 AtSTP2 AT1G07340 AtSUC2 AT1G22710 AtPLT2 AT2G16130 AtSTP3 AT5G61520 AtSUC3 AT2G02860 AtPLT3 AT2G18480 AtSTP4 AT3G19930 AtSUC4 AT1G09960 AtPLT5 AT3G18830 AtSTP5 AT1G34580 AtSUC5 AT1G71890 AtPLT6 AT4G36670 AtSTP6 AT3G05960 AtSUC6 AT5G43610 AtSTP7 AT4G02050 AtSUC7 AT1G66570 AtSTP8 AT5G26250 AtSUC8 AT2G14670 AtSTP9 AT1G50310 AtSUC9 AT5G06170 AtSTP10 AT3G19940 Gènes de références AtSTP11 AT5G23270 Nom Locus AtSTP12 AT4G21480 Actine 11 At3G12110 AtSTP13 AT5G26340 Histone H4 At2G28740 AtSTP14 AT1G77210 Ef1α At5G60390.1 MATERIEL ET METHODES 2.2.7.5 Suivi de la conductance stomatique La conductance stomatique est mesurée à l’aide d’un poromètre (Leaf Porometer model SC-1, DECAGON DEVICE) tous les 2 jours, à partir de la première application du PEG. Les mesures sont effectuées entre 9h30 et 11h sur les feuilles 8 et 10, de 5 plantes cultivées en conditions témoins et 5 plantes cultivées en conditions stressées. La calibration de l’appareil s’effectue une heure avant chaque expérimentation selon les instructions du fabricant. L’expérience a été menée sur les plantes des Campagnes « stress » et « réhydratation ». 2.2.8 Méthodes d’analyse de l’expression des gènes 2.2.8.1 Extraction des ARN Les ARN des feuilles et des racines (échantillons constitués d’un pool de plusieurs plantes) sont extraits à partir de matériel congelé à -80°C suivant la méthode d’extraction au REB (RNA Extraction Buffer : Tris HCl 25 mM, pH 8 ; EDTA 25 mM ; NaCl 75 mM ; SDS 1% v/w ; β-mercaptoethanol 1M) mise au point par Kay et collaborateurs (1987). Après extraction, les ARN sont dosés au spectrophotomètre et leur qualité est vérifiée sur gel d’agarose 2% après coloration au bromure d’éthidium (BET 0,5 µg.mL-1). 2.2.8.2 Analyse de l’expression par macroarray - Elaboration des membranes de macroarray : Des travaux réalisés précédemment au laboratoire ont permis la réalisation d’un filtre thématique « transporteurs de sucre » (macroarray) comportant des séquences partielles correspondant aux 14 gènes de transporteurs d’hexose de la famille des AtSTPs (AtSTP1 à AtSTP14), aux 9 gènes de transporteurs de saccharose AtSUCs (AtSUC1 à AtSUC9) ainsi qu’aux 5 gènes de transporteurs de polyol AtPLTs (AtPLT1, AtPLT2, AtPLT3, AtPLT5 et AtPLT6) d’A. thaliana . Les séquences partielles sont utilisées afin d’éviter les hybridations aspécifiques dues aux fortes homologies de séquence entre les gènes de transporteurs de sucre (Afoufa-Bastien et al. 2010). De plus 3 gènes de référence, EF1 (AtEF1), l’Histone (AtHISH4) et l’Actine (AtACT2) ont été déposés sur la membrane afin de pouvoir normaliser les résultats d’expression. La liste complète des sondes utilisées pour les macroarrays avec leurs annotations respectives dans genbank est rapportée sur le Tableau 3. 31 Figure 20 : Plan de dépôt des différentes sondes sur les membranes de macroarray MATERIEL ET METHODES Chacune des sondes déposées sur les macroarrays a été clonée dans un plasmide bactérien pGemT-Easy (Promega). En vue de réaliser les macroarrays nécessaires à nos analyses. Les sondes de chacun des gènes déposés sur le filtre ont été amplifiées en grande quantité. Pour ce faire, les séquences partielles des gènes de transporteurs de sucre ainsi que les gènes de référence, ont été amplifiés par PCR à partir des plasmides en utilisant des amorces positionnées dans la région 3’UTR des gènes. Cinquante ng de sondes des gènes d’intérêt et 100 ng des sondes des gènes de ménage ont été ensuite déposés sur une membrane de nylon (Amersham Hybond-N+, GE Healthcare) à l’aide d’un « dotter » (BIO-RAD BIO-DOT Apparatus). Toutes les sondes ont été déposées en triple sur la membrane comme indiqué sur la Figure 20. La membrane est ensuite placée 2 minutes dans une solution de dénaturation (1,5 M NaCl ; 0,5 M NaOH) afin de dénaturer les ADN déposés sur la membrane. Cette dernière est ensuite déposée dans une solution de neutralisation (1,5 M NaCl ; 0,5 M Tris pH8) pendant 30s, puis dans une solution de SSC 2x (0,3M NaCl ; 0,03 M Citrate trisodique ; pH 7). Les ADN sont ensuite fixés de façon covalente à la membrane par une exposition aux UV pendant 1 minute à 0,120 J.cm-² à l’aide d’un cross-linker (Bio-Link, BLXE, E254). La membrane est ensuite séchée puis conservée à 4°C dans un sac hermétiquement fermé jusqu’à son utilisation. - Préparation des ADNc radiomarqués : Les ADNc radiomarqués sont synthétisés à partir des ARN totaux extraits. Dans un premier temps les ARN vont subir un traitement DNase afin d’éliminer toute trace d’ADN dans ces extraits. Ainsi, 10 µL de tampon RDD (QUIAGEN) et 2,5 µL de DNaseI (QUIAGEN) sont ajoutés à une solution contenant maximum 100 µg d’ARN. Le volume du mélange est ramené à 100 µL par ajout d’eau ultrapure puis incubé 30 min à 37°C. A la suite du traitement DNase, la solution d’ARN obtenue est purifiée par le kit RNeasy kit (QIAGEN) en suivant les instructions du fabricant. Les ARN ainsi préparés sont ensuite rétrotranscrits. Pour se faire, 30 µg d’ARN sont suspendus dans 20 µL d’eau ultrapure et 1 µL d’oligo dT 100 µM (16 thymines) sont ajoutés à la solution. Le mélange est incubé 5 minutes à 70°C. Après l’incubation, 10 µL de tampon MMLV 5x (PROMEGA), 5 µL d’un mix de dNTPs (0,5 mM dATP, dGTP, dTTP et 2,26 µM dCTP), 4 µL de reverse transcriptase M-MLV 200 u/µL (PROMEGA) et 5 µL de [α-33P]dCTP 0,33 µM sont ajoutés et le mélange est incubé 2h à 37°C. La réaction de reverse transcription est ensuite stoppée par 15 min d’incubation à 70°C et le mélange réactionnel est transféré immédiatement dans la glace. Après rétro-transcription, les ARN sont dégradés par 32 Figure 21 : Image obtenue après exposition d’une membrane de macroarray sur un écran PhosphoImager. MATERIEL ET METHODES l’ajout de 5 µL de Ribonucléase 2 u/µL (PROMEGA) et incubation pendant 30 min à 37°C. Les ADNc radiomarqués sont alors purifiés sur colonne GR 50 IllustraTM ProbeQuantTM (GE Healthcare). Les ADNc radiomarqués sont ensuite dénaturés 5 minutes à 100°C puis incorporés au tampon Church (0,25 M Na2HPO4-NaH2PO4 pH 7,2 ; 1 mM Na2EDTA ; 7% SDS (m/v) et 1% BSA (m/v)). - Hybridation des membranes de macroarray : Afin de saturer les sites aspécifiques des membranes de macroarray, ces dernières sont pré-hybridées dans 20 mL de tampon Church (NaPO4 (pH 7,2) 0,25M ; SDS 7% (p/v) ; Na2EDTA 1mM ; BSA 1% (p/v)) dans des tubes à vis pour hybridation, pendant 3h à 65°C sous rotation lente. Au terme de la pré-hybridation, les membranes sont hybridées en présence des ADNc radioactivement marqués, dans 20 mL de tampon Church à 65°C pendant toute une nuit. Après une nuit de préhybridation, les membranes sont lavées à 65°C, 2 fois 15 min avec une solution de 2X SSC, 0,1X SDS, 2 fois 15 min avec une solution de 1X SSC, 0,1X SDS puis 1 fois 15 min avec une solution de 1X SSC, 0,1X SDS. Les membranes sont ensuite déposées sur un papier Whatman® préalablement imbibé de SSC 2x puis emballées hermétiquement dans un sac plastique thermosoudé. Les membranes sont enfin déposées dans des cassettes et sur un écran PhosphoImager (Storage Phosphor Screen ; Molecular Dynamics) pendant 96h. Les écrans exposés sont ensuite révélés par un scanner (Scanner Typhoon, GE Healthcare ; Figure 21). L’intensité des spots est analysée à l’aide du logiciel ImageQuantTL 7.0 (GE Healthcare). Les données sont ensuite analysées dans un tableur Excel qui permettra de normaliser les intensités des spots des gènes d’intérêt en fonction de l’intensité des spots des 3 gènes de références utilisés sur les membranes (EF1α, ACT2 et HISH4). 2.2.8.3 Analyse de l’expression des gènes par RT-qPCR L’analyse de l’expression de gènes par PCR en temps réel est réalisée selon la méthode utilisant le réactif SYBRGreen. Le SYBRGreen est un agent intercalant qui émet de la fluorescence lorsqu’il est lié à un fragment d’ADN double brin. Pendant une réaction PCR, l’intensité de la fluorescence est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés. Ainsi, la mesure de fluorescence à chaque cycle permet le suivi de l’amplification en temps réel. Les résultats obtenus sont les nombres de cycles (Cycle threshold, Ct) nécessaires pour que la fluorescence émise par les amplicons atteigne un signal seuil déterminé par le logiciel. 33 Tableau 4 : Séquences des amorces utilisées pour l’amplification des gènes par RTqPCR Nom des gènes At5g12240 AtSUC1 AtSUC2 AtSUC5 AtSTP13 AtPLT6 AtRD29 AtTIP1,2 Amorce sens Amorce antisens AATATCGCTTTGCAGCTTCTG TATGCCGCTGGTTCGTACACT ATCTAGCCATTGTCGTCCCTC GTGCGTCCGGAGGCGGTGAA TATGGGACCGCCAAGATTAAA GGAGGCGTGTTGGAAGAA GAAAGGAGGAGGAGGAATGGTT CAAGAACGGTAGTCTCGGAACA GATTTTGCAAGGCTTTCGAG GAACAAAGGAACGCTTGA AGAGAGCCAAACAACCAC GGACGCTCAATTCGGCGG AAGCTCCGACCGTTAGAAGAA TGGTGAAGGAGTGTGGAA GGAGCCAAGTGATTGTGGAGA GACCAGCCCAGTAAACCCAGT MATERIEL ET METHODES Un gène de référence (At5g12240), de fonction inconnue, dont l’expression est constante lors d’un stress hydrique (Czechowski et al. 2005), est utilisé pour normaliser l’expression des gènes d’intérêt. Le Ct obtenu pour ce gène est systématiquement soustraits aux Ct obtenus pour les gènes étudiés permettant d’obtenir une valeur de delta de Ct (ΔCt). Le ΔCt obtenu pour chaque gène étudié est comparé dans les différentes conditions testées. De plus, pour comparer les modifications du transcriptome dans nos conditions de stress hydrique avec celle d’autres études sur le même stress, des gènes dont l’expression est modifiée lors d’un stress ont été sélectionnés dans la littérature. Ainsi l’expression des gènes RD29a , dont l’expression est systématiquement induite en condition de stress hydrique (Alexanderson et al. 2005 ; Msanne et al. 2011), et TIP1,2, connu pour avoir une expression fortement réprimée en stress hydrique (Hundertmark and Hincha 2008), sera suivie pour chacune de nos expérimentations. Ces 2 gènes servent de contrôle de stress pour toutes les analyses en RT-qPCR de chacune de nos expérimentations. Les PCR sont réalisées à partir des ADNC synthétisés à partir des ARN totaux extraits des racines ou des feuilles de plantes soumises à différentes expérimentations. En vue de réaliser la synthèse de ADNc à partir de ces ARN extraits et afin d’éliminer toute trace d’ADN (en vue des études d’expression), ceux-ci sont traités avec la DNase RQ1 (Promega) pendant 30 minutes à 37°C. Les ARN sont ensuite rétrotranscrits en utilisant une réverse transcriptase (M-MLV, Promega) selon les instructions du fabricant. Les amorces utilisées sont sélectionnées pour une température d’hybridation de 60°C, une composition en GC proche de 50% et une longueur d’environ 20 nucléotides (Tableau 4). Le mélange réactionnel (20 µL) contient 10 µL de SYBRGreen (Power SYBR®Green, Applied Biosystem), 0,2 µL de chacune des amorces 10 mM, 5 µL de matrice ADNc. Le programme d’amplification comprend une première étape de dénaturation (10 min à 95°C), 40 cycles d’amplification (15s à 95°C, 1 min à 60°C). A la fin des 41 cycles d’amplification, une augmentation progressive de la température de 60°C à 95°C est réalisée par palier de 0,1°C pour déterminer la courbe de fusion du produit d’amplification. Le profil de la courbe permet de vérifier la présence d’un seul produit d’amplification et donc la spécificité des amorces utilisées. Pour chaque réaction, 3 réplicats techniques sont réalisés. Les réactions d’amplifications sont réalisées à l’aide d’un thermocycleur Realplex² (Eppendorf). L’analyse des résultats est effectuée par le logiciel Mastercycler® ep realplex (Eppendorf). Les données obtenues sont les valeurs de Ct pour chacun des gènes étudiés. L’analyse des résultats est réalisée à l’aide du logiciel Excel, selon la méthode de quantification relative décrite 34 Figure 22 : Schéma des différentes étapes de l’élaboration des colonnes de purification des extraits de sucres solubles. MATERIEL ET METHODES par Livak et Schmittgen (2001). Dans un premier temps la moyenne des Ct des 3 réplicats techniques est calculée pour le gène cible et pour le gène de référence pour obtenir ensuite le ΔCt de chaque gène cible étudié. La quantité relative du transcrit est calculée comme 2-ΔCt. Pour effectuer une quantification relative qui met en relation l’expression du gène cible dans deux conditions (témoin et stressé), un ΔΔCt (ΔCtSt-ΔCtTm) est calculé et l’expression relative est exprimée comme 2-ΔΔCt. 2.2.9 Méthodes d’analyse biochimique 2.2.9.1 Dosage de sucres solubles Les sucres solubles sont extraits à partir de matériel végétal congelé dans l’azote liquide et stocké à -80°C. Les tissus (racines, feuilles, hampes florales ou siliques) sont dans un premier temps déshydratés par lyophilisation (48h à -30°C). L’extraction est ensuite réalisée sur 50 mg de tissu lyophilisé en suivant le protocole d’extraction au Méthanol-Chloroforme-Eau (125-3 v/v/v) décrit par Dickson (1979). Après extraction, la solution aqueuse contenant les sucres est prélevée afin d’être purifié, et 10 mL d’éthanol 80% est ajouté au culot afin de doser l’amidon ultérieurement. La purification des extraits glucidiques est réalisée sur des cartouches de purification ionique fabriquées au laboratoire. Ces cartouches sont élaborées à partir d’une résine anionique (AG1*8 100-200 mesh, forme HCO3-), d’une résine cationique (DOWEX 50W *8 400 Mesh forme H+), et de PVPP (protocole INRA Clermont-Ferrand). La purification de ces extraits permet d’éliminer les composés polaires (acides aminés ou sucres-phosphate) et les pigments. Cette purification permet de mieux séparer les différents sucres lors de l’analyse HPLC. La résine anionique, achetée sous forme acétate, est passée sous forme carbonate par 3h d’incubation sous agitation dans une solution de Na2CO3 1M. Les résines ainsi que le PVPP sont ensuite lavées 3 fois avec de l’eau ultrapure avant d’être déposées dans les cartouches. La Figure 22 décrit les étapes de la fabrication de ces colonnes de purification. Les extraits glucidiques, préalablement ramenés à un volume de 1 mL par évaporation sous vide 5h à 30°C (MiVac Quatro concentrator, GeneVac), sont déposés sur la colonne de purification qui sera ensuite rincée avec 1 mL d’eau ultrapure. Les 2 mL ainsi purifiés, sont enfin ramené à un volume de 1 mL par évaporation sous vide 2h à 30°C. La séparation des sucres est réalisée par méthode isocratique (eau ; 0,6 mL.min-1 ; 85°C.) sur une colonne Aminex HPX-87C (300 X 7,8 mm ; BIO-RAD) qui combine les mécanismes des chromatographies d’exclusion et d’échange d’ions. Les molécules sont détectées à l’aide d’un 35 Figure 23 : Schéma du système de culture des plantes utilisé pour l’absorption du saccharose radiomarqué. MATERIEL ET METHODES refractomètre différentiel IOTA2 (Refractive Index detector 475, Kontron Instruments). La concentration pour chacun des sucres présents dans l’échantillon dosé est déterminée à partir de courbe étalons (absorbance = f (concentration)) réalisées pour chacun des sucres et stockées dans le logiciel d’analyse (TOTAL CHROME, Perkin Elmer). Les différentes dilutions réalisées sont prises en compte pour exprimer le contenu en sucre de l’échantillon en µmol sucre par g masse sèche. 2.2.9.2 Dosage de l’amidon Les culots obtenus après extraction des sucres solubles sont utilisés pour extraire l’amidon. Dans un premier temps, 5 mL d’eau ultrapure sont ajoutés au culot d’amidon obtenu, et le mélange est vigoureusement agité afin d’obtenir une solution assez homogène. La préparation des échantillons est réalisée selon le protocole de Smith et Zeeman (2005). Le dosage de l’amidon s’effectue ensuite sur 0,5 mL à l’aide du kit ‘Starch Assay Reagent, HK’ (SIGMA SA20-1KT). L’amidon est dans un premier temps clivé en glucose par l’amyloglucosidase. Le glucose produit est ensuite phosphorylé en glucose-6-phosphate par l’hexokinase en présence d’ATP. Une dernière enzyme, la glucose-6-phosphatedeshydrogénase va enfin oxyder le glucose-6-phosphate en présence de NADP+ qui est réduit en NADPH. L’absorbance du NADPH est ensuite mesurée au spectrophotomètre à 340 nm et est divisée par le quotient d’extinction molaire du NADPH (ɛ = 6,22). La teneur en amidon des échantillons est calculée selon l’équation donnée par Smith et Zeeman (2006) : -1 [Amidon] mg.gMS = 162 X Absorbance (340 nm)/6,22 Volume d’incubation de l’échantillon (0,1 ml) 10 X Masse sèche de l’échantillon (g) 2.2.10 Etude du transport de [U-14C]-saccharose - Mise en place des plantes étudiées : Chaque plante est placée dans un tube Falcon® contenant 50 mL du milieu de culture, le bouchon ayant été percé pour introduire le porte-graine (Figure 23). Les plantes sont acclimatées la veille de l’expérience dans une enceinte en plexiglass avec un éclairage artificiel (80 µmol.m-2.s-1), à température ambiante. - Préparation de la solution de [U-14C] -saccharose : Le [U-14C]-saccharose (Perkin Elmer) est en solution dans un mélange éthanol/eau (9/1). La veille de l’expérience, pour chaque plante, 5 µL soit 18,5 kBq de cette solution sont évaporés 36 MATERIEL ET METHODES pendant la nuit sous une hotte à flux laminaire. Après évaporation, juste avant l’expérience, le [U-14C]-saccharose est dissous dans 2 µL de tampon MES (10 mM, pH 5,5). - Transport du [U-14C] -saccharose : Sur chaque plante, une feuille adulte est choisie. Cette feuille est légèrement abrasée sur une portion de la face supérieure, à l’aide de particules de carborundum de 60 µm (Prolabo). Deux µL de [U-14C]-saccharose sont déposés sur cette zone. Après 5h d’absorption, les plantes sont récoltées. - Récolte des plantes : A la récolte, la feuille sur laquelle a été déposé le saccharose radioactif, est isolée du reste de la rosette. De même les différents organes de la plantes sont séparés les uns des autres. Les racines sont séchées sur papier absorbant puis tous les organes sont placés sur une feuille de papier Whatman® et recouverts d’un film transparent. L’ensemble est placé entre 2 plaques d’acier préalablement refroidies à -80°C. Toutes ces opérations doivent être effectuées le plus rapidement possible afin d’éviter la redistribution du traceur radioactif dans les tissus après la récolte. Les plantes sont ensuite lyophilisées 1 semaine. - Autoradiographie : Après lyophilisation, dans le but de visualiser la répartition du marquage au sein des plantes, celles-ci sont placées dans des cassettes d’exposition avec un écran de PhosphorImager (Storage Phosphor Screen ; Molecular Dynamics). Après une semaine d’exposition, le marquage est révélé, à une résolution de 50 micromètres, par un scanner (Scanner Typhoon, GE Healthcare). - Quantification de la radioactivité : Afin de mesurer la radioactivité dans les différents tissus, ils sont découpés, pesés et digérés par un mélange acide perchlorique/eau oxygénée/Triton X100 0,1% (56/17/27) pendant 24h à 55°C (Girousse et al. 2003). Un facteur de proportion est gardé entre la masse sèche des échantillons (20 mg maximum) et le volume du milieu de digestion (150 µL). Puis 4 mL de scintillant (EcoliteTM) sont ajoutés au milieu de digestion. La radioactivité dans le milieu de culture a également été mesurée : 250 µL de milieu sont prélevés auxquels sont ajoutés 4 mL de scintillant (EcoliteTM). La radioactivité contenue dans les différents tissus et dans le milieu de culture peut ainsi être évaluée par un compteur à scintillation liquide (Tri-Carb 2910TR, Perkin Elmer). 37 MATERIEL ET METHODES 2.2.11 Analyses statistiques L’analyse statistique des résultats a été effectuée à l’aide du logiciel SigmaStat 3.5. Le test statistique effectué est choisi en fonction du nombre de données obtenues pour chaque expérimentation. Ainsi lorsque le nombre de données est supérieur à 30, un t-test de Student est réalisé. En revanche, lorsque le nombre de donnée est compris entre 5 et 30, un u-test de Mann et Witney est utilisé. Aucun test statistique n’a en revanche été réalisé pour un nombre d’échantillon inférieur à 5. Un test d’analyse de la variance (ANOVA) à un facteur, a aussi été utilisé pour l’analyse des résultats de dosage des chlorophylles au cours du développement. 38 RESULTATS ET DISCUSSION 3 RESULTATS ET DISCUSSION 39 Figure 24 : Schéma de la disposition des 4 systèmes de culture en hydroponie dans le phytotron. Les 4 systèmes de culture d’hydroponie A, B, C et D sont disposés sur l’étagère médiane gauche du phytotron. Un système d’hydroponie est composé d’un bac-réservoir (A0, B0, C0 ou D0) relié à 4 bacs Araponics (noté par exemple pour le système A : AI, AII, AIII et AIV), eux-mêmes reliés en série. RESULTATS ET DISCUSSION 3.1 Mise en place de la culture en hydroponie La mise en place de la culture en hydroponie a été réalisée sur l’écotype C24 d’A. thaliana au cours de l’expérimentation nommée « Campagne mise en place hydroponie ». Ce travail devait initialement être mené sur l’écotype Col-0. Cependant, une mauvaise annotation des tubes de graines stock a entrainé une inversion entre les graines de l’écotype Col-0 et les graines de l’écotype C24. Cette erreur n’a été mise en évidence qu’après le semis des plantes utilisées lors des expérimentations « Campagne mise en place hydroponie» et « Essai stress C24 ». La « Campagne mise en place hydroponie » a été menée afin de contrôler les conditions de culture des plantes au cours de leur développement. Ce contrôle était nécessaire aussi bien au niveau du phytotron, remis en fonctionnement après une longue période d’inactivité, qu’au niveau du système de culture hydroponique nouvellement mis en place au laboratoire. De ce fait, l’erreur concernant l’écotype utilisé pour cette première expérimentation a été de faible conséquence pour la suite de ce travail de thèse. Cette expérimentation a été réalisée à l’aide de 4 systèmes d’hydroponie notés A, B, C et D, disposés comme indiqué sur le schéma de la Figure 24. Les 4 bacs Araponics sont numérotés I, pour le premier bac à recevoir le milieu de culture, puis II, III et IV par ordre de remplissage des différents bacs. Les 4 bacs-réservoirs contenant le milieu de culture sont, quant à eux, appelés A0, B0, C0 et D0. 3.1.1 Mesure de paramètres physiques de la chambre de culture et du milieu de culture 3.1.1.1 Suivi de la température et de l’humidité dans le phytotron Le suivi de la température et de l’humidité du phytotron a été effectué par un enregistreur d’humidité relative et de température au cours de la journée et de la nuit (Datalogger ECOLOG TH1, ELPROG). Ce suivi a été effectué afin de vérifier si le phytotron, remis en fonctionnement après une longue période d’inactivité, régulait ces deux paramètres correctement. Ces mesures ont permis de montrer que la température est maintenue à 23°C pendant la journée et à 18°C au cours de la nuit. L’humidité relative enregistrée par l’appareil a permis de déterminer une valeur de 50% le jour et de 70% la nuit, comme ce qui était attendu. Ces données permettent de conclure au bon fonctionnement du phytotron après sa remise en marche. 3.1.1.2 Suivi du PAR dans le phytotron La mesure du PAR (photosynthetically active radiation) a été effectuée par un photomètre (LI-250A light meter LI-COR) à l’intérieur du phytotron, au niveau des systèmes de culture 40 Figure 25 : Schéma de la disposition des 4 systèmes d’hydroponie sur l’étagère du phytotron avec les valeurs de PAR en µmol.m-2.s-1, mesurées au niveau des plantes au milieu de chaque système de culture. Figure 26 : Schéma du bloc de culture en hydroponie A avec les valeurs de PAR en µmol.m-2.s-1, mesurées au niveau l’étagère du phytotron, aux 4 coins du système de culture ainsi qu’au centre du système de culture. Tableau 5 : Valeurs des températures du milieu de culture mesurées dans les bacsréservoirs A0, B0, C0 et D0 toutes les 2h, de 9h à 19h (photopériode jour de 10h) au cours d’une journée de culture. Heures de mesure 9h 11h 13h 15h 17h 19h Bac A0 Bac B0 Bac C0 Bac D0 19,5 21,5 22,5 23 23 23 20 22 23 24 24 24 20 22 23 24 24 24 20 22 23 24 24 24 RESULTATS ET DISCUSSION d’hydroponie. Les mesures de PAR ont, dans un premier temps, été effectuées au centre des systèmes A, B, C et D, au niveau des plantes comme indiqué sur la Figue 25. Les résultats montrent que les valeurs de PAR sont comprises entre 74,04 et 88,97 µmol.m-2.s-1. Ces valeurs mesurées au niveau des différents blocs correspondent à une valeur de luminosité modérée (80 µmol.m-2.s-1) permettant cependant une bonne croissance des plantes d’A. thaliana (Tikkanen et al. 2006). Les valeurs de PAR ont aussi été mesurées au niveau de l’étagère du phytotron autour du système de culture en hydroponie A. La Figure 26 représente les valeurs de PAR mesurées au niveau de l’étagère, aux 4 angles du système de culture ainsi qu’au milieu de celui-ci. Les valeurs indiquent que le PAR mesuré aux quatre coins du bloc est beaucoup plus faible (entre 31 µmol.m-2.s-1 et 66 µmol.m-2.s-1) qu’au centre de ce dernier (74 µmol.m-2.s-1) mais au niveau des plantes. Ce résultat est vraisemblablement dû à la géométrie de la chambre de culture. Afin de limiter l’influence de cette différence de PAR sur la croissance des plantes, une rotation des plateaux des 4 bacs Araponics (par exemple AI, AII, AIII et AIV) de chaque système d’hydroponie (A, B, C et D) est effectuée tout au long de l’expérimentation. 3.1.1.3 Mesure de la température du milieu nutritif Dans un premier temps, les températures du milieu de culture des bacs A I à AIV ainsi que du bac-réservoir A0 ont été mesurées au moment de l’allumage des lampes de la chambre de culture, correspondant au passage de la température de nuit (18°C) à la température de jour (23°C). La température du milieu nutritif mesurée dans les bacs A I, AII, AIII et AIV et dans le bac-réservoir A0 à ce moment-là est de 19,5°C. Ces résultats montrent que la température du milieu de culture des quatre bacs Araponics (AI, II, III et IV) ainsi que du bac-réservoir A0 sont identiques. Etant donné que la température du milieu de culture est la même dans les 5 compartiments du système d’hydroponie (AI, II, III, IV et A0), pour la suite des expérimentations la température n’a été mesurée que dans les 4 bacs-réservoirs. Afin de savoir si la température du milieu nutritif varie dans les 4 bacs-réservoirs (A0, B0, C0 et D0) au cours d’une journée de culture, celle-ci a été mesurée toutes les 2 heures au cours de la photopériode de 10h appliquée (9h à 19h). Les résultats montrent une augmentation de la température des différents milieux de culture de 9h à 15h. En effet, la température moyenne des bacs-réservoirs à 9h du matin est de 20°C et à 15h celle-ci a atteint 24°C (Tableau 5). L’élévation de la température observée au niveau du milieu de culture est due à l’augmentation de la température de l’air. La température du milieu de culture se stabilise à 41 Tableau 6 : Valeurs de pH du milieu de culture mesurées dans les bacs-réservoirs A0, B0, C0 et D0, et dans chaque bac Araponics (AI, II, III et IV, BI, II, III et IV, CI, II ,III et IV et DI, II ,III et IV) après 14 jours de semis (J14). Milieu mesuré pH Bac-réservoir A0 Milieu mesuré Bac-réservoir 6,1 Milieu pH mesuré Bac-réservoir 6,1 B0 pH Milieu mesuré pH Bac-réservoir 6,1 C0 D0 6,1 Bac AI 6,1 Bac BI 6,1 Bac CI 6,1 Bac DI 6,1 Bac AII 6,1 Bac BII 6,1 Bac CII 6,1 Bac DII 6,1 Bac AIII 6,1 Bac BIII 6 Bac CIII 6,1 Bac DIII 6,1 Bac AIV 6,1 Bac BIV 6,1 Bac CIV 6,1 Bac DIV 6,1 Milieu Témoin 5,9 Tableau 7 : Valeurs de pH du milieu de culture mesurées dans les bacs-réservoirs A0, B0, C0 et D0 à J14, J21, J28, J35 et J42 après semis. Jours pH du après milieu semis témoin 14 pH du bac- pH du bac- pH du bac- pH du bac- réservoir A0 réservoir B0 réservoir C0 réservoir D0 5,9 6,1 6,1 6,1 6,1 21 5,7 6,4 6,5 6,4 6,4 28 5,6 6,4 6,4 6,4 6,4 35 5,9 6,3 6,4 6,2 6,2 42 5,7 6,5 6,6 6,5 6,3 RESULTATS ET DISCUSSION une température de 23°C pour le milieu de culture du bac-réservoir A0 et de 24°C pour les autres bacs-réservoirs entre 15h et 19h (Tableau 5). 3.1.1.4 Mesure du pH du milieu nutritif Le pH du milieu de culture est un paramètre important car le milieu de culture est en contact direct avec les racines. Au niveau de la rhizosphère, des travaux indiquent que le pH influence l’absorption de certains éléments nutritifs comme le Fe, Zn, Mn ou P (Walter et al. 2009). Il a aussi été montré que des variations de pH peuvent avoir un impact sur l’effet toxique de certains ions. Une étude réalisée par Degenhardt et collaborateurs (1998) met ainsi en évidence une toxicité plus forte de l’ion aluminium chez des plantes d’A. thaliana cultivées dans un milieu acide. Aussi, afin de vérifier les conditions de pH dans notre système de culture, la mesure de ce paramètre est réalisée sur le milieu nutritif fraichement préparé. Une autre mesure est réalisée dans le milieu après une semaine de culture des plantes et juste avant le changement de milieu. Dans un premier temps, le pH du milieu de culture de chaque bac Araponics (AI, II, III et IV, BI, II, III et IV, CI, II ,III et IV et DI, II ,III et IV aussi notés XI, II, III et VI où X = A, B, C ou D), ainsi que des bacs-réservoirs (A0, B0, C0 et D0 aussi notés X0 où X = A, B, C ou D) a été mesuré 14 jours après le semis (J14), période qui correspond à la sortie des premières racines à travers le porte-graine. Le pH mesuré dans le milieu nutritif frais (milieu témoin) est de 5,9 unités pH (Tableau 6), ce qui correspond à la valeur de pH attendu pour la solution nutritive que nous utilisons (Gibeaut et al. 1997). Le pH du milieu nutritif mesuré dans tous les bacs Araponics (XI, II, III et IV) et dans les bacs-réservoirs (X0) est assez similaire et oscille entre 6 et 6,1 unités pH (Tableau 6). Pour la suite de l’expérimentation, le pH sera mesuré uniquement dans les 4 bacs-réservoirs (X0). Les valeurs de pH ont été mesurées avant chaque changement de milieu de culture dans les 4 bacs-réservoirs (X0). Les mesures ont débuté 14 jours après le semis (apparition des racines) et ont été effectuées une fois par semaine, jusqu’à J42 (fin de l’expérimentation), afin de suivre l’évolution de pH du milieu nutritif tout au long du développement des plantes. Le Tableau 7 indique le pH mesuré dans les 4 bacs-réservoirs (X0), et pour chaque jour de mesure (J14, J21, J28, J35 et J42). 42 Tableau 8 : Valeurs de potentiel hydrique (Ψ) du milieu de culture dans les différents bacs Araponics (AI, II, III et IV, BI, II, III et IV, CI, II ,III et IV et DI, II ,III et IV) et bacs-réservoirs (A0, B0, C0 et D0) après 14 jours de semis (J14). Ψ Milieu (MPa) mesuré -0,06 Bac B0 Ψ Milieu (MPa) mesuré -0,06 Bac C0 Ψ Milieu (MPa) mesuré -0,06 Bac D0 Bac AI -0,06 Bac BI -0,05 Bac CI -0,06 Bac D1 -0,07 Bac AII -0,06 Bac BII -0,06 Bac CII -0,07 Bac D2 -0,06 Bac AIII -0,06 Bac BIII -0,06 Bac CIII -0,06 Bac D3 -0,07 Bac AIV -0,05 Bac BIV -0,07 Bac CIV -0,07 Bac D4 -0,07 Milieu mesuré Bac A0 Milieu Tm -0,08 Ψ (MPa) -0,07 RESULTATS ET DISCUSSION Les résultats montrent dans un premier temps de légères variations de la valeur du pH (de 5,6 à 5,9 unités pH) pour les milieux nutritifs préparés en début de chaque semaine (J 14, J21, J28, J35 et J42) au cours de l’expérimentation. Le pH n’étant pas ajusté lors des préparations du milieu nutritif, ces variations pourraient s’expliquer par les variations de pH de l’eau utilisée. En effet, l’eau utilisée est de l’eau osmosée, ayant par conséquent des variations de pH plus importantes que l’eau du robinet. Pour tous les jours de mesures considérés (J14, J21, J28, J35 et J42), les valeurs de pH mesurées dans les 4 bacs-réservoirs (X0) restent proches entre elles. Par exemple, à J21 les valeurs de pH pour les bacs-réservoirs A0, B0, C0 et D0 sont respectivement de 6,4 ; 6,5 ; 6,4 et 6,4 (Tableau 7). La mesure du pH, après une semaine de culture des plantes, révèle une alcalinisation du milieu nutritif par rapport au pH du milieu nutritif frais. Cette augmentation du pH est faible après 14 jours de culture (+0,2 unités pH) mais devient plus importante à partir de J21 et jusqu’à J42 (en moyenne +0,7 unités pH / pH du milieu frais à J21 ; et +0,8 unités pH / pH du milieu frais à J42 ; Tableau 7). 3.1.1.5 Suivi du potentiel hydrique (Ψ) du milieu nutritif Le relargage éventuel de composés par les racines dans le milieu nutritif peut entrainer, une variation du potentiel hydrique de celui-ci, entre 2 changements de milieu de culture (Badri and Vivanco 2009). Dans le but de déterminer si ce paramètre varie au sein du système de culture d’hydroponie, le potentiel hydrique du milieu de culture a été calculé à partir de la mesure de l’osmolarité et en appliquant l’équation de Van’t Hoff (cf § n°2.2.7.2). Tout comme pour les mesures de pH, une première mesure de potentiel hydrique du milieu de culture a été effectuée après 14 jours de culture, sur les bacs-réservoirs (X0) et les 4 bacs Araponics (XI, II, III, IV), ainsi que dans le milieu nutritif fraichement préparé. Le potentiel hydrique calculé pour le milieu de culture frais est de -0,08 MPa. Concernant le milieu nutritif contenu dans les bacs Araponics (XI, II, III et IV) et les bacs-réservoirs (X0), les valeurs de potentiel hydrique calculées oscillent entre -0,05 MPa et -0,07 MPa (Tableau 8). Ces résultats montrent que le potentiel hydrique du milieu nutritif des 4 bacs Araponics de chaque système d’hydroponie, ainsi que leur bac-réservoir respectif, est très proche de celui du milieu témoin. De plus, il est à noter que les valeurs de potentiel hydrique sont très homogènes dans les différents bacs XI, II, III et IV du système d’hydroponie quel que soit le système considéré (A, B, C ou D ; Tableau 8). Aussi, pour la suite de l’expérimentation, le potentiel osmotique sera déterminé uniquement dans les bacs-réservoirs (A0, B0, C0 et D0). 43 Tableau 9 : Valeurs de potentiel hydrique (Ψ) du milieu de culture mesurées dans les bacs-réservoirs A0, B0, C0 et D0 à J14, J21, J28, J35 et J42 après semis et dans le milieu frais. Ψ du Ψ du bacΨ du bacΨ du bacΨ du bacJours après milieu frais réservoir A réservoir B réservoir C réservoir D semis (MPa) (MPa) (MPa) (MPa) (MPa) -0,08 -0,06 -0,06 -0,06 -0,07 14 -0,10 -0,09 -0,09 -0,09 -0,09 21 -0,06 -0,11 -0,10 -0,10 -0,10 28 -0,10 -0,09 -0,07 -0,07 -0,09 35 -0,09 -0,05 -0,05 -0,04 -0,05 42 RESULTATS ET DISCUSSION Les valeurs du potentiel hydrique, pour les milieux nutritifs contenus dans les 4 bacsréservoirs (A0, B0, C0 et D0), ont été mesurées une fois par semaine avant le changement de milieu, à partir de 14 jours après semis (apparition des premières racines) jusqu’à la fin de l’expérimentation à J42. Le Tableau 9 montre que les valeurs de potentiel osmotique déterminées dans les quatre bacs-réservoirs A0, B0, C0 et D0 restent très homogènes pour un jour de mesure donné. Par exemple pour le prélèvement à J 28 les valeurs de potentiel hydrique du milieu nutritif dans les bacs-réservoirs sont comprises entre -0,11 MPa et -0,10 MPa. Cependant, de faibles variations des valeurs du potentiel hydrique (entre -0,04 MPa et -0,1 MPa) sont observables dans les 4 bacs-réservoirs (A0, B0, C0 et D0) lors les différents jours de mesures (J14, J21, J28, J35 et J42 ; Tableau 9). 3.1.1.6 Discussion Afin de contrôler les conditions de culture de plantes d’A. thaliana (C24) au cours de leur développement dans le phytotron et dans chaque système de culture en hydroponie, quelques paramètres physiques du phytotron et du milieu nutritif ont été mesurés. L’ensemble des valeurs des paramètres physiques mesurés indique un bon maintien de la température et de l’humidité par le phytotron tout au long de la journée et de la nuit. Le PAR mesuré au centre des systèmes de culture est assez proche pour les quatre systèmes d’hydroponie utilisés (A, B, C et D). Les valeurs de PAR, autour de 80 µmol.m -2.s-1, sont suffisantes pour la croissance et le développement des plantes comme l’indique le suivi des plantes au cours l’expérimentation appelé « Campagne mise en place hydroponie ». Bien qu’il ait été montré que le développement optimal d’A. thaliana avait lieu pour une intensité lumineuse comprise entre 100 et 150 µmol.m-2.s-1, sa croissance est cependant maintenue pour une valeur de 80 µmol.m-2.s-1 (Tikkanen et al. 2006). En revanche, au sein d’un même système de culture (A, B, C ou D), les valeurs de PAR retrouvées peuvent varier de façon assez importante. C’est la raison pour laquelle, une rotation des bacs Araponics a été réalisée une fois par semaine tout au long de l’expérimentation, afin d’homogénéiser la quantité de lumière reçue par les plantes tout au long de leur développement. Pour ce qui est des paramètres physiques du milieu de culture, une augmentation de la température des milieux nutritifs est observée jusqu’au milieu de journée (de 9h à 15h). Cette augmentation suit celle de la température ambiante du phytotron. Cependant nos mesures montrent que la température du milieu de culture des différents systèmes est très légèrement supérieure à la température ambiante dans le phytotron. Ce résultat peut s’expliquer par la chaleur 44 RESULTATS ET DISCUSSION apportée par la pompe électrique et qui permet la circulation du milieu de culture dans le système. De plus, les bacs-réservoirs sont composés de boîtes en plastique grises fermées par un couvercle de couleur noire. Ces paramètres peuvent contribuer à maintenir une température légèrement plus élevée dans le milieu de culture que dans l’atmosphère ambiante du phytotron. Il est à noter que cette variation de température reste néanmoins très proche de celle observée dans les premières couches du sol. En effet, sur les 5 premiers centimètres d’un sol, les racines vont subir une variation de température d’environ 5°C entre le jour et la nuit (Walter et al. 2009). De plus, les températures du milieu de culture mesurées dans nos conditions restent dans la gamme de températures utilisées en laboratoire pour la culture d’A. thaliana, comprises entre 16°C et 25°C (Gibeaut et al 1997), et permet une croissance normale des racines d’A. thaliana (Walter et al. 2002). Concernant les mesures de pH dans le milieu de culture, une légère alcalinisation est observée après 3 semaines de culture des plantes malgré un changement de milieu chaque semaine. L’alcalinisation du milieu nutritif en culture hydroponique est un phénomène observé dans d’autres études, comme celle présentée par Smeet et collaborateurs (2008) dans laquelle le pH du milieu nutritif augmente de 5,75 à 6,22 en deux semaines de culture. Ce résultat peut s’expliquer par la sortie du porte-graine de presque toutes les racines des plantes cultivées. En effet, l’alcalinisation de la rhizosphère par les racines est un phénomène couramment observé lors de l’assimilation du nitrate par les plantes (Stitt 1999) : dans le milieu de culture utilisé pour notre étude, la totalité de l’azote apporté aux plantes est sous forme de nitrate. Dans notre expérimentation, il semblerait que ce phénomène soit observé à partir de la période où l’ensemble des racines des plantules baigne dans le milieu (3 semaines) et réalise l’absorption des éléments nutritifs du milieu. Les valeurs de pH du milieu de culture restent en revanche très homogènes entre les différents systèmes d’hydroponie (A, B, C et D). De plus, les valeurs de pH mesurées pour les milieux frais sont comprises dans la gamme de pH classiquement utilisée pour la culture en hydroponie d’A. thaliana . En effet, plusieurs études menées sur la culture d’A. thaliana en hydroponie (Gibeaut et al. 1997 ; Toda et al. 1999) préconisent que le pH du milieu nutritif doit être compris entre 5,5 et 6 unités pH. La détermination du potentiel hydrique du milieu de culture des différents systèmes d’hydroponie a permis de montrer une assez bonne homogénéité de cette valeur au sein d’un même système et au cours du développement des plantes (J14, J21, J28, J35 et J42). Il semblerait que 45 Figure 27 : Schéma du protocole expérimental appliqué pour la culture des plantes au cours de l’expérimentation « Campagne mise en place hydroponie ». Les 288 plantes de l’écotype C24 sont cultivées dans 4 systèmes d’hydroponie contenant du milieu nutritif pendant 39 jours. Une première récolte des plantes au stade jeune est réalisée après 20 jours de culture. Une seconde récolte est réalisée à la fin de l’expérimentation. RESULTATS ET DISCUSSION l’exsudation racinaire ne soit pas assez importante pour modifier ce paramètre entre chaque changement de milieu nutritif. Toutefois, malgré ces faibles variations, ces valeurs de potentiel hydrique restent proches du potentiel hydrique utilisé pour définir des conditions de culture sans carence hydrique (-0,1 MPa) par van der Weele et collaborateurs (2000). L’ensemble des paramètres physiques mesurés sur le milieu de culture reste donc dans des gammes de valeurs couramment mesurées dans la culture d’A. thaliana en laboratoire (Arteca et Arteca 2000 ; Gibeaut et al. 1997 ; Smeets et al. 2007 et Siedlecka et Krupa 2002). De plus, ces paramètres présentent très peu de variations entre les différents systèmes de culture hydroponique utilisée. Ces résultats confirment que l’utilisation de ces quatre systèmes Araponics permet d’appliquer des conditions de culture relativement homogènes. Ces systèmes seront donc utilisés pour étudier d’une part, le cycle de développement complet de l’écotype Col-0 en hydroponie ainsi que quelques paramètres de son métabolisme carboné. D’autre part, l’étude de son métabolisme carboné sera suivie au cours d’une journée de 24h sur des jeunes plantules de 20 jours. Par ailleurs, ces systèmes seront aussi utilisés afin de mettre en place le stress osmotique destiné à mimer un stress hydrique sur des plantes cultivées en hydroponie. En effet, l’objectif de ce travail est d’étudier le métabolisme carboné des racines et plus particulièrement le profil d’expression des transporteurs de sucre, en réponse à un stress osmotique. 3.1.2 Etude du développement végétatif d’Arabidopsis thaliana (C24) en culture hydroponique En parallèle du suivi des paramètres physiques, un suivi des plantes a été effectué afin vérifier leur croissance et leur développement dans les différents systèmes de culture en hydroponie. Ainsi, la croissance foliaire, le rapport Root/Shoot (rapport de la masse sèche des racines sur la masse sèche des rosettes) et l’état hydrique des plantes ont été déterminés au cours de l’expérimentation « Campagne mise en place hydroponie ». Au cours de cette expérimentation, les plantes ont été cultivées pendant 39 jours. Deux récoltes ont été effectuées correspondant au stade jeune (J20) et au stade adulte (J39) (Figure 27). Le stade jeune correspond à des rosettes comportant environ 7 feuilles et le stade adulte correspond, quant à lui, à des rosettes possédant environ 27 feuilles. Pour ces deux récoltes, les racines et les feuilles de plantes individuelles ont été récoltées. La récolte des racines et des feuilles, à ces deux stades de développement, a permis de déterminer la biomasse sèche de ces 2 organes et 46 Figure 28 : Nombre moyen de feuilles par plante mesuré pour les plantes d’Arabidopsis thaliana cultivées dans les 4 systèmes A, B, C et D après 11, 18, 25, 32 et 39 jours. Le nombre de feuilles moyen (± écart type) a été déterminé à partir de 18 plantes pour chaque système étudié. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). . RESULTATS ET DISCUSSION de calculer le rapport R/S d’une part. D’autre part, ces récoltes ont servi aussi à vérifier l’état hydrique des plantes cultivées en hydroponie en calculant le contenu relatif en eau (ou relative water content, RWC) ainsi que le potentiel osmotique. 3.1.2.1 Observation phénotypique La première observation qu’il est possible de faire sur des plantes cultivées en hydroponie, est que celles-ci se développement de la même manière que des plantes cultivées en terre. En effet, dans notre système, la germination des plantules s’effectue en 2 ou 3 jours comme cela a pu être observé sur l’écotype Landsberg erecta (Ler) cultivées avec une photopériode de 10h (Gibeaut, 1997). C’est aussi ce qui est généralement observé pour des plantes de Col-0 cultivées en terre dans notre laboratoire. L’émergence de la première vraie feuille, quant à elle, apparaît à J6 comme ceci a pu être noté pour les plantes cultivées en terre (communication personnelle de Thierry Allario). De plus, comme pour de nombreuses études utilisant la culture en hydroponie, il est observé que les plantes cultivées en hydroponie ont une taille beaucoup plus importante que les plantes cultivées en terre dans les mêmes conditions (T°, humidité et photopériode). Au niveau des racines, la culture en hydroponie permet aussi d’obtenir une plus grande quantité de matériel végétal que pour les plantes cultivées en terre. 3.1.2.2 Suivi de la croissance foliaire Afin de suivre la croissance des plantes de l’expérimentation « Campagne mise en place hydroponie », les feuilles de 72 plantes (18 plantes par système) ont été comptées 11, 18, 25, 32 et 39 jours après le semis. Les résultats représentés sur la Figure 28 indiquent le nombre moyen de feuilles comptées sur les plantes cultivées dans chacun des 4 systèmes A, B, C et D. Les valeurs montrent que le nombre moyen de feuilles par plante augmente sur toute la période de culture des plantes. Pour les plantes du système A par exemple, le nombre moyen de feuilles par plante est de 3,75 feuilles à J11, 7,44 à J18, 12,94 à J25, 22 à J32 et 27,81 pour le dernier jour de comptage J39. L’analyse des moyennes par le test statistique non paramétrique de Mann et Witney (P < 0,05) indique des différences significatives dans le nombre moyen de feuilles entre chaque jour de comptage (J11, J18, J25, J32 et J39). En revanche, aucune différence significative du nombre moyen de feuilles par plante n’est toutefois observée entre les différents systèmes et ce, pour chaque jour de comptage considéré. Par exemple, après 18 jours de culture, le nombre moyen de feuilles pour les plantes du système A est de 7,44, de 6,72 pour celles du système B, de 7,21 pour celles du système C et de 6,71 pour les plantes du système D (Figure 28). Ceci indique une croissance homogène des plantes dans les 4 systèmes 47 Figure 29 : Vitesse d’émergence moyenne des feuilles de plantes, mesurée pour les plantes d’Arabidopsis thaliana cultivées dans les 4 systèmes A, B, C et D dans les intervalles de temps [J11/J18], [J18/J25], [J25/J32] et [J32/J39]. La vitesse d’émergence des feuilles a été calculée à partir du nombre de feuille déterminé sur 18 plantes pour chaque système étudié. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). Figure 30 : Masse sèche moyenne des racines et des feuilles mesurées au stade jeune (J 20) et au stade adulte (J39). La masse moyenne (± écart type) a été calculée à partir de 5 plantes dont 2 prélevées dans le système A et 1 dans chacun des systèmes B, C et D. RESULTATS ET DISCUSSION d’hydroponie (A, B, C et D) utilisés. A partir du comptage des feuilles, la vitesse moyenne d’émergence des feuilles par jour a pu être calculée pour l’ensemble des plantes de chaque système (A, B, C et D). Cette vitesse d’apparition des feuilles par jour a été calculée dans les intervalles de temps [J11 ; J18], [J18 ; J25], [J25 ; J32] ainsi que [J32 ; J39]. Les résultats montrent une augmentation de la vitesse moyenne d’émergence des feuilles pour les plantes de tous les systèmes (A, B, C et D) jusqu’à J32 (Figure 29). Puis une diminution de cette vitesse d’émergence des feuilles est observée entre J32 et J39 pour les plantes de tous les systèmes. L’analyse des vitesses moyennes d’apparition des feuilles par jour, réalisée à l’aide d’un test statistique de Mann et Witney (P < 0,05), indique que les variations de cette moyenne au cours des 4 périodes étudiées ([J11 ; J18], [J18 ; J25], [J25 ; J32], [J32 ; J39]) sont significativement différentes. Cependant, aucune différence significative dans les vitesses moyennes d’apparition des feuilles par jour n’a été notée entre les différents systèmes et ce, pour chaque période considérée. Comme pour le nombre de feuilles moyen par plante, ces analyses indiquent que les plantes cultivées dans les 4 systèmes d’hydroponie (A, B, C et D) ont une croissance homogène. 3.1.2.3 Biomasse sèche des racines et des feuilles Afin de suivre le développement des plantes dans les différents systèmes de culture en hydroponie, la croissance des plantes est estimée par la mesure de biomasse sèche et le calcul du rapport R/S a été réalisé à partir de ces données (rapport de la masse sèche des racines sur la masse sèche des rosettes). Ces mesures sont effectuées sur 5 plantes individuelles au stade jeune (20 jours après semis, 7 feuilles) et au stade adulte (39 jours après semis, 27 feuilles). Sur les 5 plantes prélevées, 2 ont été prélevées sur le bloc A et 1 dans chacun des blocs B, C et D. Les masses sèches moyennes des racines et des feuilles mesurées sont présentées sur la Figure 30. Les résultats montrent qu’au stade jeune (J20), la masse sèche des feuilles (1,3 mg) est environ 3 fois plus importante que la masse des racines (0,4 mg). A ce stade de développement, la masse des feuilles représente 75,5% de la masse totale de la plante et les racines 24,5%. Au stade adulte (J39), la masse sèche moyenne des racines est de 22 mg et celle des feuilles de 126 mg. Pour ce stade de développement, la masse sèche des racines ne représente plus que 17% de la biomasse totale de la plante et les rosettes 83%. Ces résultats semblent indiquer qu’après J20, la biomasse des racines augmente donc moins rapidement que celle des feuilles. 48 Tableau 10 : Valeurs des rapports R/S calculés au stade jeune (J20) et au stade adulte (J39). Le calcul du rapport R/S a été effectué à partir des masse sèche déterminées sur 5 plantes dont 2 prélevées sur le système A et 1 sur les systèmes B, C et D. Echantillon J20 J39 Plante 1 Plante 2 Plante 3 Plante 4 Plante 5 0,20 0,18 0,25 0,18 0,25 0,17 0,26 0,50 0,17 0,17 RESULTATS ET DISCUSSION 3.1.2.4 Rapport R/S Les valeurs des rapports R/S ont été calculées à partir des masses sèches des racines et des feuilles et les données sont consignées dans le Tableau 10. Les résultats montrent que les rapports R/S des plantes au stade jeune (J20) sont très proches pour 4 plantes sur les 5 étudiées et est compris entre 0,20 et à et 0,26. Une seule des plantes étudiées présente un R/S de 0,50 (Tableau 10). L’hétérogénéité de cette valeur de R/S, par rapport à celles trouvées pour les 4 autres plantes, pourrait s’expliquer par les erreurs introduites lors de la pesée des racines et de la feuille eue égard au seuil de sensibilité de la balance. En effet, à ce stade de développement, les masses pesées pour ces deux organes sont de l’ordre de 1 mg. Les rapports R/S des plantes de notre expérimentation déterminés au stade adulte (J 39) sont en revanche très homogènes et compris entre 0,17 et 0,18 pour les 5 plantes étudiées Tableau 10). Cette diminution du R/S reflète bien les résultats obtenus pour les biomasses à J39. En effet, ceux-ci indiquent que la masse des racines a diminué par rapport à la masse totale de la plante, ce qui a pour conséquence de diminuer la valeur du R/S. En comparant les résultats obtenus après 20 et 39 jours dans notre étude, il apparaît que le rapport R/S de l’écotype C24 diminue au cours de cette période de développement des plantes. Ce phénomène est dû à une augmentation plus importante de la croissance de la partie aérienne par rapport à celle de la partie racinaire entre J20 et J39 (Figure 30). 3.1.2.5 Détermination de paramètres permettant d’estimer l’état hydrique des plantes cultivées en hydroponie : Après avoir suivi le développement végétatif de l’écotype C24 d’A. thaliana en culture hydroponique, nous avons souhaité étudier l’état hydrique des plantes à J20 et J39 correspondant respectivement, au stade jeune et au stade adulte du développement de la rosette. Ces premières mesures ont été réalisées sur les rosettes, mais aussi sur les racines. L’objectif de ce travail étant d’étudier plus tard, l’impact d’un stress osmotique sur l’état physiologique des plantes et sur leur métabolisme carboné, le développement de mesures permettant de suivre cet état hydrique était donc indispensable. Les deux paramètres que nous avons choisi de suivre pour estimer l’état hydrique des plantes sont le contenu relatif en eau (ou RWC pour relative water content) et le potentiel osmotique, car il est très difficile de mesurer le potentiel hydrique sur A. thaliana . 49 Figure 31 : Valeurs moyennes de RWC calculées sur les racines et les rosettes récoltées au stade jeune (J20) et au stade adulte (J39) de plantes cultivées en hydroponie. Les moyennes (± écart type) sont calculées à partir de 5 plantes dont 2 prélevées sur le système B et 1 sur les systèmes A, C et D. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). Figure 32 : Valeurs moyennes de potentiel osmotique calculées sur les racines et 3 feuilles récoltées au stade jeune (J20) et au stade adulte (J39) de plantes cultivées en hydroponie. Les moyennes (± écart type) sont calculées à partir de 5 plantes dont 2 prélevées sur le système D et 1 sur les systèmes A, B et C. RESULTATS ET DISCUSSION - Détermination du RWC (contenu relatif en eau = relative water content) Le calcul du RWC a été effectué sur les rosettes et les racines de 5 plantes individuelles au stade jeune (J20) et au stade adulte (J39). Sur les 5 plantes prélevées, 2 ont été prélevées sur le bloc B et 1 dans chacun des blocs A, C et D. Après 20 jours de culture, le RWC moyen calculé dans les rosettes est de 86,6% et celui calculé dans les racines de 80,9% (Figure 31). Au stade adulte (J 39), la valeur moyenne de RWC déterminée dans les feuilles est de 83,5% et de 89,1% dans les racines. Pour les feuilles et les racines , les analyses statistiques (test statistique de Mann et Witney avec P < 0,05%), des résultats n’indiquent aucune différence significative pour les valeurs de RWC calculées au stade jeune et au stade adulte. Cependant, le graphe (Figure 31) montre que l’écart des valeurs de RWC mesurées entre J20 et J39 dans les racines est plus important que celui observé dans les feuilles. - Détermination du potentiel osmotique Le potentiel osmotique est un paramètre permettant de prédire les mouvements d’eau au travers d’un compartiment. Il est fortement dépendant de la concentration en solutés présent dans le compartiment étudié. Ce potentiel osmotique est calculé dans les racines et les feuilles grâce à l’équation de Van’t Hoff, à partir de la mesure de l’osmolarité. La quantité de liquide physiologique collecté sur les tissus des plantes après 20 jours de culture n’étant pas suffisante pour la mesure de l’osmolarité, le potentiel osmotique des racines et des feuilles n’a été calculé qu’au stade adulte à partir de 5 plantes (2 prélevées dans le système D, et 1 sur chacun des systèmes A, B et C). Les résultats obtenus montrent que les feuilles présentent un potentiel osmotique plus faible que les racines (Figure 32). En effet, la valeur moyenne de potentiel osmotique mesurée dans les racines est de -0,56 MPa alors qu’elle est de -1 MPa dans les feuilles. 3.1.2.6 Discussion L’étude du développement végétatif d’A. thaliana (C24) en culture hydroponie (photopériode de 10h de jour) a permis de montrer que son développement était similaire à celui observé lors de sa culture en terre. Ce résultat est à rapprocher des travaux réalisés sur l’écotype Col-0 cultivé avec une photopériode de 16h et sur l’écotype Wassilewskija (Ws) soumis à une photopériode de 8h, en parallèle sur des plantes en terre et en hydroponie. Leurs résultats indiquent que les plantes d’ A. tha lia na présentent les mêmes caractéristiques 50 RESULTATS ET DISCUSSION morphologiques et physiologiques dans les deux systèmes de culture (Artéca et Artéca 2000 ; Norén et al. 2004). De plus, l’observation du phénotype des plantes cultivées en hydroponie indique que les plantes de l’écotype C24 ont des rosettes de plus grande taille que lorsqu’elles sont cultivées en terre. Ceci a été aussi montré lors de l’étude menée sur Ws qui indique que cet écotype en hydroponie avait plus de feuilles que les plantes du même âge cultivées en terre, ce qui conduit à une rosette beaucoup plus dense. De plus, ces auteurs ont aussi montré que le diamètre des feuilles en hydroponie est 5 fois plus large que celui des feuilles des plantes cultivées en terre (Norén et al. 2004). De même la masse de racines des plantes cultivées en hydroponie est beaucoup plus importante que pour les plantes cultivées en terre (Norén et collaborateurs (2004). En effet, ces auteurs ont montré que la biomasse des racines des plantes cultivées en hydroponie était deux fois plus élevée que la biomasse des plantes cultivées en terre. Il est généralement admis que la culture des plantes en hydroponie fournit beaucoup plus de matériel végétal (jusqu’à 5 fois plus) que la culture en terre, mais surtout elle permet l’obtention de plantes présentant un développement plus uniforme (Gibeaut et al. 1997 ; Norén et al. 2004). Afin de suivre le développement végétatif d’A. thaliana (écotype C24) dans nos conditions de culture en hydroponie, plusieurs paramètres physiologiques ont été suivis au cours de l’expérimentation. La mesure du nombre de feuilles par plante et de la vitesse d’émergence des feuilles par jour a été effectuée tout au long de la culture des plantes. Nos résultats indiquent une diminution de la vitesse moyenne d’émergence des feuilles des plantes entre les intervalles de temps J32 et J39 qui pourrait s’expliquer par la fin de la période de croissance végétative. En effet, un ralentissement de l’émergence des feuilles pour l’écotype Col-0 est observé par Boyes et collaborateurs (2001), lors de phase de transition des plantes du stade végétatif au stade reproducteur. Ces auteurs ont pu observer un ralentissement de la vitesse d’émergence des feuilles à J22, 4 jours avant l’émergence de la hampe florale (J26) sur des plantes cultivées en terre. Dans nos conditions, l’émergence des premières hampes florales sur les plantes de l’écotype C24 d’A. thaliana a lieu autour de 50 jours de culture en hydroponie (observation personnelle). Ainsi, le ralentissement de la vitesse d’émergence des feuilles a lieu 10 jours avant que les hampes florales n’apparaissent. L’augmentation de la durée de la phase de transition du stade végétatif au stade reproducteur observée dans notre expérimentation, pourrait s’expliquer en partie, par le fait de la différence de développement entre les 2 51 RESULTATS ET DISCUSSION écotypes (C24 vs Col-0). Des études ont montré la variation de la date de floraison pour différents écotypes et mutants d’A. thaliana (Koornneef et al. 1998, Loudet et al. 2003). D’autre part, la photopériode utilisée dans nos conditions de culture peut aussi expliquer le décalage dans les dates de floraison. En effet, dans notre expérimentation, les plantes sont cultivées avec une photopériode de 10h de jour alors que dans l’étude de Boyes et collaborateurs (2001), une photopériode de 16h est appliquée. Cependant, la mesure du nombre de feuilles et le calcul de la vitesse d’émergence des feuilles par jour montrent que la morphologie des plantes cultivées en hydroponie est similaire à celles cultivées en terre. De plus, ces paramètres ne présentent pas de différences significatives entre les plantes cultivées dans les quatre systèmes de cultures En parallèle de la mesure du nombre de feuilles et du calcul de la vitesse d’émergence des feuilles par jour, la mesure de la masse des racines et des feuilles ainsi que le calcul du rapport R/S ont été effectués. Ceci a été réalisé afin d’estimer la croissance des plantes au cours de l’expérimentation. Une première mesure de la masse sèche a été réalisée sur des plantes au stade jeune (J20) et les résultats indiquent que la masse des rosettes (75,5% de la masse totale de la plante) est très supérieure à la masse des racines (24,5%). Ces résultats sont à rapprocher d’une étude réalisée sur l’écotype Col-0 cultivé en hydroponie avec une photopériode de 16h de jour. En effet dans cette étude, après 18 jours de culture en hydroponie, la masse sèche de la rosette représente 84% de la masse totale de la plante et la masse sèche des racines 16% (Artéca et Artéca 2000). Les écarts observés au niveau des valeurs de pourcentage entre les deux expérimentations (masse de rosette/masse totale de la plante et masse des racines /masse totale de la plante) pourraient être liés au fait que ces résultats concernent deux écotypes différents. En effet, nous avons pu observer au laboratoire que pour un même jour de culture post-semis, l’écotype C24 a une plus grande taille que l’écotype Col-0, ce qui reflète un taux de croissance différent entre les deux écotypes. Ces différences de croissance pourraient expliquer les variations de masses des racines et rosettes par rapport à la masse totale de la plante entre les deux écotypes. Des études ont montré que la taille des plantes ainsi que leur taux de croissance pouvaient varier en fonction des écotypes (Koornneef et al. 2004, Li et al. 1998) Au stade adulte (J39), les résultats ont permis de montrer une augmentation de la biomasse sèche des feuilles et des racines entre les deux stades de développement étudiés (stade jeune, J20 ; 52 RESULTATS ET DISCUSSION stade adulte, J39). Cependant, la part de la biomasse des racines (17%) diminue par rapport à la biomasse totale de la plante alors que celle des rosettes (83%) augmente, ce qui semble indiquer qu’après J20, la masse des racines de C24 augmente moins rapidement que celle des feuilles. Dans l’étude menée sur l’écotype Col-0, les auteurs ont mis en évidence qu’après 35 jours de culture en hydroponie avec une photopériode de 16h, la masse sèche de la rosette représente 76% de la masse totale de la plante et la masse sèche des racines 24%. Pour cette étude, les résultats indiquent qu’entre J18 et J35, la masse de la rosette des plantes Col-0 a diminué. Ceci peut s’expliquer par le fait que la phase de transition entre le stade végétatif et le stade reproducteur a lieu en 4 jours, entre J22 et J26, ce qui a pour conséquence de stopper l’émergence des feuilles et donc la croissance de la rosette (Arteca et Arteca 2000). Dans notre expérimentation, la vitesse d’émergence des feuilles commence à diminuer à J 39 (cf § n°3.1.2.2) et la hampe florale n’apparait qu’à J50, ce qui peut expliquer que la masse de la rosette par rapport à la masse totale de la plante n’ait pas encore diminué. De plus, il est à noter que des variations de la biomasse racinaire et foliaire au cours du développement des plantes sont couramment observées chez d’A. thaliana , que ce soit en culture en hydroponie (Arteca and Arteca 2000) ou en culture en terre (Devienne-Barret et al. 2006) A partir des mesures des matières sèches des deux organes, il a été possible de déterminer le rapport R/S. Au stade jeune J20, les valeurs de R/S (entre 0,2 et 0,3) déterminées sur 4 des 5 plantes étudiées sont proches de celles mesurées par Artéca et Artéca sur l’écotype Col-0 (2000). En effet, ces auteurs ont montré qu’après 18 jours de culture en hydroponie avec une photopériode de 16h le R/S pour leurs plantes est de 0,2 (Arteca et Artéca, 2000). Cette valeur correspond à la plus petite valeur de R/S trouvée parmi les 5 plantes qui ont servi à nos mesures. L’augmentation plus rapide de la biomasse sèche des feuilles par rapport à celle des racines se traduit, dans notre expérimentation, par la diminution du rapport R/S entre les deux points de récolte effectués (J20 et J39). Dans les travaux réalisés par Arteca et Arteca (2000), c’est l’inverse qui est observé, à savoir qu’à J35, la masse des racines par rapport à la masse de la plante entière augmente (croissance de la rosette stoppée). Ceci a pour conséquence d’augmenter le rapport R/S qui est alors de 0,33±0,01 pour des plantes de l’écotype Col-0 après 35 jours de culture en hydroponie. Des travaux menés sur l’écotype Ler soumis à une photopériode de 10h montrent en revanche, que la valeur du R/S diminue légèrement entre les deux temps de récolte J25 (0,23) et J39 (0,19). 53 RESULTATS ET DISCUSSION Les rapports de R/S étant calculés à partir de la masse sèche des racines et des rosettes, la variation des rapports R/S entre les différents cultivars est à rapprocher de résultats mettant en évidence des différences dans la taille et le taux de croissance des différents écotypes d’A. thaliana (Koornneef et al.2004 ; Li et al. 1998). Néanmoins, on peut à nouveau souligner l’homogénéité du matériel végétal obtenu dans nos conditions de culture, notamment à J39. Le statut hydrique des plantes a aussi été étudié par la mesure du RWC et du potentiel osmotique. Ainsi, les valeurs de RWC obtenues dans les feuilles ( 86,6% à J20 et 83,5% à J39) sont très proches de celles observées dans une étude réalisée par Jha et collaborateurs (2010). Ces travaux indiquent que les valeurs de RWC dans les feuilles de plantes d’A. thaliana (écotype C24) cultivées 5 semaines en hydroponie, est de l’ordre de 85,5%. De plus, des travaux menés sur différents écotypes d’A. thaliana cultivés dans un sol bien irrigué, indiquent que les valeurs de RWC en condition témoin varient très peu entre les feuilles de différents écotypes et sont comprises entre 80 et 90% (Bouchabke et al. 2008). Les valeurs de RWC que nous avons notées pour les racines au stade adulte à J39 (89,1%) sont proches de celles mesurées par Jha et collaborateurs (2010) sur l’écotype C24 (cultivé en hydroponie) et qui sont de l’ordre de 94,5%. En revanche, dans les racines au stade jeune (J20), la valeur de RWC mesurée (80,9%) est inférieure à celle obtenue pour les plantes adultes (J39), de notre expérimentation (89,1%). La difficulté de pesée des racines de petite taille au stade jeune (dont la masse est de l’ordre du mg) pourrait entrainer un biais dans les pesées et engendrer des variations dans les valeurs de RWC. En effet, afin de déterminer la masse fraiche des racines, ces dernières sont égouttées après la sortie du milieu de culture. Une faible variation de la masse peut être due soit à la présence sur les racines d’une goutte de milieu non essuyée, soit à l’inverse, par un égouttage trop vigoureux entrainant la sortie d’eau de la racine. Ces problèmes de pesée peuvent entraîner une grande variation dans les valeurs permettant le calcul du RWC. En effet, ce type d’erreur peut être reproduit à une autre étape, à savoir la pesée de la masse imbibée des racines. La masse imbibée des organes est obtenue après leur imbibition pendant 24h dans l’eau à 4°C. Avant la pesée, il est nécessaire de procéder à une légère absorption de l’eau en excès avant de déposer l’organe sur la balance. Afin de limiter au maximum les biais engendrés par la pesée, il est important de procéder aux mesures en réalisant les mêmes gestes et pour une expérimentation donnée, ces mesures doivent être réalisées par le même manipulateur. 54 RESULTATS ET DISCUSSION En ce qui concerne le potentiel osmotique de nos plantes (écotype C 24), la valeur obtenue dans les racines est de -0,56 MPa et pour les feuilles -1 MPa. Cette valeur de potentiel osmotique) est du même ordre de grandeur que celles mesurées sur des racines de maïs (de 0,68 à -0,61 MPa), cultivés dans un sol bien irrigué, selon une étude réalisée par Schmidhalter et collaborateurs (1998). Les valeurs de potentiel osmotique obtenues dans les feuilles de C24 sont légèrement inférieures (-1 MPa) à celles mesurées dans d’autres études sur A. thaliana . Par exemple, l’étude réalisée par Déjardin et collaborateurs (1999) indique que les feuilles d’A. thaliana (Col-0) cultivée en terre présente une valeur moyenne du potentiel osmotique de -0,82 MPa. Le potentiel osmotique plus faible retrouvé dans nos conditions pourrait s’expliquer d’une part, par la différence entre les 2 écotypes utilisés et d’autre part, par le choix des feuilles utilisées pour déterminer ce paramètre. Dans l’étude réalisée par Déjardin et collaborateurs (1999), seules les feuilles adultes sont utilisées pour la détermination du potentiel osmotique. Or, dans notre étude un mélange de feuilles adultes et de jeunes feuilles est utilisé pour déterminer ce paramètre. Les feuilles en croissance possédant un potentiel osmotique plus négatif pour permettre l’élongation cellulaire (Cosgrove 1981), il parait justifié que le potentiel osmotique mesuré sur notre échantillonnage de feuille soit inférieur à celui mesuré dans l’étude réalisée par Déjardin et collaborateurs (1999). Cependant les valeurs de potentiel osmotique mesurées dans notre expérimentation restent dans une gamme correspondant à des potentiels osmotiques de plantes d’A. thaliana cultivées en terre, dans un sol normalement irrigué (Schmidhalter et al. 1998 ; Déjardin et al. 1999). L’étude des paramètres estimant la croissance et le développement des plantes (nombre de feuilles, vitesse d’émergence des feuilles, évolution de la biomasse des racines et des feuilles, RWC et potentiel osmotique) a permis de déterminer des valeurs de ces paramètres proches de celles mesurées sur des plantes cultivées dans un sol bien irrigué. Ces résultats valident l’utilisation du système de culture en hydroponie sur des plantes d’A. thaliana . Une première expérimentation réalisée sur Col-0 cette fois-ci va permettre d’étudier son cycle de développement complet en hydroponie, ainsi que la réalisation de quelques mesures de paramètres liés à son métabolisme carboné. D’autre part, une étude permettra le suivi toutes les 2h, au cours d’une journée de 24h, de jeunes plantules de 20 jours. 55 RESULTATS ET DISCUSSION 3.2 Etude du cycle complet de développement d’Arabidopsis thaliana (Col-0) cultivée en hydroponie et mesure de quelques paramètres reflétant son métabolisme carboné Tout au long du cycle de vie de la plante, la répartition des ressources carbonées va être considérablement modifiée. Les différents organes des plantes peuvent être classés en fonction de leur bilan carboné : les organes sources, qui produisent plus de sucres qu’ils n’en utilisent, et les organes puits, incapables de produire les sucres, nécessitant par conséquent l’apport constant de sucres venant des organes sources. Au début du développement de la plante, les seuls organes nécessitant l’apport de sucre (puits) sont les racines et les jeunes feuilles de la rosette. Par la suite, de nouveaux organes vont apparaitre (organes reproducteurs, soit chez A. thaliana , successivement, hampes florales, siliques puis graines) qui seront autant de nouveaux puits pour la plante. Le principal apport en molécules carbonées de ces organes provient du saccharose produit dans les feuilles matures (organes sources) et transporté à longue distance par le phloème. Ce transport à longue distance est dépendant de l’activité des transporteurs de sucre au niveau des différents organes sources et puits. Dans le cadre de ce travail, nous souhaitons étudier les variations de la répartition des sucres et l’expression des différents gènes de transporteurs de sucre dans les différents organes au cours du développement. Afin de mettre en évidence ces variations d’expression chez A. thaliana , des plantes de l’écotype Col-0 ont été cultivées en hydroponie. Nous voulions vérifier, dans un premier temps, que les plantes (Col-0) pouvaient effectuer un cycle de développement complet en hydroponie et comparer ce développement avec celui d’une part, de l’écotype C24 cultivé en hydroponie précédemment (malencontreusement utilisé dans la mise en place du système d’hydroponie) et d’autre part, avec des plantes de Col-0 cultivées en terre. Il s’agit d’un point important pour les comparaisons avec les données de la littérature. Ainsi, une cartographie des gènes de transporteur de sucre exprimés dans les différents organes de la plante au cours de son développement a été réalisée et, en parallèle, la distribution de la biomasse entre les différents organes a été mesurée ainsi que le contenu en principaux sucres solubles (saccharose, glucose et fructose) et amidon. Ces mesures permettront d’évaluer la force d’appel respective des différents puits présents aux différents stades de développement étudiés au cours du cycle complet de développement d’A. thaliana . Enfin, le transport à longue distance du saccharose dans la plante a été estimé par l’étude du flux de [U-14C]-saccharose. 56 Figure 33 : Photographies des plantes aux 6 stades de développements étudiés : stade jeune (J), stade adulte (A), stade émergence de la hampe florale (E), stade fleurs (F), stade siliques vertes (SV) et stade graines (G). RESULTATS ET DISCUSSION Six différents stades de développement ont été étudiés au cours de cette étude : le stade jeune (20 jours après germination, rosette jeune présentant une dizaine de feuilles), stade adulte (40 jours après germination, rosette présentant une trentaine de feuilles), stade émergence de la hampe florale (53 jours après germination), stade fleurs (67 jours après germination), stade siliques vertes (95 jours après germination) et stade graines (114 jours après germination). Ces 6 stades de développement sont les 6 principaux stades décrits chez A. thaliana par Boyes et collaborateurs (2001). En effet, ces auteurs ont proposé une nomenclature permettant d’indexer les différents phénotypes observés au cours du développement en terre d’A. thaliana. 3.2.1 Observation du phénotype La photographie des plantes observées pour chacun des 6 stades de développement étudiés est présentée sur la Figure 33. Elle montre que les plantes de l’écotype Col-0 sont capables de se développer de façon tout à fait satisfaisante dans les conditions de culture choisies comme cela a déjà été décrit dans le sous-chapitre 3.1, mise en place de l’hydroponie. Comme pour l’écotype C24, le développement de l’écotype Col-0 en hydroponie met en évidence des plantes de plus grande taille que lorsqu’elles sont cultivées en terre (observations personnelles). L’étude du développement de l’écotype Col-0 en hydroponie, nous indique que la phase du passage du stade végétatif au stade reproducteur (émergence de la hampe florale) a lieu 53 jours après le semis (Figure 33). Dans l’étude précédente menée sur l’écotype C24 (souschapitre 3.1, mise en place de l’hydroponie) cette phase de transition était apparue à J50, ce qui semble indiquer que ces 2 écotypes ont un cycle de développement très proche dans ce système de culture. De plus, le passage au stade reproducteur s’effectue au même moment que pour des plantes de l’écotype Col-0 cultivées en pot dans le même phytotron (Communication personnelle de Thierry Allario). L’accomplissement complet du cycle de développement de l’écotype Col-0, en hydroponie et avec une photopériode de 10h/jour, est assez long puisqu’il se déroule en environ 4 mois, avec une très abondante production de graines qui a lieu après 114 jours. 3.2.2 Répartition de la biomasse Afin de suivre la croissance des plantes en hydroponie, pour chacun des stades étudiés (stade jeune (J), adulte (A), stade émergence la hampe florale (E), fleurs (F), siliques vertes (SV) et graines (G)), la croissance des plantes a été estimée par la mesure de biomasse sèche. Cette biomasse sèche a été mesurée sur 4 organes lorsqu’ils étaient présents : les racines, les feuilles, 57 Figure 34 : Répartition de la biomasse de la plante entre les racines, les feuilles, les hampes florales et les siliques pour les 6 stades de développement étudiés : stade jeune (J), stade adulte (A), stade émergence de la hampe florale (E), stade fleurs (F), stade siliques vertes (SV) et stade graines (G). (A) Masses sèches moyennes (± Ecart type) des racines, des feuilles, des hampes florales et des siliques mesurées sur 5 plantes pour chaque stade de développement. (B) Répartition en pourcentage de la masse sèche des racines, feuilles, hampes florales et siliques par rapport à la masse totale des plantes. Les pourcentages sont calculés à partir de la moyenne des masses sèches mesurées sur 5 plantes par stade de développement. RESULTATS ET DISCUSSION les hampes florales et les siliques. Ces mesures sont effectuées sur 5 plantes individuelles pour chacun des stades. L’évolution de la masse sèche de ces organes au cours du développement complet de Col-0 en hydroponie est consignée dans la Figure 34A. La répartition de la biomasse sèche entre les différents organes présents sur les plantes à un stade de développement donné est représentée sur la Figure 34B. En ce qui concerne l’organe qui fait l’objet de cette thèse, les racines, le graphe représenté sur la Figure 34A indique que leur masse sèche augmente régulièrement du stade jeune jusqu’au stade fleurs, pour rester assez stable ensuite. Au stade jeune, la masse sèche des racines est de 14 mg et de 238 mg au stade fleurs (Figure 34A). Cependant les résultats indiquent que les racines sont, avec les siliques, les organes présentant la masse sèche la moins élevée puisque leur valeur ne dépasse pas 0,5g. La masse sèche des feuilles mesurée aux 6 stades de développement augmente de façon importante du stade jeune, pour lequel la masse de la rosette est de 30 mg, jusqu’au stade siliques vertes où elle atteint 1962 mg. A ce stade de développement, la rosette est l’organe qui représente la masse sèche la plus importante de tous les autres organes présents, à savoir la racine, les hampes florales et les siliques. Après le stade siliques vertes (1962 mg), la masse sèche de la rosette diminue et sa valeur est de 1495 mg au stade graines. Ceci représente donc une diminution de 23%. Les hampes florales apparaissent après 53 jours de culture en hydroponie et la première mesure de masse sèche a été réalisée au stade fleurs à J67 et est de 546 mg. La masse sèche des hampes florales augmente alors jusqu’au dernier stade étudié, le stade graines, où elles atteignent une masse de 2219 mg. Cette variation représente une augmentation de 400% entre ces 2 stades. Au stade graines, les hampes florales représentent d’ailleurs l’organe qui a la masse sèche la plus importante. Ceci souligne l’importance que représente cet organe dans la masse de la partie aérienne d’A. thaliana . Les derniers organes qui apparaissent à J95 sont les siliques. Leur masse sèche a été mesurée pour les deux derniers stades où ils sont présents : le stade siliques vertes et le stade graines. Le graphe indique que la valeur de leurs masses sèches augmente entre ces deux stades (90 mg au stade siliques vertes et 280 mg au stade graines). Cependant les siliques, comme les racines, sont les organes qui ont la masse sèche la plus faible. Afin de pouvoir mieux estimer la croissance relative de chaque organe aux différents stades de développement, la répartition de la biomasse totale représentée par les différents organes a été exprimée en pourcentage Figure 34B. 58 RESULTATS ET DISCUSSION Pour le stade jeune la masse de la racine représente environ un tiers (32%) de la masse totale de la plante, contre deux tiers pour les feuilles (68%) (Figure 34B). Nos premières études sur la biomasse qui ont porté sur l’écotype C24 (cf § 3.1, Mise en place de l’hydroponie), montraient que pour le même stade de développement (J20) la rosette représentée 75,5% de la masse sèche totale de la plante et les racines 24,5%. Ces résultats corroborent nos observations personnelles puisque nous avons observé que, pour un même stade de développement, l’écotype C24 présentait des rosettes de plus grande taille que l’écotype Col-0. Au stade adulte, la biomasse sèche du compartiment racinaire ne représente plus que 24% de la biomasse sèche totale de la plante (Figure 34B), contre 76% pour le compartiment aérien. De plus, nos résultats indiquent que la masse de la rosette de Col-0 a plus fortement augmenté que celle de la racine entre J20 et J 40. En effet, le graphe de la Figure 34A montre que les valeurs de la biomasse sèche des racines augmentent faiblement du stade jeune (J20) au stade fleurs (J67). Cette différence de vitesse de croissance entre les deux organes a donc un impact direct sur la répartition de la biomasse au sein de la plante. Au moment de l’émergence de la hampe florale, la masse relative des racines continue de diminuer pour atteindre 17% de la masse totale de la plante et celle des feuilles a encore augmentée (83%). Assez rapidement après l’émergence des premières inflorescences (14 jours), les premières fleurs sont observées sur les hampes florales d’A. thaliana . Bien que la masse sèche des feuilles de la rosette continue d’augmenter par rapport au stade précédent (de 660 mg à 1400 g ; Figure 34A), ce compartiment ne représente plus que 64% de la biomasse totale de la plante au stade fleurs (Figure 34B). La masse sèche des racines a elle aussi augmenté mais plus légèrement du stade émergence de la hampe florale au stade fleurs (de 130 mg à 240 mg, (Figure 34 A). Cependant, comme pour les feuilles à ce stade (stade fleurs), la représentation de la biomasse des racines diminue par rapport à la biomasse totale de la plante (de 17% à 11%, Figure 34B). Les hampes florales quant à elles représentent déjà 25% de la biomasse totale de la plante (0,56g) à ce stade de développement (Figure 34B). Au cours du remplissage de la graine (stade siliques vertes), le compartiment racinaire ne représente plus que 6% de la masse totale de la plante (Figure 34B) et sa masse sèche se stabilise à ce stade de développement comme l’indique la Figure 34A. Au stade siliques vertes, la biomasse des feuilles (54%) représente la moitié de la masse totale de la plante ce 59 Figure 35 : Teneurs moyennes en chlorophylles totales. Le dosage des chlorophylles a été réalisé sur un mélange de jeunes feuilles et feuilles matures, issues de 5 plantes individuelles pour chaque stade de développement : stade jeune (J), stade adulte (A), stade émergence la hampe florale (E), stade fleurs (F), stade siliques vertes (SV) et stade graines (G). Le test statistique effectué est un test ANOVA P < 0,05 : les moyennes identifiées par des lettres différentes sont statistiquement différentes au seuil de 5% d’après le test de Fisher. RESULTATS ET DISCUSSION qui représente une chute de 15% par rapport à la représentation de sa biomasse (64%) au stade précédent (stade fleurs). Le graphe de la Figure 34A indique que ce stade (stade siliques vertes) correspond au stade où la masse sèche des feuilles commence à chuter. Les hampes florales quant à elles, représentent 37% de la biomasse totale de la plante ce qui représente une augmentation de 12% par rapport au stade fleurs (25%). En effet, leur biomasse augmente entre le stade fleurs (546,5 mg) et le stade siliques vertes (1334,7 mg) comme l’indique la Figure 34A. Ce stade de développement (siliques vertes) correspond à la phase d’apparition des siliques dont la biomasse représente 2% de la masse totale de la plante (Figure 34B). A ce stade, les hampes florales et les siliques représentent les deux organes puits majoritaires d’A. thaliana (hampes florales et siliques représentent 39% de la biomasse totale de la plantes contre 6 % pour les racines). En effet, en parallèle du développement des siliques, le développement de nouvelles fleurs et de hampes florales axillaires entraine une demande en ressources carbonées très importante. Enfin pour le dernier stade de développement étudié, le stade graines, les feuilles de la rosette voient leur masse sèche diminuer de façon importante par rapport au stade siliques vertes (-460 mg en moyenne, Figure 34A). En effet, la photo d’une plante à ce stade de développement (Figure 33) montre qu’un plus grand nombre de feuilles de la rosette sont sénescentes comparées au stade précédent (stade siliques vertes). Ainsi, la masse sèche des feuilles ne représente plus que 34% de la masse totale de la plante (Figure 34B). La masse sèche du compartiment racinaire augmente légèrement (130 mg) entre les deux derniers stades de développement étudiés (Figure 34A). Il ne représente toutefois que 6% de la biomasse totale de la plante (Figure 34B). En revanche, les masses sèches des hampes florales et des siliques ont encore augmenté. La masse sèche des hampes florales est passée de 1334 mg au stade siliques vertes à 2219 mg au stade graines, ce qui représente une augmentation de 66% (Figure 34). La biomasse des hampes florales représente à ce stade 51% de la masse totale de la plante et celle des graines 6%. 3.2.3 Etude de la teneur en chlorophylles. Afin d’estimer l’état photosynthétique des plantes aux différents stades de développement, le dosage des chlorophylles des feuilles a été effectué. Les résultats présentés Figure 35, montrent que pour les 3 premiers stades de développement étudiés (jeune, adule, émergence de la hampe florale), aucune différence significative n’est observée dans la teneur en chlorophylles 60 RESULTATS ET DISCUSSION des feuilles des rosettes. Pour ces 3 stades la teneur en chlorophylles totales est comprise entre 12,9 et 14,3 mg.gMS-1. Dans nos échantillons la teneur en chlorophylles augmente de façon significative pour les plantes au stade fleurs et au stade siliques vertes. Ces valeurs sont respectivement de 16,6 et 16,3 mg.gMS-1. Il est à noter que dans notre étude, l’échantillon sur lequel les dosages des chlorophylles ont été réalisés correspond à un mélange de feuilles jeunes (n’ayant pas encore complètement mis en place son système photosynthétique) et de feuilles matures. Pour le dernier stade de développement étudié (stade graines, J114), la teneur en chlorophylle diminue de façon importante (10,8 mg.gMS-1). En effet, la quantité de chlorophylles ne représente plus que 67% de la quantité mesurée au stade siliques vertes (J 95) témoignant de la perte en chlorophylles des feuilles de la rosette. 3.2.4 Discussion L’étude du développement complet de l’écotype Col-0 en hydroponie nous a permis de voir, comme de nombreux auteurs sur Col-0 ou sur d’autres écotypes d’A. thaliana , que les plantes cultivées en hydroponie présentent les mêmes traits morphologiques et physiologiques que les plantes cultivées en terre (Arteca et Arteca 2000 ; Norén et al. 2004). Ceci a déjà été observé, en première partie des résultats (sous-chapitre 3.1, mise en place de l’hydroponie) sur la croissance de la partie végétative de la plante (écotype C24). De même, l’étude du cycle complet de développement de Col-0 en culture hydroponique indique aussi que le développement des inflorescences, dans ces conditions, est morphologiquement identique à celui observé sur les plantes cultivées en pot (Arteca et Arteca 2000). Cependant, comme nous l’avons observé dans le sous-chapitre précèdent, la culture en hydroponie permet la production de plantes de plus grande taille (Norén et al. 2007 ; Gibeaut et al. 1997). En effet, pour un stade de développement donné, ces plantes présentent un appareil végétatif plus important que les plantes cultivées en terre, mais aussi un grand nombre hampes florales (Gibeaut et al. 1997 ; Norén et al. 2004). Ce phénomène est de plus amplifié si la photopériode appliquée est de 8 ou 10h comme c’est le cas dans notre étude (Norèn et al. 2004). Cette étude nous a permis de noter que pour l’écotype Col-0, le passage du stade végétatif au stade reproducteur s’effectue 53 jours après le semis, comme pour les cultures en terre. Ces observations sont à rapprocher de travaux menés sur la sénescence de l’écotype Col-0 qui ont montré que pour une photopériode de 12h/jour, la hampe florale émergeait à J46 après le semis (Wingler et al. 2004). De plus, les études comparatives sur des plantes cultivées en et en terre, 61 RESULTATS ET DISCUSSION ont montré que, pour une même photopériode, l’émergence de la hampe florale se faisait au même jour. En effet, l’écotype Ws, sous une photopériode de 8h/jour, voit sa hampe florale émerger 50 jours après le semis en terre ou en hydroponie (Norén et al. 2004) et l’écotype Col-0, cultivé avec une photopériode de 16h/jour, après 22 jours de culture en hydroponie ou en terre Artéca et Artéca (2000). Notre travail a aussi permis de montrer que l’écotype Col-0 cultivé en hydroponie avec une photopériode de 10h/jour, accomplissait son cycle de développement complet sur une période d’environ 4 mois avec, en fin de cycle, une production de graines. Dans une étude menée sur la senescence (Wingler et al. 2004), les auteurs indiquent que l’écotype Col-0 cultivé en pot (12h de photopériode) accompli son cycle de développement complet en plus de 3 mois, résultat qui se rapproche donc de notre étude. Cependant, quelques différences dans le phénotype des feuilles de la rosette entre ces 2 études peuvent être soulignées. En effet, dans l’étude sur la sénescence de Col-0 cultivées en terre, la sénescence foliaire s’accompagne d’une accumulation d’anthocyanes dans les feuilles dès l’émergence de la hampe florale (Wingler et al. 2004) ce que nous n’observons pas. De plus, des travaux menés sur des lignées recombinantes d’A. thaliana montrent que les lignées présentant une matière sèche importante présentent une sénescence retardée (Diaz et al. 2008). Ces résultats pourraient indiquer que les plantes cultivées en hydroponie ne subissent que de rares carences, ce qui explique d’une part leur sénescence retardée et d’autre part, la taille importante des plantes par rapport à des plantes cultivées en terre, ainsi que leur développement. Ceci pourrait s’expliquer par la plus grande disponibilité des éléments minéraux et d’eau dans un système de culture en hydroponie (Gibeaut et al. 1997). La masse et le nombre plus important de feuilles observés pour les plantes cultivées en hydroponie pourraient permettre de prolonger la capacité photosynthétique des plantes, comme pour les écotypes présentant une phénotype « stay green » (Davies et Gan 2012). L’ensemble de ces remarques pourrait expliquer le retard dans l’apparition des symptômes de sénescence caractéristiques de l’écotype Col-0 cultivés en hydroponie. La croissance des plantes Col-0 cultivées en hydroponie a été suivie en estimant la biomasse sèche des plantes aux différents stades étudiés : le stade jeune (J), stade adulte (A), stade émergence la hampe florale (E), le stade fleurs (F), stade siliques vertes (SV) et stade graines (G). 62 RESULTATS ET DISCUSSION A ce jour, nous n’avons pas trouvé de publications ayant étudiées les différents organes au cours du suivi du développement complet de Col-0 en hydroponie. Cependant, les quelques études réalisées sur d’A. thaliana cultivées en hydroponie montrent les mêmes types de résultats malgré une période plus courte de l’étude de la croissance. Nos résultats indiquent que la biomasse des racines augmente de J20 (stade jeune) à J67 stade fleurs), celle des feuilles de J20 (stade jeune) à J95 (stade siliques vertes), et celle des hampes florales augmente du jour de leur apparition J53 (stade émergence de la hampe florale) jusqu’au dernier stade étudié à J114 (stade graines). Des études menées sur Col-0 sous une photopériode de 16h montrent que la masse sèche des racines, des feuilles et des hampes florales augmente au cours de leur période d’étude allant de J 18 à J35 après le semis (Arteca et arteca 2000). De même Gibeaut et collaborateurs (1997) ont montré que la masse sèche des racines et des feuilles de l’écotype Ler, cultivés sous 10h de jour, augmentait tout au long de leur étude (J25 à J48 après le semis). Comme pour notre étude, Arteca et Arteca (2000) montrent qu’à la fin de leur expérimentation à J35, la masse des inflorescences est plus importante que la masse des feuilles. Cependant les valeurs des masse sèches trouvées dans les différentes expérimentations sont difficilement comparables étant donnés que, d’une part ce n’est pas toujours le même écotype qui est étudié, et d’autre part les conditions de cultures, notamment les photopériodes utilisées, ne sont pas identiques. L’évolution de la croissance de chaque organe au cours du développement de l’écotype Col-0 cultivée en hydroponie a été suivie en calculant le pourcentage que représente leur biomasse par rapport à la biomasse totale de la plantes aux différents stades étudiés. Nos résultats indiquent qu’au stade jeune (J20), les racines représentent un tiers (32% racines, 68% feuilles) de la masse totale de la plante alors que pour l’écotype C24 (souschapitre 3.1, mise en place de la culture hydroponique), la masse des racines représentait un quart (24,5% racines, 75,5% feuilles) de la masse totale de la plante. En effet, nous avions observé que pour un même stade de développement les plantes de C24 présentaient une taille plus grande que les plantes de Col-0. Les variations de taille et de vitesse de croissance de plantes sont des traits mis en évidence au sein de la variabilité naturelle d’A. thaliana (écotype) (Koorneef et al 2004 ; Li et al 1998). Cependant l’étude de la biomasse sur l’écotype Col-0, menée par Meyer et collaborateurs (2004a) montrent une répartition de la biomasse très proche de celle mise en évidence par nos résultats. En effet, les racines représentent 28% de la biomasse totale de la plante et les feuilles 72% pour des plantules d’A. thaliana âgées de 15 jours, cultivées en boite de Pétri. 63 RESULTATS ET DISCUSSION Au stade adulte (J40), Le pourcentage représenté par le compartiment racinaire a diminué et ne représente plus qu’un quart de la biomasse sèche totale de la plante. Cette augmentation plus rapide de la biomasse des feuilles par rapport à la biomasse des racines est assez habituelle lors de la culture de plantes d’A. thaliana aussi bien en culture hydroponique (Arteca and Arteca 2000) qu’en culture en rhizotron (Devienne-Barret et al. 2006). Ce phénomène se poursuit d’ailleurs progressivement ensuite de J53 (stade émergence de la hampe florale) jusqu’à J95 (stade siliques vertes). Artéca et Artéca (2000) observent eux aussi sur Col-0 cultivé en hydroponie, une diminution de la masse sèche des racines (14,4%) par rapport à celle des feuilles (85,6%) pour le stade de développement précédent l’apparition de la hampe florale. Ce stade de développement marque un bouleversement majeur dans l’allocation de la biomasse, puisque la plante passe du stade végétatif au stade floraison. En plus des racines et des jeunes feuilles de la rosette, jusque-là principaux organes puits, un nouvel organe puits émerge : la hampe florale. Ce stade de développement marque ainsi le début d’une compétition pour les ressources carbonées entre les organes végétatifs et les organes de reproduction (Christophe et al. 2008). Rapidement après l’émergence de la hampe florale (J53), le pourcentage de la biomasse des feuilles par rapport à la plante entière va diminuer, alors que celle de la hampe florale va augmenter et au stade fleurs (J67), celle-ci représente déjà 25% de la biomasse totale de la plante (11%racines, 64% feuilles). Ces résultats sont à nouveau à rapprocher des résultats obtenu sur Col-0 cultivé en hydroponie, avec une photopériode de 16h qui indiquent des répartitions de biomasses très similaires pour ces 3 organes, à savoir 17% pour les racines, 55% pour les feuilles et 28% pour les hampes florales (Artéca et Artéca 2000). L’apparition des siliques J95 (stade siliques vertes), représente un nouveau puits pour la plante. A ce stade, la biomasse des racines diminue de moitié en pourcentage par rapport au stade précédent. A ce stade de développement, les feuilles matures de la rosette d’A. thaliana sont en pleine remobilisation de leurs nutriments en faveur de la hampe florale et des siliques. Cette remobilisation d’éléments a pour rôle d’apporter les ressources nécessaires au développement des hampes florales (Hensel et al. 1993). La photo d’une plante à ce stade de développement, présentée sur la Figure 33, montre en effet que les feuilles les plus âgées de la rosette sont jaunes et présentent donc des symptômes avancés de sénescence (BuchananWollaston et al. 2003). 64 RESULTATS ET DISCUSSION Pour le dernier stade de développement étudié, le stade graines (J114) la biomasse des feuilles (34%) a fortement diminuée par rapport à la biomasse entière. De plus, les feuilles les plus âgées présentent des symptômes de sénescence avancée. Ceci laisse aussi supposer, qu’à ce stade, les feuilles ont remobilisé une grande partie de leurs ressources en carbone et azote vers les siliques, pour le remplissage de graines. Ces deux processus vont conduire à une diminution de la biomasse de la feuille, comme observée dans notre expérimentation (Masclaux-Daubresse et al. 2010 ; Wingler et al. 2004). En revanche, la biomasse des hampes florales a augmenté à ce stade (51%) comparé au stade précédent (37%, stade silique vertes, J95,). Ces résultats sont à rapprocher de ceux obtenus sur Col-0 cultivé en hydroponie sous une photopériode de 16 h de jour. En effet, cette étude montre qu’après 35 jours de culture (inflorescences matures), la biomasse sèche des racines représente 8% de la masse totale de la plante, celles des feuilles 26% et les inflorescences (hampes florales, siliques et graines) 65% (Arteca et Arteca 2000). Ces résultats indiquent bien que les ressources remobilisées depuis les feuilles au cours de la sénescence sont allouées à la formation des hampes florales et des graines (MasclauxDaubresse et al. 2010 ; Diaz et al. 2008). L’ensemble de ces résultats montre qu’au cours du cycle de vie d’A. thaliana , deux phases distinctes régissent l’allocation de la biomasse de la plante. En effet, au cours des 53 premiers jours de son cycle de vie, le développement végétatif de la plante est privilégié, avec une augmentation importante de la masse des racines et des feuilles. Ainsi, au cours de la première phase de développement d’A. thaliana , les organes puits principaux de la plante sont les racines et les jeunes feuilles de la rosette. Il apparait tout de même que durant cette phase de développement, la croissance des parties aériennes devient progressivement plus importante que celle de la partie racinaire. En effet, la culture hydroponique limite les contraintes d’absorption de l’eau et des minéraux par les racines, augmentant probablement l’activité photosynthétique des plantes, et permettant ainsi le développement plus rapide des parties aériennes au détriment des parties racinaires (Gibeaut et al. 1997). A partir de l’émergence des hampes florales (53 jours), le développement végétatif est ralenti pour permettre l’apparition des organes floraux. Dans un premier temps les feuilles de la rosette, principaux organes sources, restent le compartiment le plus important en pourcentage de biomasse bien que l’on puisse supposer que la remobilisation des ressources par 65 RESULTATS ET DISCUSSION par sénescence monocarpique ait débuté (Masclaux-Daubresse et al. 2010 ; Wingler et al. 2004). La biomasse du compartiment racinaire va en revanche décroitre en pourcentage assez fortement à partir de ce stade de développement par rapport à la biomasse totale de la plante. Cependant sa croissance ne semble pas stoppée puisque la biomasse sèche moyenne des racines augmente jusqu’au dernier stade de développement étudié. Au stade siliques vertes et graines, le pourcentage représenté par la biomasse des feuilles par rapport à la biomasse totale continue de diminuer, reflétant la forte remobilisation des nutriments liée au processus de sénescence foliaire. Cette étape est nécessaire à la mise en place des premières siliques et pour le remplissage des graines (Hensel et al. 1993 ; Robinson and Hill 1999 ; Masclaux-Daubresse et al. 2010). Cependant, il semblerait que dans nos conditions de culture hydroponique, les symptômes liés à la sénescence des feuilles soient retardés par rapport à ceux observés sur des cultures de Col-0 cultivés en terre (Wingler et al. 2004). En revanche, cette remobilisation des ressources des feuilles semble pourtant se manifester au dernier stade de développement des plantes puisque une diminution de la masse sèche moyenne des rosettes est observée. Pour avoir plus d’informations sur l’état de sénescence des feuilles, nous avons procédé à des mesures de contenu en chlorophylles. Les valeurs de chlorophylles mesurées sur les feuilles prélevées aux 3 premiers stades de développement étudiés (stade jeune J20, stade adulte J40 et stade émergence de la hampe florale J53) sont très proches entre elles et sont comprises entre 12,9 et 13,3 mg.gMS-1. Ces valeurs correspondent à des valeurs de chlorophylles classiquement retrouvées dans les jeunes feuilles d’A. thaliana cultivées en terre (Diaz et al 2008). De même, une étude menée sur l’écotype Ws cultivé à la fois en hydroponie et en terre, montre des teneurs équivalentes en chlorophylles sur 6 feuilles prélevées au même stade de développement et pour les deux systèmes de culture (Norén et al 2004). En revanche nos mesures indiquent que les teneurs en chlorophylles totales augmentent dans les feuilles aux stades fleurs (J67) et siliques vertes (J95). Ces résultats sont contradictoires avec ce qui est rapporté dans la littérature. En effet, chez A. thaliana il est connu que les feuilles entrent en sénescence (sénescence végétative) avant même que le développement complet de la rosette ne soit terminé (Stessman et al. 2002) et la première étape de la sénescence foliaire correspond à la dégradation des chlorophylles (BuchananWollaston et al. 2003 ; Pruzinska et al. 2005). Dans notre étude, l’échantillon sur lequel les dosages des chlorophylles ont été réalisés correspond à un mélange de feuilles jeunes (n’ayant pas encore compétemment mis en place son système photosynthétique) et de feuilles matures. Il est à noter que nous n’avons pas récolté de feuilles présentant les premiers symptômes 66 RESULTATS ET DISCUSSION avancés de sénescence à savoir un jaunissement au niveau de l’extrémité des feuilles. Nous ne pouvons pas exclure que ce problème d’échantillonnage crée un biais dans nos résultats. En effet, l’augmentation de la teneur en chlorophylles observée au stade fleurs et siliques vertes semble refléter la présence de feuilles ayant atteint leur maturité plutôt que la teneur réelle en chlorophylles de la rosette. Si les dosages avaient été réalisés sur l’ensemble de la rosette ou sur exactement les mêmes rangs foliaires, la teneur en chlorophylles aurait diminuée au cours du développement des plantes comme cela a été observé dans la littérature (Wingler et al. 2004 ; Pourtau et al. 2006) De plus, les mesures de la masse sèche des rosettes (Figure 34) à ces deux stades de développement montrent que la biomasse totale de feuilles diminue par rapport à la biomasse totale de la plante. A la vue de ces résultats, il est possible d’imaginer que la teneur globale en chlorophylles de la rosette diminue dans le même sens que la biomasse. Cependant l’étude phénotypique du développement des A. thaliana Col-0 a montré qu’en culture hydroponique le processus de sénescence semble être ralenti. Aussi, il n’est pas surprenant que dans notre échantillon composé de jeunes feuilles et de feuilles matures la quantité de chlorophylles soit encore élevée comparée à des plantes cultivées en terre ou en boites de Pétri. Pour le dernier stade de développement étudié, le stade graines (J 114), la teneur en chlorophylle diminue de façon importante. Ceci reflète une perte en chlorophylles des feuilles correspondant au premier phénomène observé au cours de la sénescence foliaire et qui conduit, à plus long terme, aux symptômes de sénescence avancée résultant au jaunissement des feuilles et à leur dessèchement (Stressmann et al. 2002 ; Buchanan-Wallason et al. 2003). 3.2.5 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre L’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre a été réalisée par la technique de macroarray sur les racines, les feuilles et les hampes florales, pour les 6 stades de développement étudiés. Cette technique permet de suivre l’expression de 14 gènes de transporteurs d’hexose (AtSTP1 à AtSTP14), de 9 gènes de transporteurs de saccharose (AtSUC1 à AtSUC9) et de 5 gènes de transporteurs de polyols (AtPLT1, 2, 3, 5 et AtPLT6). Seuls les gènes dont l’expression est supérieure au seuil de sensibilité fixé sont représentés. 67 Figure 36 : Expression de gènes de transporteurs de sucre dans les racines d’Arabidopsis thaliana analysée par la technique de macroarray pour chaque stade de développement étudié : stade jeune, stade adulte, stade émergence de la hampe florale, stade fleurs, stade siliques vertes et stade graines. Pour chaque gène, l’étude de l’expression a été réalisée sur les racines de 10 plantes. L’expression des gènes de transporteurs de sucre a été normalisée par la moyenne d’expression des gènes de ménage Ef1α, Actine2 et HistoneH4. RESULTATS ET DISCUSSION 3.2.5.1 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines 3.2.5.1.1 Les gènes de transporteurs de saccharose Les résultats d’expression obtenus dans les racines mettent en évidence l’expression de 3 gènes de transporteurs de saccharose, AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5, pour tous les stades de développement étudiés (Figure 36). Le gène AtSUC1 est le gène de transporteurs de sucre le plus exprimé dans les racines d’A. thaliana . Son expression est toujours très importante, quel que soit le stade de développement considéré. Cependant, un pic d’expression de ce gène est mesuré au stade émergence de la hampe florale et au stade siliques vertes, stades correspondant à l’apparition de nouveaux organes puits. Le gène AtSUC2 présente moins de variation de son expression que le gène AtSUC1 au cours des différents stades de développement étudiés. La quantité de transcrits mesurés par macroarray est assez faible dans les racines pour les 4 premiers stades de développement étudiés (stade jeune, stade adulte, stade émergence de la hampe florale et stade fleurs). L’expression d’AtSUC2 est ensuite fortement augmentée dans les racines au moment du remplissage des siliques, puis diminue une fois les siliques matures, en restant toutefois supérieure à celle mesurée dans les 4 premiers stades (stade jeune, adulte, émergence de la hampe florale et fleurs). Le dernier gène de transporteurs de saccharose dont l’expression a été mesurée dans les racines est le gène AtSUC5. L’expression de ce gène est assez faible, comparable à celle mesurée pour AtSUC2 au stade jeune. Nos résultats montrent que l’expression d’AtSUC5 est constante dans les racines tout au long du développement des plantes. 3.2.5.1.2 Les gènes de transporteurs de polyol L’étude transcriptomique effectuée par macroarray dans les racines a aussi révélée l’expression de 2 gènes de transporteurs de polyols, les gènes AtPLT5 et AtPLT6 (Figure 36). Les transcrits du gène AtPLT5 sont retrouvés dans les racines pour chaque stade de développement étudié. L’expression de ce gène est assez faible aux stades jeune, adulte et fleurs. En revanche, son expression est plus importante dans les racines aux stades émergence de la hampe florale, siliques vertes et graines. En ce qui concerne le gène AtPLT6, son expression est détectée dans les racines pour tous les stades de développement, excepté le stade siliques vertes. Son niveau d’expression est très faible et est similaire pour tous les stades de développement où il a été détecté. 68 Figure 37 : Expression de gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles d’ Arabidopsis thaliana analysée par la technique de macroarray pour chaque stade de développement étudié : stade jeune, stade adulte, stade émergence de la hampe florale, stade fleurs, stade siliques vertes et stade graines. Pour chaque gène, l’étude de l’expression a été réalisée sur les feuilles de 10 plantes. L’expression des gènes de transporteurs de sucre a été normalisée par la moyenne d’expression des gènes de ménage Ef1α, Actine2 et HistoneH4. RESULTATS ET DISCUSSION 3.2.5.1.3 Les gènes de transporteurs d’hexose L’étude de l’expression des gènes de la famille des STPs (Sugar Transporter Protein) par macroarray a révélé l’expression de 2 gènes de transporteurs d’hexose dans les racines d’A. thaliana , les gènes AtSTP7 et AtSTP13 (Figure 36). A l’exception du stade émergence de la hampe florale, les transcrits du gène AtSTP7 sont détectés dans les racines des plantes pour tous les stades de développement étudiés. L’expression de ce gène de transporteur de sucre est assez faible, excepté au stade siliques vertes pour lequel une forte quantité de transcrit d’AtSTP7 a été détectée. Le second gène de transporteurs d’hexose retrouvé exprimé dans les racines d’A. thaliana est le gène AtSTP13. Son expression n’est détectée dans les racines que pour deux stades de développement : le stade siliques vertes et le stade graines. L’expression de ce gène reste assez faible pour ces deux stades de développement. Toutefois, la quantité de transcrits mesurée dans les racines des plantes au stade graines est quasiment 2 fois plus importante que celle mesurée dans les racines au stade siliques vertes. 3.2.5.2 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles 3.2.5.2.1 Les gènes de transporteurs de saccharose L’analyse de l’expression des gènes de transporteurs de saccharose dans les feuilles d’A. thaliana au cours du développement a montré l’expression des gènes AtSUC1 et AtSUC2 (Figure 37). Le gène AtSUC5, exprimé dans les racines, n’est pas retrouvé dans les feuilles. L’expression du gène AtSUC1 est mesurée dans les feuilles d’A. thaliana pour tous les stades de développement étudiés. Au stade jeune, il est avec le gène AtSUC2 le gène le plus exprimé dans les feuilles. L’expression d’AtSUC1 augmente ensuite dans les feuilles adultes puis diminue légèrement dans les feuilles des plantes au stade émergence de la hampe florale. Pour le stade fleurs, l’expression d’AtSUC1 augmente à nouveau dans les feuilles pour atteindre un niveau plus élevé que celui mesuré au stade adulte. Le niveau d’expression au stade siliques vertes est identique à celui du stade émergence de la hampe florale. C’est au stade graines que le plus grand nombre de transcrits d’AtSUC1 a été détecté dans les feuilles d’A. thaliana . En ce qui concerne le gène AtSUC2, son expression est aussi mesurée dans les feuilles pour chaque stade de développement étudié. Les variations d’expression de ce gène au cours du développement sont moins importantes que celles observées pour le gène AtSUC1. Aux stades jeune et émergence de la hampe florale, la quantité de transcrits détectée pour le gène AtSUC2 est du même ordre que celle mesurée pour le gène AtSUC1. L’expression d’AtSUC2 69 RESULTATS ET DISCUSSION est en revanche plus forte dans les feuilles au stade adulte, au stade hampes florales et au stade fleurs, et atteint son maximum d’expression dans les feuilles au stade graines. 3.2.5.2.2 Les gènes de transporteurs de polyol Parmi les 7 gènes de transporteurs de sucre exprimés dans les feuilles au cours du développement de la plante, deux sont des gènes de transporteurs de polyol, AtPLT5 et AtPLT6 (Figure 37), les mêmes que ceux exprimés dans les racines. Aux stades jeune et adulte, le nombre de transcrits retrouvé dans les feuilles pour le gène AtPLT5 est assez faible. L’expression de ce gène va ensuite augmenter progressivement dans les feuilles à chaque stade de développement étudié. Son expression pour les 3 derniers stades de développement étudiés (fleurs, siliques vertes et graines) est d’ailleurs supérieure à celle retrouvée pour le gène AtSUC2. En ce qui concerne le gène AtPLT6, son expression est extrêmement faible au stade jeune et elle n’est pas détectée au stade adulte (Figure 37). Pour les stades émergence de la hampe florale, fleurs et siliques vertes, le nombre de transcrits du gène AtPLT6 est plus important et reste identique pour ces 3 stades de développement. Son expression, en revanche, augmente fortement dans les feuilles au stade graines. 3.2.5.2.3 Les gènes de transporteurs d’hexose L’expression de trois gènes de transporteurs d’hexose a été détectée dans les feuilles d’A. thaliana au cours de son cycle de vie, les gènes AtSTP13, AtSTP14 et AtSTP3 (Figure 37). Seul AtSTP13 est commun avec les gènes exprimés dans les racines. L’expression du gène AtSTP3 n’est pas détectée dans les feuilles des plantes au stade jeune. Aux stades adulte et émergence de la hampe florale, l’expression de ce gène reste assez faible. En revanche, son expression augmente de façon assez importante dans les feuilles au stade fleurs. Le nombre de transcrits détecté pour ce gène aux stades siliques vertes et graines reste assez élevé, bien qu’un peu plus faible que pour le stade fleurs. Le gène AtSTP13 est exprimé dans les feuilles pour tous les stades de développement étudiés. Son expression reste toutefois très faible aux stades jeune et fleurs. Le nombre de transcrits mesuré dans les feuilles aux stades adulte, émergence de la hampe florale et siliques vertes est en revanche plus élevé. Mais c’est au stade graines que la plus forte expression d’AtSTP13 est mesurée. C’est d’ailleurs le gène de transporteur de sucre le plus exprimé dans les feuilles à ce stade de développement. Concernant, l’expression du gène AtSTP14, celle-ci n’est détectée qu’aux stades : jeune, émergence de la hampe florale, fleurs et siliques vertes (Figure 37). Son expression est très 70 Figure 38 : Expression de gènes de transporteurs de sucre dans les hampes florales d’Arabidopsis thaliana analysée par la technique de macroarray pour chaque stade de développement étudié : stade jeune, stade adulte, stade émergence de la hampe florale, stade fleurs, stade siliques vertes et stade graines. Pour chaque gène, l’étude de l’expression a été réalisée sur les hampes florales de 10 plantes. L’expression des gènes de transporteurs de sucre a été normalisée par la moyenne d’expression des gènes de ménage Ef1α, Actine2 et HistoneH4. RESULTATS ET DISCUSSION faible aux stades jeune et émergence de la hampe florale et semble légèrement augmenter lors de la floraison et la formation des siliques. 3.2.5.3 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les hampes florales Nous avons pu observer que pour les plantes d’A. thaliana cultivées en hydroponie, les hampes florales émergent après 53 jours de culture. L’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans cet organe ne sera donc effectuée que pour les stades fleurs, siliques vertes et graines. 3.2.5.3.1 Les gènes de transporteurs de saccharose Tout comme dans les racines, les trois gènes de transporteurs de saccharose AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5 sont exprimés dans les hampes florales (Figure 38). Le gène AtSUC1 est, avec AtSUC2, le gène le plus exprimé dans les hampes florales d’A. thaliana au stade fleurs. Le niveau d’expression d’AtSUC1 va ensuite légèrement augmenter dans les hampes au stade siliques vertes, puis augmenter de façon beaucoup plus importante dans les hampes florales des plantes au stade graines. Le niveau d’expression du gène AtSUC2 est, quant à lui, similaire à celui d’AtSUC1 dans les hampes florales des plantes au stade fleurs. Au stade siliques vertes, l’expression de ce gène augmente, puis celle-ci diminue dans les hampes florales des plantes au stade graines. Le dernier gène de transporteurs de sucres dont la présence de transcrits a été mesurée dans les hampes florales est le gène AtSUC5. Son expression n’a été détectée qu’au stade fleurs et au stade graines, bien qu’elle soit cependant très faible. 3.2.5.3.2 Les gènes de transporteurs de polyol Le seul gène de transporteur de polyol dont l’expression a pu être mesurée dans les hampes florales est le gène AtPLT5 (Figure 38). Son expression est très faible dans les hampes des plantes au stade fleurs mais augmente de façon importante pour les deux derniers stades de développement étudiés (siliques vertes et graines). Cette forte expression est d’ailleurs aussi observée sur les feuilles de la rosette pour ces 2 derniers stades de développement. 3.2.5.3.3 Les gènes de transporteurs d’hexose L’étude de l’expression des gènes de transporteurs d’hexose dans les hampes florales n’a révélé l’expression que d’un seul gène de transporteur d’hexose dans ce compartiment, le gène AtSTP13 (Figure 38). Ce gène est peu exprimé dans les hampes florales des plantes aux stades fleurs et siliques vertes, mais les résultats indiquent une surexpression de ce gène dans les hampes florales au stade graines. 71 RESULTATS ET DISCUSSION 3.2.5.4 Discussion L’étude de l’expression des transporteurs de sucre dans la racine au cours du cycle de développement complet de Col-0 en hydroponie a permis de mettre en évidence un certain nombres de gènes. Parmi les transporteurs de saccharose, le gène AtSUC1 est celui qui est le plus exprimé tout au long du développement de Col-0. L’expression de ce gène dans les racines d’A. thaliana a été mis en évidence dans les travaux menés par Sivitz et collaborateurs (2008). Cette étude montre que l’expression de d’AtSUC1 est localisée dans les pointes racinaires et les racines latérales des plantules d’A. thaliana . Ce transporteur de sucre permettrait le déchargement du saccharose par voie apoplastique dans ces zones de la racine. Les valeurs d’expression maximales d’AtSUC1 que nous avons observées au cours du développement d’A. thaliana, coïncident avec deux stades particuliers du cycle de développement de la plante. Ces stades correspondent à l’apparition de nouveaux organes puits, à savoir la hampe florale et les siliques qui constituent de nouveau puits de carbone au niveau de la plante, qui vont entrainer une compétition pour cette ressource avec les racines (Christophe et al. 2008). Le second gène de transporteur de saccharose le plus exprimé dans la racine est le gène AtSUC2. Nos résultats montrent que son expression augmente fortement dans les derniers stades de développement étudiés (stade siliques vertes J95 et stades graines, J114). Les travaux de Truernit et Sauer (1995) ont permis de localiser l’expression d’AtSUC2 dans les racines d’A. thaliana . La fonction de ce transporteur dans les racines est encore mal connue. Il pourrait, comme pour AtSUC1, jouer un rôle dans le déchargement apoplastique du saccharose (Carpaneto et al. 2005, Juergensen et al. 2003). L’augmentation de l’expression de ce gène dans les racines, à la fin du développement de la plante pourrait, de la même façon qu’AtSUC1, participer au maintien d’un flux de carbone des feuilles vers ce compartiment. Le dernier gène de transporteur de saccharose dont l’expression a été observée dans notre étude est le gène AtSUC5. Son expression, assez faible, est constante dans les racines tout au long du développement des plantes, et elle est proche de celle mesurée pour AtSUC2 au stade jeune. De précédents travaux réalisés par Baud et collaborateurs (2005) ont permis de montrer l’expression de ce gène dans les racines d’A. thaliana , mais sur l’écotype Ws. En revanche, aucune étude n’a été effectuée sur le rôle d’AtSUC5 dans ce compartiment. L’analyse des données d’expression de la base de données microarray Genevestigator semble aussi montrer un niveau d’expression assez constant de ce gène au cours du développement de la plante. 72 RESULTATS ET DISCUSSION Parmi les gènes de transporteurs de polyol étudiés, seuls 2 d’entre eux sont exprimés dans la racine : AtPLT5 et AtPLT6. Nos travaux indiquent que le gène AtPLT5 s’exprime tout au long du développement. Son expression semble augmenter au cours des derniers stades de développement étudiés (stade émergence de la hampe florale J53, stade fleurs J67, stade siliques vertes, J95 et stade graines, J114). L’expression d’AtPLT5 a précédemment été mise en évidence dans les racines par des études réalisées par Klepek et collaborateurs (2005). Ces travaux ont permis de localiser l’expression de ce gène dans la zone d’élongation de la racine d’A. thaliana. D’après Reinders et collaborateurs (2005), ce transporteur de sucre participerait au déchargement apoplastique des sucres depuis le phloème. En effet, il permettrait le transport d’hexoses issus du clivage de saccharose par les invertases pariétales au niveau des cellules de la racine. L’augmentation de l’expression de ce gène dans la racine au cours des derniers stades de développement des plantes permettrait d’accélérer le déchargement du saccharose dans l’apoplaste des cellules de la racine, créant une force de puits plus importante au niveau de ces dernières, permettant de compenser la demande importante des autres puits de la plante. En effet, les siliques vertes et les graines représentent des puits de carbone importants lors du développement de la plante (Hensel et al. 1994), celles-ci entrant en compétition avec le puits racines. Les racines vont donc activer l’ensemble des transporteurs de sucre qui leur permettront d’augmenter leur approvisionnement en sucre. En ce qui concerne le gène AtPLT6, son expression a été détectée dans les racines pour 5 des 6 stades de développement étudiés (non exprimé au stade siliques vertes, J95). Cependant cette expression reste faible et identique pour tous les stades de développement où il a été détecté. Les études sur l’expression de ce gène disponibles sur la base de données microarray Genevestigator semblent aussi montrer que l’expression de ce gène ne varie pas au cours du développement de la plante. Toutefois, aucune donnée n’est disponible sur la nature des substrats transportés par AtPLT6. Une étude phylogénétique sur les transporteurs de polyols, réalisée au laboratoire, laisse supposer qu’AtPLT6 est assez éloigné des autres transporteurs de polyol caractérisés (Lemoine, Porcheron, Mainson, Maurousset et Laloi, soumis pour publication). Seuls deux gènes de transporteurs d’hexose, AtSTP7 et AtSTP13, semblent s’exprimer dans les racines de plantes cultivées au cours de notre expérimentation. Le transporteur d’hexose AtSTP7 s’exprime à tous les stades de développement à l’exception du stade émergence de la hampe florale (J53) et son expression est la plus importante au stade siliques vertes (J95). Aucune étude n’a été à ce jour réalisée sur l’expression de ce gène. Cependant, l’analyse des données AREX ( Ar a bidopsis Gene Expression Database), regroupant des 73 RESULTATS ET DISCUSSION données d’expression issues de microarray, a permis de retrouver l’expression de ce gène dans les racines, et plus particulièrement dans les cellules de l’épiderme de la coiffe des racines d’A. thaliana . L’analyse des données de microarray Genevestigator semble aussi montrer l’expression d’AtSTP7 dans les racines (Buttner 2007, Buttner 2010). Ces données d’expression semblent aussi indiquer une augmentation de son expression au stade siliques vertes, tout comme ce qui est observé dans notre étude. L’expression du gène AtSTP13 n’a été mesurée que pour les stades siliques vertes (J95) et graines (J114). L’expression d’AtSTP13 dans les racines a fait l’objet d’une étude réalisée par Yamada et collaborateurs (2011). Tout comme dans notre analyse, l’expression de ce gène reste très faible dans cet organe. En revanche, ce gène est surexprimé dans les racines en condition de stress salin. Il aurait pour rôle de collecter les hexoses relargués dans le milieu extérieur suite aux dommages engendrés par le stress. Ainsi, il est possible d’imaginer que l’augmentation de l’expression d’AtSTP13 observée dans notre étude aux derniers stades de développement de la plante (siliques vertes et graines) pourrait s’expliquer par la récupération des hexoses engendrés par la mort naturelle des cellules racinaires. Lors d’une étude sur les gènes de transporteurs AtSTPs exprimés dans les racines et d’A. thaliana , Yamada et collaborateurs (2011), retrouvent en plus d’AtSTP7 et AtSTP13, deux autres gènes de transporteurs assez fortement exprimés, AtSTP1 et AtSTP4. Nous n’avons pas retrouvé ces 2 gènes dans nos résultats, mais ceci pourrait s’expliquer par le fait que les racines étudiées par Yamada et collaborateurs (2011) provenaient de plantes cultivées in vitro avec du saccharose dans le milieu de culture. Il a été démontré que les plantules sont capables d’acquérir les molécules carbonées présentes dans le milieu, via les racines, et que AtSTP1 est principalement responsable de cette absorption (Yamada et al. 2011). Aussi, dans ces conditions, il est compréhensible que nous ne retrouvions pas l’expression d’AtSTP1 dans notre étude, le milieu de culture en hydroponie ne contenant pas de sucre. Ces premiers résultats sur l’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines d’A. thaliana cultivée en hydroponie ont permis de montrer que le gène AtSUC1 est le gène le plus exprimé dans ce compartiment. Il est celui, avec le gène AtPLT5, dont l’expression est la plus variable au cours du développement. Ces deux gènes possèdent d’ailleurs l’expression la plus forte dans les racines au stade émergence de la hampe florale. Leur rôle potentiel dans le déchargement du phloème au niveau des racines (Sivitz et al. 2008 ; Reinders et al. 2005) pourrait suggérer que leur expression dans cet organe soit liée à un transport plus important des sucres dans les racines. Il est ainsi possible d’imaginer que 74 RESULTATS ET DISCUSSION l’expression plus importante des gènes AtSUC1 et AtPLT5 pourrait jouer un rôle dans le maintien de la force de puits des racines, permettant de continuer un transport de sucre suffisant pour le maintien de la croissance et du développement de ce compartiment. Ces deux gènes sont d’ailleurs également surexprimés dans la racine, tout comme les gènes AtSUC2 et AtSTP7, au moment de l’apparition des siliques, nouvel organe puits majeur dans la plante. L’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles d’A. thaliana en hydroponie a permis de mettre en évidence l’expression de 2 gènes de transporteurs de saccharose (AtSUC1 et AtSUC2), de 3 gènes de transporteurs d’hexose (AtSTP3, AtSTP13 et AtSTP14) et de 2 gènes de transporteurs de polyol (AtPLT5 et AtPLT6). Concernant les transporteurs de saccharose, les résultats montrent que le gène AtSUC1 s’exprime dans les feuilles tout au long du développement de la plante mais aussi que cette expression est fluctuante. Les 3 stades de développement au cours desquels il est le plus fortement exprimé sont : le stade adulte (J40), stade fleur (J67) et le stade graines (J114). L’expression du gène AtSUC1 a été suivie par Sivitz et collaborateurs (2007) en utilisant le gène rapporteur de la β-glucuronidase. Cette étude a permis de localiser l’expression de ce gène uniquement dans les trichomes des feuilles d’A. thaliana . Très clairement, l’expression d’AtSUC1 se maintient tout au long du développement de la plante, sans que l’on puisse attribuer une fonction précise au trichome. L’étude du gène AtSUC2 indique que ce gène s’exprime dans les feuilles à tous les stades de développement étudiés et que son expression montre de faibles variations au cours du développement. Plusieurs études ont permis de localiser le transporteur AtSUC2 dans le phloème des feuilles d’A. thaliana et plus précisément dans la membrane plasmique des cellules compagnes (Stadler and Sauer 1996, Truernit and Sauer 1995). Ce transporteur de sucre est le transporteur impliqué dans le chargement apoplastique du saccharose dans le phloème (Gotwald et al. 2000 ; Srivastava et al. 2008). De plus, notre étude montre qu’AtSUC2 est le gène ayant l’expression la plus stable dans les feuilles au cours du développement. La faible variation de son expression au cours du développement de la plante pourrait indiquer un chargement constant du phloème afin de subvenir aux besoins en sucre des différents compartiments puits de la plante : les racines et les jeunes feuilles dans les premiers stades de développement, puis les hampes florales, fleurs et siliques en fin de développement. De plus, quelle que soit l’origine du saccharose, photosynthétique durant la majeure partie du développement, ou provenant de la dégradation de 75 RESULTATS ET DISCUSSION réserves au cours de la sénescence, les feuilles adultes sont toujours exportatrices de saccharose, ce qui nécessite l’expression d’AtSUC2. En ce qui concerne les transporteurs de polyol, notre étude indique que l’expression dans les feuilles du gène AtPLT5 est stable au cours des deux premiers stades de développement étudiés (stade jeune J20 et stade adulte J40). Pour les 4 derniers stades de développement, son expression augmente graduellement pour atteindre son maximum au stade graines (J 114). La localisation de l’expression du gène de transporteur de sucre AtPLT5 a été étudiée par Reinders et collaborateurs (2005) à l’aide du gène rapporteur de la β-glucuronidase. Ces études ont permis de mettre en évidence l’expression de ce gène dans les principaux vaisseaux conducteurs des feuilles. Ce transporteur de sucre pourrait être impliqué dans la collecte des hexoses relargués lors de la dégradation des cellules qui se déroule à la fin du processus de sénescence, et qui conduit à la mort cellulaire (Reinders et al. 2005). Ceci pourrait expliquer la forte expression de ce gène dans les feuilles aux derniers stades de développement, au cours de la sénescence. Concernant le gène AtPLT6, son expression est mesurable dans les feuilles à tous les stades de développement étudiés, à l’exception du stade adulte (J40), et celle-ci est maximale au stade graines (J114). Aucune étude n’a été effectuée sur le transporteur de sucre AtPLT6. L’analyse des données de microarray disponible sur la base de données Genevestigator permet tout de même de préciser son expression dans les feuilles. Ces données semblent aussi montrer une expression plus importante du gène AtPLT6 dans les feuilles des plantes au stade graines, confirmant ainsi nos résultats. Parmi les transporteurs d’hexose étudiés, l’expression du gène AtSTP3 a été mise en évidence dans les feuilles. Son expression est observée à tous les stades de développement étudiés à l’exception du stade jeune (J40), et son expression la plus importante a été notée au stade graines (J114). De plus, il est à noter que l’expression du gène AtSTP3 n’a été détectée dans nos expérimentations que dans les feuilles. En effet, ce gène semble avoir une expression spécifique dans les feuilles d’A. thaliana (Büttner et al. 2000). L’analyse des données d’expression AREX a aussi permet de montrer une expression plus importante de ce gène dans les feuilles au dernier stade de développement. L’expression du gène AtSPT13 dans les feuilles est observée à tous les stades de développement étudiés. Son expression varie au cours des 5 premiers stades de développement et est fortement activée au stade graines (J114). Le gène AtSPT13 a fait l’objet d’une étude réalisée par Norholm et collaborateurs (2006) qui a permis de montrer son expression 76 RESULTATS ET DISCUSSION dans les feuilles d’A. thaliana . Tout comme dans notre étude, ces travaux ont montré que l’expression du gène AtSTP13 est fortement induite dans les feuilles au cours de la sénescence. Il a été supposé, comme pour AtPLT5, que ce transporteur de sucre permettrait de collecter les hexoses laissés dans le compartiment apoplastique après la mort des cellules des feuilles sénescentes. Concernant le gène AtSTP14 son expression n’est pas détectée dans les feuilles au stade adulte (J40) et au stade graines (J114). Il est détecté dans tous les autres stades de développement mais son niveau d’expression est cependant assez faible. Les études réalisées par Poschet et collaborateurs (2010) ont aussi permis de montrer l’expression du gène AtSTP14 dans les feuilles d’A. thaliana . Cette étude montre qu’AtSTP14 transporte essentiellement du galactose. Ce gène serait donc impliqué dans le transport des sucres qui entrent dans la structure et la mise en place de la paroi au niveau des jeunes feuilles. De plus, il serait aussi responsable, dans les feuilles, du recyclage du galactose des parois lors de leur démantèlement au cours de la sénescence (Poschet et al. 2010). On peut penser que l’augmentation de l’expression des gènes de transporteurs d’hexose dans les feuilles d’A. thaliana au cours du développement est liée à la remobilisation des ressources carbonées des feuilles au cours de la sénescence. En effet, plusieurs études suggèrent l’implication des gènes AtSTP13, AtPLT5 et AtSTP14 dans la récolte des hexoses présents dans l’apoplaste après la mort des cellules par sénescence (Norholm et al. 2006 ; Reinders et al. 2005 ; Poschet et al. 2010). L’étude de l’expression des transporteurs de sucre dans les hampes florales a été réalisée pour 3 stades de développement uniquement : le stade fleurs (J67), le stade siliques vertes (J95) et le stade graines (J114). Les résultats ont permis de mettre en évidence l’expression de 5 gènes de transporteurs de sucre : les gènes AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5, AtPLT5 et AtSTP3. Tout comme dans les racines, les trois gènes de transporteurs de saccharose AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5 sont exprimés dans les hampes florales. L’expression du gène AtSUC1 dans les hampes florales est assez important et augmente progressivement au cours des 3 stades de développement étudiés. Dans l’étude menée par Stadler et collaborateurs (1999), une forte expression du gène AtSUC1 a été mis en évidence dans les anthères des plantes d’A. thaliana . En effet, ce transporteur de sucre serait impliqué dans la déhiscence des anthères en modulant le potentiel hydrique dans les tissus environnants par accumulation de saccharose. L’expression du gène AtSUC1 a aussi été mise en évidence dans 77 RESULTATS ET DISCUSSION les trichomes des feuilles d’A. thaliana (Sivitz et al. 2007) et il est à noter que de nombreuses feuilles caulinaires sont présentes sur les hampes florales d’A. thaliana . L’expression d’AtSUC1 mesurée dans notre expérimentation est certainement due à l’expression de ce gène à la fois dans les feuilles caulinaires et les anthères des fleurs présentes sur les hampes florales. L’expression du gène AtSUC2 dans les hampes florales est très proche de celle observée pour le gène AtSUC1, avec l’expression la plus importante observée aux stades siliques vertes (J95) et graines (J114). Le profil d’expression dans les hampes florales aux stades : fleurs, siliques vertes et graines est proche de celui observé dans la base de données de microarray AREX. En effet l’analyse de ces données montre une expression assez forte d’AtSUC2 dans les feuilles caulinaires de la hampe florale, expression qui diminue ensuite progressivement dans ce compartiment à la fin du cycle de vie de la plante. Ce transporteur de sucre étant impliqué dans le chargement du saccharose dans le phloème pourrait avoir un rôle dans l’exportation des sucres des feuilles caulinaires vers les organes puits de la hampe (fleur, siliques et graines). Le dernier transporteur de saccharose exprimé dans les hampes florales est le gène AtSUC5. Son expression n’a été détectée que pour 2 des 3 stades de développement étudiés (stade fleurs J67 et le stade graines J114) et celle-ci est de faible niveau. L’expression de ce gène a été mise en évidence dans l’étude menée par Baud et collaborateurs (2005) au niveau de l’endoderme des graines d’A. thaliana dès le début de leur développement. Il est ainsi possible de penser que l’expression d’AtSUC5 détectée dans notre étude serait localisée dans les siliques en formation de la hampe florale. Notre étude montre que, le seul transporteur de polyol dont l’expression a pu être mesurée dans les hampes florales, est AtPLT5. Son expression est très faible au stade fleurs (J67) et augmente fortement pour les 2 derniers stades étudiés (stade siliques vertes J97 et stades graines J114). Une forte expression de ce gène a déjà été mise en évidence dans les hampes florales d’A. thaliana (Reinders et al. 2005). Les auteurs suggèrent qu’AtPLT5, dont l’expression est fortement détectée dans les zones d’abscission florale, serait impliqué dans la collecte des sucres produits par la dégradation des polysaccharides de la paroi des cellules localisées dans ces zones et lors de remobilisation des ressources carbonées des feuilles caulinaires vers les hampes florales. Un seul gène de transporteur d’hexose a été mis en évidence dans les hampes florales, le gène AtSTP13. Ce gène s’exprime au cours des 3 stades de développement étudiés mais nos travaux indiquent une forte surexpression de ce gène au stade graines (J114). Conformément aux 78 Figure 39 : Teneur en saccharose, glucose et fructose dans les racines, pour chaque stade de développement étudié : stade jeune (J), adulte (A), émergence de la hampe florale (E), fleurs (F), siliques vertes (SV) et graines (G). Le dosage des sucres a été réalisé sur les racines de 5 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. Les valeurs notés ND présentent les points où les quantités de sucres n’ont pas pu être déterminés, étant inférieurs au seuil de détection de l’HPLC (300 nmol.L-1). RESULTATS ET DISCUSSION résultats de Norholm et collaborateurs (2006) ce transporteur de sucre serait impliqué dans la collecte des hexoses relargués au cours de la destruction des membranes cellulaires lors de la sénescence des feuilles caulinaires. Les 2 transporteurs de monosaccharides, AtSTP13 et AtPLT5 auraient la même fonction à savoir : la collecte des hexoses produits par la dégradation des parois et la mort des cellules au cours de la sénescence. 3.2.6 Etude de la teneur en sucres solubles : saccharose, glucose et fructose Afin de mieux comprendre les modifications de la répartition des ressources carbonées dans la plante au cours de son développement, le dosage du saccharose, glucose et fructose a été effectué dans les racines, feuilles, hampes florales et siliques, pour les 6 stades de développement étudiés. Le choix s’est porté sur ces 3 sucres car le saccharose est la principale forme de transport du carbone à longue distance chez A. thaliana et le glucose et le fructose sont ses produits d’hydrolyse par les invertases. 3.2.6.1 Teneurs en sucres solubles (saccharose, glucose, fructose) dans les racines La Figure 39 présente les résultats de dosage du saccharose, glucose et fructose dans les racines des plantes aux différents stades de développement étudiés. Les teneurs en saccharose dans les racines des plantes aux stades adulte, émergence de la hampe florale et fleurs n’ont pas pu être déterminées, étant inférieures au seuil de sensibilité de l’HPLC (300 nmol). La quantité de saccharose la plus importante est retrouvée dans les plantes au stade jeune (3,4 µmol.gMS-1, Figure 39). Pour les stades siliques vertes et graines, les teneurs en saccharose des racines restent très faibles (respectivement 1,5 et 0,5 µmol.gMS-1). Le dosage du glucose montre que ce sucre est le plus représenté dans les racines, quel que soit le stade de développement étudié. La teneur en glucose des racines pour les plantes des 3 premiers stades étudiés (jeune, adulte, émergence de la hampe florale) est assez similaire (respectivement 19, 18,2 et 21 µmol.gMS-1), puis diminue pour les trois derniers stades de développement fleurs, siliques vertes et graines (respectivement 9,2, 8,8 et 6,4 µmol.gMS-1 ; Figure 39). Les quantités de fructose mesurées sont environ deux fois moins importantes que celles mesurées pour le glucose pour chaque stade de développement étudié (Figure 39), sauf au stade émergence de la hampe florale, où la quantité de fructose représente moins de la moitié de celle de glucose. Aux stades jeune, adulte et émergence de la hampe florale, les quantités respectives en fructose des racines sont de 9, 10,3 et 7,8 µmol.gMS-1. La teneur en fructose est 79 Figure 40 : Teneur en saccharose, glucose et fructose dans les feuilles, pour chaque stade de développement étudié : stade jeune (J), adulte (A), émergence de la hampe florale (E), fleurs (F), siliques vertes (SV) et graines (G). Le dosage des sucres a été réalisé sur les feuilles de 5 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. RESULTATS ET DISCUSSION ensuite moins importante dans les racines des plantes aux stades fleurs, siliques vertes et graines (respectivement 5,2, 4,4 et 2,8 µmol.gMS-1 ; Figure 39). En sommant les quantités de ces 3 sucres, il est possible de montrer que les teneurs en sucres solubles dans les racines restent assez stables pour les 3 premiers stades de développement (31,4 µmol.gMS-1 au stade jeune, 28 µmol.gMS-1 au stade adulte et 29 µmol.gMS-1 au stade émergence de la hampe florale). Une diminution de la quantité de ces sucres solubles est ensuite observée dans les plantes aux stades fleurs et siliques vertes (respectivement 14 et 14,5 µmol.gMS-1). Au stade graines enfin, la teneur en sucres solubles totale mesurée est très faible (9,5 µmol.gMS-1). 3.2.6.2 Teneurs en sucres solubles (saccharose, glucose, fructose) dans les feuilles Les teneurs en saccharose, glucose et fructose mesurées dans les feuilles de la rosette sont présentées sur la Figure 40. Les résultats obtenus montrent que la teneur en sucres solubles présente deux phases bien distinctes mais comparables dans leur déroulement : une première phase voit une diminution progressive de la teneur en sucres depuis le stade jeune jusqu’au stade émergence de la hampe florale. La deuxième phase se déroule du stade fleurs au stade graines : les teneurs en sucres solubles augmentent nettement au stade fleurs et diminuent à nouveau jusqu’au stade graines. Comme dans le compartiment racinaire, le sucre le moins présent dans les feuilles est le saccharose. Il est toutefois retrouvé en plus grande quantité dans les feuilles que dans les racines et surtout, à tous les stades de développement. Les teneurs en saccharose mesurées dans les feuilles au stade jeune, adulte et siliques vertes sont assez similaires (respectivement 5,9.gMS-1, 7,6 et 6,1 µmol.gMS-1). La plus grande quantité de saccharose est retrouvée dans les feuilles au stade fleurs (14,5 µmol.gMS-1) et la plus faible aux stades émergence de la hampe florale (2,5 µmol.gMS-1) et graines (2,1 µmol.gMS-1 ; Figure 40). Le glucose est le sucre soluble le plus représenté dans les feuilles des plantes pour chaque stade de développement étudié. La teneur en glucose dans les feuilles aux stades jeune, adulte et siliques vertes est assez proche (respectivement 35,3, 33,7 et 39,9 µmol.gMS -1 ; Figure 40). Comme pour les teneurs en saccharose, la quantité de glucose la plus importante dans les feuilles est mesurée au stade fleurs (61,9 µmol.gMS-1) et la plus faible aux stades émergence de la hampe florale (17,3 µmol.gMS-1) et graines (14,4 µmol.gMS-1 ; Figure 40). La quantité de fructose mesurée au stade jeune (22,4 µmol.gMS-1) est la quantité maximum de fructose retrouvée dans les feuilles pour tous les stades de développement étudiés 80 Figure 41 : Teneur en saccharose, glucose et fructose dans les hampes florales, pour les 3 derniers stades de développement étudiés : stade fleurs (F), siliques vertes (SV) et au stade graines (G). Le dosage des sucres a été réalisé sur les hampes florales de 5 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. Les valeurs notés ND présentent les points où les quantités de sucres n’ont pas pu être déterminés, étant inférieurs au seuil de détection de l’HPLC (300 nmol.L-1). RESULTATS ET DISCUSSION (Figure 40). Aux stades adulte, fleurs et siliques vertes, la quantité de fructose est très proche (respectivement 16,5, 17,7 et 12,4 µmol.gMS-1). Comme pour les teneurs en saccharose et glucose, les quantités de fructose les plus faibles sont retrouvées dans les feuilles au stade émergence de la hampe florale (8,6 µmol.gMS-1) et au stade graines (5,9 µmol.gMS-1). 3.2.6.3 Teneurs en sucres solubles (saccharose, glucose, fructose) dans les hampes florales Les teneurs des 3 sucres solubles (saccharose, glucose et fructose) mesurées dans les hampes florales sont représentées Figure 41. Chez une plante en rosette comme A. thaliana , le passage au stade reproducteur représente un grand changement dans l’architecture de la plante. En effet, les hampes florales qui vont se développer portent des feuilles caulinaires capables de photosynthèse et donc de synthétiser des sucres. Une étude sur différents écotypes d’A. thaliana (mais pas Col-0) a permis de montrer que les inflorescences contribuent pour une part très importante à l’acquisition globale du carbone dans le cycle de la plante (Earley et al. 2009). Le dosage du saccharose dans les hampes florales au stade fleurs montre une valeur assez faible (2,3 µmol.gMS-1), beaucoup plus faible que celle mesurée dans les feuilles au même stade de développement (14,5 µmol.gMS-1). Au stade siliques vertes, le saccharose dans les hampes florales n’a pas pu être détecté. En revanche, cette quantité semble assez importante dans les hampes florales au stade graines (8,8 µmol.gMS-1). En ce qui concerne les teneurs en glucose dans les hampes florales, elles sont moins élevées que celles mesurées dans les feuilles au stade fleurs (61,9 contre 17,9 µmol.gMS-1 ; Figure 40 et 41). Par contre, la quantité de glucose augmente fortement dans les hampes florales au stade siliques vertes (49,6 µmol.gMS-1) et au stade graines (129,8 µmol.gMS-1). Le dosage du fructose a aussi montré une teneur plus faible dans les hampes florale que dans les feuilles pour les plantes au stade fleurs (17,7 dans les feuilles µmol.gMS-1 contre 8,5 µmol.gMS-1 dans les siliques ; Figure 40 et 41). Comme pour le glucose, cette quantité augmente de façon importante dans les hampes des plantes au stade siliques vertes (44,3 µmol.gMS-1). Elle est d’ailleurs à ce stade quasiment 4 fois plus importante que celle mesurée dans les feuilles. Au stade graines, la teneur en fructose mesurée dans les hampes florales reste identique à celle mesurée au stade siliques vertes (44 µmol.gMS-1 ; Figure 41). 81 Figure 42 : Teneur en saccharose (A), glucose (B) et fructose (C) dans les siliques, pour les 2 derniers stades de développement étudiés : stade siliques vertes (SV) et au stade graines (G). Le dosage des sucres a été réalisé sur les siliques de 5 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. RESULTATS ET DISCUSSION 3.2.6.4 Teneurs en sucres solubles (saccharose, glucose, fructose) dans les siliques Le dernier compartiment étudié est le compartiment silique où les quantités de saccharose, glucose et fructose ont été dosées pour les deux derniers stades de développement (Figure 42). Les résultats montrent que les quantités de saccharose dosées sont quasiment identiques dans les siliques pour les deux derniers stades de développement (2,6 µmol.gMS-1 pour le stade siliques vertes et 2 µmol.gMS-1 pour le stade graines ; Figure 42). En ce qui concerne le glucose, les quantités mesurées pour le stade siliques vertes sont très importantes (53,7 µmol.gMS-1), comparables à celles mesurées dans les hampes florales (49,6 µmol.gMS-1 ; Figure 41). Cette teneur en glucose augmente ensuite au stade graines (77,3 µmol.gMS-1) bien qu’elle reste inférieure à celle mesurée dans les hampes florales au même stade (129,8 µmol.gMS-1). Le dosage du fructose a aussi permis de mettre en évidence d’importantes teneurs dans les plantes au stade siliques vertes (28,7 µmol.gMS-1) et au stade graines (36,8 µmol.gMS-1 ; Figure 42). Pour ce sucre aussi, les quantités mesurées restent inférieures à celles mesurées dans els hampes florales (44,3 et 44 µmol.gMS-1 ; Figure 41) 3.2.6.5 Discussion Les résultats du dosage des 3 sucres solubles dans les racines semblent montrer que les teneurs en saccharose, glucose et fructose sont assez faibles dans cet organe. En effet, les résultats montrent que les teneurs en saccharose dans les racines sont très faibles pour 3 stades de développement étudiés (stades jeune J20, stade siliques vertes J95 et stade graines J114) et non mesurables pour les stades adulte, émergence de la hampe florale fleurs. En revanche, le dosage du glucose montre qu’il est le sucre soluble majoritaire retrouvé dans les racines, et sa teneur est importante pour les 3 premiers stades de développement. Elle diminue ensuite pour les derniers stades étudiés. Cette diminution dans les racines en fin de développement pourrait s’expliquer par une augmentation du métabolisme des racines, ou bien par le ralentissement du transport des sucres dans ce compartiment. La mesure de la biomasse de la plante montre que la croissance des racines est ralentie en fin de développement. Il est ainsi possible de penser que la diminution de la quantité de glucose dans les racines en fin de développement serait plutôt due à un transport moins important de molécules carbonées vers ce compartiment. Le dosage du fructose dans les racines montre que les quantités mesurées pour ce sucre sont deux fois moins importantes que celles du glucose. Cependant, le profil de teneur en 82 RESULTATS ET DISCUSSION fructose est similaire à celui observé pour le glucose. Le même constat que pour les teneurs en glucose peut être établi pour les quantités de fructose. Toutefois, il est à noter que la teneur en hexoses est systématiquement plus importante que la teneur en saccharose. Ces résultats corroborent les travaux réalisés par Wang et collaborateurs (2010) qui trouvent des teneurs en saccharose de 5,5 µmol.gMS-1, en glucose de 11,6 µmol.gMS-1 et en fructose de 9,4 µmol.gMS-1, mesurées dans les racines de plante d’A. thaliana (écotype Col-0) cultivées pendant 11 jours en boite de Pétri. Ces valeurs sont assez proches des quantités de sucres dosées dans notre expérimentation. Une étude a d’ailleurs montré le lien entre l’expression et l’activité de l’invertase vacuolaire et la croissance racinaire chez A. thaliana (Sergeeva et al. 2006) : ceci pourrait expliquer le fait que les hexoses soient beaucoup plus présents que le saccharose. Les travaux de Freixes et collaborateurs (2002) ont également montré un lien entre la croissance racinaire et la concentration en hexoses mais pas en saccharose. Ainsi, la faible quantité de sucres présents dans cet organe pourrait s’expliquer par l’utilisation rapide de ces derniers dans le métabolisme de la racine (Deuschle et al. 2006) mais aussi par le relargage de sucres dans le milieu extérieur, phénomène couramment observé chez A. thaliana (Jaeger et al. 1999) En considérant la quantité totale de sucres solubles mesurée dans les racines au cours du développement, nos résultats montrent que cette quantité est élevée et reste stable dans les 3 premiers stades de développements étudiés (stade jeune J20, stade adulte J40 et stade émergence de la hampe florale J53). Pour les 3 derniers stades de développement étudiés (stade fleurs, J67, stade siliques vertes, J95 et stade graines, J114), la quantité totale de sucres solubles diminue mais reste stable pour ces 3 derniers stades. Ces résultats montrent clairement deux phases différentes correspondant au passage de la croissance végétative d’A. thaliana à la phase reproductive. En effet, au cours du développement végétatif, la racine est le principal organe puits de la plante avec les très jeunes feuilles. La quantité la plus importante en saccharose mesurée dans les racines l’est d’ailleurs au stade jeune, laissant supposer que l’apport en sucre dans ce compartiment est même supérieur à sa consommation. De plus, la quantité importante d’hexoses à ces premiers stades est en accord avec un développement important du système racinaire lié aux hexoses (Freixes et al. 2002) et à l’activité de l’invertase vacuolaire (Sergeeva et al. 2006). Dès l’apparition de la hampe florale, une compétition va s’installer entre les racines et les autres organes puits émergents (hampes florales, fleurs, siliques puis graines ; Christophe et al. 2008). Les sucres solubles vont ainsi être répartis dans tous ces organes en fonction de la force de puits des différents 83 RESULTATS ET DISCUSSION compartiments. Cette répartition des sucres est directement liée à la répartition de la biomasse observée dans la plante au cours du développement (Schulze et al. 1991). En effet, nos résultats montrent que le compartiment racinaire, qui représente quasiment un tiers de la masse totale de la plante au stade jeune, est de moins en moins représenté dans la biomasse totale de la plante au cours de son développement, au détriment d’autres organes puits comme les hampes florales par exemple. Le résultat du dosage des sucres solubles dans les feuilles montre dans un premier temps que le saccharose est présent en quantité moins importante dans les feuilles que les hexoses (glucose et fructose), et ce, pour tous les stades de développement étudiés. Les teneurs en saccharose varient tout au long du développement de la plante. Les valeurs de saccharose mesurées dans notre expérimentation sont proches de celles trouvées dans une étude sur les feuilles de Col-0 en condition témoin et qui est de l’ordre de 4,3 µmol.gMS-1 (Taji et al. 2002). Notre étude montre que, la quantité maximale de saccharose est mesurée au stade fleurs (J67) et minimale aux stades émergence de la hampe florale (J53) et graines (J114). A priori, la quantité la plus importante de saccharose était attendue au stade adulte avant la mise en place de la hampe florale et des fleurs, et non pas au stade fleurs qui correspond plutôt à un stade de sénescence. En fait, deux explications peuvent être avancées : soit la forte teneur en saccharose traduit la remobilisation des ressources carbonées des feuilles, sachant que les dosages ont été réalisés sur la rosette entière, feuilles sénescentes incluses, soit elle est la conséquence de la culture en hydroponie et du retard déjà discuté de la mise en place de la sénescence. La quantité de glucose mesurée dans les feuilles varie pour les différents stades de développement étudiés. La teneur maximale a été détectée dans les feuilles des plantes du stade fleurs (J67) et la teneur minimale est mesurée pour deux stades, le stade émergence de la hampe florale (J95) et le stade graines (J114). Concernant le fructose les résultats montrent que pour ce sucre aussi les teneurs varient tout le long du développement. Le maximum est dosé au niveau des feuilles de plantes du stade jeune (J20) et du stade fleurs (J67), alors que la plus faible quantité de fructose est mesurée dans les feuilles du stade graines (J114). Il est à noter que pour ces deux derniers sucres, les valeurs trouvées sont proches de celles trouvées dans deux études différentes portant sur l’étude de feuilles de Col-0 de plantes cultivées en terre. Une des deux études indique des valeurs de glucose de l’ordre de 27 µmol.gMS-1 et de valeurs de fructose de l’ordre de 13, 5 µmol.gMS-1 (Taji et al. 2002). Pour l’autre étude, les teneurs en glucose et fructose sont plus faibles, 22 µmol.gMS-1 et 8 µmol.gMS-1 respectivement (Srivastava et al. 2008). Il est important de noter qu’il existe une grande variabilité parmi les 84 RESULTATS ET DISCUSSION données de la littérature portant sur le dosage des sucres chez A. thaliana , probablement due aux différentes conditions de culture utilisées dans les différentes études. Aussi, il est assez difficile de comparer nos résultats à d’autres études. Toutefois, nos résultats montrent que le saccharose est présent en quantité moins importante dans les feuilles que les hexoses (glucose et fructose), et ce, pour tous les stades de développement étudiés. Cette répartition de ces 3 sucres est retrouvée dans plusieurs études réalisées sur l’écotype Col-0 d’A. thaliana (Bae and Sicher 2004, Hummel et al. 2010). En ce qui concerne le glucose et le fructose, nos résultats montrent que les quantités de glucose sont environ 2 fois plus importantes que les quantités de fructose quel que soit le stade de développement des plantes. Ces résultats corroborent ceux de Blasing et collaborateurs (2005) qui montrent une quantité de glucose (3 µmol.gMS-1) quasiment deux fois plus importante que celle de fructose (1,8 µmol.gMS-1) après 5 semaines de culture des plantes. Une autre étude a été menée au laboratoire sur 3 écotypes d’A. thaliana cultivés en terre (Thèse de Cyril Abadie), et a montré que sur des plantes adultes de l’écotype Col-0, récoltées 47 jours après semis (soit un âge un peu plus avancé que le stade adulte), les teneurs en sucres solubles sont très comparables : 8,9 µmol.gMS-1 contre 7,6 µmol.gMS-1 dans nos expériences pour le saccharose, 42,7 µmol.gMS-1 contre 33,7 µmol.gMS-1 pour le glucose dans nos expériences et 19 µmol.gMS-1 contre 16,3 µmol.gMS-1 dans nos expériences pour le fructose. Les conditions de culture (température, intensité lumineuse, photopériode et humidité) étant comparables, la similarité des résultats démontre que le système de culture en hydroponie est, du moins sur ce point, proche d’autres systèmes de culture. Les différences dans les teneurs en sucres solubles observées en comparaison avec les données de la littérature seraient probablement dues aux conditions de culture (intensité lumineuse, température humidité…). En considérant la quantité totale de sucres solubles mesurée dans les feuilles au cours du développement, nos résultats montrent que cette quantité est élevée pour 3 des 6 stades de développement étudiés (jeune, J20, adulte, J40, et siliques vertes, J95) et est en revanche faible pour deux autres stades considérés (émergence de la hampe florale, J67, et graines, J114). En revanche au stade fleurs (J67) la quantité totale de sucres solubles augmente de manière importante. A l’apparition de la hampe florale, ce nouvel organe puits est de faible taille et les feuilles de la rosette ne sont pas encore entrées en phase de sénescence monocarpique. En revanche, au stade suivant, une fois les premières fleurs mise en place, les quantités de sucres (surtout de saccharose et de glucose) augmentent de façon importante dans les feuilles. A ce 85 RESULTATS ET DISCUSSION stade de développement, la sénescence au niveau des feuilles a déjà commencé et la remobilisation des ressources carbonées devient assez importante. Les fortes teneurs mesurées s’expliquent également par le fait que l’ensemble des feuilles de la rosette a été utilisé pour l’extraction des sucres. Les études menées par Wingler et collaborateurs (2006b) montrent en effet une augmentation assez importante du saccharose, glucose et fructose dans les feuilles à ce stade de développement. La forte teneur en sucres dans les feuilles au stade fleurs va ensuite progressivement diminuer jusqu’au stade graines, avec des valeurs comparables au stade émergence de la hampe florale. En effet au stade graines, la majorité des feuilles ont remobilisé toutes leurs ressources et ont atteint le dernier stade de sénescence. Le dosage des sucres solubles dans les hampes florales a été réalisée pour 3 stades de développement uniquement : les stades fleurs (J67), siliques vertes (J95) et graines (J114). Les résultats concernant le dosage du saccharose dans cet organe indiquent que le saccharose n’est pas détectable au stade siliques vertes (J95). Concernant le glucose, sa valeur augmente au cours des 3 stades étudiés pour atteindre sa valeur maximale au stade graines (J 114). Pour le fructose, en revanche, sa teneur augmente du stade fleur (J67), au stade siliques vertes (J95) où il atteint sa quantité maximale, et qui est maintenue dans le dernier stade de développement étudié (stade graines J114). Comme pour les racines et les feuilles, nos résultats montrent que le saccharose est présent en moins grande quantité que le glucose et fructose dans les hampes florales. Au stade fleurs, la quantité de fructose dans les hampes florales augmente fortement puis reste stable au stade graines. La teneur en glucose augmente fortement entre le stade fleurs et le stade siliques vertes mais aussi entre le stade siliques verte et le stade graines où elle est maximum. Il s’agit d’ailleurs de la plus forte teneur en glucose mesurée, tous organes confondus. Ces résultats montrent que la quantité de sucres solubles va augmenter de façon importante dans les hampes florales lors des derniers stades de développement. Au stade fleurs, la quantité en saccharose, glucose et fructose des hampes est déjà plus importante que celle mesurée dans les racines, mais nettement inférieure à celle des feuilles. Ce résultat pourrait suggérer que les hampes florales possèdent à ce stade une force de puits déjà plus importante que celle des racines. Il faut toutefois tempérer ces explications car les feuilles caulinaires sont-elles mêmes capables de photosynthèse, et les sucres mesurés proviennent aussi bien de la rosette que des feuilles caulinaires, sans que nos mesures puissent détecter l’origine de ces derniers. Les quantités de glucose et fructose des hampes florales deviennent supérieures à celle mesurées dans les feuilles à partir de l’apparition des premières siliques. A 86 RESULTATS ET DISCUSSION ce stade de développement, la croissance et le développement des nouveaux organes (fleurs, siliques) au niveau des hampes florales, vont nécessiter une grosse quantité de sucres qui va d’ailleurs s’accentuer jusqu’à la fin du développement des plantes. En effet au stade graines, la quantité de saccharose, glucose et fructose continue d’augmenter dans les hampes florales, alors qu’elle diminue toujours plus dans les feuilles de la rosette. Ce dernier stade de développement semble le stade où la demande en sucres est la plus forte dans les hampes florales Le dosage des sucres solubles dans les siliques a été réalisé pour 2 stades de développement uniquement : le stade le stade siliques vertes (J95) et le stade graines (J114). Les résultats du dosage des sucres dans les siliques montrent que la quantité de saccharose est identique pour les 2 stades de développement étudiés. Pour ce qui est du dosage du glucose, notre étude montre que ce sucre est le plus abondant dans les siliques, et cette valeur élevée au stade siliques vertes (J95) augmente au stade graines (J114). Le fructose, quant à lui, est présent dans les siliques mais dans à un niveau moindre que le glucose, et sa valeur augmente du stade siliques vertes (J95) au stade graines (J114). Les résultats montrent que les graines accumulent beaucoup d’hexoses (glucose et fructose), mais très peu de saccharose. En effet, le saccharose est le sucre importé dans les graines par le transport à longue distance, mais il est très vite métabolisé pour mettre en place les réserves de la graine (Focks and Benning 1998). Les hexoses résultant de la dégradation du saccharose serviront ensuite à mettre en place les réserves formées d’amidon, mais surtout de lipides comme les triacylglycérols (Baud et al. 2002). L’étude du contenu en sucre dans les différents organes d’A. thaliana a permis de mettre en évidence que le saccharose est très peu représenté dans les différents organes étudiés (racines, feuilles, hampes florales et graines), par rapport aux hexoses (glucose et fructose). En effet, le saccharose produit au niveau des feuilles, est transporté dans les organes puits où il sera métabolisé afin de fournir les besoins en énergie et en squelettes carbonés. Les résultats ont aussi montré que le glucose est le sucre le plus présent dans tous les organes étudiés et quel que soit le stade de développement considéré. En effet ce sucre est directement assimilable par les cellules ce qui expliquerait sa forte disponibilité dans tous les organes étudiés. D’importantes modifications dans les teneurs en sucres solubles de la plante ont été mises en évidence au cours de son développement. Lors des premiers stades de développement de la 87 RESULTATS ET DISCUSSION plante (jeune et adulte), les quantités mesurées dans les racines et les feuilles semblent assez stables. Ces deux stades de développement correspondent à la croissance végétative des plantes. Ainsi, le saccharose sera principalement transporté dans les racines et les jeunes feuilles, pour être rapidement clivé en hexoses, assimilables par les cellules (Dinant and Lemoine 2010). La constance dans les teneurs en saccharose, glucose et fructose pour ces deux stades de développement suppose un équilibre constant entre saccharose stocké et le saccharose exporté vers les racines. Ce résultat peut être mis en relation avec les résultats d’expression des gènes de transporteurs de sucre. En effet, dans les racines l’expression des gènes AtSUC1 et AtSUC2, potentiellement impliqués dans le déchargement du phloème, est assez constante au stade jeune et adulte. Dans les feuilles, il a été observé une augmentation de l’expression du gène AtSUC2 entre le stade jeune et le stade adulte. L’augmentation de la biomasse des racines, observée entre ces 2 stades de développement, suppose une demande en molécule carbonée plus importante de ce compartiment. Ainsi, l’augmentation de l’expression d’AtSUC2 permettrait d’augmenter le chargement de saccharose dans le phloème pour alimenter le système racinaire. L’émergence de la hampe florale marque le début de la phase de reproduction des plantes et donc l’apparition des futurs organes floraux. A ce stade de développement, une assez forte diminution dans la teneur en saccharose, glucose et fructose a été mesurée dans les feuilles. Cette diminution pourrait être due à la remobilisation importante des sucres solubles au niveau des feuilles, afin de subvenir au besoin énergétique de la nouvelle hampe florale, mais aussi des racines. En effet, dans les racines, la quantité de sucres solubles semble rester au même niveau qu’au stade jeune et adulte. Les racines pourraient donc posséder à ce stade de développement une force de puits suffisante pour rivaliser avec la demande en sucres au niveau des hampes florales. Nos résultats ont montré une importante augmentation de l’expression d’AtSUC1dans les racines pour ce stade de développement. Ces résultats laissent penser que ce gène pourrait participer à l’augmentation de la force de puits dans les racines en augmentant le déchargement du saccharose dans ce compartiment. A partir de l’apparition des fleurs, les quantités d’hexoses mesurées dans les racines deviennent plus faibles que pour les 3 premiers stades de développement. Cela pourrait laisser penser que la force de puits des racines devient moins importante que celle des hampes florales (Davies and Gan 2012). En effet, dès le stade fleurs, la quantité de sucres dosée dans les hampes florales est plus importante que celle des racines. Les feuilles de la rosette restent cependant, à ce stade de développement, l’organe contenant le plus de sucres solubles. Cette accumulation des sucres dans les feuilles entre le stade émergence de la hampe florale et le stade 88 Figure 43: Teneur en amidon dans les racines, pour tous les stades de développement étudiés : stade jeune (J), adulte (A), émergence de la hampe florale (E), fleurs (F), siliques vertes (SV) et au stade graines (G). Le dosage de l’amidon a été réalisé sur les racines de 5 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. Figure 44: Teneur en amidon dans les feuilles, pour tous les stades de développement étudiés : stade jeune (J), adulte (A), émergence de la hampe florale (E), fleurs (F), siliques vertes (SV) et au stade graines (G). Le dosage de l’amidon a été réalisé sur les feuilles de 5 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. RESULTATS ET DISCUSSION fleurs pourrait s’expliquer par une remobilisation importante des molécules carbonées au niveau des feuilles. En effet, chez les espèces ayant une sénescence monocarpique comme A. thaliana , la sénescence des feuilles serait accélérée après la floraison (Guiboileau et al. 2010). Au stade siliques vertes, la quantité de sucres mesurée dans les hampes florales augmente de façon très importante, vraisemblablement aux dépens des feuilles de la rosette, où la quantité de sucres solubles diminue. Il semblerait en effet que les feuilles remobilisent leurs sucres de façon importante pour ce stade de développement, afin de subvenir à la demande des hampes florales. Ce phénomène est encore plus marqué au stade graines, surtout en ce qui concerne le glucose. En effet, la quantité de sucres solubles mesurée dans les feuilles à ce stade de développement est très faible, alors que celle mesurée dans les hampes et les siliques continue d’augmenter, certainement avec l’apport des sucres synthétisés dans les feuilles caulinaires. Cette importante diminution de la quantité de saccharose, glucose et fructose dans les feuilles de la rosette est classique en toute fin de développement chez A. thaliana (Pourtau et al. 2006). Ces sucres sont remobilisés dans les graines où ils vont permettre la synthèse des réserves, essentiellement sous forme de triacylglycerol (Baud et al. 2008). 3.2.7 Etude de la teneur en amidon au cours du développement. Afin de compléter l’étude de l’allocation du carbone dans la plante, les teneurs en amidon ont été mesurées dans les racines, feuilles, hampes florales et siliques. La Figure 43 présente les teneurs en amidon mesurées dans les racines. Les quantités d’amidon mesurées au stade jeune (0,5 mg.gMS-1) et au stade émergence de la hampe florale (0,2 mg.gMS-1) sont les plus faibles observées dans les racines au cours du développement de la plante. La teneur en amidon est en revanche la plus forte au stade adulte avec 1,5 mg.gMS-1. Pour les stades fleurs et siliques vertes, la quantité d’amidon mesurée est quasiment similaire (0,7 mg.gMS-1) et est légèrement inférieure à celle mesurée dans les racines au stade graines (1,1 mg.gMS-1). Les teneurs en amidon mesurées dans les feuilles sont beaucoup plus élevées que celles observées dans les racines, à tous les stades de développement, sauf au stade graines (1,1 mg.gMS-1 contre 0,5 mg.gMS-1 ; Figure 43 et 44). La quantité d’amidon déterminée reste assez élevée aux stades adulte et émergence de la hampe florale (6,4 mg.gMS-1) puis diminue assez fortement aux stades fleurs et siliques vertes (2 mg.gMS-1 et 1,9 mg.gMS-1). Au stade graine, la teneur en amidon dans les feuilles devient très faible (0,5 mg.gMS-1). 89 Figure 45: Teneur en amidon dans les hampes florales, pour les 3 derniers stades de développement étudiés : stade fleurs (F), siliques vertes (SV) et au stade graines (G). Le dosage de l’amidon a été réalisé sur les hampes florales de 5 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. Figure 46 : Teneur en amidon dans les siliques, pour les 2 derniers stades de développement étudiés : stade siliques vertes (SV) et au stade graines (G). Le dosage de l’amidon a été réalisé sur les siliques de 5 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. RESULTATS ET DISCUSSION La Figure 45 montre les teneurs en amidon mesurées dans les hampes florales des plantes au stade fleurs, siliques vertes et graines. Au stade fleurs, la quantité d’amidon retrouvée dans ce compartiment est sensiblement égale à celle retrouvée dans les feuilles, pour le même stade de développement (2,4 mg.gMS-1). Cette quantité d’amidon va ensuite augmenter de façon assez importante dans les hampes florales pour le stade siliques vertes (8,9 mg.gMS-1) puis revenir à des valeurs plus faibles dans les plantes au stade graines matures (4 mg.gMS-1 ; Figure 45). L’amidon a aussi été dosé dans les siliques pour les deux derniers stades de développement étudiés. La teneur en amidon mesuré est de 2,2 mg.gMS-1 au stade siliques vertes et va ensuite doubler dans les siliques des plantes au stade graines (4,2 mg.gMS-1 ; Figure 46). 3.2.7.1 Discussion Le dosage de l’amidon dans les différents organes d’A. thaliana a permis de suivre la répartition de l’amidon au sein de la plante au cours de son développement. Dans notre expérimentation, les quantités d’amidon mesurées dans les racines d’A. thaliana sont faibles par rapport à celles mesurées dans les autres organes, et ce pour chaque stade de développement étudié. Ceci s’explique dans la mesure où la racine d’A. thaliana n’est pas un organe de réserve. Des études réalisées par Tsai et collaborateurs (2009) montrent que l’accumulation d’amidon dans les racines d’A. thaliana est limitée exclusivement aux cellules de la coiffe racinaire et plus précisément aux cellules de la columelle. L’amidon y est synthétisé dans les amyloplastes et est surtout impliqué dans la croissance géotropique et hydrotropique des racines (Ponce et al. 2008). La présence d’amidon à tous les stades de développement suggère que, dans notre système de culture, la croissance des racines est possible tout au long du développement de la plante. Dans les feuilles les quantités d’amidon mesurées sont plus importantes que dans les racines. Les résultats indiquent que les quantités les plus importantes (entre 6,4 et 9,3 mg.gMS1 ) sont dosées pour les 3 premiers stades de développement (stade jeune, adulte et émergence de la hampe florale J53), alors que les quantités les plus faibles (entre 0,5 et 2 mg.gMS-1) sont retrouvées pour les derniers stades de développement étudiées (stade fleurs, J67, stade siliques vertes, J95, et le stade graines, J114). Les quantités d’amidon retrouvées dans notre expérimentation semblent assez équivalentes à celles mesurées lors des travaux de Smith et Zeeman (2006), pour lesquels la teneur en amidon des feuilles d’A. thaliana est comprise 9,5 et 28,5 mg.gMS-1. 90 RESULTATS ET DISCUSSION Cependant nos travaux montrent que dans les feuilles, la teneur en amidon est beaucoup plus variable au cours du développement de la plante. En effet, au début du développement des plantes, une grande quantité d’amidon est accumulée dans les feuilles d’A. thaliana . Dès l’apparition des hampes florales, la quantité d’amidon diminue fortement dans les feuilles. Cette forte dégradation de l’amidon au stade fleurs est à mettre en parallèle de la forte accumulation de sucres solubles observée dans les feuilles pour ce stade de développement. Cette dégradation importante de l’amidon est certainement à l’origine de l’augmentation de la quantité de sucres solubles observée et témoigne de la remobilisation importante des réserves carbonées de la feuille pour la croissance et le développement des organes floraux (hampes florales, fleurs) (Wingler et al. 2006a). Au dernier stade de développement étudié, le stade graines, quasiment la totalité de l’amidon des feuilles a été dégradée ce qui indique que la remobilisation de l’amidon des feuilles continue au stade siliques vertes puis au stade graines, pour lequel une très faible quantité d’amidon a été mesurée. Le dosage de l’amidon dans les hampes florales a été réalisé pour les 3 derniers stades de développement étudiées (stade fleurs, J67, stade siliques vertes, J95, et stade graines, J114). Les données obtenues pour les hampes florales indiquent que l’amidon mesuré dans les hampes florales est assez faible au stade fleurs (2,4 mg.gMS-1), augmente fortement au stade siliques vertes (8,9 mg.gMS-1), puis diminue ensuite au stade graines (4 mg.gMS-1). L’amidon retrouvé provient vraisemblablement en majorité des feuilles caulinaires présentes sur les hampes florales. Ces feuilles vont se mettre en place au stade fleurs et sont matures au stade siliques vertes. La forte quantité d’amidon mesurée pour le stade siliques vertes correspondrait à un pic d’accumulation d’amidon dans les feuilles caulinaires. Au stade graines, l’amidon contenu dans les hampes florales diminue et semble donc remobilisé pour la croissance et le développement des siliques et des graines. Cette remobilisation des molécules carbonées au niveau des hampes florales semble se rapprocher de ce qui est observé pour l’azote chez A. thaliana . En effet, les études menées par Diaz et collaborateurs (2008) ont mis en évidence dans un premier temps une accumulation de l’azote dans les hampes florales et les feuilles caulinaires d’A. thaliana avant que cet azote ne soit stocké dans les graines. De la même façon, la remobilisation importante de l’amidon au stade graines pourrait expliquer l’importante accumulation de sucres solubles mesurée dans les hampes florales pour ce stade de développement. Cette accumulation puis remobilisation des ressources carbonées dans les hampes florales, pendant la phase de reproduction d’A. thaliana , a aussi été mise en évidence dans les travaux réalisés par Christophe et collaborateurs (2008). 91 RESULTATS ET DISCUSSION Le dosage de l’amidon dans les siliques a été réalisé pour les 2 derniers stades de développement étudiées (stade siliques vertes, J95, et stade graines, J114). La présence d’amidon dans les siliques d’A. thaliana a été détectée aussi bien au stade siliques vertes qu’au stade graines. Les quantités d’amidon mesurées sont d’ailleurs assez élevées par rapport à ce qui est classiquement observé dans les graines d’A. thaliana . Focks et Benning (1998) montrent par exemple, que la quantité d’amidon par graine serait d’environ 1 µg, 4 jours après floraison, et que cet amidon disparait en fin de maturation des graines. Dans notre étude, les dosages des sucres et de l’amidon ont été réalisés dans l’ensemble siliques + graines. Aussi, il est possible de penser que les fortes quantités d’amidon retrouvées proviennent de la silique elle-même. Par ailleurs, la quantité d’amidon semble même augmenter dans les siliques entre ces deux stades de développement (de 2,2 à 4,2 mg.gMS-1). Ce résultat est assez étonnant puisque les graines d’A. thaliana n’accumulent normalement l’amidon qu’au début de la maturation de ces dernières, avant d’être dégradé pour permettre la synthèse de triacylglycérols, principale réserve de la graine (Hills 2004). Il semblerait tout de même que lorsqu’une quantité importante de sucres solubles est présente dans les graines d’A. thaliana , l’excédent des sucres ne pouvant pas être synthétisés en triacylglycerols est stocké dans la graine sous forme d’amidon (Focks and Benning 1998). 3.2.8 Etude du flux de saccharose radiomarqué : Afin d’étudier le flux de saccharose entre les différents organes des plantes d’A. thaliana , le transport du [U-14C]-saccharose a été suivi aux différents stades de développement étudiés. Pour ce faire, une goutte de [U-14C]-saccharose est déposée sur une feuille mature d’A. thaliana préalablement abrasée. La répartition de la radioactivité dans la plante est étudiée après 5h de transport. Dans un premier temps, la répartition de la radioactivité dans les différents organes de la plante est visualisée après exposition sur un écran de PhosphorImager. La radioactivité est ensuite quantifiée, après digestion des tissus, par comptage en scintillation liquide. Les racines ont été récoltées en deux parties : les racines proprement dites et la portion des racines incluant le collet qui se trouve dans le portegraine. C’est cette partie qui est dénommée collet dans la suite des analyses. 92 Figure 47 : Photographies et autoradiographies de plantes après transport de [U-14C]saccharose pendant 5h, pour chaque stade de développement étudié : jeune, adulte, émergence de la hampe florale, fleurs, siliques vertes et graines. C : Collet ; FD : Feuille donneuse ; FM : Feuille marquée ; HF : Hampe florale ; M : Méristème de l’inflorescence ; Ra : Racines ; Ro : Rosette. Les flèches rouges montrent l’emplacement de la feuille donneuse. RESULTATS ET DISCUSSION 3.2.8.1 Etude qualitative du transport de [U-14C]-saccharose . Les autoradiographies des plantes à chaque stade de développement sont représentées Figure 47, en parallèle des photographies des plantes. A chaque stade de développement une grande partie de la radioactivité détectée reste dans la feuille où la goutte de [U-14C]-saccharose a été déposée (feuille donneuse). Les résultats montrent qu’au stade jeune (Figure 47), le 14 C a été transporté de la feuille donneuse vers les racines et vers la rosette, principalement dans une seule feuille puits. Il faut noter qu’il s’agit de la feuille en développement située directement au-dessus de la feuille donneuse, donc sur la même orthostichie. Le même profil de marquage au niveau des racines est retrouvé au stade émergence de la hampe florale. La présence de 14 C est aussi faiblement détectée dans le méristème de l’inflorescence (M en Figure 47). A partir du stade fleurs, la radioactivité révélée devient plus diffuse dans la plante et difficilement visualisable, en raison de la grande quantité de feuilles sur la rosette et sur la hampe florale. En effet, la quantité de [U-14C]-saccharose déposée sur les plantes étant la même pour chaque stade de développement, le 14 C transporté est réparti sur une surface plus grande, diminuant ainsi le radiomarquage final. Les résultats semblent tout de même montrer qu’une quantité de carbone radioactif non négligeable a été transportée dans les racines pour les 3 derniers stades de développement étudiés (fleurs, siliques vertes, graines). Le radiomarquage est en revanche toujours observé au niveau de la rosette, sur les feuilles adjacentes à la feuille donneuse. Un radiomarquage est aussi observé au niveau des hampes florales pour les 3 derniers stades de développement. De façon remarquable, seules quelques hampes florales sont radiomarquées. 3.2.8.2 Etude quantitative du transport de [U-14C]-saccharose Afin de déterminer la quantité réelle de 14C retrouvé dans les différents organes de la plante, le comptage de la radioactivité présente dans les différents organes des plantes pour chaque stade de développement a été effectué. La Figure 48 représente le pourcentage de radioactivité retrouvée dans chaque compartiment étudié (racine, feuilles, hampes florales et milieu nutritif). L’avantage du système de culture en hydroponie est de pouvoir analyser également le milieu entourant les racines et ainsi d’évaluer d’éventuels échanges entre les racines et ce milieu. La radioactivité mesurée dans la feuille donneuse n’a pas été prise en compte dans le calcul des pourcentages afin de n’étudier que la répartition du 14C transporté. 93 Figure 48 : Pourcentage de carbone radiomarqué transporté, mesuré dans les racines, les feuilles, les hampes florales et le milieu extérieur. Les pourcentages pour chaque organe sont calculés à partir de la radioactivité moyenne mesurée sur 3 plantes. La radioactivité mesurée dans la feuille donneuse est en revanche retirée des calculs pour ne prendre en compte que la radioactivité transportée. RESULTATS ET DISCUSSION Au stade jeune, 61% de la radioactivité transportée est retrouvée dans les feuilles, 19 % dans les racines et 20% dans le milieu de culture. Au stade adulte, la quantité de radioactivité mesurée dans les racines (32%) augmente par rapport au stade jeune, au détriment de la quantité trouvée dans les feuilles (45%). La quantité de radioactivité relarguée dans le milieu nutritif reste similaire à ce qui a été mesuré au stade jeune (23%). Au stade émergence de la hampe florale, quasiment 1% de la radioactivité mesurée est détectée dans la hampe florale en émergence. Le reste de la radioactivité est majoritairement retrouvée dans les feuilles et les racines (respectivement, 57% et 38%) et de façon moins importante dans le milieu nutritif (4%). Pour le stade fleurs, le maximum de radioactivité transportée est retrouvé dans les feuilles (69%). La hampe florale est le second compartiment où le carbone radiomarqué est retrouvé (22%), alors que seulement 9% de la radioactivité est mesurée dans les racines. Chez les plantes au stade siliques vertes, la rosette est toujours le compartiment accumulant le plus de radioactivité (41%), suivi par les hampes florales (30%) et les racines (28%). Très peu de radioactivité est mesurée dans le milieu nutritif (1%). Pour le dernier stade de développement étudié (stade graines), la radioactivité mesurée dans les rosettes reste la plus importante (68%). Le pourcentage de carbone radiomarqué dans les racines et dans les hampes florales est, quant à lui, assez proche (respectivement 14% et 18%). Pour ce stade de développement également la radioactivité mesurée dans le milieu nutritif est très faible. 3.2.8.3 Discussion L’étude qualitative du transport de [U-14C]-saccharose dans les différents organes d’A. thaliana a montré que pour tous stades étudiés, le 14 C a été transporté de la feuille donneuse vers les racines, et vers une seule feuille puits de la rosette. Cette feuille correspond à la feuille puits localisée directement au-dessus de la feuille donneuse. Une telle répartition selon l’orthostichie a été retrouvée chez A. thaliana par Kiefer et Slusarenko (2003). A partir du stade fleurs (J67), la radioactivité utilisée (même quantité pour chacun des stades) devient plus diffuse dans la plante du fait de la taille plus importante des plantes. Cependant un marquage dans les racines est toujours visible pour les 3 derniers stades de développement étudiés (stade fleurs, J67, stade siliques vertes, J95, et stade graine, J114). Ces résultats corroborent ceux de Robinson et Hill (1999) qui, par le biais d’un suivi du 14C dans la plante après assimilation de CO2, ont montré que radiomarquage dans les racines d’A. thaliana diminuait mais restait 14 mesurable lors de la phase de reproduction de la plante. De plus, les autoradiographies indiquent, de façon inattendue, que la radioactivité n’est détectée que sur quelques hampes 94 RESULTATS ET DISCUSSION florales et non sur l’ensemble de l’inflorescence. Ce résultat suggère que la feuille donneuse alimente préférentiellement certaines parties de l’inflorescence de la plante. L’étude quantitative du transport de [U-14C]-saccharose dans les différents organes d’A. thaliana a été réalisée. La quantité de radioactivité comptée a été exprimée en pourcentage de radioactivité mesurée dans les racines, les feuilles, les hampes florales ainsi que le milieu nutritif. Les résultats montrent que le 14 C est majoritairement présent dans les feuilles et les racines et ce, pour chacun des stades de développement étudiés. Les quantités mesurées dans les hampes florales peuvent sembler assez faibles a priori. Une des explications possibles est le temps de transport choisi (5h). En effet ce temps de transport avait été déterminé au préalable sur des plantes au stade adulte afin d’obtenir une quantité de radioactivité suffisante pour être facilement détectable dans les jeunes feuilles puits et les racines. Toutefois, cette durée de transport n’est peut-être pas suffisante pour permettre un transport important vers des organes plus distants de la feuille tels que la hampe florale. De plus, au cours des 3 premiers stades (stade jeune, J20, stade adulte, J40, et stade émergence de la hampe florale, J53), un pourcentage important de radioactivité est mesuré dans le milieu extérieur. Le relargage de molécules carbonées (saccharose ou autre) dans le milieu extérieur est un phénomène bien connu nommé rhizodéposition (Nguyen 2003). Il permettrait d’attirer les micro-organismes du sol autour des racines, micro-organismes qui en contrepartie faciliteraient l’absorption des ions par les racines. Il faut rappeler qu’A. thaliana , comme les autres Brassicacées, n’établit pas de mycorhizes. Ce relargage du carbone devient ensuite très faible à partir de l’apparition de la hampe florale (stades fleurs, siliques vertes et graines). Nos résultats montrent quelques variations de la répartition de la radioactivité entre les organes pour certains stades de développement. En effet, au stade fleurs, il semblerait qu’une grosse partie de la radioactivité soit transportée dans les hampes florales aux dépens des racines. La mise en place de la hampe florale marque chez A. thaliana un changement de l’allocation des ressources des parties végétatives de la plante aux parties reproductivesensel et al. 1994). Au stade siliques et graines, les résultats montrent que le [U-14C]-saccharose est transporté de la même façon dans les racines et les inflorescences des plantes. Ce résultat pourrait laisser penser que le transport de saccharose des feuilles vers les racines est maintenu lors des derniers stades de développement de la plante (siliques vertes et graines), au moins pendant les 5 h de transport de l’expérience. Il convient toutefois d’être prudent dans les interprétations dans la mesure où de nombreux paramètres, tels que l’âge de la feuille donneuse et son état physiologique, sa position sur la rosette, peuvent influer sur les résultats 95 RESULTATS ET DISCUSSION mesurés. Malgré les précautions prises pour choisir des feuilles donneuses, aussi semblables que possible, certains paramètres ne peuvent être contrôlés, notamment aux derniers stades de développement. 3.2.9 Bilan L’ensemble des résultats obtenu sur le transport des sucres, le dosage des sucres et de l’amidon et le flux de [U-14C]-saccharose dans la plante ont permis de distinguer deux phases distinctes caractérisant le développement des plantes d’A. thaliana : la phase de croissance végétative et la phase de reproduction (Hensel et al. 2003). Au cours de la croissance végétative, les feuilles de la rosette vont se développer et accumuler des réserves d’amidon, tout en exportant du saccharose dans les racines. En effet, l’analyse du flux de [U-14C]saccharose montre un transport notable du 14C des feuilles vers le compartiment racinaire au cours de ces deux stades de développement. Ce transport à longue distance est possible grâce au chargement continu du phloème en saccharose, faisant majoritairement intervenir le transporteur de saccharose AtSUC2 (Srivastava et al. 2008). Au niveau des racines, en plus du déchargement symplastique du saccharose au niveau des pointes racinaires (Oparka 1990), les transporteurs de sucre AtSUC2, AtSUC1 et AtPLT5 peuvent permettre un déchargement apoplastique, au niveau des pointes racinaires et des zones d’émergences des racines latérales (Sivitz et al, 2008 ; Reinders et al, 2005). Le suivi du transport de [U-14C]-saccharose a aussi permis de montrer un relargage assez important du 14 C dans le milieu de culture aux stades jeune et adulte. Dès l’apparition du méristème de l’inflorescence, il semblerait que l’allocation des ressources carbonées soit modifiée. En effet, la teneur en sucres solubles des feuilles diminue légèrement (Figure 40) et le relargage du 14C dans le milieu extérieur semble moins important. L’apparition de ce nouvel organe marque l’entrée d’A. thaliana dans la phase reproductive de son développement. Le développement des hampes florales va ainsi bouleverser les rapports sources/puits de la plante (Hensel et al. 1994). En effet, une compétition pour le carbone va s’installer entre les racines et les organes floraux (hampes florales, fleurs, siliques et graines). Ainsi au stade fleurs, le transport de saccharose provenant des feuilles vers les racines est fortement ralenti, diminuant ainsi la teneur en sucres solubles de ce compartiment au profit des hampes florales (Figure 39). Au niveau des feuilles, une forte teneur en sucres a pu être mesurée 96 RESULTATS ET DISCUSSION au moment de la mise en place des fleurs (Figure 40). A ce stade de développement, la demande en sucres des organes floraux est telle que les feuilles commencent à remobiliser les ressources carbonées des cellules de façon importante (Guiboileau et al. 2010). Les feuilles caulinaires de la hampe florale contribuent aussi à fournir les sucres solubles nécessaires au développement des organes floraux, en produisant des sucres via la photosynthèse (Earley et al. 2009). L’expression quasiment constante du transporteur de saccharose AtSUC2 mesurée dans notre expérimentation pour ce compartiment sous-entend l’export, via le phloème, du saccharose produit dans ces feuilles. Aux derniers stades de développement étudiés (siliques vertes et graines), les feuilles de la rosette sont en fin de sénescence. La majorité des ressources carbonées (sucres solubles et amidon) sont remobilisées (Wingler et al. 2004). La récupération des hexoses dans les zones de sénescence fait intervenir des transporteurs de sucre comme AtSTP13 mais aussi probablement AtSTP14 et AtPLT5 (Norholm et al. 2006 ; Reinders et al. 2005 ; Poschet et al. 2010). Ces sucres pourraient être transportés sous forme de saccharose, via le phloème, vers les inflorescences, mais aussi les racines. Il est possible d’imaginer que le transport de saccharose dans les racines permet de maintenir un métabolisme suffisant dans ce compartiment, afin de permettre l’absorption de l’eau et des sels minéraux. Ce transport pourrait faire intervenir les transporteurs AtSUC1 et AtPLT5, dont l’expression dans les racines s’est révélée assez forte pour ces stades de développement et dont l’implication dans le déchargement au niveau des organes puits a été suggéré dans plusieurs études (Sivitz et al, 2008 ; Reinders et al, 2005). Au niveau des inflorescences, il semblerait que les besoins en ressources carbonées soient complétés par la remobilisation des ressources des feuilles caulinaires. En effet, les résultats ont montré qu’une grosse partie de l’amidon qui avait jusque-là été stocké (stade fleurs et siliques vertes) est dégradé au stade graines, pour leur remplissage (Baud et al. 2008). 97 Figure 49 : Etude de l’expression par macroarray de gènes de transporteurs de sucre dans les racines (A) et les feuilles (B) d’Arabidopsis thaliana cultivées en hydroponie tout au long d’un cycle de 24h. Pour chaque gène, l’expression dans les racines et les feuilles de 10 plantes prélevées pour chaque heures de récolte est normalisée par la moyenne d’expression des gènes de ménage Ef1α, Actine2 et HistoneH4. Les zones grisées sur le graphique représentent les périodes de nuit (19h à 9h) et les zones non grisées la photopériode (9h – 19h). RESULTATS ET DISCUSSION 3.3 Etude de quelques paramètres liés au métabolisme et au transport du carbone au cours d’une période de 24h. L’étude des gènes de transporteurs de sucre dans les différents organes de la plante au cours de son développement a permis d’effectuer une première cartographie de l’expression de ces gènes. Cependant, certains gènes de transporteurs de sucre, pourtant décrits comme étant exprimés chez A. thaliana n’ont pas été détectés. Dans notre étude précédente, l’expression des gènes a été étudiée à 13h, soit 4h après le début de la photopériode ce qui pourrait ne pas correspondre au pic d’expression de certains gènes. Afin de compléter cette étude, l’expression de ces gènes a été étudiée par macroarray dans les racines et les feuilles de plantes âgées de 20 jours (stade jeune) récoltées à 9h (dès l’allumage de l’éclairage), 13h, 17h, 21h (2h après l’arrêt de l’éclairage), 1h et 5h. Les récoltes nocturnes ont été effectuées à l’aide d’un éclairage vert (Active LED verte, HYDROZONE). En effet, les études réalisés par Kircher et collaborateurs (1999) ont montré que cet éclairage permet de ne pas perturber le métabolisme nocturne des plantes. Parallèlement à l’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre, le dosage du saccharose, glucose et fructose ainsi que le dosage de l’amidon ont été effectués. 3.3.1 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre par macroarray Les résultats d’expression des gènes dans le compartiment racinaire sont représentés sur la Figure 49A. Ils mettent en évidence que 5 gènes de transporteurs de sucre sont principalement exprimés dans les racines au cours de la journée et de la nuit, les gènes AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5, AtPLT5 et AtPLT6. Ces 5 gènes sont les mêmes que ceux retrouvés exprimés dans les racines des plantes au stade jeune et l’expression d’aucun nouveau gène de transporteurs de sucre n’a pu être détectée dans les conditions utilisées. Le gène le plus exprimé dans les racines, quel que soit le moment de la journée, est AtSUC1. Ce gène est aussi celui montrant la plus grande variation d’expression au cours du cycle de 24h. En effet, son expression est maximum à 13h et minimum à 17h. Pendant la nuit en revanche, l’expression de ce gène semble assez stable et importante. En ce qui concerne les 4 autres gènes, leur variation d’expression semble assez similaire au cours du cycle de 24h. En effet, ces gènes, assez faiblement exprimés dans les racines, montrent tous un pic d’expression en milieu de journée (13h) et en début de nuit (21h). Parmi ces 4 gènes, seule l’expression du gène AtPLT5 a été détectée pour chaque point de récolte. Pour AtSUC2, AtPLT6 et AtSUC5, une expression faible voire nulle est détectée en dehors des deux pics d’expression à 13h et 21h. 98 RESULTATS ET DISCUSSION Dans les feuilles, les gènes AtSUC1, AtSUC2, AtPLT5, AtSTP3 et AtSTP13 ont été détectés au cours d’un cycle de 24h (Figure 49B). Ces résultats d’expression corroborent ceux obtenus sur les feuilles des plantes récoltées au stade jeune. Comme ce qui a été observé dans les racines, aucun nouveaux gènes n’a été détecté. Les gènes AtSUC1 et AtSUC2 s’expriment aussi bien dans les feuilles que dans les racines. Cependant, dans les feuilles, le gène AtSUC2 est plus exprimé que le gène AtSUC1. Le transporteur de sucre AtSUC2 joue un rôle important dans les feuilles d’A. thaliana , puisqu’il est impliqué dans le chargement du phloème au niveau des fines nervures. L’expression d’AtSUC2 est maximum en début de journée (9h), diminue régulièrement pendant la journée (13h et 17h), pour ré-augmenter pendant la nuit (à partir de 21h). Le gène AtSUC1, quant à lui, voit un pic d’expression au milieu de la nuit (1h). Son expression semble ensuite diminuer pendant le reste de la nuit et de la journée, pour à nouveau atteindre un niveau d’expression assez élevé en début de nuit (21h). Les gènes AtSTP3, AtSTP13 et AtPLT5, transportant des hexoses, sont assez peu exprimés dans les feuilles. L’expression du gène AtSTP13 n’est d’ailleurs mesurée qu’en fin de journée (17h). L’étude de l’expression d’AtSTP3 au cours d’un cycle de 24h montre que ce gène semble plus exprimé au cours de la nuit, dans les feuilles d’A. thaliana . En effet, son expression est assez forte en début et milieu de nuit (21h et 1h), mais n’est pas détectée en fin de nuit (5h). Au cours de la journée, ce gène ne semble que légèrement exprimé en début (9h) et fin de journée (17h). Le gène AtPLT5 montre un profil d’expression assez similaire. En effet, les résultats montrent aussi un maximum d’expression pour ce gène en début et milieu de nuit (21h et 1h), puis son extinction en fin de nuit (5h). Pendant la journée (de 9h à 17h), l’expression du gène AtPLT5 semble cependant assez constante (Figure 49B). 99 Figure 50 : Teneur en saccharose (A), glucose (B) et fructose (C) dans les racines et les feuilles de plantes cultivées en hydroponie, tout au long d’un cycle de 24h. Le dosage des sucres a été réalisé sur 10 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. Les zones grisées sur le graphique représentent les périodes de nuit (19h à 9h) et les zones non grisées la photopériode (9h – 19h). Les valeurs notés ND présentent les points où les quantités de sucres n’ont pas pu être déterminés, étant inférieurs au seuil de détection de l’HPLC (300 nmol.L-1). RESULTATS ET DISCUSSION 3.3.2 Etude du contenu en sucre solubles (saccharose, glucose, fructose) Parallèlement à l’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre, les teneurs en saccharose, glucose et fructose d’A. thaliana ont été mesurées sur toute une journée et une nuit de culture, dans les racines et les feuilles de plantes cultivées en hydroponie. Les résultats présentés Figure 50 montrent que les variations dans les quantités de ces 3 sucres sont assez importantes dans les racines, sur toute la période étudiée. Au moment de l’allumage des lampes à 9h, les teneurs en saccharose, glucose et fructose sont respectivement de 3,2, 10 et 7,4 µmol.gMS-1. Une légère diminution dans la quantité de ces 3 sucres est observée au milieu de la journée (13h), puis la teneur en saccharose, glucose et fructose augmente jusqu’à 21h (2h après extinction des lampes). Au milieu et à la fin de la nuit (1h et 5h), les quantités de saccharose et glucose sont trop faibles pour être détectées, contrairement au fructose dont 7 et 8,3 µmol.gMS-1 sont mesurées dans les racines des plantes récoltées respectivement à 1h et 5h. Les résultats de dosage de saccharose, glucose et fructose dans les feuilles semblent montrer moins de variation que dans les racines tout au long du cycle de 24h. Les teneurs en saccharose sont par exemple assez stables au cours la journée et de la nuit (le maximum mesuré est de 3,9 µmol.gMS-1 à 5h et le minimum de 2,2 µmol.gMS-1 à 17h ; Figure 50A). Il est cependant à noter une légère diminution de la quantité en hexoses (glucose et fructose) en milieu et fin de journée (de 13h à 21h ; Figure 50B et C). 100 Figure 51 : Teneur en amidon dans les racines (A) et les feuilles (B) des plantes cultivées en hydroponie, tout au long du cycle de 24h. Le dosage des sucres a été réalisé sur 10 plantes mélangées pour chaque point de récolte. Les zones grisées sur le graphique représentent les périodes de nuit (19h à 9h) et les zones non grisées la photopériode (9h – 19h). RESULTATS ET DISCUSSION 3.3.3 Etude de la teneur en amidon Afin de compléter l’étude de l’allocation des ressources carbonées dans les plantes d’A. thaliana au cours d’une journée, le dosage de l’amidon a été effectué dans les racines et les feuilles des mêmes plantes ayant permis le dosage des sucres solubles. Les résultats présentés Figure 51 montrent dans un premier temps que les quantités d’amidon mesurées dans les racines sont très faibles, comparées à celle retrouvées dans les feuilles. Peu de variations dans la quantité d’amidon sont d’ailleurs observées au cours de la journée et de la nuit dans les racines (Figure 51A). Dans les feuilles, la quantité d’amidon est très faible en début de journée (0,8 mg.gMS-1 à 9h), augmente très rapidement, pour atteindre de fortes teneurs en milieu de journée (9,5 mg.gMS-1 à 13h et 10,8 mg.gMS-1 à 17h), puis diminue progressivement jusqu’à retrouver des teneurs très faible en fin de nuit (1,4 mg.gMS-1 à 5h). 3.3.4 Discussion L’étude de l’expression des transporteurs de sucre dans les racines et dans les feuilles de plantes (stade jeune, J20) a été réalisée au cours d’une journée (récolte à 9h, 13h, 17h, 21h, 1h et 5h). Au niveau des racines, 5 gènes de transporteurs de sucre sont principalement exprimés : AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5, AtPLT5 et AtPLT6 et correspondent aux gènes identifiées au cours de l’expérimentation « développement » pour le même stade de développement (stade jeune, J20). Le gène AtSUC1 est le gène le plus fortement exprimé alors que les 4 autres (AtSUC2, AtSUC5, AtPLT5 et AtPLT6) présentent une expression plus modérée. Les résultats semblent montrer que l’expression de ces gènes varie peu au cours du cycle de 24h. Il faut remarquer un pic d’expression pour tous les gènes identifiés à 13h (milieu de journée). Ce pic d’expression pourrait correspondre à une augmentation importante de la croissance des racines, mise en évidence 3h après le début de la photopériode sur des racines de plante d’ A. thaliana (écotype Col-0) cultivées en boite de Pétri (Yazdanbakhsh and Fisahn 2011). Cette augmentation de la croissance racinaire repose sur l’apport en sucres depuis les parties aériennes, ce qui correspond donc à une augmentation de la force puits des racines. L’augmentation de l’expression du gène AtSUC1, potentiellement impliqué dans le déchargement du phloème, pourrait donc participer à l’augmentation de la force puits des racines à cette heure de la journée. A un niveau moindre, AtSUC2, avec un profil d’expression assez similaire, pourrait avoir le même rôle. 101 RESULTATS ET DISCUSSION Dans les feuilles, nos résultats indiquent que les gènes AtSUC1, AtSUC2, AtPLT5, AtSTP3 et AtSTP13 s’expriment au cours de 24h, et ces gènes correspondent aussi aux gènes identifiés au cours de l’expérimentation « développement », pour le même stade de développement (stade jeune, J20). Nos résultats montrent que l’expression d’AtSUC2 diminue au cours de la journée (entre 9h et 17h), et ré-augmente la nuit (à partir de 21h), pour atteindre son maximum en début de journée (9h). Le gène AtSUC1 présente un maximum d’expression au milieu de la nuit (1h) puis son expression diminue au cours du reste de la nuit et de la journée, et ré-augmente en début de nuit (21h). Concernent les transporteurs de monosaccharides (AtPLT5, AtSTP3 et AtSTP13), notre étude montre que leur expression est faible dans les feuilles. L’expression du gène AtSTP13 n’est détectable qu’en fin de journée (17h). Ce résultat est en accord avec une expression très spécialisé des gènes de transporteurs d’hexose dans les feuilles, qui permettraient une récupération des hexoses sortis du cytoplasme de façon passive (Buttner et al. 2000) ou bien provenant de cellules endommagées (Klepek et al. 2005 ; Norholm et al. 2006). L’expression des gènes AtSTP3 et AtPLT5 est assez importante au cours de la nuit (entre 21h et 1h). De manière générale, les résultats suggèrent que les gènes de transporteurs de sucre identifiés dans les feuilles sont moins exprimés le jour que la nuit. En ce qui concerne les transporteurs d’hexose, ce résultat semble confirmer les résultats d’expression mesuré pour le gène AtSTP1 dans les travaux de Stadler et collaborateurs (2003). En effet, dans leur étude, les auteurs montrent que ce gène de transporteur d’hexose est exprimé de façon plus importante au cours de la nuit. Ils supposent qu’AtSTP1 aurait un rôle à jouer dans la récupération des hexoses relargués dans l’apoplaste pendant la dégradation de l’amidon. Ainsi, il est possible d’imaginer que les transporteurs AtSTP3, AtPLT5 et AtSTP13, connus pour transporter des hexoses, jouent le même rôle qu’AtSTP1 au cours de la nuit. L’expression préférentielle des gènes de transporteurs de saccharose au cours de la nuit dans les feuilles d’A. thaliana pourrait sembler paradoxale. Pourtant, des travaux réalisés par Kuhn et collaborateurs (1997) ont montré que StSUT1, l’homologue fonctionnel du gène AtSUC2 chez la tomate ou la pomme de terre, deux solanacées, ne voit son expression diminuer qu’après une période d’obscurité longue (15h). La protéine correspondante est même présente sur des durées encore plus longues. Il faut donc garder à l’esprit qu’il peut y avoir un décalage entre l’expression d’un gène, et la quantité de protéine correspondante et l’activité de celle-ci. Des études réalisées sur une autre solanacée, le tabac, ont montré que le maximum de croissance 102 RESULTATS ET DISCUSSION des feuilles est mesuré au début de la nuit, supposant un besoin important des feuilles en molécules carbonées pendant cette période (Walter and Schurr 2005). Ainsi, il est possible d’imaginer que les sucres présents dans les feuilles seront préférentiellement utilisés pour la croissance plutôt que transportés vers les organes puits. Chez A. thaliana , un profil différent de croissance est observé. En effet, les études réalisées par Ruts et collaborateurs (2012) ont montré que la croissance des feuilles est plus importante au cours de la journée qu’au cours de la nuit. Les besoins en sucres dans les feuilles seraient donc plus importants au cours de la journée qu’au cours de la nuit. Ce résultat laisse penser que le transport des sucres des feuilles vers les organes puits serait ralenti au cours de la journée, expliquant l’expression moins importante des gènes de transporteurs de sucre pendant la photopériode. Les résultats des dosages des sucres solubles montrent que dans les racines les valeurs obtenues varient au cours du cycle de 24h. Au cours de la période allant de 9h à 21h, les profils des quantités de saccharose, glucose et fructose sont similaires, avec une chute des quantités à 13h et un pic à 21h. Pour la période qui suit, les quantités de saccharose et glucose sont trop faibles pour être détectées, contrairement au fructose qui présente une quantité constante au 2 dernières heures de mesure 1h et 5h. Les sucres solubles mesurés dans les racines sont essentiellement utilisés comme ressources carbonées pour la croissance et le développement de l’organe. Les résultats montrent une teneur plus importante de ces sucres au cours de la journée par rapport à la nuit. Ces résultats laissent penser que la consommation des sucres est plus importante au cours de la nuit qu’au cours de la journée, traduisant une activité métabolique des racines plus importante au cours de la nuit. Les travaux réalisés par Yazdanbakhsh et Fisahn (2011) montrent en effet une croissance globalement plus rapide des racines au cours de la nuit par rapport à la journée sur des plantes de Col-0 cultivées boite de Pétri. Concernant le dosage des sucres solubles dans les feuilles nos résultats indiquent que les quantités de sucres sont beaucoup plus stables dans cet organe tout au long de la journée. Les teneurs en saccharose varient peu, et sont comprises entre 2,2 et 3,9 µmol.gMS-1. Pour le glucose et le fructose, les quantités mesurées dans les feuilles sont assez stables avec cependant une légère diminution en milieu de journée entre 13h et 17h. Une étude menée par Zeeman et Rees (1999) au cours du cycle de 24h sur l’écotype Col-0 montre un pic dans la teneur en hexose dans les feuilles en début de la journée (3h après le début de la photopériode), avant une diminution progressive pendant le reste de la journée et de la nuit. En ce 103 RESULTATS ET DISCUSSION qui concerne la teneur en saccharose, leur étude montre des quantités stables tout au long du cycle de 24h, sauf en début de nuit, où sa teneur diminue sur une période de 2h, avant de revenir à des valeurs comparables à celles mesurées dans la journée. La diminution progressive des hexoses dans les feuilles au cours de la journée observée dans notre étude laisse penser que les sucres produits sont rapidement utilisés. En effet, Graf et collaborateurs (2010) mettent en évidence l’utilisation rapide des produits de la photosynthèse dans les feuilles d’A. thaliana au cours de la journée. Ils sont directement utilisés pour fournir de l’énergie et permettre la croissance des feuilles, ou bien stockés sous forme d’amidon pour subvenir aux besoins de la plante en carbone pendant la nuit. Les résultats que nous avons obtenus peuvent être comparés à ceux obtenus au cours de l’étude sur le développement. En effet les plantes utilisées pour l’étude sur le rythme circadien étaient au stade jeune et la récolte à 13h est commune aux deux expériences. Dans les racines, les teneurs en hexoses sont plus faibles pour l’étude sur le rythme circadien, mais les teneurs en saccharose sont comparables. Par contre, dans les feuilles, toutes les valeurs obtenues pour l’expérience développement sont largement supérieures à celles présentées dans la Figure 50, principalement à nouveau pour les hexoses. Ces différences entre les expériences seront discutées ultérieurement. Le dosage de l’amidon au cours de 24h montre que dans les racines les valeurs mesurées sont très faibles et varient très peu au cours de la journée (entre 0,1 et 0,7 mg.gMS-1). Ces faibles valeurs sont du même ordre de grandeur que celle mesurées dans les plantes du même âge (0,5 mg.gMS-1), lors de l’étude du développement d’A. thaliana . Pour les feuilles, en revanche, les teneurs en amidon mesurées sont faibles en début de journées et en fin de nuit, puis augmentent de façon considérable entre 13h et 1h, où elles sont comprises de 9 et 10,9 mg.gMS-1. Ce profil dans le contenu en amidon des feuilles est le profil classiquement observé pour l’écotype Col-0 d’A. thaliana . Plusieurs études ont en effet montré l’accumulation progressive d’amidon tout au long de la journée et une dégradation de l’amidon du début et jusqu’à la fin de la nuit (Gibon et al. 2009 ; Zeeman and Rees 1999). Les sucres produits par la dégradation de l’amidon sont ensuite soit directement utilisés pour la respiration, soit exportés sous forme de saccharose, afin d’alimenter les organes puits de la plante et plus particulièrement les racines dont la croissance est globalement stimulée pendant la nuit (Yazdanbakhsh and Fisahn 2011). 104 RESULTATS ET DISCUSSION 3.3.5 Bilan Les résultats de dosage de sucres ont permis de montrer que la teneur en sucres solubles dans les feuilles d’A. thaliana semble diminuer au cours de la photopériode. Parallèlement, le dosage de l’amidon a montré que la quantité d’amidon dosé dans les feuilles augmente tout au long de la journée. Ces résultats suggèrent que les sucres solubles sont préférentiellement utilisés par les feuilles pendant la phase lumineuse. En effet, chez A. thaliana , la photosynthèse va permettre la production d’une forte quantité de sucres dans les feuilles dont la moitié est directement utilisée par la plante (pour la croissance et le développement), et l’autre moitié est stockée sous forme d’amidon (Zeeman and Rees 1999). Pendant la nuit, en revanche, les résultats montrent que la quantité de sucres solubles augmente progressivement, alors que l’amidon présent dans les feuilles est dégradé pour atteindre son minimum en fin de nuit (5h). Cette dégradation de l’amidon explique en partie l’augmentation de la teneur en sucres solubles (Wiese et al. 2007), mais cette accumulation témoignerait aussi d’un ralentissement de la croissance foliaire. En effet, les travaux effectués par Ruts et collaborateurs (2012) ont permis de montrer une croissance des feuilles plus rapide au cours de la journée par rapport à la nuit. Parallèlement à ces résultats, l’étude de l’expression des gènes de transporteurs au cours du cycle de 24h semble montrer une expression du gène de transporteur de saccharose AtSUC2 plus faible dans les feuilles pendant la photopériode. Ce transporteur étant connu pour être impliqué dans le chargement du phloème, il est possible d’imaginer que ce chargement pourrait être moins important au cours de la période lumineuse. Tous ces résultats pourraient laisser penser qu’au cours de la journée, les feuilles vont exporter moins de sucres vers les organes puits qu’au cours de la nuit. Pour des raisons pratiques, la mesure du transport à longue distance du saccharose radiomarqué n’a pas été réalisée. Cette expérience aurait permis de répondre, au moins partiellement à ces questions. Contrairement à ce qui a été mesuré dans les feuilles, le dosage de sucres dans les racines semble montrer une accumulation de sucres solubles pendant la journée et une diminution importante de la teneur en ces sucres au cours de la nuit. Ce phénomène pourrait traduire une utilisation préférentielle des sucres pour la croissance et le développement au cours de la nuit. L’étude menée par Yazdanbakhsh et Fisahn (2011) montre bien une croissance globalement plus importante des racines au cours de la nuit que de la journée. Parallèlement à la diminution des quantités de sucres dans les racines, une expression assez élevée du gène AtSUC2 a été notée dans les feuilles au cours de la nuit. Ces résultats suggèrent qu’au cours de la nuit, le transport des sucres des feuilles vers les racines est élevé et va permettre d’approvisionner ce compartiment en sucres solubles. 105 Figure 52 : Schéma du protocole expérimental d’application du stress utilisé au cours de l’expérimentation « Essai stress Col-0 ». Les 36 plantes de l’écotype Col-0 sont cultivées dans 2 bacs Araponics individuels (bac témoin et bac stressé ; 18 plantes/bac) pendant 28 jours dans le milieu nutritif. Au bout de 28 jours de culture (J28), une première dose de PEG est ajoutée au milieu nutritif du bac réservoir stressé pour atteindre une concentration de 1%. Par la suite 1% de PEG est ajouté au milieu nutritif tous les 2 jours jusqu’à atteindre la dose de 3% à J42. Puis la concentration de PEG a été augmentée de 0,5%, pour atteindre la concentration de 3,5% à J46. Les plantes sont récoltées 5h après l’application de la dose 3,5% RESULTATS ET DISCUSSION 3.4 Mise en place d’un protocole de stress osmotique en hydroponie Dans le but de mimer un stress hydrique en hydroponie, un protocole d’application de stress osmotique par ajout d’un agent osmotique, le polyéthylène glycol (PEG 6000), a été mis en place. Ce système permettra d’étudier la répartition des sucres dans la plante et l’expression des gènes de transporteurs de sucre, notamment dans les racines, au cours d’un tel stress. Les résultats précédents ont montré qu’au cours du développement végétatif (stade jeune et adulte) l’expression des gènes de transporteurs de sucre reste assez constante dans la racine (sous-chapitre 3.2). Il a donc été choisi d’étudier l’impact du stress osmotique sur des plantes au stade adulte. De même, il a été montré que le maximum d’expression des gènes de transporteurs de sucre dans la racine est autour de 13h (sous-chapitre 3.3). Il a donc été décidé d’étudier l’expression de ces gènes à cette heure de la journée. 3.4.1 Mise en place du stress osmotique sur l’écotype Col-0 (« Essai stress Col-0 ») Le premier essai d’application du stress osmotique par ajout de PEG a été réalisé sur l’écotype C24 d’A. thaliana (« Essai stress C24 »). Cette expérimentation devait à l’origine être effectuée sur l’écotype Col-0. Cependant, suite à une erreur dans l’annotation des tubes stock de graines, c’est l’écotype C24 qui a été semé lors de cet essai. Les résultats de cette étude sont présentés dans l’Annexe 1. Cette expérimentation avait pour but de déterminer le pas d’augmentation de la concentration en PEG dans le milieu de culture, ainsi que la dose maximum de PEG que les plantes peuvent tolérer. Au cours de ce premier essai sur l’écotype C24, la concentration en PEG a été ajoutée de 0,5% en 0,5% dans le milieu de culture à partir de J 28. Le suivi du phénotype des plantes a permis d’observer les premiers symptômes de stress osmotique (flétrissement des feuilles) à partir de 5% de PEG dans le milieu de culture (J 46). La dose de 6% (J53) de PEG a, quant à elle, entrainé une mort assez rapide des plantes de l’écotype C24 d’A. thaliana . Suite à la mise en évidence de l’erreur d’écotype, il nous a fallu refaire un essai de mis en place du stress osmotique sur l’écotype Col-0. La première expérimentation réalisée sur C24 a servi de base pour la mise en place du protocole d’application du stress sur Col-0 (« Essai stress Col-0 » ; Figure 52). En effet, l’essai du stress osmotique sur C24 a permis de mettre en évidence que, les premiers symptômes du stress (flétrissement des feuilles) sont apparus alors que les plantes étaient âgées de 46 jours L’étude du développement complet de l’écotype Col0 en hydroponie (sous-chapitre 3.2) indique que les plantes de Col-0 à J46 sont proches du passage du stade végétatif au stade reproductif (J53). Au cours de cette étude du développement, 106 Figure 53 : Photographies des racines et des rosettes de l'écotype Col-0 d'Arabidopsis thaliana au cours de la mise en place du stress osmotique. (A) : Photographie des racines des plantes témoins et stressées un jour après l’application de 1% de PEG dans le milieu de culture (J29). (B) : Photographie des rosettes des plantes témoins et stressées, un jour après l’application des concentrations en PEG de 1%, 2% et 3% respectivement à J29, J31 et J33, et quelques heures après l’ajout de 3,5% de PEG J34. Figure 54 : Valeurs moyennes de RWC (A) et de potentiel osmotique (B) pour les racines et les rosettes des plantes témoins et des plantes stressées (5h à 3,5% de PEG). Les moyennes (± écart type) sont calculées à partir de 3 plantes témoins et 3 plantes stressées. Les valeurs moyennes de potentiels osmotiques calculés pour les rosettes sont mesurées à partir de 3 feuilles des plantes témoins et stressées. RESULTATS ET DISCUSSION nous avons pu voir que cette transition entraine de nombreuses modifications dans les paramètres liés au métabolisme carboné des plantes. Il nous est alors apparu nécessaire de raccourcir la durée d’application du stress sur Col-0. Comme pour l’expérimentation « Essai stress C24 », la première dose de PEG a été ajoutée après 28 jours de culture des plantes Figure 52. Pour atteindre plus rapidement la dose de 5%, la première concentration en PEG ajoutée au milieu de culture est de 1%. Cette concentration a ensuite été augmentée de 1% en 1% tous les 2 jours. De façon surprenante, les premiers symptômes sont apparus sur les feuilles des rosettes stressées de Col-0 dès la dose 3% de PEG (à J33). Afin de ne pas entrainer d’aggravation trop rapide de ces symptômes, la concentration en PEG du milieu de culture a ensuite été augmentée de 0,5% pour atteindre la dernière dose appliquée de 3,5% (J36). A la vue de l’état des feuilles 5h après l’application de cette dose, les plantes ont été aussitôt récoltées. 3.4.1.1 Observation phénotypique des plantes Le premier phénotype observé, dès l’application de la première dose de PEG (1%), est un brunissement des racines des plantes stressées (J29 ; Figure 53A). Ce brunissement ne semble pas s’accentuer avec l’ajout de PEG dans le milieu de culture. En ce qui concerne les feuilles, le premier symptôme de réponse phénotypique au stress observé est un flétrissement des feuilles des plantes stressées. Ce phénotype n’apparait qu’à partir de 3% de PEG dans le milieu nutritif. Dès les premières heures après l’application de la dose de 3,5% de PEG, ce flétrissement s’accentue de façon importante (Figure 53B), comme ce qui avait été observé sur les feuilles de l’écotype C24 à 6% de PEG dans le milieu nutritif. 3.4.1.2 Etude de l’état hydrique des plantes : Afin de comparer l’état hydrique des plantes en condition témoin et en condition stressé, le RWC (contenu relatif en eau, Relative Water Content) et le potentiel osmotique des racines et des feuilles ont été déterminés. Ces deux paramètres ont été déterminés sur 3 plantes témoins et 3 plantes stressées, récoltées 5h après que la concentration du milieu de culture ait atteint 3,5% de PEG. Les résultats de RWC représentés sur la Figure 54A tendent à montrer des valeurs légèrement inférieures dans les feuilles stressées (-3,5%) par rapport aux feuilles témoins. En revanche, le RWC dans les racines reste très proche en conditions témoins et stressées (respectivement 71,5% et 70,1%). Le potentiel osmotique dans les feuilles témoins est de -0,95 MPa (Figure 54B). En condition de stress osmotique, le potentiel osmotique des feuilles diminue de façon assez 107 Figure 55 : Expression relative des gènes de transporteurs de sucre dans les racines des plantes témoins et stressées (5h après que la concentration en PEG du milieu de culture ait atteint 3,5%). Pour chaque gène, l’expression mesurée par macroarray dans les racines de 10 plantes est normalisée par la moyenne d’expression des gènes de ménage Ef1α, Actine2 et HistoneH4. Figure 56 : Rapport de l’expression relative des gènes de transporteurs de sucre des racines stressées sur celle des racines témoins lors de l’« Essai stress Col-0» exprimée en log2 (St/Tm). Pour chaque gène, l’expression mesurée par macroarray dans les racines (témoins ou stressées) de 10 plantes est normalisée par la moyenne d’expression des gènes de ménage Ef1α, Actine2 et HistoneH4 et le logarithme de base 2 du rapport d’expression dans les deux conditions (St/Tm), est reporté sur le graphe. Une valeur seuil de log2 ≥1,5 (ou ≤ 1,5) a été définie pour considérer un gène comme induit ou réprimé. RESULTATS ET DISCUSSION importante (-1.42 MPa). Le potentiel osmotique des racines est plus élevé (moins négatif) que celui calculé dans les feuilles et varie peu dans les deux conditions de culture (πTm = -0,64 MPa et πSt = -0,59 MPa ; Figure 54B). Le potentiel osmotique dans les feuilles témoins de -0,95 MPa (Figure 54B). En condition de stress osmotique, le potentiel osmotique des feuilles diminue de façon assez importante (1.42 MPa). Le potentiel osmotique des racines est plus élevé (moins négatif) que celui calculé dans les feuilles et varie peu dans les deux conditions de culture (πTm = -0,64 MPa et πSt = 0,59 MPa ; Figure 54B). 3.4.1.3 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre : L’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre réalisée dans le sous-chapitre 3.2 a permis de réaliser une cartographie dans l’espace de l’expression des gènes dans les plantes de l’écotype Col-0. En effet cette étude a mis en évidence l’expression spécifique des transporteurs de sucre dans 4 organes différents (racines, feuilles, hampes florales et siliques avec graines) et ceci au cours de 6 stades de développement différents. Le sous-chapitre 3.3 a, quant à lui, permis de réaliser une cartographie dans le temps de l’expression des transporteurs de sucre en mesurant cette expression à différentes heures d’une journées de 24h sur des plantes adules (J40). L’étude menée ici, et qui consiste au premier essai d’application du stress osmotique sur l’écotype Col-0, devrait nous permette de réaliser une étude comparée de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines et les feuilles des plantes témoins et des plantes stressées. Cette analyse a été réalisée par macroarray sur les racines et les feuilles de plantes récoltées 5h après que la concentration en PEG du milieu ait atteint 3,5%. 3.4.1.3.1 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines La Figure 55 montre l’expression des gènes de transporteurs de sucre retrouvés dans les racines témoins et stressées. Parmi tous les gènes de transporteurs de sucre étudiés, l’expression de 6 d’entre eux a été détectée dans les racines. Le profil d'expression de ces gènes dans l'ordre décroissant en condition témoin est le suivant : AtSUC1 > AtPLT5 > AtSUC2 > AtSTP7 > AtSUC5 > AtPLT6. Les différences d’expression de ces gènes dans les racines des plantes les témoins et des plantes stressées sont consignées dans la Figure 55. Ainsi, les résultats montrent que 3 gènes sont réprimés de façon significative (log2<-1,5) dans les racines des plantes stressées par rapport aux plantes témoins, les gènes AtSUC1, AtSUC5 et AtPLT6. Au contraire, le gène 108 Figure 57 : Expression relative des gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles des plantes témoins et stressées (5h après que la concentration en PEG du milieu de culture ait atteint 3,5%). Pour chaque gène, l’expression mesurée par macroarray dans les feuilles de 10 plantes est normalisée par la moyenne d’expression des gènes de ménage Ef1α, Actine2 et HistoneH4. Figure 58 : Rapport de l’expression relative des gènes de transporteurs de sucre des feuilles stressées sur celle des feuilles témoins lors de l’« Essai stress Col-0» exprimé en log2 (St/Tm). Pour chaque gène, l’expression mesurée par macroarray dans les feuilles de 10 plantes (témoins ou stressées) est normalisée par la moyenne d’expression des gènes de ménage Ef1α, Actine2 et HistoneH4 et le logarithme de base 2 du rapport d’expression dans les deux conditions (St/Tm), est reporté sur le graphe. Une valeur seuil de log2 ≥1,5 (ou ≤-1,5) a été définie pour considérer un gène comme induit ou réprimé. RESULTATS ET DISCUSSION AtSTP13 voit son expression augmenter de façon significative (log2>1,5) dans les racines des plantes stressées par rapport aux plantes témoins. En ce qui concerne les gènes AtPLT5, AtSTP7 et AtSUC2, les variations de leur expression en conditions stressées par rapport aux conditions témoins sont inférieures au seuil de significativité défini dans nos expérimentations. 3.4.1.3.2 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles Les résultats présentés sur la Figure 57 montrent les valeurs d’expression relative des gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles témoins et stressées. Sur les 26 gènes de transporteurs de sucre étudiés, l’expression de 6 d’entre eux a été mesurée dans les feuilles témoins et stressées (Figure 57). Ces gènes correspondent à 2 gènes de transporteurs de saccharose, AtSUC1 et AtSUC2, 3 gènes de transporteurs d’hexose, AtSTP3, AtSTP7 et AtSTP13, et 1 gène de transporteurs de polyol, AtPLT5. La comparaison de l’expression de ces gènes en condition témoin et en condition de stress osmotique montre que les différences d’expression observées sont inférieures au seuil de log2 que nous avons défini pour définir l’induction ou la répression d’un gène (Figure 58). En considérant tout de même les faibles différences d’expression observées, les résultats semblent montrer une légère augmentation des gènes AtSUC2, AtPLT5, AtSTP3, AtSTP7 et AtSTP13, ainsi qu’une légère diminution de l’expression du gène AtSUC1. 3.4.2 Discussion : La mise en place du premier essai d’application du stress osmotique sur l’écotype Col-0 a été établie à partir du premier essai réalisé sur l’écotype C24 (Annexe 1, erreur d’écotype). Dans cette expérimentation, la dose finale de PEG était de 6%, et c’était donc cette dose que nous avions projetée d’imposer à l’écotype Col-0, afin de vérifier la dose maximale que cet écotype pouvait supporter. Il s’est avéré que l’état physiologique des plantes de Col-0 au cours de l’application de ce protocole ne nous a pas permis d’atteindre la dose de 5% de PEG dans le milieu de culture, comme ce qui avait été réalisé sur l’écotype C24 (« Essai stress C24 », Annexe 1). En effet, des symptômes de flétrissement des feuilles sont apparus sur Col0 dès la dose de 3% de PEG, alors même que les plantes sont âgées de 32 jours. Ceci est différent de ce que nous avions observé préalablement sur les plantes stressées de C24 (Annexe 1), qui au même âge étaient exposées à une dose de 1,5% de PEG. De plus, pour C24 la dose de 3% a été atteinte lorsque les plantes étaient âgées de 38 jours, et les premiers symptômes de flétrissement des feuilles sont observés pour 5% de PEG à J46. 109 RESULTATS ET DISCUSSION Il est ainsi possible de penser, que pour une même dose de PEG, la différence de comportement des plantes observées entre Col-0 et C24 soit liée à l’écart d’âges des plantes lors de l’application de cette dose. Cette différence pourrait aussi s’expliquer par une différence de sensibilité des deux écotypes vis-à-vis du stress appliqué. En effet, plusieurs études mettent en évidence que les différents écotypes d’A. thaliana ne tolèrent pas le stress hydrique de la même façon. Les travaux menées par Granier et collaborateurs (2006) montrent par exemple, que les plantes de l’écotype An-1 tolèrent mieux le stress hydrique appliqué en terre par arrêt d’arrosage que les plantes de l’écotype Col-0. Cependant, cette première expérimentation de stress osmotique menées sur Col-0 a aussi permis de montrer que l’application de 3,5% de PEG dans le milieu nutritif entraine une accélération très rapide de ces symptômes de flétrissement des feuilles de la rosette. Parallèlement à ce flétrissement des feuilles, un brunissement des racines des plantes en condition de stress a été observé. Il avait été envisagé, lors d’un premier comité de thèse (Octobre 2010), la possibilité que ce brunissement soit causé par une hypoxie. Pour tester cette hypothèse, une expérimentation a été réalisée au cours de laquelle la concentration en oxygène du milieu de culture, ainsi que l’expression du gène de l’alcool déshydrogénase, deux marqueurs du stress hypoxie, ont été mesurés. Pour cette étude, les 4 systèmes ont été utilisés, et des bulleurs d’aquarium ont été ajoutés dans deux d’entre eux. Ainsi, il a été possible d’étudier l’impact de l’ajout de PEG sur la concentration en oxygène dans les bacs témoins et stressés, avec ou sans bulleurs. Les résultats ont montré que la concentration d’oxygène varie très peu, aussi bien entre les milieux témoins avec et sans bulleurs, qu’entre les milieux témoins et stressés. De même, cette expérimentation a permis de mettre en évidence que le gène de l’ADH est exprimé aussi bien dans les racines des plantes cultivées dans le milieu témoins qu’en présence de PEG. Il est tout de même à noter une légère diminution de l’expression du gène dans les plantes cultivées dans le milieu stressé, oxygéné avec un bulleur. Cependant, le même brunissement des racines est observé, aussi bien sur les plantes stressées pour lesquelles un bulleur a été ajouté dans le milieu, que pour celles cultivées sans bulleur dans le milieu. Le brunissement des racines observé en présence de PEG ne serait donc pas provoqué par une hypoxie. Ce brunissement pourrait en revanche se rapprocher de celui décrit par Chen et collaborateurs (2006) sur les racines du riz cultivé en hydroponie et provoqué par un dépôt de fer. L’oxygénation du milieu de culture étant un paramètre très important lors de la culture des plantes en hydroponie 110 Figure 59 : Valeurs de potentiel hydrique dans le milieu de culture en fonction de la concentration en PEG dans le milieu. Le potentiel hydrique a été déterminé après mesure de l’osmolarité les milieux testés (milieu nutritif seul, puis milieu nutritif contenant les différentes concentrations de PEG utilisées). RESULTATS ET DISCUSSION (Gibeaut et al. 1997), pour la suite des expérimentations, un bulleur d’aquarium a tout de même été ajoutée dans chacun des bacs-réservoirs, afin d’améliorer l’oxygénation du milieu. L’état hydrique des plantes a été évalué à la fin du stress par le calcul du RWC et du potentiel osmotique. Les résultats tendent à montrer une légère diminution du RWC et une diminution plus importante de leur potentiel osmotique dans les feuilles de la rosette des plantes stressées, comparées aux plantes témoins. La diminution de ces deux paramètres au cours d’une contrainte hydrique est un phénomène classiquement observé chez A. thaliana (Chaves et al. 2003 ; Verslue et al. 2006). Les études réalisées en terre sur des plantes de Col0 par Hummel et collaborateurs (2010) montrent par exemple une diminution moyenne de 8% de RWC au cours d’un stress hydrique modéré, et de 21% lors d’un stress sévère. Néanmoins, certaines publications montrent des variations beaucoup plus faibles voir nulles du RWC chez des plantes de l’écotype Col-0 en condition de stress hydrique appliqué en terre (Bouchabke et al. 2008). La diminution du potentiel osmotique des feuilles en condition de stress est aussi retrouvée dans les travaux de Hummel et collaborateurs (2010) : elle est de 0,19 MPa lors d’un stress modéré et de 0,52 MPa lors d’un stress sévère. Cette baisse du potentiel osmotique dans les feuilles peut s’expliquer d’une part, par la perte d’eau des cellules, entrainant une concentration des solutés dans celle-ci, et d’autre part, par l’accumulation de certains solutés compatibles comme la proline ou certains sucres solubles (Zhang et al. 1999). Les premiers résultats obtenus dans nos conditions sur l’écotype Col-0 d’A. thaliana laisseraient ainsi supposer que le stress osmotique appliqué se rapproche d’un stress hydrique modéré. La dose de 3,5% de PEG dans le milieu correspond à une différence de potentiel hydrique de 0,06 MPa par rapport au milieu témoin (Figure 59), ce qui représente une variation assez minime entre les deux milieux. Cependant, les symptômes observés sur les feuilles stressées de notre étude ne correspondent pas à l’effet d’un stress hydrique modéré, mais semblent refléter un stress plus sévère. Ces symptômes apparaissent plus importants que ce que les valeurs des paramètres mesurés le laissent penser, et ils pourraient être liés d’une part, au système de culture en hydroponie et d’autre part, à un effet secondaire due à l’utilisation de PEG. Des travaux préalables ont toutefois montré que, l’utilisation de PEG de poids moléculaires compris entre 1000 g.mol-1 < PEG < 6000 g.mol-1, engendrait peu ou pas de toxicité sur les plantes et permettait une bonne aération du milieu de culture par sa faible viscosité (Dubos et al. 2003). 111 RESULTATS ET DISCUSSION Ce premier essai d’application du stress sur l’écotype Col-0 a permis d’effectuer une comparaison de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines et les feuilles des plantes témoins et stressées. A l’exception du gène AtSTP7, le profil d'expression des gènes exprimés dans les racines témoins est identique à celui mesuré dans les racines des plantes d’A. thaliana au stade adulte lors des études précédentes (sous-chapitre 3.2 et 3.3) : le gène le plus fortement exprimé est AtSUC1 puis AtPLT5, AtSUC2, AtSTP7, AtSUC5 et AtPLT6. Dans les feuilles des plantes témoins, l’expression des gènes AtSUC1, AtSUC2, AtSTP3, AtSTP7 , AtSTP13 et AtPLT5 a été mesuré. Hormis pour le gène AtSTP7 , ces gènes sont les mêmes que ceux retrouvés exprimés dans les feuilles d’A. thaliana au stade adulte, lors de l’étude sur le développement des plantes. En ce qui concerne ce gène, peu de données sont disponibles dans la littérature. Les données Genevestigator, compilées par Büttner (2007) semblent cependant confirmer une faible expression de ce gène dans les feuilles d’A. thaliana , tout comme les travaux effectués au laboratoire par Maryse Laloi et Cyril Abadie. A part AtSTP7, nous n’avons pas identifié de nouveaux gènes en condition de stress, aussi bien dans les racines que dans les feuilles. La comparaison de l’expression de ces gènes dans les racines a permis de mettre en évidence la répression des gènes AtSUC1, AtSUC5 et AtPLT6 ainsi que l’augmentation de l’expression du gène AtSTP13. En revanche, les résultats n’ont pas permis de montrer de différences significatives d’expression dans les feuilles. En considérant tout de même les faibles différences d’expression observées, les résultats semblent montrer une légère augmentation des gènes AtSUC2, AtPLT5, AtSTP3, AtSTP7 et AtSTP13 ainsi qu’une légère diminution de l’expression du gène AtSUC1. De telles variations de l’expression de ces gènes de transporteurs de sucre ont plusieurs fois été mises en évidence sur des travaux de stress hydrique menées au laboratoire, notamment par les études de Maryse Laloi et de Cyril Abadie (communication personnelle et manuscrit de thèse). Cependant, les valeurs d’induction ou de répression mesurées dans leurs études étaient supérieures au seuil de log2 définissant la significativité des résultats d’expression De plus, dans notre expérimentation, la récolte des plantes a été effectuée rapidement après l’application de la dose de 3,5% de PEG, en raison de l’importante augmentation des symptômes de flétrissement observés sur les feuilles de la rosette. Il est possible de penser que la récolte précipitée des plantes ait été trop rapide pour permettre une réponse des gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles stressées des plantes d’A. thaliana . L’étude d’un stress 112 Figure 60 : Schéma du protocole expérimental d’application du stress au cours de la « Campagne stress ». Les 288 plantes de l’écotype Col-0 sont cultivées dans les quatre systèmes (systèmes A et C : témoins ; et systèmes B et D : stressées ; 72 plantes par système) pendant 20 jours dans le milieu Gibeaut. Au bout de 20 jours, une première récolte de 120 plantes, nommée « stade jeune », a été réalisée. Puis, une première dose de PEG est ajoutée au milieu nutritif des bacs réservoir St à J35, permettant d’atteindre une concentration de 1%. Par la suite 1% de PEG est ajoutée à J37 pour atteindre la dose 2%. La concentration de PEG a ensuite été augmentée de 0,5%, car les plantes présentaient les premiers signes de flétrissement après l’application de la dose 2%, pour atteindre la concentration de 2,5% à J 39. Une première récolte de 50 plantes (25 plantes témoins et 25 plantes stressées) a été réalisée après 3 jours d’application de la dose 2,5% (J42) et une seconde de 50 plantes également (25 plantes témoins et 25 plantes stressées) après 6 jours d’application de la dose 2,5% (J45). RESULTATS ET DISCUSSION moins poussé pourrait permettre de déterminer si les tendances d’induction ou de répression observées se confirment dans les feuilles ayant subi le stress osmotique. Cette première expérimentation nous indique aussi que pour le prochain stress osmotique à réaliser sur l’écotype Col-0, la dose de 3% de PEG ne pourra être dépassée. L’expérimentation « Campagne stress », (expérimentation suivante), a été effectuée sur des plantes cultivées dans les quatre systèmes d’hydroponie. Cette expérimentation a été réalisée afin d’effectuer un stress osmotique plus long (6 jours à la dose maximale) et sur un plus grand nombre de plantes. De même, afin de déterminer si la sensibilité différente visà-vis du stress observée dans notre expérimentation entre l’écotype Col-0 et l’écotype C24 est liée à l’âge des plantes au moment de l’application du stress, le début du traitement sera réalisé sur des plantes plus âgées. Ceci nous permettra de comparer les réponses de ces deux écotypes à une même dose et au même stade de développement. 3.5 Etude d’une cinétique de stress osmotique (« Campagne stress ») La « Campagne stress » a été réalisée sur les 4 systèmes d’hydroponie disponibles au laboratoire. Le protocole utilisé pour appliquer le stress osmotique lors de cette expérimentation s’inspire de celui utilisé lors de l’« Essai stress Col-0 » (Figure 60). La concentration en PEG a ainsi été augmentée de 1% en 1% dans le milieu de culture. Cependant, afin d’avoir des plantes plus matures lors de l’application du PEG, la première dose n’a été ajoutée qu’après 35 jours de culture des plantes (contre 28 jours pour « l’essai stress Col-0 »). A partir de 2% (J38), la concentration en PEG du milieu n’a été augmentée que de 0,5% dans le but d’atteindre la dose de 3% de PEG plus progressivement que lors de l’expérimentation « essai stress Col-0 ». Ceci a été mis en place afin que les feuilles des rosettes ne présentent pas trop rapidement les symptômes de stress, comme ceci avait été observé dans l’expérimentation précédente. De plus, à la fin de l’expérimentation « essai stress Col-0 », nous avions émis l’hypothèse que le faible niveau d’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles pouvait être dû au fait que les plantes n’étaient restées que quelques heures à la dose maximale (3,5%). Aussi, pour l’expérimentation « campagne stress » nous souhaitions que les plantes restent plus longtemps (quelques jours) à la dose maximale (initialement prévue à 3%), afin de vérifier l’expression des transporteurs de sucre dans cette nouvelle condition. L’observation des plantes au cours de cette nouvelle expérimentation « campagne stress » montre que les premiers symptômes de flétrissement apparaissent sur les feuilles dès que le 113 Figure 61 : Photographies de l'écotype Col-0 d'Arabidopsis thaliana au cours de l’application du stress osmotique, lors de la « Campagne stress ». (A) Photographie des rosettes des plantes témoins et stressées de l'écotype Col-0 un jour après l’application des concentrations en PEG de 1%, 2%, et 2,5% respectivement à J36, J38 et J40. (B) : Photographie des rosettes des plantes stressées de l’écotype Col-0, 3 et 6 jours après l’application de 2,5% de PEG. Figure 62 : Valeurs moyennes de RWC calculées pour les racines et les feuilles de plantes témoins ou stressées après 3 jours (A) et 6 jours (B) de stress à 2,5% de PEG. Les moyennes (± écart type) sont calculées à partir de 5 plantes pour chaque condition testée. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). RESULTATS ET DISCUSSION milieu nutritif a atteint la concentration de 2,5% en PEG. Aussi, l’augmentation de la concentration en PEG n’a pas été poursuivie. Une première récolte de 50 plantes (25 plantes témoins et 25 plantes stressées) a été réalisée après 3 jours d’application de la dose de 2,5% (J42). Afin, d’étudier le comportement des plantes sur un temps plus long, le stress osmotique a été maintenu 3 jours de plus. Ainsi, après 6 jours de stress à 2,5% (J45), une seconde récolte de 50 plantes (25 plantes témoins et 25 plantes stressées) a été réalisée (Figure 60). 3.5.1 Observation phénotypique des plantes Dans un premier temps, le phénotype des plantes témoins et stressées a été suivi au cours de l’application du stress osmotique. Dès l’application de PEG dans le milieu de culture, un brunissement des racines des plantes stressées est observé (résultats non montré). Pour cette expérimentation, les premiers symptômes de stress sur les feuilles apparaissent dès l’application de la concentration de 2,5% de PEG (Figure 61A). Trois jours après l’application de la dose 2,5% les feuilles des plantes stressées sont flétries et montrent un léger brunissement (Figure 61B). L’observation des plantes après 6 jours de stress à 2,5% de PEG semble montrer une faible accentuation des symptômes de flétrissement sur les feuilles. En revanche, le brunissement des feuilles des plantes stressées semble, quant à lui, plus important après 6 jours de stress qu’après 3 jours. 3.5.2 Etude de l’état hydrique des plantes Dans le but de déterminer l’intensité du stress osmotique appliqué aux plantes lors de cette expérimentation, le RWC et le potentiel hydrique ont été déterminés dans les feuilles et les racines des plantes témoins et stressées, au moment des deux récoltes (3 et 6 jours après l’application de 2,5% de PEG). - Détermination du RWC A J43 (3 jours à 2,5% de PEG), le RWC dans les feuilles des plantes stressées est inférieur (70,5%) à celui mesuré sur les plantes témoins (74% ; Figure 62A), bien que cette différence ne soit pas significative. Cette légère diminution paraît confirmer les précédents résultats de RWC obtenus sur cet organe lors de l’Essai stress Col-0 . En revanche pour les racines, et comme observé dans les précédentes expérimentations, la valeur moyenne de RWC des racines stressées (74,1%) reste très proche de celle mesuré sur les racines témoins (74% ; Figure 62A) Les résultats représentés Figure 62B représentent les valeurs de RWC après 6 jours d’application de 2,5% de PEG. Les résultats montrent très peu de variation du RWC entre les 114 Figure 63 : Valeurs moyennes de potentiel osmotique calculées pour les racines et 3 feuilles de plantes témoins ou stressées après 3 jours (A) et 6 jours (B) de stress à 2,5% de PEG. Les moyennes (± écart type) sont calculées à partir de 5 plantes pour chaque condition testée. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). Figure 64 : Masse sèche moyenne des racines et des feuilles des plantes témoins et stressées après 3 (J43) et 6 jours (J46) de stress à 2,5% de PEG. La masse sèche moyenne (± écart type) a été calculée à partir de 5 plantes pour chaque condition testée. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). RESULTATS ET DISCUSSION plantes stressées et témoins. En effet, le RWC des feuilles témoins est de 73% et celui mesuré dans les feuilles stressées est de 72%, tandis que dans les racines témoin, le RWC est de 72,1%, et 73,9% dans les racines stressées. Il faut donc noter que la différence de RWC entre les feuilles stressées et témoins est plus importante à J3 du stress qu’à J6. - Détermination du potentiel osmotique Les résultats présentés Figure 63A montrent le potentiel osmotique calculé dans les racines et feuilles des plantes témoins et stressées, après 3 jours d’application de 2,5% de PEG. A J43 (3 jours à 2,5% de PEG), le potentiel osmotique dans les feuilles des plantes stressées est significativement inférieur (Δ = -0,45 MPa) à celui mesuré sur les plantes témoins (Figure 63A). En revanche, pour les racines, le potentiel osmotique mesuré dans les racines stressées varie peu par rapport à celui mesuré sur les racines témoins (Δ = +0,1 MPa, Figure 63A). Après 6 jours à 2,5% de PEG, les résultats indiquent que la différence de potentiel osmotique entre les feuilles témoins et stressées est moins importante (non significative) qu’après 3 jours de stress (Δ = -0,06 au lieu de -0,45, Figure 63B). Dans les feuilles stressées, les valeurs de potentiel osmotique mesurées (-0,95 MPa) sont revenues à des valeurs sensiblement égales à celles mesurées dans les plantes témoins (-0,90 MPa). Concernant le compartiment racinaire, le potentiel osmotique des racines stressées, après 6 jours de stress, est toujours légèrement plus élevé que celui mesuré sur les racines témoins (Δ = +0,04, Figure 63B). 3.5.3 Détermination des masses sèches et du rapport Root/Shoot (rapport R/S) La masse sèche moyenne des racines et des feuilles des plantes témoins et stressées après 3 (J43) et 6 jours de stress (J46) est représentée sur la Figure 64. Les résultats montrent que les masses des racines et des feuilles des plantes témoins à J43, sont respectivement identiques à celles des racines et des feuilles des plantes stressées pour ce point de récolte (3 jours de stress à 2,5% de PEG). Les résultats montrent aussi que la masse moyenne des feuilles et des racines augmente significativement dans les plantes témoins entre J43 et J46. En revanche, aucune différence significative n’est mesurée entre la masse des racines stressées récoltées à 3 et 6 jours de stress. Il en est de même pour les feuilles des plantes stressées, bien que leur masse après 6 jours de stress à 2,5% (223 mg) soit légèrement plus importante que celle mesurée après 3 jours de stress à 2,5% (197 mg). 115 Figure 65 : Valeurs moyennes de rapport R/S calculées pour les racines et les feuilles de plantes témoins ou stressées après 3 (J43) et 6 jours (J46) de stress à 2,5% de PEG. Le calcul du rapport R/S a été effectué à partir des masses sèches déterminées sur 5 plantes pour chaque condition testée. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). Figure 66 : Teneurs moyennes en chlorophylles totales déterminées sur un mélange de feuilles jeunes et adultes de plantes témoins et stressées après 3 (J43) et 6 jours (J46) de stress osmotique à 2,5% de PEG. Le dosage des chlorophylles a été effectué sur 5 plantes pour chaque condition testée. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). RESULTATS ET DISCUSSION Le rapport R/S a été calculé à partir des résultats précédents. Les résultats représentés Figure 65 montrent un rapport R/S proche entre les plantes témoins et les plantes stressées, après 3 jours de stress à 2,5% de PEG (respectivement 0,15 et 0,14). En revanche, 6 jours après l’application de 2,5% de PEG, une diminution significative du rapport R/S des plantes stressées est observée par rapport aux plantes témoins, respectivement 0,11 et 0,14. 3.5.4 Teneurs en chlorophylles au cours du stress Afin de mieux caractériser l’effet du stress osmotique sur le métabolisme carboné au sens large, le dosage des chlorophylles totales a été effectué sur les feuilles (échantillon constitué de feuilles jeunes et matures) après 3 et 6 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG. Les résultats représentés Figure 66 montrent une teneur moyenne en chlorophylles dans les feuilles témoins de 11,8 mg.gMS-1 à J43 et 11,2 mg.gMS-1 à J46. En condition de stress, une diminution significative de la teneur en chlorophylles dans les feuilles stressées est mesurée de l’ordre de 37% après 3 jours de stress, et de 31% après 6 jours de stress. Les teneurs en chlorophylles mesurées dans les feuilles stressées des deux points de stress ne sont en revanche pas significativement différentes : 7,4 mg.gMS-1 après 3 jours de stress et, 7,7 mg.gMS-1 après 6 jours de stress. 3.5.5 Suivi du contenu en quelques éléments constitutifs de la plante Parmi les 92 éléments identifiés sur Terre, 17 sont connus pour être indispensables à toutes les plantes. Les macroéléments (C, H, O, N, S, P, Ca, K et Mg) sont requis en grande quantité (ils représentent plus de 0,1% la masse sèche) alors que les microéléments (Ni, Mo, Cu, Zn, B, Fe et Cl) représentent moins 0,01% de la masse sèche. Parmi ces éléments, nous avons choisi de doser le Ca, Mg, K, P, Fe et également une molécule organique, le nitrate qui est la forme sous laquelle l’azote était fourni aux plantes. Ce dosage a été réalisé afin de vérifier si le stress osmotique avait un impact sur l’absorption de ces éléments par les racines, et pouvait entrainer ainsi une carence dans la plante. Les résultats observés dans notre étude (Tableau 11) peuvent être comparés avec ceux obtenus dans les travaux de Lequeux et collaborateurs (2010), également effectuée sur des plantes d’A. thaliana cultivées en hydroponie. Dans ces travaux, comme dans notre étude, les mêmes éléments sont mesurés par la même technique d’analyse à savoir l’absorption atomique de flamme. Dans notre étude, les valeurs de dosages obtenues dans les racines et les feuilles des plantes en conditions témoins sont très proches de celles obtenues dans leur étude, et ce pour tous les éléments étudiés. 116 RESULTATS ET DISCUSSION Le rapport R/S des différents éléments a également été étudié. En fonction de ce rapport, les éléments peuvent être rangés en plusieurs catégories : soit l’élément est plus présent dans les feuilles que dans les racines (R/S<1, cas du Ca2+, Mg2+ et NO3-) soit l’élément est plus présent dans les racines que dans les feuilles (R/S>1, cas du K+, du Fe et du P). Un premier élément à noter est que, quel que soit l’élément considéré, le rapport R/S n’est pas inversé en cas de stress osmotique, après 3 ou 6 jours de stress. Ceci signifie que la répartition globale des ions n’est pas affectée par le stress osmotique. De plus, les valeurs de dosage et les R/S ne changent pas de façon considérable, ce qui permet de penser qu’il n’y pas de carence qui se développe pendant le stress. Ceci peut s’expliquer par le système de culture en hydroponie où les ions sont facilement disponibles, et par le maintien d’un flux de sève entre racines et feuilles. D’autre part, il est probable, qu’au niveau de la rosette, un certain nombre d’ions sont remobilisés depuis les feuilles qui entrent en sénescence. L’ensemble de ces éléments peut donc conduire à une sorte d’homéostasie des ions, du moins dans nos conditions de stress. Il s’agit d’un argument supplémentaire pour conclure à un stress modéré. 3.5.6 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre au cours d’une cinétique de stress osmotique Dans les expérimentations intitulées « Essai », l’étude de l’expression des transporteurs de sucre a été réalisée par l’analyse de macroarray et/ou RT-qPCR sur les racines et par macroarray sur les feuilles. En effet, ces expérimentations ont généralement été mises en place afin de tester différents protocoles d’application de stress sur les plantes cultivées en hydroponie. Aussi, pour chacun de ces essais il nous fallait d’une part cartographier la population de transporteurs qui s’exprimaient en réponse au protocole expérimental appliqué. D’autre part, la seule référence disponible au laboratoire pour la réponse des transporteurs de sucre à un stress hydrique (terre) concerne l’organe feuille. Nous avons donc vérifié que le stress osmotique appliqué dans nos expérimentations via l’utilisation du PEG mimait un stress hydrique. Pour cela, dans chaque expérimentation essai, l’étude de l’expression des transporteurs de sucre dans les feuilles a été réalisée afin de la comparer au profil déjà établi au laboratoire (stress hydrique en terre, communication personnelle Maryse Laloi, manuscrit de thèse Cyril Abadie). Dans les expérimentations « Campagne », l’expression des transporteurs de sucre n’a été étudiée que sur l’organe racine, qui fait l’objet de ce travail de thèse. Cette analyse a été réalisée par RT-qPCR afin d’obtenir des valeurs plus précises. Seuls les gènes de transporteurs 117 Figure 67 : Rapport de l’expression relative des gènes AtRD29a et AtTIP1;2 mesurée par RT-qPCR dans les racines après 3 (A) et 6 (B) jours de stress à 2,5% de PEG. L’expression des gènes a été mesurée sur un mélange de 10 plantes et est normalisée par rapport à l’expression du gène de référence At5g12240. Le logarithme de base 2 du rapport d’expression dans les deux conditions (St/Tm), est reporté sur le graphe. Une valeur seuil de log2 ≥1,5 (ou ≤ -1,5) a été définie pour considérer un gène comme induit ou réprimé. Figure 68 : Etude de l’expression par RT-qPCR de six gènes de transporteurs de sucre dans les racines d’A. thaliana en condition normales et en condition de stress osmotique, après 3 (A) et 6 (B) jours de stress à 2,5% de PEG. L’expression des gènes a été mesurée sur un mélange de 10 plantes et est normalisée par rapport à l’expression du gène de référence At5g12240. Le logarithme de base 2 du rapport d’expression dans les deux conditions (St/Tm), est reporté sur le graphe. Une valeur seuil de log2 ≥1,5 (ou ≤ -1,5) a été définie pour considérer un gène comme induit ou réprimé. RESULTATS ET DISCUSSION de sucre présentant une différence d’expression dans les racines (stress osmotique vs témoin) lors de l’expérimentation préliminaire « Essai stress Col-0 » ont été étudiés : AtPLT5, AtPLT6, AtSTP13, AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5. Le gène AtSTP7 n’a pu être étudié car aucune des amorces dessinées pour l’analyse en RT-qPCR n’a permis d’amplifier le fragment attendu. Lors de cette étude, l’expression de deux gènes, connus pour être différentiellement exprimés dans les racines des plantes lors d’un stress hydrique, a aussi été analysée par RTqPCR. Ces gènes sont AtRD29a et AtTIP1;2 qui codent tous les deux des aquaporines. Le gène AtRD29a a été décrit dans plusieurs études comme étant induit lors d’un stress hydrique, salin ou osmotique (Hundertmark and Hincha 2008 ; Msanne et al. 2011 ; Xiong et al. 2006). Pour le gène AtTIP1;2 en revanche, une forte répression de son expression est mesurée dans les racines en réponse à un stress hydrique ou salin (Alexandersson, Fraysse, Sjovall-Larsen, Gustavsson, Fellert, Karlsson, Johanson and Kjellbom 2005, Boursiac et al. 2005). Il est à noter aussi que l’expression de ce gène est quasiment identique dans les racines et les feuilles cultivées aussi bien en terre qu’en hydroponie (Alexandersson et al. 2005). La Figure 67A montre les rapports d’expression St/Tm (stressées/témoins) des gènes AtRD29a et AtTIP1;2 mesurés dans les racines après 3 jours de stress à 2,5% de PEG. Les résultats montrent une augmentation de l’expression d’AtRD29a de 2,7 fois. En ce qui concerne le gène AtTIP1;2, son expression est réprimée de 145 fois. Les rapports d’expression ont été également mesurés dans les racines des plantes stressées après 6 jours d’application de 2,5% de PEG (Figure 67B). Les résultats montrent que le niveau d’expression des gènes AtRD29a et AtTIP1;2 ne varie pas entre les racines témoins et stressées. La Figure 68A présente les rapports d’expression relative des 6 gènes de transporteurs de sucre étudiés dans les racines après 3 jours de stress à 2,5% de PEG. Les résultats montrent que l’expression des 3 gènes de transporteurs de saccharose AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5 et des 2 gènes de transporteur de polyol AtPLT6 et AtPLT5, est réprimée dans les racines stressées par rapport aux racines témoins. Seul le gène AtSTP13 montre une augmentation d’expression après 3 jours de stress osmotique. Les résultats d’expression après 6 jours de stress osmotique montrent, qu’excepté pour les gènes AtPLT6 et AtSUC1, l’expression mesurée dans les racines stressées est quasiment similaire à celle observée dans les racines témoins (Figure 68B). Les gènes AtPLT6 et AtSUC1, quant à eux, sont réprimés, mais de façon moins importante qu’après 3 jours à 2,5% de PEG. 118 Figure 69 : Teneur en saccharose, glucose et fructose dans les racines (A) et les feuilles (B) des plantes témoins et stressées, après 3 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG. Le dosage des sucres a été réalisé sur les racines et les feuilles de 5 plantes mélangées pour chaque condition étudiée. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. Figure 70 : Teneur en saccharose, glucose et fructose dans les racines (A) et les feuilles (B) des plantes témoins et stressées, après 6 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG. Le dosage des sucres a été réalisé sur les racines et les feuilles de 5 plantes mélangées pour chaque condition étudiée. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. RESULTATS ET DISCUSSION 3.5.7 Etude de la teneur en sucres solubles au cours d’une cinétique de stress osmotique La Figure 69A présente les résultats du dosage du saccharose, glucose et fructose dans les racines des plantes témoins et stressées après 3 jours de stress à 2,5% de PEG. Les résultats montrent que la teneur en saccharose augmente de façon importante dans les racines après 3 jours de stress à 2,5% de PEG (2,2 µmol.gMS-1 dans les racines témoins et 15,7 µmol.gMS-1 dans les racines stressées). En revanche, les teneurs en glucose et fructose semblent diminuer dans les racines des plantes stressées (respectivement 19.8 et 8,7 µmol.gMS-1) par rapport aux racines des plantes témoins (respectivement 63,4 et 28,1 µmol.gMS-1). La Figure 69B présente les résultats de dosage du saccharose, glucose et fructose dans les feuilles des plantes témoins et stressées après 3 jours de stress à 2,5% de PEG. En condition témoins, les teneurs en saccharose, glucose et fructose mesurées dans les feuilles sont respectivement de 2,6, 26,1 et 12 µmol.gMS-1. Après 3 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG, les résultats montrent que pour chacun des 3 sucres dosés, la quantité retrouvée dans les feuilles stressées est plus importante que celle mesurée dans les feuilles témoins. Pour le saccharose, la teneur dans les plantes stressées est quasiment 6 fois supérieure à celle mesurée dans les plantes témoins (respectivement 16,4 et 2,6 µmol.gMS-1 ; Figure 69B) ; le fructose mesuré dans les feuilles stressées est approximativement 5 fois plus important que dans les feuilles témoins (respectivement 59.5 et 12 µmol.gMS-1 ; Figure 69B) ; et le glucose quant à lui, est presque 10 fois plus présent dans les feuilles stressées que dans les feuilles témoins (respectivement 253,9 et 26,1 µmol.gMS-1 ; Figure 69B). La Figure 70A présente les teneurs en saccharose, glucose et fructose après 6 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG. La teneur en saccharose mesurée dans les racines témoins (2,7 µmol.gMS-1) est proche de celle mesurée 3 jours avant à J 43 (2,2 µmol.gMS-1). En revanche, en ce qui concerne les quantités de glucose et de fructose, une diminution importante est mesurée dans les racines témoins entre ces deux points de récolte : la teneur en glucose est de 20,9 µmol.gMS-1 à J46 alors qu’elle était de 63,4 µmol.gMS-1 à J43 ; pour le fructose la teneur à J46 est de 13 µmol.gMS-1 alors qu’elle est de 28,1 µmol.gMS-1 à J43. En comparant les teneurs de ces 3 sucres dans les racines témoins et stressées, les résultats montrent que la quantité de saccharose dans les racines stressées (21,5 µmol.gMS-1) est supérieure à celle retrouvée dans les racines témoins (2,7 µmol.gMS-1 ; Figure 70A). Cette quantité mesurée dans les racines stressées après 6 jours de stress (21,5 µmol.gMS-1 ; Figure 70A) est aussi supérieure à celle retrouvée dans les racines stressées après 3 jours de stress osmotique (15,7 µmol.gMS-1 ; Figure 69A). De la même façon, après 6 jours de stress, les teneurs 119 Figure 71 : Teneur en amidon dans les racines et les feuilles des plantes après 3 et 6 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG. Le dosage de l’amidon a été réalisé sur les racines et les feuilles de 5 plantes mélangées pour chaque condition étudiée. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. RESULTATS ET DISCUSSION en glucose et fructose des racines stressées (respectivement 61,9 et 31,5 µmol.gMS -1) sont supérieures à celles mesurées dans les racines témoins (respectivement 20,9 et 13 µmol.gMS1 ; Figure 70A). En ce qui concerne les feuilles (Figure 70B), le dosage du saccharose, glucose et fructose montre, une forte accumulation de ces 3 sucres dans les feuilles des plantes stressées après 6 jours de stress (respectivement 16,1, 249 et 61,2 µmol.gMS-1). Ces teneurs dans les feuilles stressées sont très proches de celles mesurées dans les feuilles stressées après 3 jours de stress osmotique (respectivement 16,4, 253,9 et 59,5 µmol.gMS-1 ; Figure 69B) 3.5.8 Etude de la teneur en amidon au cours d’une cinétique de stress osmotique La Figure 71 représente les teneurs en amidon mesurées dans les racines et les feuilles des plantes témoins et stressées après 3 et 6 jours de stress à 2,5% de PEG. Les résultats montrent dans un premier temps que la teneur en amidon est beaucoup plus faible dans les racines que dans les feuilles, aussi bien en condition témoin qu’en condition de stress osmotique. Après 3 jours de stress, les résultats semblent indiquer une diminution de la teneur en amidon dans les racines stressées (0,7 mg.gMS-1) par rapport aux racines témoins (1,3 mg.gMS-1). En revanche, après 6 jours de stress, une augmentation de la teneur en amidon est observée dans les racines stressées par rapport aux racines témoins (respectivement 1 et 0,7 mg.gMS-1). En ce qui concerne les feuilles, la teneur en amidon augmente légèrement dans les feuilles stressées par rapport aux feuilles témoins, aussi bien après 3 jours que 6 jours de stress à 2,5% et reste élevée dans les deux cas. 3.5.9 Discussion L’expérimentation « Campagne stress » a permis de tester un nouveau protocole d’application du stress hydrique sur l’écotype Col-0 d’A. thaliana . Cette expérimentation a été effectuée sur les 4 systèmes d’hydroponie disponibles au laboratoire. Le plus grand nombre de plantes disponibles a ainsi permis d’effectuer deux récoltes de plantes stressées, une première après 3 jours de stress à 2,5% de PEG et une seconde après 6 jours de stress à 2,5% de PEG. 3.5.9.1 Etude phénotypique et physiologique des plantes en condition de stress osmotique L’observation phénotypique des plantes a dans un premier temps montré un brunissement des racines, dès la première application de PEG, comme lors de l’expérimentation « essai stress Col-0 », ainsi que le flétrissement des feuilles après l’ajout de 2,5% de PEG dans le milieu. 120 RESULTATS ET DISCUSSION Le suivi phénotypique des plantes entre 3 et 6 jours de stress n’a pas mis en évidence une aggravation importante du flétrissement des feuilles entre ces 2 points de stress. Après 3 jours de stress, les feuilles stressées présentent un léger brunissement par rapport aux feuilles témoins. Ce brunissement semble, en revanche, s’accentuer entre 3 et 6 jours de stress. Cette couleur brune observée sur les feuilles pourrait être due à l’accumulation d’anthocyanes dans les feuilles des plantes stressées. En effet, ce phénomène est couramment observé sur les feuilles des plantes en condition de stress hydrique, où l’accumulation d’anthocyanes permettrait de limiter le stress oxydatif généré par un tel stress (Sperdouli and Moustakas 2012). L’étude de l’état hydrique des plantes au cours de l’expérimentation « Campagne stress », a montré une diminution du RWC et du potentiel osmotique dans les feuilles stressées après 3 jours d’application de la dose de 2,5% de PEG dans le milieu. Cette diminution du RWC est du même ordre de grandeur que celle qui a été observé lors de l’« Essai stress Col-0 ». En revanche, les valeurs de ces deux paramètres sont quasiment équivalentes dans les feuilles témoins et stressées après 6 jours de stress osmotique. Ces résultats présentent la même tendance que ceux obtenus par Harb et collaborateurs (2010), lors d’une étude effectuée en terre sur l’écotype Col-0 d’A. thaliana . Ces auteurs montrent après 2 jours de stress une diminution du RWC des feuilles stressées par rapport aux feuilles témoins (-5%), et après 6 jours de stress, des valeurs comparables de ce paramètre dans les feuilles témoins et stressées (RWC d’environ 72%). Ces résultats indiquent donc que les plantes sont capables de s’acclimater pour retrouver un nouvel équilibre hydrique après une exposition prolongée à un stress modéré. Il est aussi intéressant de noter que ce phénomène est observé à la fois en hydroponie et en terre. En ce qui concerne les racines, le potentiel osmotique et le RWC varient très peu entre les plantes témoins et les plantes stressées. Ne pouvant pas dégager de variation nette de ces deux paramètres dans les racines stressées, les mesures du RWC et du potentiel osmotique ne seront réalisées que sur les feuilles lors des prochaines expérimentations. Le suivi de la biomasse des plantes semble montrer que le stress osmotique n’a pas d’impact sur l’accumulation de biomasse des plantes (feuilles et racines) stressées après 3 jours. En revanche, après 6 jours de stress osmotique, la biomasse des feuilles et racines stressées est plus faible que celle des racines et feuilles témoins du même âge. De même, le rapport R/S, mesuré après 3 jours de stress, est comparable entre les plantes témoins et stressées, mais diminue après 6 jours. Cette diminution serait due à une légère augmentation de la masse sèche de la rosette plutôt qu’à une diminution de la masse sèche des racines. Autrement 121 RESULTATS ET DISCUSSION dit, il semblerait que l’accumulation de biomasse des racines soit stoppée entre 3 et 6 jours de stress, alors que celle des feuilles, bien que très ralentie, continue entre ces deux moments de récolte. Cette augmentation de biomasse dans les feuilles pourrait être due en partie à l’accumulation d’anthocyanes observée dans cet organe au cours du stress. L’accumulation d’anthocyanes dans les feuilles de l’écotype Col-0 est un phénomène qui a déjà été observé au cours de son développement (Wingler et al 2004). Afin de mieux suivre l’état physiologique des plantes au cours du stress hydrique, le dosage des chlorophylles totales a été effectué sur les plantes témoins et les plantes stressées. Les résultats indiquent que la teneur en chlorophylle diminue de façon significative chez les plantes stressées après 3 et 6 jours de stress osmotique. La diminution de la teneur en chlorophylles au cours d’un stress hydrique est un phénomène décrit dans la littérature depuis longtemps. Les travaux d’Alberte et al. (1977) montrent par exemple une diminution de 27% de la quantité en chlorophylles totales, 2 jours après l’application d’un stress hydrique par arrêt d’arrosage sur le maïs. Des études réalisées par Wingler et collaborateurs (2004) sur A. thaliana montrent que la diminution de la teneur en chlorophylles des feuilles s’accompagne d’un stress oxydatif (accumulation de ROS) dû au déséquilibre produit entre l’énergie lumineuse capturée et dissipée au niveau des antennes collectrices des photosystèmes. Ces résultats sont en accord avec les observations d’accumulation d’anthocyanes dans les feuilles stressées, dont un de leur rôle est de participer à la dissipation de l’excès d’énergie d’excitation et à la protection de l’appareil photosynthétique. De plus, ces auteurs montrent que la diminution de la teneur en de chlorophylles des feuilles est associée à une baisse de l’activité photosynthétique du photosystème II. Aussi nos résultats sur les teneurs en chlorophylles dans les feuilles laissent penser que le stress hydrique appliqué entraine une diminution de l’activité photosynthétique dans les plantes en condition de stress. Cette hypothèse semble aussi appuyée par les résultats de dosage de certains éléments de la plante comme le magnésium ou le phosphore, directement impliqués dans les processus de photosynthèse, et dont la quantité diminue dans les feuilles en condition de stress osmotique. Plusieurs études ont en effet montré une diminution importante de l’activité photosynthétique de la plante au cours d’un stress hydrique entrainée d’une part, par la moins grande disponibilité en CO2 dans les tissus résultant de la fermeture des stomates (Sperdouli and Moustakas 2012), et d’autre part par la diminution de l’activité métabolique des cellules des feuilles au cours du stress hydrique (Hummel et al. 2010). 122 RESULTATS ET DISCUSSION 3.5.9.2 Etude de paramètres liés au transport et au métabolisme du carbone des plantes en condition de stress osmotique L’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre a été effectuée par RT-qPCR en temps réel sur les racines des plantes témoins et stressées (3 et 6 jours à 2,5% de PEG). Les résultats montrent une répression de l’expression de 3 gènes, AtSUC1, AtSUC5 et AtPLT6 ainsi que l’induction d’un gène AtSTP13 après 3 jours de stress à 2,5%. Ces résultats corroborent les résultats précédemment obtenus lors de l’expérimentation « Essais stress Col0» où les mêmes variations d’expression avaient été mesurées dans les racines stressées. L’induction du gène AtSTP13 dans les racines d’A. thaliana a aussi été retrouvée dans une étude effectuée par Yamada et collaborateurs (2011) en condition de stress salin. En effet, ce transporteur de sucre permettrait l’absorption des hexoses présents dans la rhizosphère en condition de stress salin. En ce qui concerne les gènes AtSUC1 et AtSUC5, il est possible d’imaginer que la diminution de l’expression de ces gènes entrainerait une diminution du déchargement du saccharose au niveau des racines. L’expression de tous ces gènes semble en revanche retourner à un niveau témoin après 6 jours de stress à 2,5% de PEG. L’étude du contenu en sucres solubles dans les racines et les feuilles des plantes témoins et stressées a permis de montrer une augmentation assez importante de la teneur en saccharose, aussi bien dans les racines que dans les feuilles stressées, après 3 et 6 jours de stress osmotique. En ce qui concerne la teneur en hexose dans les racines, les résultats montrent qu’elle est beaucoup plus importante dans les racines témoins à J43 qu’à J46. En raison de cette très forte variabilité dans les plantes témoins, il est difficile d’interpréter les différences mesurées en conditions de stress osmotique dans les racines. Dans les feuilles, après 3 et 6 jours de stress, une augmentation assez importante de la teneur en glucose et fructose est mesurée. Plusieurs études ont montré une accumulation de sucres dans les feuilles des plantes en condition de stress hydrique. Les travaux réalisés par Xue et collaborateurs (2008) ont par exemple montré chez le blé qu’un stress hydrique entraine l’accumulation de 10 fois plus de glucose et fructose dans les feuilles stressées par rapport au feuilles témoins. Une autre étude, réalisée sur le maïs, a aussi montré une forte accumulation de glucose, fructose et, dans une moindre mesure, de saccharose dans les feuilles subissant un stress hydrique (Pelleschi et al. 1997). Chez A. thaliana , les travaux de Hummel et collaborateurs (2010) ont aussi mis en évidence une accumulation d’hexose et de saccharose au cours d’un stress hydrique appliqué en terre. De même, lors d’un stress hydrique réalisé par application de 100 mM d’ABA sur des plantes de l’écotype Col-0 cultivées en boite de Pétri, le dosage de ces sucres montre que leurs teneurs augment au cours du stress (Taji et al ,2002). Les sucres 123 RESULTATS ET DISCUSSION accumulés dans les feuilles des plantes stressées pourraient jouer un rôle dans l’ajustement osmotique des cellules (Bray et al. 1997 ; Chaves et al. 2003). Cette augmentation de la quantité de sucres dans les feuilles coïncide effectivement dans notre étude avec la diminution importante du potentiel osmotique dans les feuilles stressées. De plus cette augmentation des sucres solubles est maintenue pendant la durée du stress dans les feuilles. La grande quantité de sucres solubles mesurés dans les feuilles des plantes stressées pourrait aussi être à l’origine de l’accumulation d’anthocyanes observée en condition de stress. En effet, il a été montré que les sucres induisent l’activité de certaines enzymes de la voie de biosynthèse des anthocyanes dans les feuilles en condition de stress hydrique (Solfanelli et al. 2006). Afin de mieux comprendre l’origine de l’accumulation de ces sucres, le dosage de l’amidon a été effectué. En effet, plusieurs études ont montré qu’au cours d’un stress hydrique, l’amidon était dégradé afin de pourvoir les besoins en sucres pour la respiration ou bien pour permettre l’accumulation de sucres solubles comme composés compatibles (Basu et al. 2007, Todaka et al. 2000). De façon surprenante, aucune diminution de la quantité d’amidon n’est mesurée dans les plantes stressées par rapport aux plantes témoins dans notre expérimentation. Il est possible de penser que cette différence est liée à notre système de culture. En effet, comme il a pu être discuté au cours du sous-chapitre 3.2, il semblerait que les teneurs en sucres solubles mesurées dans notre étude soient plus importantes que celle mesurées sur des plantes en terre. Il est alors possible de penser que les quantités de sucres des feuilles soient suffisantes pour les besoins de la plante, sans faire appel aux sucres stockés sous forme d’amidon. Un grand nombre de paramètres que nous avons mesurés sur les plantes après 6 jours stress ont tendance à revenir à des valeurs proches de celles mesurées sur les plantes témoins notamment dans les feuilles. Ceci indique que les variations notées sur les plantes après 3 jours de stress sont en fait transitoires et correspondent à la réponse rapide au stress osmotique. Ces observations concernent les paramètres liés au contenu hydrique comme le RWC et le potentiel osmotique et l’expression des gènes marqueurs du stress et de transporteurs de sucre. Ces résultats indiquent que notre protocole d’application du stress a permis une acclimatation des feuilles aux conditions de stress après 6 jours. Cette acclimatation de la plante au stress appliqué est possible grâce au rétablissement d’une certaine homéostasie de l’eau dans les feuilles. Un tel processus a été observé lors de l’acclimatation des plantes à un stress hydrique modéré (Ingram and Bartels 1996). Pour permettre 124 Figure 72 : Schéma du protocole expérimental d’application du stress utilisé au cours de l'« Essai réhydratation ». Les 36 plantes de l’écotype Col-0 sont cultivées dans 2 bacs Araponics individuels (bac témoin et bac stressé ; 18 plantes/bac) pendant 35 jours dans le Gibeaut. Au bout de 35 jours de culture (J35), une première dose de PEG est ajoutée au milieu nutritif du bac réservoir stressé permettant d’atteindre une concentration de 1%. Puis 1% de PEG est ajouté à J37 pour atteindre la dose 2%. La concentration de PEG a ensuite été augmentée de 0,5%, car les plantes présentaient les premiers signes de flétrissement après l’application de la dose 2%, pour atteindre la concentration de 2,5% à J 39 et 3% à J41. Une première récolte de 12 plantes (6 plantes témoins et 6 plantes stressées) a été réalisée après 2 jours d’application de la dose 3% (J43). A J43, le milieu de culture des 2 bacs a été changé par du milieu nutritif frais et les plantes du bac stressé ont suivi la phase de réhydratation pendant une semaine. L’ensemble des plantes (6 témoins et 6 stressées) a été récolté à J50. RESULTATS ET DISCUSSION une telle réponse, plusieurs phénomènes physiologiques doivent être mis en place par la plante stressée, et l’un de ces phénomènes pourrait être l’accumulation de solutés compatibles, comme certains sucres solubles. Il y a toutefois deux exceptions notables pour les paramètres que nous avons mesurés : la teneur en chlorophylles dans les feuilles reste à un niveau faible après 6 jours de stress alors que la teneur en sucres solubles est maintenue à un fort niveau dans des feuilles entre 3 et 6 jours de stress. La forte teneur en sucres solubles, notamment en hexoses, est certainement nécessaire pour rétablir l’équilibre hydrique dans les feuilles. En revanche, l’explication de l’origine de ces sucres dans les feuilles reste problématique dans la mesure où les quantités d’amidon ne varient pas de façon significative. Cette accumulation pourrait résulter du fait que la photosynthèse des plantes est inhibée moins rapidement que le métabolisme de croissance des plantes. La non utilisation des sucres produits entrainerait alors leur accumulation dans les cellules les produisant (Muller et al. 2011). 3.6 Mise en place du stress osmotique suivi d’une réhydratation sur l’écotype Col-0 (« Essai réhydratation ») L’expérimentation « Campagne stress » a permis de montrer que le protocole expérimental que nous avons mis en place avec l’application progressive de PEG dans le milieu de culture hydroponique permet de se rapprocher de la réponse des plantes vis-à-vis d’un stress hydrique modéré, du moins en ce qui concerne les critères étudiés. Ce protocole d’application du stress a ainsi permis de mettre en évidence une expression contrastée des gènes de transporteurs de sucre suite au stress osmotique par comparaison avec les conditions témoins Afin de mimer les conditions hydriques observées en conditions naturelles caractérisées par des alternances de périodes de déficit hydrique et de périodes de régimes hydriques satisfaisants, nous avons souhaité mettre en place un protocole de réhydratation pour nous permettre l’étude de la réversibilité de la réponse des plantes vis-à-vis du stress. Comme pour l’« Essai stress Col-0 » et la « Campagne stress », la première concentration en PEG appliquée à J35 est de 1%, puis celle-ci a été augmentée 2 jours après (J37) pour atteindre 2% (Figure 72). Par la suite, la concentration en PEG dans le milieu de culture a été augmentée de 0,5% pour atteindre la concentration de 2,5% à J41. Il semblerait que lors des expérimentations « Essais », la dose de 2,5% de PEG induise peu de symptômes de flétrissement des feuilles, comme cela a été observé lors des expérimentations sur les systèmes complets d’hydroponie. En effet, pour retrouver les mêmes 125 Figure 73 : Photographies des rosettes de l'écotype Col-0 d'Arabidopsis thaliana au cours de la mise en place du stress hydrique et de la réhydratation. (A) Photographies des rosettes de l'écotype Col-0 un jour après l’application des concentrations en PEG de 2%, 2,5% et 3% respectivement à J38, J40 et J42. (B) : Photographies d’une rosette de l’écotype Col-0 deux jours après l’application de 3% de PEG (J43) et à J44, J47 et J50 correspondant à la semaine de réhydratation après le remplacement du milieu de culture avec PEG par le milieu nutritif seul. Figure 74 : Photographie d’une rosette d’Arabidopsis thaliana, présentant un dépôt de cristaux blancs sur la face supérieure, après un stress osmotique à 3% de PEG (J43). RESULTATS ET DISCUSSION symptômes de flétrissement des feuilles de la rosette, il faut attendre la concentration de 3% de PEG dans le milieu de culture. Ce résultat pourrait s’expliquer par la forte densité des plantes dans les systèmes « Essais » (18 plantes par bacs) comparés au système complet, où les plantes sont éclaircies (7 plantes par bacs). En effet, la forte densité de plantes dans les systèmes « Essais » permet le recouvrant des feuilles des plantes contigües. Ceci aurait pour effet une limitation de l’évapotranspiration des plantes qui seraient alors en mesure de résister à des doses plus fortes de PEG. Dans le système complet, les plantes ne sont plus que 7 par plateau au lieu de 18, et ces plantes sont assez éloignées les unes des autres pour que leurs feuilles ne se recouvrent pas. Du fait cette adaptation des plantes lors de cette expérimentation, un dernier ajout de PEG a été effectué à J43 pour atteindre la concentration de 3% de PEG dans le milieu de culture. Les plantes sont laissées pendant 2 jours à cette dernière dose de PEG avant une première récolte. A la suite du stress osmotique, les plantes sont réhydratées en remplaçant le milieu de culture avec PEG par du milieu nutritif frais. Les plantes ainsi réhydratées sont récoltées après une semaine. 3.6.1 Observation phénotypique des plantes Le phénotype des plantes a été suivi au cours de l’application du stress osmotique et pendant la semaine de réhydratation. Comme dans les études précédentes (« Essai stress Col0 » et « Campagne stress »), un brunissement des racines est observé un jour après l’application de PEG (1% de PEG) dans le milieu de culture (résultats non montrés). Les premiers symptômes de flétrissement sur les feuilles apparaissent dès 2,5% pour cette expérimentation. Ces symptômes sont beaucoup plus importants pour la dose de 3% (Figure 73A). De plus, au cours de cette expérimentation, un nouveau symptôme est apparu sur les feuilles des plantes stressées : un dépôt de cristaux blancs apparait sur les feuilles adultes du centre de la rosette après l’application de 3% de PEG dans le milieu nutritif (Figure 74). Lors des premières observations, il a été supposé que les cristaux présents sur les feuilles adultes de la rosette étaient le résultat d’une sécrétion par les feuilles de PEG absorbé par les racines. Un prélèvement de ces cristaux a été effectué et étudié par analyse thermodifférentielle et thermogravimétrique (ATD-ATG) (plateforme de chimie, par Christelle Roudaut). Cette analyse soumet l’échantillon à une gamme de température allant de la température ambiante jusqu’à une température de 600°C par pallier de 5°C toutes les minutes, et mesure la perte de masse de l’échantillon tout au long de l’analyse. Ainsi, il a été montré que les cristaux blancs sont 126 Figure 75 : Valeurs moyennes de RWC calculées à partir de feuilles de plantes témoins et de plantes stressées (2 jours à 3% de PEG J43). Les moyennes (± écart type) sont calculées à partir de 3 feuilles par plante, sur 3 plantes témoins et 3 plantes stressées soit 9 feuilles au total. Figure 76 : Valeurs moyennes de potentiels osmotiques calculées à partir de 3 les feuilles de plantes témoins et stressées (2 jours à 3% de PEG). Les moyennes (± écart type) sont calculées à partir de 3 plantes et 3 mesures par plante ont été effectuées. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). RESULTATS ET DISCUSSION détruits par une température légèrement supérieure à 100°C, alors que pour la même température, la masse du PEG pur n’a pas évolué. Il faut atteindre 300°C pour que le PEG soit détruit. Cette analyse laisse penser que ces cristaux blancs sont formés par une autre molécule que le PEG. Des analyses en spectrographie de masse sont en cours et en vue de déterminer leur nature. La Figure 73B représente l’évolution du phénotype des rosettes à partir de la fin de l’application du stress osmotique (J43, 3% de PEG) et pendant la période de réhydratation (de J43 à J50). Dès le lendemain de la réhydratation, les jeunes feuilles du centre de la rosette semblent retrouver un phénotype similaire à celui des feuilles témoins. Les feuilles plus matures, qui présentaient des symptômes de flétrissement « moyen » après 2 jours à 3% de PEG, commencent aussi à retrouver un phénotype identique à celui des feuilles témoins (Figure 73B). Le recouvrement du phénotype témoin de ces deux lots de feuilles est observé tout au long de la semaine de réhydratation (Figure 73B). En effet, les jeunes feuilles continuent leur croissance et les feuilles plus matures reprennent un développement normal, comme celui observé sur les feuilles des plantes témoins. Parallèlement, de nouvelles feuilles vont émerger au centre de la rosette. En revanche, pour certaines feuilles plus âgées présentant les symptômes de flétrissement les plus importants, les tissus ne se sont pas réhydratés et montrent plutôt une accentuation du processus jusqu’au dessèchement complet des feuilles (Figure 73B). 3.6.2 Etude de l’état hydrique des plantes : - Comparaison plantes témoins/plantes stressées Afin de comparer l’état hydrique des plantes en conditions témoins et en conditions stressées, le RWC et le potentiel osmotique des feuilles ont été déterminés. Pour cette expérimentation Essai, le nombre de plantes disponibles étant assez limité, le RWC a été mesuré sur 3 feuilles adultes prélevées sur 3 plantes témoins et 3 plantes stressées après 2 jours de culture à 3% de PEG (J43). Les résultats indiquent que la valeur moyenne de RWC des feuilles témoins (81,2%) est supérieure à celle des feuilles stressées (71,9% ; Figure 75) ce qui représente une diminution de 9,3% entre les deux conditions. Le potentiel osmotique des feuilles a été calculé à partir de la mesure de l’osmolarité des tissus de 3 feuilles adultes prélevées sur 3 plantes témoins et 3 plantes stressées (9 feuilles au total). Les résultats représentés Figure 76 montrent que le potentiel osmotique des feuilles des 127 Figure 77 : Valeurs moyennes de RWC calculées à partir de 3 feuilles de plantes témoins et de plantes réhydratées (J50). Les moyennes (± écart type) sont calculées à partir de 3 plantes témoins et 3 plantes stressées. Figure 78 : Valeurs moyennes de potentiels osmotiques calculées et les feuilles des plantes témoins et stressées (2 jours à 3% de PEG). Les moyennes (± écart type) sont calculées à partir de 3 plantes et 3 mesures par plante ont été effectuées. Un test de Mann et Witney a été effectué. Des lettres différentes sur le graphique indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05). RESULTATS ET DISCUSSION 128 Figure 79 : Expression relative des gènes AtRD29a et AtTIP1;2 dans les racines des plantes témoins et stressées (2 jours à 3% de PEG J43). Pour chaque gène, l’expression mesurée par RT-qPCR dans les racines de 5 plantes est normalisée par rapport à l’expression du gène de référence At5g12240. Figure 80 : Rapport de l’expression relative des gènes AtRD29a et AtTIP1;2 mesurée par RT-qPCR dans les racines après le stress osmotique (2 jours à 3% de PEG ; A) et après une semaine de réhydratation (B). L’expression des gènes a été mesurée sur un mélange de 5 plantes et est normalisée par rapport à l’expression du gène de référence At5g12240. Le logarithme de base 2 du rapport d’expression dans les deux conditions (Traité/Tm), est reporté sur le graphe. Une valeur seuil de log2 ≥1,5 (ou ≤ -1,5) a été définie pour considérer un gène comme induit ou réprimé. RESULTATS ET DISCUSSION plantes stressées (-1,18 MPa) est significativement inférieur ( = -0,25) à celui mesuré dans les plantes témoins (-0,93 MPa). Après une semaine de réhydratation (J50), 3 plantes témoins et 3 plantes stressées ont été récoltées pour déterminer le RWC des feuilles (sur 3 feuilles adultes). Le RWC calculé pour les feuilles des plantes réhydratées (Réhy = 68,9%) est inférieur ( = -7,71%) à celui des feuilles des plantes témoins (TmRéhy = 76,6% ; Figure 77). Cependant l’écart des valeurs de RWC réhydratées vs témoins à J50 ( = - 7,71%) est moindre que celui observé pour témoins vs stressées à J43 ( = -9,3%). Le potentiel osmotique de 3 feuilles a été déterminé sur 3 plantes témoins et 3 plantes réhydratées. Les résultats représentés Figure 78 indiquent que le potentiel osmotique des feuilles témoins (-0,9 MPa) et réhydratées (-0,85 MPa) est pratiquement identique. 3.6.3 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre par qRT-PCR Dans cette expérimentation « Essai réhydratation », l’étude de l’expression des transporteurs de sucre a été réalisée par l’analyse macroarray sur les racines et les feuilles dans les conditions témoins vs stressées ainsi témoins vs réhydratées (Résultats non montrés). Comme aucun nouveau gène n’avait été identifié, l’expression des gènes de transporteurs de sucre retrouvés en macroarray a été vérifiée par RT-qPCR dans les racines en conditions témoins vs stressées ainsi que témoins vs réhydratées. - Etude de l’expression des gènes marqueur du stress et des gènes de transporteurs de sucre dans les racines en conditions témoin, de stress osmotique et réhydratée Dans un premier temps, l’expression des gènes AtRD29a et AtTIP1,2, gènes marqueurs du stress hydrique, a été étudiée par RT-qPCR. La Figure 79 présente les résultats d’expression de ces 2 gènes et montre que l’expression d’AtRD29a est supérieure dans les racines stressées par rapport aux racines témoins. Le gène AtTIP1;2, quant à lui, est fortement réprimé dans les racines stressées par rapport aux racines témoins. La comparaison de l’expression de ces deux gènes a été effectuée par le calcul du rapport de leur expression mesurée dans les racines stressées par rapport aux racines témoins (Figure 80A). Ainsi, les résultats montrent que l’expression du gène AtRD29a est augmentée de 7 fois dans les racines stressées par rapport aux racines témoins. A l’inverse, l’expression du gène AtTIP1;2 diminue de 77 fois dans les racines stressées par rapport aux racines témoins. Après une période de réhydratation d’une semaine, l’expression de ces deux gènes dans les racines des plantes réhydratées est semblable à celle mesurée dans les plantes témoins (Figure 80B). 129 Figure 81 : Expressions relative de six gènes de transporteurs de sucre dans les racines des plantes témoins et stressées (2 jours à 3% de PEG J43). Pour chaque gène, l’expression mesurée par RT-qPCR dans les feuilles de 5 plantes est normalisée par rapport à l’expression du gène de référence At5g12240. Figure 82 : Etude de l’expression par RT-qPCR de six gènes de transporteurs de sucre dans les racines d’Arabidopsis thaliana en condition témoin et de stress osmotique (A) et en condition témoin et réhydratation (B). L’expression des gènes a été mesurée sur un mélange de 5 plantes et est normalisée par rapport à l’expression du gène de référence At5g12240. Le logarithme de base 2 du rapport d’expression dans les deux conditions (St/Tm), est reporté sur le graphe. Une valeur seuil de log2 ≥1,5 (ou ≤ -1,5) a été définie pour considérer un gène comme induit ou réprimé. RESULTATS ET DISCUSSION L’étude de l’expression des 6 gènes de transporteurs de sucre préalablement sélectionnés par les résultats de macroarray a été réalisée. Les résultats montrent que le gène le plus exprimé dans les racines témoins est le gène AtSUC1. Les gènes les plus exprimés sont ensuite AtPLT5, AtSUC2, AtSUC5, AtPLT6 et AtSTP13 (Figure 81). Les rapports d’expression entre les conditions stressées et témoins pour ces 6 gènes sont représentés sur la Figure 82A. Les résultats montrent dans un premier temps que l’expression des gènes AtSUC2 et AtPLT5 ne varie quasiment pas (rapport d’expression inférieur au seuil de log2 de ±1,5). En revanche pour les gènes AtSUC1, AtSUC5 et AtPLT6, une forte répression de leur expression est mesurée dans les racines stressées. Le gène AtSTP13, quant à lui, voit son expression fortement augmenter dans les racines stressées. Les rapports d'expression des gènes exprimés dans les racines réhydratées sur les gènes exprimés dans les racines témoins sont présentés sur la Figure 82B. Les résultats montrent que les différences d’expression observées dans les racines témoins et les racines réhydratées sont très faibles. L’expression des gènes de transporteurs de sucres observés dans les racines après réhydratation est revenue à un niveau comparable à celui observé dans les racines témoins. - Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les feuilles en condition témoin, en condition de stress osmotique et en réhydratation L’analyse de l’expression des transporteurs de sucre dans les feuilles a été réalisée par macroarray pour les conditions témoins vs stressées ainsi témoins vs réhydratées (Résultats non montrés). Cette étude a été réalisée afin de la comparer au profil déjà établi au laboratoire (stress hydrique en terre, communication personnelle Maryse Laloi, manuscrit de thèse Cyril Abadie) afin de valider notre protocole expérimental en hydroponie. Les résultats macroarray ont permis de montrer le même profil d’expression pour les gènes de transporteurs de sucre que celui observé lors de l’expérimentation « Essai stress Col0 » (AtPLT5, AtPLT6, AtSTP13, AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5). Les résultats indiquent une augmentation de l’expression des gènes AtSUC2, AtPLT5, AtSTP3, AtSTP7 et AtSTP13 ainsi qu’une diminution de l’expression du gène AtSUC1. L’analyse de l’expression des transporteurs de sucre des feuilles des conditions témoins vs réhydratées par macroarray montre que leur expression est revenue à un niveau comparable à celui observé dans feuilles témoins. 130 RESULTATS ET DISCUSSION Tout comme pour les racines ces résultats semblent montrer que les modifications d’expression des gènes observées lors du stress osmotique sont réversibles et qu’une période de réhydratation d’une semaine permet un retour de l’expression de ces gènes à un niveau témoin. 3.6.4 Discussion L’expérimentation « Essai réhydratation » a été réalisée afin de mettre en place un protocole de stress osmotique suivi d’une période de réhydratation des plantes stressées. Cette expérimentation avait pour but de déterminer si dans nos conditions, une période de réhydratation appliquée après un stress osmotique pouvait permettre une restauration de la croissance des plantes stressées. Dans un premier temps un stress osmotique par ajout progressif de PEG a été appliqué. L’observation phénotypique des plantes a permis de mettre en évidence un brunissement des racines dès l’ajout de PEG dans le milieu nutritif, et un début d’apparition des symptômes de flétrissement des feuilles à 2,5% de PEG, qui ont atteint leur maximum pour la dose de 3%. A ce stade, les symptômes observés sur les plantes étaient identiques à ceux observés lors de l’expérimentation « Campagne stress ». Au cours de la semaine de réhydratation, une reprise de croissance des jeunes feuilles et une récupération de l’état hydrique des feuilles un peu plus développées est observée. Ce phénomène est classiquement observé sur les plantes d’A. thaliana cultivées en terre, réhydratées après un stress hydrique modéré (Chaves et al. 2009). Tout comme pour les expérimentations précédentes (« Essai stress Col-0 » et « Campagne stress »), la mesure du RWC et du potentiel osmotique a permis de mettre en évidence une diminution de ces deux paramètres dans les feuilles des plantes stressées par rapport aux plantes témoins. Il est tout de même à noter que la diminution de RWC des feuilles stressées est plus importante dans cette expérimentation que celle mesurées dans les expérimentations « Essai stress Col-0 » et « Campagne stress ». Ce résultat pourrait être expliqué par le fait que dans cette étude, le RWC n’a été mesuré qu’à partir de 3 feuilles de la rosette, en raison du faible nombre de plantes disponibles, et non sur la rosette entière comme pour ces 2 autres expérimentations. Il peut être supposé que l’échantillonnage est responsable d’un biais dans la mesure du RWC. En effet, l’absence des jeunes feuilles, moins touchées par le stress osmotique, peut entrainer une valeur de RWC plus basse. La mesure du potentiel osmotique des feuilles a permis de mettre en évidence une diminution de ce paramètre dans les feuilles stressées (J43, 2 jours à 3%) comme cela a été observé 131 RESULTATS ET DISCUSSION pour les plantes stressées lors de « l’essai stress Col-0 » et la « Campagne stress ». La diminution du potentiel osmotique observé dans les feuilles au cours du stress hydrique pourrait être la conséquence de la faible consommation des solutés organiques de la cellule (saccharose par exemple), en plus d’une réponse de la plante accumulant des osmoticums (Serraj and Sinclair 2002) Après une semaine de réhydratation, les résultats de RWC semblent indiquer que cette période de réhydratation ne permet pas de retrouver des valeurs de RWC comparables à celles des feuilles témoins dans les feuilles réhydratées. Ainsi, après une période de réhydratation, la reprise de l’activité métabolique de la plante, et donc la consommation des composés organiques jusque-là accumulés dans la cellule, expliquerait un retour du potentiel osmotique à des valeurs comparables à celles des plantes témoins, sans que pour autant la turgescence normale des cellules soit rétablie. En revanche, après une semaine de réhydratation, la mesure du le potentiel osmotique des feuilles réhydratées indique que celui-ci revient à des valeurs comparables à celles des feuilles témoins. Ces valeurs sont proches de celles retrouvées pour des feuilles d’A. thaliana en conditions normales de culture de -0,9 MPa (Déjardin et al. 1999). Ce rétablissement assez rapide du potentiel osmotique après réhydratation est un résultat couramment observé après l’application d’un stress hydrique modéré sur les plantes d’A. thaliana (Jung 2004 ; Martre et al. 2002) L’analyse de l’expression des gènes de transporteurs de sucre par macroarray et par RTqPCR a été effectuée dans les racines témoins et stressées. Les résultats ont mis en évidence, une forte répression des gènes AtSUC1, AtSUC5 et AtPLT6 dans les racines stressées alors que le gène AtSTP13 y est surexprimé. Ces résultats confirment les modifications d’expression mesurées lors des expérimentations « Essai stress Col-0 » et « Campagne stress ». Dans les feuilles et pour les mêmes conditions, les résultats de macroarray confirment l’expression des mêmes transporteurs de sucre que ceux précédemment identifiés lors de l’« Essai stress Col-0 », mais aussi les résultats obtenus au laboratoire lors de l’étude d’un stress hydrique sur les feuilles d’A. thaliana en terre après arrêt d’arrosage (communications personnelles Cyril Abadie et Maryse Laloi). Pour les racines comme pour les feuilles, après une semaine de réhydratation, les résultats ont permis de montrer que les gènes présentant variation d’expression dans ces deux organes au cours du stress osmotique, retrouvent une expression proche de celle des plantes témoins après 132 Figure 83 : Schéma du protocole expérimental permettant l’étude d’un stress avec réhydratation (Expérimentation « Campagne réhydratation »). Les 288 plantes de l’écotype Col-0 sont cultivées dans 16 bacs Araponics (8 bacs témoins et 8 bacs stressés; 72 plantes par condition) pendant 24 jours dans le milieu nutritif. Une première dose de PEG est ajoutée au milieu nutritif des bacs-réservoirs après cette date, permettant d’atteindre une concentration de 0,5%. Par la suite 0.5% de PEG est ajouté au milieu de culture tous les 2 jours jusqu’à l’obtention d’une concentration de 2,5% de PEG. Trois jours après l’application de 2,5% de PEG le milieu de culture des bacs-réservoir St a été changé par du milieu nutritif frais et les plantes du bac stressé ont suivi la phase de réhydratation pendant une semaine. RESULTATS ET DISCUSSION une semaine de réhydratation. Ces résultats montrent que les modifications d’expression des gènes sont réversibles. Une étude transcriptomique réalisées sur A. thaliana a permis de montrer que sur les 2000 gènes dont l’expression est modifiée en condition de stress hydrique modéré (diminution de 5% du RWC des plantes pendant 5 jours), la plupart d’entre eux retrouvent une expression témoins après seulement 3h de réhydratation (Huang et al. 2008). Ceci semble confirmer que le stress appliqué dans notre expérimentation est bien un stress modéré permettant un rétablissement des plantes. Cette première étude de la réhydratation des plantes après une période de stress osmotique montre que la période d’une semaine est suffisante pour retrouver un profil d’expression des gènes comparable à celui des plantes témoins. Cependant, le suivi de l’état hydrique des plantes a montré que cette semaine de réhydratation ne permettait pas la restauration d’un RWC comparable à celui des plantes témoins chez les plantes réhydratées. Le faible nombre d’échantillons étudiés lors de cette expérimentation ne permet cependant pas de montrer de différence significative entre ces valeurs. Pour ce faire, une étude de la réhydratation sur un nombre de plantes plus important a été effectuée. 3.7 Etude d’un stress hydrique suivi d’une réhydratation (« Campagne réhydratation ») Dans le but de confirmer les résultats obtenus au cours de l’« Essai réhydratation », l’étude de la réhydratation des plantes après l’application d’un stress osmotique a été effectuée sur quatre systèmes d’hydroponie, permettant ainsi l’étude d’un plus grand nombre de plantes. Ceci permet de mesurer de nouveaux paramètres physiologiques, comme la surface foliaire et la conductance stomatique ,ainsi qu’un plus grand nombre de paramètres liés au métabolisme carboné des plantes, notamment la quantité de sucre et le transport à longue distance. Le protocole d’application du stress et de réhydratation a été légèrement modifié par rapport à celui qui a été utilisé lors de « l’essai réhydratation ». D’une part, l’apparition des premiers symptômes de stress sur les feuilles dès la dose 2,5% de PEG observé lors de « l’essai réhydratation » nous a amené à choisir cette dose comme nouvelle concentration finale en PEG. D’autre part, l’observation de l’apparition de cristaux blancs sur les feuilles après l’application de la dose maximale de PEG 3% (« essai réhydratation »), nous a amené à penser que cette apparition pouvait être due à une réaction de la plante vis à vis d’une exposition trop rapide des plantes au PEG. Ceci nous a conduits à établir un protocole d’ajout de PEG dans le milieu de culture encore plus progressif. Pour cela, l’ajout de PEG dans le milieu nutritif s’est fait de 0,5% en 0,5% jusqu’à l’obtention de la dose de 2,5% (Figure 83). 133 Figure 84 : Photographies de l'écotype Col-0 d'Arabidopsis thaliana au cours du stress osmotique, lors de la « Campagne réhydratation ». (A) Photographies des rosettes de l'écotype Col-0 le jour de l’application du stress (T0), un jour après l’application des concentrations en PEG de 0,5%, 1%, 1,5%, 2% (respectivement à J 25, J27, J29, J31) et trois jours après l’application de la dose de 2,5% (J35) ; (B) Photographies d’une rosette de plante témoin et de plante stressée en réhydratation pendant la semaine de réhydratation (J35 à J42). RESULTATS ET DISCUSSION Pour que les plantes ne soient pas trop âgées à la fin de la période de stress, le premier ajout de PEG s’est effectué à J24 (au lieu de J35 pour l’ensemble des expérimentations précédentes) permettant d’atteindre la concentration en PEG de 2,5% à J 32. Après 3 jours de suivi des plantes à cette dose, le milieu de culture contenant le PEG est remplacé par un milieu de culture frais. Les plantes en réhydratation sont ensuite suivies pendant toute une semaine. 3.7.1 Observation phénotypique des plantes Comme observé pour les expérimentations « Essais » d’application du stress osmotique (« Essai stress Col-0 », « Essai réhydratation ») et la « Campagne stress », l’ajout progressif de PEG dans le milieu de culture entraine un brunissement des racines dès la première dose ajoutée, et un flétrissement des feuilles stressées dès l’ajout de la dernière dose de PEG dans le milieu nutritif (ici 2,5%). Pour cette nouvelle expérimentation, ce flétrissement augmente progressivement pendant les 3 jours suivant l’ajout de cette dose de PEG (Figure 84A). Au cours de la période de réhydratation, ces symptômes disparaissent progressivement sur les jeunes feuilles et les feuilles plus développées. Aussi, l’apparition de cristaux blancs a été notée sur les feuilles adultes du centre de la rosette des plantes stressées après l’application de la dernière dose de PEG 2,5%. De plus, de façon surprenante, ces cristaux sont apparus sur des feuilles adultes stressées après 3 jours de réhydratation (J38), alors que celles-ci n’en possédaient pas lors de l’application du PEG (feuilles à l’extérieur du centre de la rosette (Figure 84B). Par ailleurs, pendant cette semaine de suivi des plantes, de nouvelles feuilles d’aspect normal sont apparues sur la rosette. En revanche, pour les feuilles les plus âgées, présentant des symptômes de flétrissement plus importants, les tissus montrent une accentuation du processus jusqu’au dessèchement complet des feuilles (Figure 84B). 3.7.2 Suivi de la croissance des plantes Afin d’avoir plus d’informations sur l’impact du stress osmotique sur la croissance les plantes, la surface foliaire, comme indicateur de la croissance des plantes, a été mesurée tout au long de l’expérimentation. Les résultats représentés sur la Figure 85 montrent que les plantes du lot témoin et du lot stressé ont une surface foliaire projetée équivalente avant l’application du stress osmotique. Après 25 et 27 jours de culture, lendemain des jours auxquels sont appliquées les doses de 0,5% puis 1% de PEG dans le milieu, la surface foliaire projetée des plantes stressées (1789 mm² et 2427 mm²) reste similaire à celle des plantes témoins (1801 mm² et 2371 mm² ; Figure 85). Dès l’application des doses de 1,5% et 2% de PEG, la surface foliaire projetée mesurée devient plus faible chez les plantes stressées (2955 134 Figure 85 : Evolution de la surface foliaire projetée des plantes témoins et stressées au cours de l’expérimentation « Campagne réhydratation ». Les mesures sont effectuées sur 128 plantes entre J0 et J24, 49 plantes témoins et 49 stressées entre J24 et J35 et sur 25 plantes témoins et 25 stressées entre J35 et J42. La flèche rouge sur le graphe représente le début de la période de stress osmotique et la flèche bleue le début de la période de réhydratation. Le test de Student est réalisé afin de déterminer les différences significatives qui sont indiquées sur le graphique par des astérisques. Figure 86 : Evolution de la conductance stomatique des plantes témoins et stressées au cours de du stress osmotique et de la réhydratation. Les mesures de conductance stomatique ont été effectuées sur 2 feuilles pour 5 plantes témoins et 5 plantes stressées. La flèche rouge sur le graphe représente le début de la période de stress osmotique et la flèche bleue le début de la période de réhydratation. Le test de Mann-Whitney est réalisé afin de déterminer les différences significatives qui sont indiquées sur le graphique par des astérisques. RESULTATS ET DISCUSSION mm² et 3047 mm²) que chez les plantes témoins (3020 mm² et 3443 mm²), bien qu’elle continue d’augmenter dans les deux lots étudiés. Après 3 jours de stress à 2,5% de PEG, la surface foliaire projetée mesurée sur les plantes stressées devient inférieure à celle mesurée à la dose de 2% (3020 mm² à la dose de 2% de PEG contre 2708 mm² à la dose de 2,5% de PEG). Dès le lendemain du début de la réhydratation (J36), la surface foliaire projetée des plantes stressées réhydratées augmente à nouveau (3183mm²). Tout au long de la semaine de réhydratation, la surface déterminée augmente aussi bien chez les plantes témoins (560 mm²/jour) que chez les plantes en réhydratation (356 mm²/jour). 3.7.3 Suivi de la conductance stomatique au cours du stress hydrique La mesure de la conductance stomatique, directement dépendante de l’ouverture des stomates, permet d’avoir des indications sur le taux de transpiration foliaire des plantes. La première mesure de conductance stomatique est effectuée avant la première application de PEG dans le milieu de culture (J24) et est ensuite mesurée le lendemain de chaque ajout de PEG. Les résultats présentés sur la Figure 86 montrent que la conductance stomatique mesurée à J0 du stress osmotique (J24) et après l’application de 0,5% de PEG (J25), n’est pas significativement différente entre les plantes témoins (respectivement 92 et 117 mmol.m².s-1) et les plantes stressées (119 et 110 mmol.m².s-1). En revanche, les conductances stomatiques mesurées chez les plantes stressées après l’application des doses de 1%, 1,5% et 2% de PEG (respectivement 64, 51 et 52 mmol.m².s-1) sont significativement moins élevées que celles mesurées chez les plantes témoins (respectivement 93, 85 et 83 mmol.m².s-1). Après 3 jours de stress à 2,5% de PEG, la conductance stomatique mesurée chez les plantes stressées chute drastiquement pour atteindre une valeur de 13 mmol.m².s-1 alors que celle-ci reste constante chez les plantes témoins (110 mmol.m².s-1). Dès le premier de jours de réhydratation (J36), la conductance stomatique des plantes stressées augmente (45 mmol.m².s-1). A J38 la conductance stomatique mesurée sur les plantes en réhydratation (106 mmol.m².s-1) continue d’augmenter, bien qu’elle soit toujours significativement inférieure à celle mesurée chez les plantes témoins (215 mmol.m².s-1). Après 5 (J40) et 7 (J42) jours de réhydratation, en revanche, aucune différence significative n’est mesurée dans les valeurs de conductance stomatique des plantes réhydratées et des plantes témoins. Il est tout de même à noter une augmentation de la conductance stomatique 135 Figure 87 : Valeurs moyennes de RWC (A) et de potentiel osmotique (B) pour les plantes témoins et stressées, après 3 jours de stress à 2,5% de PEG (J35). Les valeurs moyennes de RWC sont calculées pour les rosettes de 5 plantes témoins et 5 plantes. Les valeurs moyennes de potentiel osmotique sont calculées à partir du liquide cellulaire de 3 feuilles par plantes sur 5 plantes témoins et 5 plantes stressées. Un test de Mann et Witney (P < 0,05) a été effectué pour tester les différences significatives : des lettres différentes sur le graphique montrent une différence significative entre les échantillons. Figure 88 : Valeurs moyennes de RWC (A) et de potentiel osmotique (B) pour les plantes témoins et réhydratées après une semaine de réhydratation (J42). Les valeurs moyennes de RWC sont calculées pour les rosettes de 5 plantes témoins et 5 plantes réhydratées. Les valeurs moyennes de potentiel osmotique sont calculées à partir du liquide cellulaire de 3 feuilles par plantes sur 5 plantes témoins et 5 plantes réhydratées. Un test de Mann et Witney (P < 0,05) a été effectué pour tester les différences significatives : des lettres différentes sur le graphique montrent une différence significative entre les échantillons. RESULTATS ET DISCUSSION observée chez les plantes témoins (215 mmol.m².s-1 à J38, 193 mmol.m².s-1 à J40 et 199 mmol.m².s-1 à J42) tout au long de cette semaine de réhydratation. 3.7.4 Etude de l’état hydrique des plantes Dans nos expériences, l’état hydrique des plantes est déterminé par le calcul du RWC ainsi que par la mesure du potentiel osmotique. Les résultats de calculs de RWC sont présentés sur la Figure 87A. Les valeurs moyennes de RWC mesurées après 3 jours de stress à 2,5% de PEG (J35) sont inférieures pour les plantes stressées (73,2%) comparées aux plantes témoins (76,2%), bien que les différences mesurées ne soient pas significatives. Le potentiel osmotique des feuilles témoins et stressées a aussi été mesuré après 3 jours de stress osmotique (Figure 87B). Les résultats mettent en évidence une diminution significative du potentiel osmotique moyen dans les feuilles des plantes stressées. En effet, le potentiel osmotique moyen mesuré dans les feuilles des plantes stressées (-1,42 MPa) est de 0.56 MPa inférieur à celui mesuré dans les feuilles des plantes témoins (-0,86 MPa). Les résultats représentés sur la Figure 88 montrent le RWC ainsi que le potentiel osmotique des plantes réhydratées pendant une semaine (J42). Les valeurs de RWC calculées sont légèrement supérieures chez les plantes réhydratées (82,8%) par rapport aux plantes témoins (79,9% et; Figure 87A). Les valeurs de potentiel osmotique mesurées sur les feuilles des plantes témoins et réhydratées sont sensiblement identiques (respectivement -0,86 MPa et -0.90 MPa ; Figure 88B). 3.7.5 Evolution de la biomasse La mesure de la biomasse ainsi que le calcul du rapport R/S (rapport de la masse racinaire des plantes sur la masse aérienne) a été effectué sur les plantes témoins et stressées après 3 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG (J35) et à la fin de la période de réhydratation (J42). La biomasse sèche mesurée après 3 jours de stress à 2,5% de PEG dans les plantes témoins et les plantes stressées ne montre pas de différences significatives, même si les valeurs mesurées dans les plantes stressées sont plus faibles (Figure 89A), aussi bien en ce qui concerne la masse racinaire (respectivement 22 mg et 16 mg) que la masse foliaire (respectivement 132 mg et 93 mg). De la même façon, la répartition de la biomasse dans la plante évaluée par le rapport R/S ne montre pas de différence significative entre les plantes 136 Figure 89 : Masse sèche moyenne des racines et des feuilles des plantes témoins ou stressées (A) et valeurs moyennes de rapport R/S (B) mesuré après 3 jours de stress à 2,5% de PEG. La masse sèche moyenne (± écart type) a été calculée à partir de 5 plantes pour chaque condition testée. Le calcul du rapport R/S a été effectué à partir des masses sèches déterminées sur 5 plantes pour chaque condition testée. Un test de Mann et Witney (P < 0,5) a été effectué pour tester les différences significatives : des lettres différentes sur le graphique montrent une différence significative entre les échantillons. Figure 90 : Masse sèche moyenne des racines et des feuilles des plantes témoins ou réhydratée (A) et valeurs moyennes de rapport R/S (B) mesuré après une semaine de réhydratation (J42). La masse sèche moyenne (± écart type) a été calculée à partir de 5 plantes pour chaque condition testée. Le calcul du rapport R/S a été effectué à partir des masses sèches déterminées sur 5 plantes pour chaque condition testée. Un test de Mann et Witney (P < 0,5) a été effectué pour tester les différences significatives : des lettres différentes sur le graphique montrent une différence significative entre les échantillons. Figure 91 : Teneurs moyennes en chlorophylles totales déterminées sur un mélange de feuilles adultes et jeunes de plantes témoins et de plantes traitées après 3 jours de stress à 2,5% (J35). (A) et une semaine de réhydratation (J42) (B). Le dosage des chlorophylles a été effectué sur 5 plantes pour chaque condition testée. Le test de Mann-Whitney est réalisé afin de déterminer les différences significatives : des lettres différentes sur le graphique montrent une différence significative entre les échantillons. RESULTATS ET DISCUSSION 137 RESULTATS ET DISCUSSION témoins et les plantes stressées à la fin de la période de stress osmotique (respectivement 0,16 et 0,17 ; Figure 89B). Après une semaine de réhydratation en revanche, la biomasse mesurée dans les feuilles des plantes réhydratées est significativement inférieure à celle mesurée dans les plantes témoins (respectivement 158 mg et 346 mg ; Figure 90A). De la même façon, la masse sèche des racines des plantes réhydratées est inférieure à celle mesurée chez les plantes témoins (respectivement 30 mg et 62 mg). En ce qui concerne les valeurs de R/S calculé en revanche, aucune différence significative n’est mesurée entre les plantes réhydratées et les plantes témoins (Figure 90B). 3.7.6 Suivi du contenu en chlorophylles Le dosage des chlorophylles totales a été effectué après 3 jours de stress osmotique (J35) et en fin de réhydratation (J42). Les résultats représentés Figure 91A mettent en évidence une diminution significative de la teneur en chlorophylles des plantes stressées par rapport aux plantes témoins de 26% (respectivement 9,5 et 12,9 mg.gMS-1). La teneur en chlorophylles mesurée dans les feuilles en fin de réhydratation (11 mg.gMS-1) montre une augmentation par rapport à la quantité mesurée dans les feuilles stressées (Figure 91B). Cette quantité de chlorophylles mesurée dans les feuilles réhydratées semble d’ailleurs légèrement inférieure à celle des feuilles témoins (13,4 mg.gMS-1). 3.7.7 Suivi du contenu en quelques élément constitutif de la plante Le contenu en Ca, Mg, K, P, Fe et en nitrate des racines et des feuilles des plantes témoins et traitées a été déterminé après 3 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG et après une semaine de réhydratation selon les méthodes de dosage identiques à celles de la campagne stress. Globalement la répartition des ions entre feuilles et racines est la même que pour la campagne stress. Lorsque la mesure de R/S dans les plantes stressées à J3 de PEG 2,5% est différente de celle des plantes témoins, la différence a tendance à s’amenuiser après une semaine de réhydratation (Tableau 12). Il y a toutefois 2 exceptions notables : le Mg2+ et le Fe pour lesquels le rapport R/S augmente fortement chez les plantes réhydratées indiquant une teneur importante dans les racines des plantes stressées. Comme lors de la campagne précédentes, ces mesures semblent indiquer qu’il n’y a pas de différence importante entre les teneurs en ions et minéraux des plantes témoins et stressées. 138 Figure 92 : Rapport de l’expression relative des gènes AtRD29a et AtTIP1;2 mesurée par RT-qPCR dans les racines après 3 jours de stress à 2,5% de PEG (A) et après une semaine de réhydratation (B). L’expression des gènes a été mesurée sur un mélange de 10 plantes et est normalisée par rapport à l’expression du gène de référence At5g12240. Le logarithme de base 2 du rapport d’expression dans les conditions (Traité/Tm), est reporté sur le graphe. Une valeur seuil de log2 ≥1,5 (ou ≤ -1,5) a été définie pour considérer un gène comme induit ou réprimé. Figure 93 : Etude de l’expression par RT-qPCR de six gènes de transporteurs de sucre dans les racines d’Arabidopsis thaliana en condition témoin et de stress osmotique (A) et en condition témoin et réhydratation (B). L’expression des gènes a été mesurée sur un mélange de 10 plantes et est normalisée par rapport à l’expression du gène de référence At5g12240. Le logarithme de base 2 du rapport d’expression dans les deux conditions (St/Tm), est reporté sur le graphe. Une valeur seuil de log2 ≥1,5 (ou ≤ -1,5) a été définie pour considérer un gène comme induit ou réprimé. RESULTATS ET DISCUSSION 3.7.8 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre L’expression des gènes de transporteurs de sucre identifiés précédemment (AtPLT5, AtPLT6, AtSTP13, AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5) a été suivie dans les racines par RT-qPCR, ainsi que celle de 2 gènes de réponse au stress hydrique (AtTIP1;2 et AtRD9a ). La Figure 92 présente les résultats d’expression des gènes AtTIP1;2 et AtRD9a après 3 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG et après une semaine de réhydratation. Les résultats montrent une importante répression du gène AtTIP1,2. Pour le gène AtRD29a , son expression est légèrement augmentée (Figure 92A). Après une semaine de réhydratation, l’expression des deux gènes AtRD29a et AtTIP1;2 ne présente pas de différence d’expression dans les racines témoins et les racines réhydratées (Figure 92B). Les résultats de l’expression des gènes de transporteurs de sucre en condition de stress osmotique sont représentés sur la Figure 93A. Ces derniers montrent une répression significative des gènes AtSUC1, AtSUC5 et AtPLT6 ainsi qu’une induction du gène AtSTP13 au cours du stress osmotique. L’expression du gène AtPLT5 augmente faiblement et de manière non significative. En revanche, dans cette expérimentation, une augmentation de l’expression du gène AtSUC2 a aussi été mise en évidence dans les racines stressées. L’étude de l’expression des six gènes de transporteurs de sucre a aussi été réalisée à la fin de la période de réhydratation. Les résultats présentés Figure 93B montrent que les rapports d’expression des gènes dans les plantes réhydratées sont très faibles et en dessous du seuil de significativité fixé, et ce pour tous les gènes étudiés. Ce résultat indique que les gènes de transporteurs de sucre ont retrouvé un niveau d’expression dans les plantes réhydratées comparable à celui des plantes témoins du même âge. 3.7.9 Etude de la teneur en sucres solubles Le dosage du saccharose, glucose et fructose a été effectué sur les racines et les feuilles des plantes témoins et stressées récoltées après 3 jours d’application de stress osmotique (J35). La Figure 94 montre les résultats de dosage dans les racines des plantes témoins et des plantes stressées. Dans un premier temps, il est à noter que les teneurs de saccharose, glucose et fructose mesurées dans les racines des plantes témoins (respectivement 3,4, 30 et 17 µmol.gMS-1 ; Figure 94A) semblent légèrement supérieures aux valeurs obtenues pour ces 3 sucres dans les racines des plantes adultes lors de l’étude du développement d’A. thaliana (respectivement ND, 18,2 et 10,3 µmol.gMS-1). Après 3 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG, le contenu en sucres solubles total des racines stressées diminue par rapport aux plantes témoins : la teneur des racines en saccharose, glucose et fructose baisse en effet dans les racines stressées de respectivement 17%, 42% et 41% (Figure 94A). 139 Figure 94 : Teneur en saccharose, glucose et fructose dans les racines (A) et les feuilles (B) des plantes témoins et stressées, après 3 jours de stress osmotique à 2,5%. Le dosage des sucres a été réalisé sur les racines et les feuilles de 5 plantes mélangées pour chaque condition étudiée. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. Figure 95 : Teneur en saccharose, glucose et fructose dans les racines (A) et les feuilles (B) des plantes témoins et réhydratées, après 3 jours de stress osmotique à 2,5%. Le dosage des sucres a été réalisé sur les racines et les feuilles de 5 plantes mélangées pour chaque condition étudiée. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. Figure 96 : Teneur en amidon dans les racines et les feuilles des plantes après 3 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG et après une semaine de réhydratation. Le dosage des sucres a été réalisé sur les racines et les feuilles de 5 plantes mélangées pour chaque condition étudiée. Les histogrammes représentent la moyenne de deux réplicats techniques du dosage. RESULTATS ET DISCUSSION Le dosage du glucose et fructose dans les feuilles témoins (respectivement 42 et 24 µmol.gMS-1 ; Figure 94B) montre une teneur un peu plus élevée que ce qui avait été mis en évidence dans les feuilles des plantes au stade adulte lors de l’étude du développement d’A. thaliana (respectivement 33,7 et 16,3 µmol.gMS-1). En revanche les quantités de saccharose mesurées dans les feuilles pour cette expérimentation (5 µmol.gMS-1) sont du même ordre de grandeur que celles mesurées lors de l’étude du développement (7,6 µmol.gMS -1). En comparant les quantités de sucres solubles mesurées dans les deux conditions (témoins et stressées), une forte augmentation de la teneur en saccharose, glucose et fructose est observée (respectivement 15,4 ; 218 et 55 µmol.gMS-1 mesuré dans les feuilles stressées ; Figure 94B). Le dosage du saccharose glucose et fructose a aussi été effectué dans les racines et les feuilles des plantes après une semaine de réhydratation (J42). Ces résultats montrent que le contenu en saccharose, glucose et fructose des racines témoins à J42 (respectivement 3,6 ; 31 et 16 µmol.gMS-1 ; Figure 95A) est quasiment identique de celui mesuré dans les racines témoins à J35 (respectivement 3,4 ; 30 et 17 µmol.gMS-1). De la même façon, le dosage de ces 3 sucres dans les racines des plantes après réhydratation (respectivement 2,8 ; 15 et 10 µmol.gMS-1) montre des teneurs assez proches de celles mesurées dans les racines après 3 jours de stress à 2,5% de PEG (2,9 ; 19 et 12 µmol.gMS-1 ; Figure 95A). En ce qui concerne les feuilles, la teneur en saccharose, glucose et fructose des plantes témoins à J42 (3,4, 27 et 13 µmol.gMS-1 Figure 95B) semble légèrement inférieure à celle mesurée dans les plantes témoins à J35 (5, 42, 24 µmol.gMS-1). Ces valeurs sont, en revanche, à rapprocher de celles mesurées dans les feuilles à J40 lors de l’étude du développement d’A. thaliana (7,6, 33,7 et 16,3 µmol.gMS-1). Le dosage de ces sucres dans les feuilles réhydratées montre toujours des valeurs supérieures à celles mesurées chez les plantes témoins (8,4 µmol.gMS-1 de saccharose, 75 µmol.gMS-1 de glucose et 32 µmol.gMS-1 de fructose ; Figure 95B), mais qui diminuent par rapport à ce qui a été mesuré dans les feuilles des plantes après 3 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG. 3.7.10 Etude de la teneur en amidon La Figure 96 représente les teneurs en amidon mesurées dans les racines et les feuilles des plantes après 3 jours de stress osmotique à 2,5% de PEG (J35) et après une semaine de réhydratation (J42). 140 Figure 97 : Photographies et autoradiographies d’une plante témoin et d’une plante stressée (3 jours à 2,5% de PEG) après transport de [U-14C]-saccharose pendant 5h. Ra : Racines ; Ro : Rosette ; FD : Feuille donneuse ; C : Collet ; FM : Feuille marquée. Les flèches rouges montrent l’emplacement de la feuille donneuse. RESULTATS ET DISCUSSION Les résultats du dosage de l’amidon montrent que les valeurs sont très proches dans les racines témoins (0,7 mg.gMS-1) et les racines stressées (0,6 mg.gMS-1). Ces valeurs sont plus faibles que celles mesurées dans les racines des plantes adultes lors de l’expérimentation sur le développement d’A. thaliana (1,5 mg.gMS-1). Après une semaine de réhydratation, les teneurs en amidon des racines des plantes témoins (0,7 mg.gMS-1) et réhydratées (1,1 mg.gMS-1) montrent une constance des valeurs pour les racines témoins et une augmentation pour les racines stressées par rapport aux valeurs précédentes (J35). La quantité d’amidon dosée dans les feuilles en condition témoins est très proche, aussi bien à J35 (7,4 mg.gMS-1) qu’à J42 (6,3 mg.gMS-1), des teneurs en amidon mesurées dans les feuilles adultes (J40) des plantes étudiées lors de l’expérimentation sur le développement d’A. thaliana (6,4 mg.gMS-1). Après 3 jours de stress osmotique à 2,5%, la quantité d’amidon mesurée dans les feuilles stressées est supérieure (11,3 mg.gMS-1) à celle mesurée dans les plantes témoins (x1,5). Après une semaine de réhydratation, la teneur en amidon des plantes réhydratées (7,8 mg.gMS-1) semble revenir à des valeurs comparables à celles mesurées dans les plantes témoins (6,3 mg.gMS-1 à J42 et 7,4 mg.gMS-1 à J35). 3.7.11 Etude du flux de saccharose radiomarqué L’étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre a montré que l’expression de ces gènes était modifiée en condition de stress osmotique. De la même façon, les résultats du dosage des sucres ont montré une forte accumulation des sucres solubles dans les feuilles, suggérant une modification du transport des sucres dans la plante. Afin de tester cette hypothèse, l’étude du flux de [U-14C]-saccharose a été réalisée. La Figure 97 montre la photographie d’une plante témoin et d’une plante stressée ayant permis l’étude du transport de [U-14C]-saccharose, ainsi que les autoradiographies de ces plantes après une semaine d’exposition sur un écran PhosphoImager. Les résultats montrent qu’outre la radioactivité retrouvée dans la feuille donneuse, celle-ci est retrouvée au niveau des feuilles adjacentes à la feuille donneuse, et de manière plus prononcée au niveau de la feuille en développement située directement au-dessus de la feuille donneuse, donc sur la même orthostichie. La radioactivité est aussi observée dans le collet et les racines. La comparaison visuelle des autoradiographies des plantes témoins et stressées semblerait indiquer qu’après le stress osmotique, le [U-14C]-saccharose serait moins transporté dans les racines. Afin de confirmer cette observation, le comptage de la radioactivité présente dans les différents organes des plantes a été effectué. 141 Figure 98 : Pourcentage de carbone radiomarqué transporté, mesuré dans les racines, les feuilles et le milieu extérieur chez les plantes témoins, stressées et réhydratées. Les pourcentages pour chaque organe sont calculés à partir de la radioactivité moyenne mesurée sur 3 plantes. La radioactivité mesurée dans la feuille donneuse est en revanche retirée des calculs pour ne prendre en compte que la radioactivité transportée. RESULTATS ET DISCUSSION Le comptage de la radioactivité moyenne des plantes étudiées est représenté Figure 98. Les résultats semblent montrer qu’en condition témoin, la moitié du carbone exporté de la feuille donneuse (51,2%) est transportée dans les autres feuilles de la rosette. L’autre moitié est retrouvée majoritairement dans les racines (44,7%) et dans le milieu de culture (4,1%). Pour les plantes stressées, les résultats montrent que 69,3% du carbone radiomarqué est retrouvé dans les feuilles, 29,9% dans les racines et seulement 0,8% dans le milieu de culture. Après une semaine de réhydratation (J42), les résultats de comptage de la radioactivité dans les plantes témoins montrent quasiment la même répartition du carbone radiomarqué que les plantes témoins de la récolte à J35, à savoir 45,4% de la radioactivité transportée dans les feuilles, 53,1% dans les racines et 1,4% dans le milieu de culture. Chez les plantes réhydratées 55,4% de la radioactivité détectée dans la plante est présente dans les feuilles, 41,2% dans les racines et 3,4% dans le milieu de culture. De plus, ce résultat indique que la radioactivité dans les feuilles réhydratées (55,4%) diminue par rapport aux feuilles stressées (69,3%). Dans les racines cependant, la radioactivité augmente en conditions réhydratées (41,2%) après avoir diminué en conditions stressées (29,9%). Il en est de même pour la radioactivité mesurée dans le milieu extérieur qui après avoir diminuée en condition de stress (0,8%) augmente à nouveau (3,4%). 3.7.12 Discussion 3.7.12.1 Etude phénotypique et physiologique des plantes en condition de stress osmotique L’expérimentation « campagne réhydratation» a permis de tester un nouveau protocole d’application du stress hydrique et de réhydratation sur l’écotype Col-0 d’A. thaliana . Cette expérimentation a été effectuée sur les 4 systèmes d’hydroponie disponibles au laboratoire. Le nombre plus important de plantes disponibles a ainsi permis d’étudier de nouveaux paramètres physiologiques (surface foliaire et conductance stomatique) sur les plantes au cours du stress et de la semaine de réhydratation. Dans cette étude l’expression des transporteurs de sucre a été vérifiée (comparaison avec les résultats de « l’essai réhydratation ») et complétée par l’étude du dosage des sucres, et le transport de de [U-14C]saccharose. Dans un premier temps, l’observation phénotypique des plantes a montré un flétrissement des feuilles stressées à partir de 2,5% de PEG dans le milieu de culture. Au cours de la semaine de réhydratation, les jeunes feuilles et les feuilles un peu plus développées vont recouvrer 142 RESULTATS ET DISCUSSION progressivement un phénotype témoin. Aussi, l’émergence de nouvelles feuilles est constatée sur les rosettes des plantes stressées. Cette évolution des feuilles des plantes en réhydratation au cours de cette expérimentation est similaire à celle observée lors du premier essai de réhydratation des plantes (« Essai réhydratation »). Dans le but d’estimer la croissance foliaire des plantes, la surface foliaire projetée a été mesurée dans cette expérimentation. Les résultats tendent à montrer que l’application des premières doses de PEG (0,5% et 1%) n’a pas d’impact sur le développement et l’état physiologique des feuilles de la rosette. Dès l’application de la dose de 1,5% de PEG dans le milieu de culture, le stress osmotique appliqué par le PEG semble freiner la croissance foliaire des plantes stressées. A partir de 2,5% de PEG, les valeurs de surfaces foliaires mesurées sur les feuilles des plantes témoins stagnent et diminue même pour les plantes stressées (3020 mm² à la dose de 2% de PEG contre 2708 mm² à la dose de 2,5% de PEG). Cette observation peut indiquer d’une part que la croissance est complètement stoppée, mais cette diminution est certainement la conséquence du flétrissement important des feuilles. Le ralentissement de la croissance des feuilles en condition de stress hydrique est un phénomène d’acclimatation classiquement observé chez A. thaliana (Aguirrezabal et al. 2006). En effet, la limitation de la croissance foliaire permettrait à long terme de diminuer les pertes d’eau de la plante par transpiration (Chaves et al. 2003 ; Granier et al. 2006). Dès le lendemain de la réhydratation, une augmentation de la surface foliaire projetée est observée sur les plantes stressées (J36). Ceci semble indiquer un rétablissement rapide de la turgescence des feuilles des plantes réhydratées. Tout au long de la semaine, l’accroissement de la surface foliaire projetée chez les plantes réhydratées reflète une reprise de la croissance foliaire. Cette reprise de croissance de plantes réhydratées est aussi observée après une période de stress hydrique modéré en terre (Chaves and Oliveira 2004). Cependant, dans notre expérimentation, la vitesse de croissance des plantes réhydratées reste tout de même moins rapide que celle mesurée chez les plantes témoins (356 mm²/jour chez les plantes réhydratées contre 560 mm²/jour pour les plantes témoins). Pour cette expérimentation et pour la première fois, le suivi de la conductance stomatique a été effectué au cours de l’application du PEG et lors de la réhydratation. Les résultats ont permis de mettre en évidence une diminution progressive de cette conductance stomatique dans les feuilles stressées dès 1,5% de PEG dans le milieu de culture. Après l’ajout de 2,5% de PEG, la conductance stomatique mesurée montre des valeurs très faibles dans les plantes stressées (13 mmol.m².s-1) et témoignerait de la fermeture de la quasi-totalité des stomates des 143 RESULTATS ET DISCUSSION feuilles. Ces résultats suggèrent que le stress osmotique appliqué entraine une fermeture des stomates des feuilles des plantes stressées. Cette réponse des plantes vis-à-vis d’un stress osmotique/hydrique est un phénomène bien décrit dans la littérature (Schroeder et al. 2001), permettant d’effectuer un ajustement rapide de la transpiration de la plante et limitant ainsi les pertes d’eau lors d’un stress hydrique (Bray 1997). Cette fermeture des stomates entraine en contrepartie une inhibition de la photosynthèse du fait de la moins grande disponibilité en CO2 (Bertamini et al. 2007). Nos résultats montrent par ailleurs une diminution de la teneur en chlorophylles dans les feuilles des plantes stressées, suggérant que le stress osmotique appliqué a bien un impact sur le système photosynthétique. Après une semaine de réhydratation, les résultats ont montré une réouverture progressive des stomates des feuilles réhydratées, jusqu’au recouvrement de valeurs proches de celles des feuilles témoins en fin de réhydratation. La réouverture des stomates sur les feuilles de plantes en réhydratation est aussi un phénomène assez rapide. Martre et collaborateurs (2002) ont, par exemple, mis en évidence un rétablissement de 84% de la conductance stomatique 4 jours après réhydratation des plantes d’A. thaliana ayant subi un stress hydrique en terre par arrêt d’arrosage. Parallèlement, le dosage des chlorophylles sur les plantes réhydratées montrent des valeurs comparables à celles des plantes témoins. Il est ainsi possible de penser que la réouverture des stomates ainsi que la néosynthèse de chlorophylles dans les feuilles réhydratées, supposent une reprise de activité des photosystèmes similaire à celle des feuilles témoins. Les travaux de Jung (2004) ont en effet montré une reprise rapide de l’activité photosynthétique, après une période de réhydratation, sur des plantes d’A. thaliana ayant subi un stress hydrique en terre. La mesure du RWC et du potentiel osmotique, témoignant de l’état hydrique des plantes, a permis de montrer une diminution de ces deux paramètres au niveau des feuilles dans les plantes soumises au stress osmotique. Ce résultat était attendu puisque systématiquement observé au cours des expérimentations « Essai stress Col-0 » et « Essai stress réhydratation », ainsi que la « Campagne stress ». Après une semaine de réhydratation, la mesure de ces deux paramètres indiquerait que les plantes ont retrouvé un état hydrique comparable à celui observé dans les feuilles témoins. Ces résultats semblent montrer que le stress osmotique appliqué par l’ajout de PEG provoque des modifications dans l’état hydrique des plantes qui sont réversibles après une semaine de réhydratation. Ce phénomène corrobore la reprise de croissance mesurée par le suivi de la surface foliaire projetée des plantes au cours de la semaine de réhydratation. 144 RESULTATS ET DISCUSSION Au cours d’un stress hydrique plusieurs auteurs ont mis en évidence que la biomasse des plantes en condition de stress diminue par rapport à la masse des plantes témoins (Hummel et al. 2010). Dans notre étude, cette diminution est observée dans les racines et les feuilles après 3 jours de stress à 2,5% de PEG. Cependant, les différences entre les valeurs mesurées ne deviennent significatives que pour les mesures réalisées après une semaine de réhydratation, même si les feuilles des plantes stressées ont regagné de la biomasse au cours de cette période. Il semblerait donc que l’impact du stress osmotique appliqué sur la biomasse des plantes soit amplifié par la semaine de réhydratation des plantes. En effet, l’étude de la surface foliaire a montré qu’au cours de la semaine de réhydratation, la vitesse de croissance des feuilles des plantes est tout de même moins élevée que celle des plantes témoins. Cette croissance moins rapide pourrait en partie expliquer la biomasse plus faible des feuilles réhydratées par rapport aux témoins. Il est tout de même à noter que le rapport R/S mesuré après le stress osmotique et la semaine de réhydratation est similaire chez les plantes témoins et les plantes réhydratées, ce qui a été observé aussi sur les rapports R/S des éléments. Ainsi, les résultats suggèrent que le ralentissement de la croissance observé au niveau des feuilles serait aussi observé au niveau du compartiment racinaire. Ce ralentissement de la croissance racinaire a aussi été mesuré dans les travaux de Xiong et collaborateurs (2006) sur des plantes d’A. thaliana soumises à un stress hydrique en terre. Afin de mesurer l’impact du stress osmotique sur le transcriptome des plantes, l’expression des gènes marqueurs de stress AtTIP1;2 et AtRD29a a été mesuré dans les racines en condition témoin et stressé. La modification d’expression retrouvée pour le gène AtTIP1;2 en condition de stress osmotique est similaire à celles décrites dans plusieurs travaux effectués sur A. thaliana en condition de stress hydrique en terre (Alexandersson et al. 2001 ; Seki et al. 2001), et en accord avec nos précédents résultats. En ce qui concerne l’expression du gène AtRD29a , les résultats montrent une faible augmentation de son expression dans les racines stressées. Bien que ce gène soit référencé dans un grand nombre d’études comme étant fortement surexprimé dans les feuilles en condition de stress hydrique, son induction dans les racines semble en revanche beaucoup plus faible (Xiong et al. 2006), tout comme ce qui a été mesuré dans notre expérimentation. 3.7.12.2 Etude de paramètres liés au transport et au métabolisme du carbone des plantes en condition de stress osmotique L’étude des gènes de transporteurs de sucre dans les racines des plantes témoins et stressées a permis de mettre en évidence une forte répression des gènes AtSUC1, AtSUC5 et 145 RESULTATS ET DISCUSSION AtPLT6, ainsi qu’une augmentation de l’expression du gène AtSTP13 et dans une moindre mesure (en dessous du seuil de significativité) d’AtPLT5. Ces résultats sont conformes à ceux obtenus dans les racines stressées des Essai « stress » et « réhydratation » et de la « Campagne stress ». En revanche pour la première fois dans cette expérimentation, une augmentation de l’expression du gène AtSUC2 a été mise en évidence dans les racines stressées. Pour ce gène, le résultat est différent de ce qui a été observé dans les expérimentions précédentes. Cependant, les informations obtenues à partir de l’observation des données de microarray Genevestigator indiquent une augmentation de l’expression du gène AtSUC2 dans certaines expérimentations portant sur le stress hydrique. Il est toutefois à noter qu’en règle générale, ces données montrent que l’expression d’AtSUC2 est faiblement modifiée au cours d’un tel stress. Après une semaine de réhydratation, l’expression de tous les gènes de transporteurs de sucre mesurée dans les racines réhydratées est similaire à celle mesurée dans les racines témoins. Ceci confirme la réversibilité du stress osmotique appliqué par notre protocole expérimental, comme cela a été supposé suite à l’expérimentation « Essai réhydratation ». Le dosage du saccharose, glucose et fructose a montré une augmentation importante de la quantité de ces 3 sucres dans les feuilles stressées. Cette forte augmentation en sucres solubles observée dans les feuilles stressées corrobore les résultats précédemment observés lors de l’expérimentation « Campagne stress ». Dans les plantes réhydratées, il semblerait que la quantité de sucres solubles mesurées dans les feuilles soit toujours supérieure à celle retrouvée dans les feuilles témoins, mais inférieures à celles mesurées dans les feuilles stressées. Autrement dit, il semblerait que la semaine de réhydratation permette une récupération partielle de la teneur en sucres solubles dans les feuilles des plantes réhydratées. Dans les racines les résultats semblent montrer une diminution de la teneur en sucres solubles en condition de stress, retrouvée aussi après une semaine de réhydratation. Afin de mieux comprendre l’origine de l’accumulation de ces sucres, le dosage de l’amidon a été effectué. Nos résultats indiquent que dans les racines la quantité d’amidon est faible et est équivalente en conditions témoins et en conditions stressées. Ceci est différent des dosages obtenus lors de la « Campagne stress » au cours de laquelle, la teneur en amidon dans les racines diminuait au cours du stress. De plus, les dosages réalisés après la période de réhydratation montrent que cette diminution se poursuit. Dans les feuilles, la quantité d’amidon des plantes stressées augmente par rapport aux plantes témoins comme cela a été observé lors la « Campagne stress ». Lors de la réhydratation, la teneur en amidon dans les 146 RESULTATS ET DISCUSSION feuilles réhydratées est légèrement supérieure à celle mesurée dans les plantes témoins mais diminue cependant par rapport à celle observée dans les feuilles stressées. Les résultats obtenus dans les racines semblent assez cohérents avec les résultats obtenus dans d’autres études. En effet, plusieurs études ont montré qu’au cours d’un stress hydrique, l’amidon était dégradé afin de pourvoir les besoins en sucres pour la respiration ou bien pour permettre l’accumulation de sucres solubles comme composés compatibles (Basu et al. 2007 ; Todaka et al. 2000). En revanche le fait que la quantité d’amidon ne diminue pas dans les feuilles stressées paraît surprenant. Comme cela a été discuté dans le chapitre 3, il est possible de penser que cette différence soit liée à notre système de culture qui permet d’obtenir des teneurs en sucres solubles plus importantes que celles généralement mesurées sur des plantes en terre. De ce fait, il est légitime de penser que les quantités de sucres des feuilles soient suffisantes pour les besoins de la plante, sans faire appel aux sucres stockés sous forme d’amidon. Parallèlement à ces résultats, l’étude du transport du [U-14C]-saccharose dans les plantes semble montrer que le transport de saccharose des feuilles sources vers les racines serait ralenti dans les plantes en condition de stress osmotique. Ce résultat serait à rapprocher de l’accumulation des sucres solubles observé dans les feuilles des plantes stressées coïncidant avec une diminution de la teneur de ces sucres dans les racines. De la même façon, ce ralentissement du transport pourrait aussi être lié avec la forte répression des gènes de transporteurs de saccharose (AtSUC1 et AtSUC5) mesurée dans les racines après 3 jours de stress osmotique. En effet, la forte inhibition de ces gènes dans les racines au cours du stress osmotique pourrait induire une diminution de la force de puits entrainant le ralentissement du transport de saccharose observé dans ces conditions. Des expérimentations complémentaires sur un plus grand nombre de plantes devront tout de même être réalisées afin de confirmer ces résultats. Après une semaine de réhydratation, il semblerait que la quantité de carbone radiomarqué dans les racines réhydratées soit comparable à celle mesurée dans les racines témoins et supérieure à celle observée dans les racines stressées. Ce phénomène pourrait suggérer que le transport du saccharose des feuilles vers les racines est en partie restauré pendant la semaine de réhydratation. Cette récupération est aussi à mettre en parallèle de la restauration du profil d’expression des gènes de transporteurs de saccharose (AtSUC1 et AtSUC5) dans les racines. En effet, la reprise de leur expression dans les plantes réhydratées permettrait de restaurer une 147 Figure 99 : Photographie des rosettes d’Arabidopsis thaliana témoins et stressées cultivées en rhizobox, au cours de leur développement. RESULTATS ET DISCUSSION force de puits au niveau des racines permettant de rétablir le transport des sucres vers ce compartiment. Les résultats ont montrés que le protocole d’application du stress osmotique suivi d’une réhydratation utilisé dans cette expérimentation a permis une restauration de l’ensemble des paramètres suivis sur les plantes. Le stress appliqué par ajout de PEG que nous avons mis en place est donc bien réversible. Cette restauration rapide de l’état physiologique des plantes après réhydratation a été observée dans des études portant sur l’impact du stress hydrique sur A. thaliana en terre (Hummel et al. 2010 ; Martre et al. 2002). La capacité des plantes à se rétablir d’un stress hydrique est dépendante de l’intensité du stress appliqué : seul un stress modéré permet aux plantes une récupération rapide après réhydratation (Xu et al. 2010). Ainsi, ces résultats suggèrent que le stress osmotique appliqué par le biais de notre protocole d’ajout de PEG serait comparable à un stress hydrique en terre modéré comme ce qui avait été supposé lors de l’étude de la cinétique de stress. 3.8 Etude du stress hydrique en culture rhizobox Dans le but de vérifier les résultats d’expression des transporteurs de sucre dans les racines de plantes cultivées en hydroponie, nous avons décidé de les comparer avec ceux obtenus à partir de racines de plantes cultivées en terre. Toutefois, comme nous l’avons déjà précisé, ceci n’est pas possible directement à partir de plantes cultivées en pot. Ainsi, un protocole de culture en rhizobox a été mis au point au laboratoire, dans lequel les racines sont séparées de la terre par une membrane perméable tout en étant toujours soumis aux échanges avec la terre (ions, eau). Ce système permet de récolter le système racinaire dans son intégralité, non souillé par la terre. Ce système permet aussi d’effectuer un suivi de la croissance foliaire et racinaire des plantes et réaliser un stress hydrique véritable en terre en appliquant différents régimes hydrique. 3.8.1 Suivi du phénotype des plantes La Figure 99 présente les photographies de plantes cultivées en rhizobox en condition normale d’irrigation (100% d’humidité, correspondant à une terre bien irriguée voir matériel et méthodes) et en condition de stress hydrique (75% de l’humidité mesurée dans les rhizobox témoins). Ce protocole a pour but d’appliquer un stress hydrique modéré sur les plantes stressées. Toutefois, contrairement aux expérimentations réalisées en hydroponie, un stress hydrique réel est cette fois ci appliqué. L’observation du phénotype des rosettes à partir du 148 Figure 100 : Nombre moyen de feuilles par plantes comptées sur les plantes témoins et les plantes stressées au cours de leurs développement. Les moyennes et écart types ont été calculés à partir de 17 plantes témoins et de 15 plantes stressées. Un test de Mann et Witney (P<0,05) a été réalisé afin de déterminer la significativité des résultats et aucune différence significative n’a été mise en évidence entre les plantes témoins et les plantes stressées pour chaque jour de mesure. Tableau 13 : Vitesse d’émergence des feuilles d’Arabidopsis thaliana témoins et stressées cultivées en rhizobox, au cours de leur développement. Les résultats sont exprimés en feuilles.J-1. Intervalle de temps [J9;J12] [J12;J16] [J16;J19] [J19;J23] [J23;J27] [J27;J30] [J9;J30] Témoins 0,39 0,53 0,33 0,57 0,81 0,63 0.54 Stressées 0,41 0,53 0,44 0,64 0,64 0,52 0.53 Figure 101 : Surface foliaire projetée moyenne des plantes témoins et stressées tout au long de l’expérimentation. Les moyennes et écart types ont été calculés à partir de 17 plantes témoins et de 15 plantes stressées. Un test de Mann et Witney a été réalisé afin de déterminer la significativité des résultats (P<0,05). Les astérisques indiquent les différences significatives entre les données témoins et stressées. RESULTATS ET DISCUSSION 16ème jour de culture et tout au long de l’expérimentation indique que les rosettes des plantes stressées sont de plus petite taille que les rosettes des plantes témoins. 3.8.1.1 Suivi du nombre de feuilles par plantes Afin de suivre le développement des plantes cultivées dans les deux conditions étudiées (témoins et stressées), les feuilles de toutes les plantes utilisées pour l’étude ont été comptées après 9, 12, 16, 19, 26 et 30 jours de culture. Les résultats présentés sur la Figure 100 indiquent que le nombre moyen de feuilles par plante est très proche dans les deux conditions étudiées. A partir de ces comptages, il a été possible de calculer la vitesse moyenne d’émergence des feuilles par plantes. Les résultats présentés dans le Tableau 13 montrent que les vitesses d’émergence des feuilles varient de manière assez importante entre chaque intervalle de comptage, aussi bien pour les plantes du lot témoins que pour les plantes du lot stressé. Les vitesses moyennes d’émergence des feuilles restent cependant très proches entre les deux lots pour chaque intervalle considéré. La vitesse moyenne d’émergence des feuilles calculée sur toute la durée l’expérimentation est d’ailleurs quasiment la même chez les plantes témoins (0,54 feuilles.jour-1) et chez les plantes stressées (0.53 feuilles.jour-1 ; Tableau 13). Ces résultats indiquent que la fréquence globale d’apparition des feuilles est équivalente pour les plantes témoins et pour les plantes stressées. 3.8.1.2 Suivi de la croissance des plantes L’évolution de la croissance a été estimée par le suivi de la surface foliaire projetée réalisée sur les plantes en condition témoin et en condition de stress hydrique. Les résultats présentés Figure 101 montrent une augmentation plus lente de la surface foliaire projetée chez les plantes stressées que chez les plantes témoins. Par exemple, la surface foliaire projetée moyenne du lot de plantes stressées passe de 910 mm² à J23 à 1520 mm² à J26, alors qu’elle passe de 1540 mm² à 2057 mm² pour le lot témoin à ces mêmes dates. 3.8.2 Suivi de la croissance du réseau racinaire Le système de culture des plantes en rhizobox permet l’observation des racines des plantes grâce à la transparence de la plaque de plexiglas composant le système. Ce système permet donc le suivi de la croissance des réseaux racinaires sur une période de 26 jours. En effet, après 26 jours de culture, les racines principales de certaines plantes atteignent le fond de la rhizobox (20 cm) et les racines latérales des plantes côte à côte dans les rhizobox commencent 149 Figure 102 : Photographie d’une rhizobox pour laquelle le suivi de la croissance racinaire n’est plus possible, les racines ayant atteint le fond du système de culture. Figure 103 : Longueur de la racine principale des plantes témoins et stressées tout au long de l’expérimentation. Les moyennes et écart types ont été calculés à partir de 12 plantes témoins et de 14 plantes stressées. Un test de Mann et Witney a été réalisé afin de déterminer la significativité (P<0,05) des résultats et aucune différence significative n’a été mise en évidence entre les plantes témoins et les plantes stressées pour chaque jour de mesure. RESULTATS ET DISCUSSION 150 Figure 104 : Suivi de la croissance et du développement des racines latérales chez les plantes témoins et stressées entre 17 et 26 jours de cultures après semis. (A) Nombre moyen de racines latérales comptées sur les plantes témoins et stressées ; (B) Longueur totale moyenne des racines latérales chez les plantes témoins et les plantes stressées. Les moyennes et écart types ont été calculés à partir de 4 plantes témoins et de 3 plantes stressées. RESULTATS ET DISCUSSION à se mélanger, empêchant toutes analyses (Figure 102). Ce suivi a été effectué sur des plantes cultivées en condition normale de culture et en condition de stress hydrique de J8 à J26 3.8.2.1 Suivi de la croissance des racines principales La mesure de la longueur de la racine principale est effectuée tous les jours entre 8 et 26 jours de culture. Pour chaque plante, les racines sont dessinées sur un papier transparent, luimême scanné. La longueur des racines principales est ensuite déterminée grâce au logiciel ‘Réseaux_racinaire’ disponible au laboratoire. Les résultats présentés Figure 103 montrent une augmentation progressive de la longueur de la racine principale aussi bien chez les plantes en conditions témoins que les plantes en conditions stressées. Ces mesures permettent de calculer la vitesse moyenne d’élongation de la racine principale qui est de 9,1 mm.jour-1 chez les plantes témoins et de 8,7 mm.jour-1 chez les plantes stressées. 3.8.2.2 Suivi de la croissance et du développement des racines latérales La croissance et le développement des racines latérales ont aussi été étudiés dans les mêmes conditions que les racines principales. Le nombre de racines latérales a été compté tous les jours à partir de J 17. Les résultats présentés sur la Figure 104A montrent une augmentation du nombre de racines latérales qui semble assez régulière chez les plantes témoins (1,3±0,1 racines.jour-1) et les plantes stressées (1,2±0,5 racines.jour-1). Pour estimer la croissance du réseau racinaire, la longueur totale des racines latérales par plante est mesurée tous les jours entre 17 et 26 jours de culture. La longueur totale des racines latérales pour une plante est la somme des longueurs de toutes les racines latérales. Les résultats présentés Figure 104B montrent que dès le début de l’étude, la longueur totale moyenne des racines latérales mesurée chez les plantes témoins est plus importante que celle mesurée chez les stressées. Par exemple pour les plantes du lot témoin, la longueur totale moyenne des racines latérales est de 3,2 cm et 4 cm à J18 et J19 alors qu’elle est de 2,7 cm et 3 cm pour les plantes du lot stressé. Cette tendance se confirme jusqu’au dernier jour de mesure (J26) où la longueur totale moyenne des racines latérales mesurée chez les plantes témoins est de 23,6 cm alors qu’elle est de 17.3 cm chez les plantes stressées. 3.8.3 Suivi de l’état hydrique des plantes L’état hydrique des plantes a été étudié en fin d’expérimentation chez les plantes témoins et les plantes stressées par la mesure du RWC et du potentiel osmotique dans les feuilles des plantes étudiées. Les valeurs de RWC, représentées sur la Figure 105A, montre qu’il y a peu de variation du contenu relatif en eau chez les plantes stressées (80%) par rapport au plantes 151 Figure 105 : Suivi de l’état hydrique des plantes témoins et stressées par la mesure du RWC et du potentiel osmotique à la fin du stress hydrique. (A) Valeur moyenne de RWC calculé chez les plantes témoins et stressées ; (B) Valeur moyenne de potentiel osmotique mesuré chez les plantes témoins et les plantes stressées. Les moyennes et écart types ont été calculés à partir de 3 plantes témoins et de 3 plantes stressées. Figure 106 : Expression des gènes de transporteurs de sucre par la technique de macroarray dans les racines de plantes témoins (100% d’humidité) et stressées (75% d’humidité). (A) : Expression relative des gènes de transporteurs de sucres dans les racines des plantes témoins et stressées, normalisées par rapport à l’expression moyenne de 3 gènes de référence (Ef1α, Actine2, Histone H4) ; (B) : Rapport d’expression en log de base 2, des gènes de transporteurs de sucre dans les racines (plantes stressées/plantes témoins). Une valeur seuil de log2 ≥ (ou ≤ -1,5) a été définie pour considérer un gène comme induit ou réprimé. RESULTATS ET DISCUSSION témoins (78,4%). De la même façon, la mesure du potentiel osmotique est quasiment identique chez les plantes stressées (-1,1 MPa) et les plantes témoins (-1 MPa ; Figure 105B). 3.8.4 Etude de l’expression des gènes de transporteurs de sucres Nous avons voulu comparer par une analyse macroarray l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines de plantes cultivées en rhizobox avec l’expression de ces gènes dans les racines des plantes cultivées en hydroponie. Les résultats présentés Figure 106A, montrent dans un premier temps qu’en conditions témoins dans les racines, 3 gènes de transporteurs de saccharose (AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5), 2 gènes de transporteurs de polyol (AtPLT5 et AtPLT6) ainsi qu’un gène de transporteur d’hexose (AtSTP7) sont exprimés. Le gène le plus exprimé est le gène AtSUC1, suivi du gène AtPLT5 et du gène AtSUC2. Les gènes AtSUC5, AtSTP7 et AtPLT6 ont, quant à eux, une expression quasiment équivalente (Figure 106A). La comparaison de l’expression de ces 6 gènes en condition témoin et en condition stressé a été effectuée par l’étude des rapports d’expression de ces gènes dans les deux conditions (Figure 106B). Les résultats montrent que les rapports d’expression de ces gènes sont inférieurs au seuil de log2 ± 1,5 établi pour définir la significativité des différences d’expression dans les deux conditions. 3.8.5 Discussion L’observation du phénotype des rosettes à partir du 16ème jour de culture et tout au long de l’expérimentation indique que les rosettes des plantes stressées sont de plus petite taille que les rosettes des plantes témoins à partir de 16 jours de culture, observation classique en cas de stress hydrique (Chaves et al. 2002 ; Koorneef et al.2004). En revanche, le comptage du nombre de feuilles par plante sur les plantes témoins et stressées n’a pas permis de mettre en évidence de différences significative entre les deux conditions. De plus, le calcul de la vitesse moyenne d’émergence des feuilles au cours de l’expérimentation [J9 ; J30] n’indique pas non plus de différence entre les 2 conditions étudiées (Tm : 0,54 feuilles.jours-1 ; St : 0,53 feuilles.jour-1). Ces résultats indiquent que la fréquence globale d’apparition des feuilles est équivalente pour les plantes témoins et pour les plantes stressées. Ceci semble confirmer les travaux de Granier et collaborateurs (2006) qui ont mis en évidence que pour certains écotypes d’A. thaliana , le nombre de feuilles par plantes n’est pas affecté par un stress hydrique modéré. Ces observations ont été aussi notées par une autre étude qui a montré que 152 RESULTATS ET DISCUSSION la carence en eau n’affectait pas le nombre final de feuilles de la rosette d’ A. thaliana (Tisne et al. 2010). En ce qui concerne la croissance des feuilles en revanche, les résultats montrent que les feuilles stressées ont une surface foliaire plus faible que celle des feuilles témoins. Ces résultats montrent une croissance plus lente chez les plantes en condition de stress hydrique par rapport aux plantes témoins. Ce ralentissement de la croissance foliaire peut être comparé à celui observé dans l’étude du stress osmotique en hydroponie où un ralentissement important de la croissance des feuilles a été observé. D’autres travaux comme par exemples ceux de Aguirrezabal et collaborateurs (2006) montrent aussi un ralentissement plus ou moins important de la croissance foliaire en condition de stress hydrique, chez plusieurs écotypes différents d’A. thaliana . Le suivi de la croissance des plantes a aussi été effectué au niveau du compartiment racinaire. Les résultats montrent qu’il n’y aurait pas de différence importante au niveau la croissance de la racine principale ainsi que sur la fréquence d’émergence des racines latérales en condition normale et en condition de stress hydrique. En revanche, une diminution de la longueur totale des racines latérales par plante est mesurée en condition de stress hydrique. L’impact du stress hydrique sur le développement du système racinaire est encore controversé à ce jour. En effet, certains auteurs ont montré que la contrainte hydrique provoquait une diminution de la croissance du système racinaire et d’autres ont mis en évidence une augmentation de sa taille. Ces différences semblent être liées à l’intensité de stress hydrique qui est appliqué lors de l’expérimentation (Xiong et al. 2006). Une étude menée sur des plantes cultivées en boite de Pétri montre que l’application d’un stress osmotique modéré (de -0,2 MPa -0,9 MPa) avec du polyéthylène glycol (PEG) stimule la croissance de la racine principale (van der Weele et al. 2000). Il a aussi été montré qu’un stress hydrique modéré avait un impact sur la formation des racines latérales. Les auteurs indiquent que la contrainte hydrique modérée entraîne une faible diminution du nombre des primordium racinaires, mais aussi une forte diminution du développement des racines latérales (Deak and Malamy 2005), ce qui semble être le cas dans nos résultats également. Ces mêmes études ont estimé la longueur totale des racines latérales en sommant la longueur de toutes les racines latérales d’une plante. Les résultats indiquent, comme pour notre expérimentation, que la longueur totale des racines latérales chez les plantes stressées est inférieure à celles mesurées chez les plantes témoins (Deak et Malamy 2005 ; Xiong et al. 2006). Ces études semblent indiquer qu’A. thaliana optimise son système racinaire en réprimant 153 RESULTATS ET DISCUSSION la prolifération de la croissance des racines dans les zones où l’eau est moins disponible (Deak and Malamy 2005) L’état hydrique des plantes a été estimé par la mesure du RWC et du potentiel osmotique dans les feuilles. Aucune différence significative de ces deux paramètres n’a pu être mesurée entre les plantes témoins et les plantes stressées. Les résultats laissent penser que les plantes en condition stressées se sont acclimatées à la moindre disponibilité en eau du sol. Il faut noter que dans le protocole expérimental appliqué, les plantes étaient soumises à un stress hydrique aussitôt après leur germination. Les travaux réalisés par Harb et collaborateurs (2010) ont en effet montré qu’après une longue période d’acclimatation des plantes au stress hydrique, ces dernières vont effectuer un ajustement osmotique au niveau des feuilles parallèlement à une réduction de la croissance. Ces deux phénomènes vont ainsi établir un équilibre entre l’absorption et l’utilisation de l’eau, permettant d’avoir un métabolisme et une physiologie similaires à ceux retrouvés chez les plantes bien irriguées. Le système de culture en rhizobox a permis de récolter les racines des plantes cultivées et ainsi d’effectuer une première étude de l’expression des gènes de transporteurs de sucre sur des plantes cultivées en terre. Nous avons retrouvé exprimés dans les racines les mêmes gènes que ceux identifiés dans les expériences en hydroponie à savoir les gènes AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5, AtPLT5, AtPLT6 et AtSTP7 (Figure 105). Ces résultats semblent dans un premier temps montrer que l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines n’est pas impactée par le mode de culture utilisé. Les résultats montrent que les rapports d’expression de ces gènes entre les conditions témoins et stressées sont inférieurs au seuil de log2 ± 1,5 établi pour définir la significativité des différences d’expression dans les deux conditions. Ce résultat pourrait s’expliquer de deux façons : d’un côté par l’intensité très faible du stress appliqué dans nos conditions, dont témoignent les valeurs de RWC et de potentiel osmotique quasiment similaires chez les plantes témoins et stressées. D’un autre côté, il a été constaté lors de l’expérimentation « Campagne stress » (sous-chapitre 3.5) qu’après une période de 6 jours de stress osmotique, le profil d’expression des gènes revient à un profil témoin. Il se pourrait donc, que dans nos conditions de stress continu, les plantes soient complétement acclimatées au stress appliqué. Afin de voir une réponse des plantes plus importante vis-à-vis du stress hydrique, une autre expérience a été réalisée en appliquant un stress hydrique plus important (50% de l’humidité mesurée dans les rhizobox témoins). Cette expérimentation est actuellement en cours d’analyse. 154 RESULTATS ET DISCUSSION Néanmoins, cette première expérience a permis de mieux définir les modifications induites par le stress hydrique au niveau de la croissance racinaire et de confirmer le profil d’expression des gènes de transporteurs de sucre obtenu en hydroponie. 155 CONCLUSION 4 CONCLUSION 156 CONCLUSION 4.1 La culture en hydroponie La première partie de ce travail a été la mise en place d’un système de culture en hydroponie sur A. thaliana . La culture en hydroponie présente le principal avantage de permettre l’étude du système racinaire aussi bien pour des analyses physiologiques, biochimiques que moléculaires. Les résultats ont montré que la culture en hydroponie permettait d’obtenir une grande quantité de matériel végétal aussi bien au niveau des racines que des parties aériennes. De plus, le matériel végétal obtenu dans nos conditions de culture était très homogène. L’étude du cycle complet de développement d’A. thaliana (écotype Col0) montre que les plantes sont capables de terminer leur cycle de développement en produisant une grande quantité de graines viables. L’inconvénient majeur rencontré lors de la culture en hydroponie est l’enchevêtrement des racines entre elles dans le milieu de culture. Ce phénomène empêche la récolte de plante individuelle sans séparer les racines, occasionnant le plus souvent des dommages au niveau de ces dernières. Afin de limiter cet emmêlement, il est nécessaire de limiter le nombre de plantes cultivées par bac Araponics. Une solution qui aurait pu être adoptée aurait été de récolter les plantes à un stade plus précoce, avant que les systèmes racinaires de 2 plantes contigües ne se mélangent (20 jours). Toutefois, ceci aurait été à l’opposé de notre démarche qui consiste à comparer avec des données obtenues sur plantes cultivées sur terre (stade de développement assez avancé, stress appliqué à J47 après semis) et non avec des plantules cultivées in vitro. D’autre part, une des perspectives à la suite de ce travail sera de mesurer les paramètres photosynthétiques des feuilles de plantes cultivées en hydroponie et cela nécessite d’avoir des feuilles dont la surface est relativement importante pour pouvoir être utilisée avec le système de mesure (CIRAS II). Un autre inconvénient de la culture en hydroponie est la difficulté d’étude de l’architecture racinaire. L’absence de contrainte physique ainsi que la circulation constante du milieu de culture rendent par nature impossible l’établissement d’une architecture racinaire stable dans le temps. Au cours de mes travaux de thèse, un système de culture en rhizobox a été mis en place parallèlement à la culture en hydroponie, permettant l’étude de l’architecture et de la croissance du réseau racinaire. De même, une collaboration avec un laboratoire d’analyse d’image (Xlim-SIC, Université de Poitiers, Signal, Image et Communication) est en cours au laboratoire et devrait permettre d’effectuer un suivi du réseau racinaire de plantes d’A. thaliana cultivées en hydroponie, en 3 dimensions et en continu dans le temps. 157 CONCLUSION De nombreux paramètres ont été mesurés sur les feuilles des plantes cultivées en hydroponie (surface foliaire, conductance stomatique, teneur en sucre, réponse au stress osmotique, expression des transporteurs de sucres) et les valeurs obtenues sont tout à fait en accord avec celles décrites dans la littérature pour des plantes cultivées en terre. La culture en hydroponie, telle que nous l’avons pratiquée, permet donc d’obtenir un matériel adapté à notre problématique et représentatif de la physiologie d’une plante. En ce qui concerne les racines, les données comparatives sont forcément moins nombreuses et souvent obtenues sur des plantules cultivées in vitro. Néanmoins nous avons également pu montrer que les racines récoltées étaient en excellent état physiologique et ont permis d’effectuer les mesures de transport de saccharose radiomarqué à longue distance. Un des points tout à fait intéressant dans cette technique est la possibilité de pouvoir analyser la radioactivité relarguée dans le milieu par les racines. Bien que cela n’était pas le thème de cette thèse, la nature des molécules radioactives (sucres ou autres) relarguées pourra être étudiée dans l’avenir. Les résultats obtenus sur l’expérience développement ont montré que, pour les premiers stades de développement des plantes, la quantité de radioactivité relarguée par les racines est tout à fait notable. La mise en place du système en hydroponie a aussi permis d’effectuer une première cartographie de l’expression de ces gènes dans les racines d’A. thaliana . Toutefois une des limites du système de culture en hydroponie est de ne pas pouvoir facilement faire d’analyses séparées sur les différents types de racines (primaires, secondaires…), ni sur les différentes régions d’une racine. C’est pourquoi nous avons commencé à développer en parallèle le système de culture en rhizobox qui permet d’observer la totalité du système racinaire en 2 dimensions. Les premiers résultats obtenus grâce au logiciel d’analyse de racines ont permis de retrouver des résultats typiques de l’effet du stress hydrique sur les racines, à savoir un ralentissement de la croissance des racines latérales et une diminution de l’épaisseur de la racine principale (van der Weele et al. 2000 ; Sharp et al. 1988). Les deux techniques de culture s’avèrent donc complémentaires dans l’étude des racines. Les premières analyses d’expression des gènes indiquent que ce sont les mêmes gènes de transporteurs de sucre qui sont exprimés dans les 2 systèmes. Nous verrons dans les perspectives, l’utilisation qui pourra être faite de la possibilité de visualiser la position des racines en rhizobox. 158 CONCLUSION 4.2 Le stress osmotique Afin de mimer une contrainte hydrique sur les plantes d’A. thaliana cultivées en hydroponie, un stress osmotique a été appliqué. Plusieurs agents osmotiques existent afin de créer ce stress osmotique comme le mannitol, le sorbitol ou le polyéthylène glycol (PEG). Le PEG présente l’avantage, a priori, de ne pas être absorbé par les tissus de la plante contrairement au mannitol et sorbitol. En effet, des travaux ont montré que le mannitol pouvait entrer librement dans la cellule en passant à travers les pores de la paroi et entrainer la plasmolyse. Ceci a pour conséquence, une diminution du volume du protoplaste sans que le volume de la paroi cellulaire ne soit affecté (Verslues et al. 2006). Ces auteurs précisent que cette réponse est différente de celle observée lors d’un stress hydrique, où l’eau quitte progressivement l’espace pariétal et le protoplaste, diminuant ainsi la taille de ces 2 compartiments. Dans cette étude les auteurs ont mis en évidence que ce même processus était observé lors de l’application d’un stress osmotique contenant des solutés de haut poids moléculaires comme le PEG 6000 (Verslues et al. 2006). Ceci est probablement lié au fait que le PEG 6000 ne rentre pas à travers les pores de la paroi cellulaire (Carpita et al. 1979, Oertli 1985). De plus, dans ce travail de thèse, l’utilisation du mannitol ou du sorbitol comme agents osmotiques pouvait aussi poser un problème lors de l’étude du métabolisme carboné de la plante. En effet, ces deux composés étant des sucres, ils pouvaient influencer le métabolisme carboné et ainsi biaiser les études de transport de sucres à longue distance ainsi que les études d’expression des gènes de transporteurs de sucre. Par ailleurs, l’utilisation du mannitol lors de l’application d’un stress osmotique a aussi montré qu’il avait des effets toxiques sur la croissance notamment la croissance cellulaire (Hohl and Schopfer 1991, Verslues et al. 1998). Généralement les molécules de faibles poids moléculaires comme le mannitol ont des effets toxiques sur les plantes et peuvent masquer les réponses liées au stress osmotique (Verslues et al. 2006). De précédents travaux ont testé la toxicité du PEG sur les plantes. Une étude a porté sur l’utilisation de PEG de différents poids moléculaires P200, P400, P1000 et P20000. Ces auteurs ont montré que le PEG de faible poids moléculaire P200, P400, P1000 pouvait entrer dans les racines et ce processus est accentué si les racines sont coupées. En revanche le PEG de très haut poids moléculaire P20000 ne pénètre pas, probablement à cause de la forte viscosité qu’il induit dans le milieu (Lawlor 1970). Ces résultats sont appuyés par une étude sur le pin qui a testé des solutions nutritives contenant du PEG de différents poids moléculaires 159 CONCLUSION pour appliquer un stress osmotique. Ces auteurs précisent que le PEG de poids moléculaire inférieur à 1000 est fortement absorbé par la plante et induit une forte toxicité pouvant conduire parfois à la mort de la plante. Au contraire l’utilisation d’un PEG de poids moléculaire compris en 1000 et 6000 utilisé dans un milieu bien oxygéné réduit le risque de toxicité de cette molécule. En revanche, l’utilisation de PEG de haut poids moléculaire, supérieur à 6000 rend la solution trop visqueuse et peut engendrer de l’anoxie s’il est utilisé sur une longue période (Dubos et al. 2003). Pour de nombreux auteurs, le PEG est le meilleur soluté utilisable pour imposer un stress osmotique de faible potentiel reflétant le stress existant dans un sol lors d’un déficit hydrique (Verslues et al. 2006). Suite à ces données de littérature, nous avons donc choisi d’utiliser du PEG 6000 pour imposer un stress osmotique à nos plantes. De plus, malgré le système de propulsion du milieu de culture dans les bacs d’hydroponie par une pompe d’aquarium créant une circulation et une certaine aération du milieu, un bulleur d’aquarium a été ajouté pour prévenir tout risque d’hypoxie des plantes Lors de la culture des plantes en sol, la contrainte hydrique appliquée par arrêt d’arrosage augmente progressivement en fonction de l’eau utilisée par la plante. Ainsi pour se rapprocher au maximum des conditions retrouvées en sol, il a été décidé d’appliquer le PEG de façon progressive dans le milieu de culture. Les premiers essais d’application du stress ont été réalisés sur des bacs Araponics individuels (18 plantes). Les premiers résultats obtenus sur l’écotype Col-0 d’A. thaliana ont montré que ce protocole d’application du stress entraine un flétrissement des feuilles de la rosette pour une dose de 3% de PEG. De façon inattendue, ce flétrissement est apparu pour une dose légèrement plus faible de PEG (2,5%) lors des expérimentations « Campagne ». La principale différence entre ces deux systèmes de culture est le nombre de plantes cultivées par bacs : 18 plantes par bac lors des « Essais » et 6 plantes par bacs lors des « Campagne ». Ces résultats semblent montrer que la densité de plantes cultivées par bacs pourrait jouer un rôle sur la tolérance des plantes vis-àvis du PEG. En effet, il semblerait que la forte densité de plantes dans les systèmes « Essais » permet le recouvrement des feuilles des plantes contigües. Ceci aurait pour effet une limitation de l’évapotranspiration des plantes qui seraient alors en mesure de résister à des doses plus fortes de PEG. Plusieurs phénomènes observés sur les plantes stressées semblent montrer que l’application du PEG dans le milieu de culture entraîne certains effets secondaires. Tout d’abord 160 CONCLUSION un brunissement des racines est systématiquement observé dès le premier ajout de PEG dans le milieu de culture. Il avait été envisagé, lors d’un premier comité de thèse, la possibilité que ce brunissement soit causé par une hypoxie. Ainsi, la concentration en oxygène du milieu de culture ainsi que l’expression du gène de l’alcool déshydrogénase, deux marqueurs du stress hypoxie ont été suivies tout au long de l’application du stress osmotique. Les résultats ont ainsi montré que la concentration en oxygène du milieu de culture varie très peu dans le milieu de culture pendant la période d’étude du stress et que l’expression de l’alcool déshydrogénase est sensiblement égale dans les racines des plantes témoins et cultivées avec PEG. Le brunissement des racines observé en présence de PEG ne serait donc pas provoqué par une hypoxie. Ce brunissement pourrait en revanche se rapprocher de celui décrit par Chen et collaborateurs (2006) sur les racines du riz cultivé en hydroponie et provoqué par un dépôt de fer présent dans la solution nutritive. Un autre phénomène observé sur les plantes stressées, est l’apparition de cristaux blancs sur les feuilles. L’origine et la nature de ces cristaux sont encore indéterminées. Les premières analyses ont tout de même permis de montrer que ces cristaux ne sont pas formés de PEG. D’autres analyses en spectrométrie de masse sont actuellement en cours afin de déterminer la composition de ces cristaux. Plusieurs paramètres ont été mesurés afin de suivre les effets du stress appliqué sur les plantes. Ainsi, les résultats ont permis de mettre en évidence un ralentissement de la croissance au niveau des feuilles de plantes soumises au stress, accompagnée d’une diminution de la biomasse sèche. De la même façon une diminution de la conductance stomatique indiquant une fermeture des stomates assez importante, est mesurée en fin de stress sur les feuilles des plantes stressées. L’état hydrique des plantes a été estimé par le suivi du RWC des rosettes et du potentiel osmotique des feuilles. Dans toutes les expérimentations effectuées, une diminution de ces deux paramètres a été mesurée dans les feuilles des plantes stressées. Il est tout de même à noter que la diminution du RWC mesurée dans nos conditions est assez faible. Il apparaitrait que le RWC des feuilles stressées chez l’écotype Col-0 d’A. thaliana n’est soumis qu’à peu de variation lors d’un stress hydrique (Bouchabke et al. 2008) En revanche, nos résultats ont montré que la mesure du potentiel osmotique des feuilles est, quant à lui, un bon indicateur de l’état de stress des plantes. 161 CONCLUSION Outre ces deux phénomènes (brunissement des racines et apparition de cristaux blancs sur les feuilles), qui semblent spécifiques à l’ajout de PEG dans le milieu de culture, les différences physiologiques mesurées entre les plantes stressées et témoins (diminution de la croissance foliaire, diminution de la conductance stomatique, baisse du RWC et du potentiel osmotique, diminution de la teneur en chlorophylles) semblent celles classiquement observées dans la littérature en réponse à une contrainte hydrique (Chaves et al 2003 ; Verslue et al.2006). Le système racinaire des plantes présente, malgré sa simplicité apparente, une grande plasticité. En effet, des plantes génétiquement identiques peuvent présenter un système racinaire différent d’un point de vue morphologique en réponse à un microenvironnement rencontré dans le milieu. Il est connu d’ailleurs que la nature du sol, son humidité et ses nutriments influencent considérablement l’architecture du réseau racinaire (Deak and Malamy 2005, Lopez-Bucio et al. 2003). Les changements qui peuvent s’observer le sont au niveau du nombre de racines latérales, de leur distribution, de leur taux de croissance et de leur orientation (Malamy 2005). De plus, il a été observé chez de nombreuses plantes dont Arabidopsis thaliana , que le potentiel osmotique du sol pouvait altérer la profondeur du système racinaire, sa masse globale, le taux d’élongation et le nombre de racines latérales (Deak et Malamy 2005 ; Van der Weele 2000). Cependant peu de choses sont connues sur les mécanismes qui contrôlent la réponse du système racinaire en réponse à la disponibilité en eau. Il semblerait cependant qu’une carence en eau aurait un impact sur la croissance de la racine principale. En effet chez le maïs il a été montré que l’élongation cellulaire était inhibée dans les régions distales de l’apex racinaire, alors que l’élongation de l’apex lui-même est maintenu à un niveau similaire à celui observé chez les témoins (Yamaguchi and Sharp 2010). En revanche, la réponse du réseau racinaire à un stress osmotique serait indirecte. En effet, elle serait liée à la fermeture des stomates qui a pour effet de diminuer la photosynthèse et limiter la croissance des jeunes feuilles. Ceci entraine par conséquent la réduction de la croissance racinaire (Galvan-Ampudia and Testerink 2011, Munns and Tester 2008). Des travaux menés sur A. thaliana en réponse à un stress osmotique induit par du mannitol ou le KCl, ont montré une réduction de la formation des racines latérales à partir des primordium, sur des plantes cultivées en boites de Pétri. En effet ces auteurs ont observé que 162 CONCLUSION pour les plantes témoins et les plantes stressées le nombre de primordium des racines latérales était identique. Cependant la croissance des racines latérales est, quant à elle, stoppée. On pourrait supposer que ce type de réponse, observé dans nos essais en rhizobox, existe aussi en hydroponie, car ces auteurs précisent que cette inhibition de la croissance des racines latérales est observée pour des potentiels osmotiques compris autour de -0,64 à -0,68 MPa dans leur milieu gélosé (potentiel témoin est de -0,51 MPa). De plus, cette étude précise que ce phénomène serait régulé par deux hormones, l’acide abscissique qui réprimerait la croissance des racines latérales et l’auxine qui l’induirait (Deak et Malamy 2005). Ces résultats ont été confirmés par une autre étude menée sur A. thaliana soumis à un stress osmotique par du saccharose ou des sels de nitrates. Dans cette étude, en plus d’une réduction de la croissance des racines latérales en réponse au stress, il a été observé une réduction de la croissance de la partie aérienne, comme nous avons pu l’observer dans nos expérimentations en hydroponie et en rhizobox. A l’inverse, certains auteurs précisent que lors de la réponse des plantes en condition hydrique limitée, les racines sont moins affectées que la partie aérienne. Leurs travaux indiquent que lors d’un stress hydrique modéré, la croissance de la tige est complètement stoppée alors que celle des racines continue pour d’aller puiser l’eau disponible dans le sol, afin que la plante puisse terminer son cycle de développement et permette la production de graines (Roycewicz and Malamy 2012). Des travaux menés sur A. thaliana cultivée en boite de Pétri et soumis à un stress osmotique par ajout de PEG dans le milieu, montrent que la réponse de la racine principale est différente selon le régime hydrique appliqué. Il semblerait qu’un stress hydrique modéré, correspondant à des valeurs de potentiels osmotiques compris entre -0,23 et -0,51 MPa, favorise le taux d’élongation de la racine principale. Au contraire, un stress hydrique sévère, correspondant à des valeurs de potentiels osmotiques compris entre -0,8 et -1,2 MPa, entrainerait une diminution de la croissance de la racine principale de 50 %. De même ces auteurs n’ont pas observé de variation dans le nombre et dans la longueur des racines latérales en conditions de stress hydrique modéré, ou dans les conditions témoins. En revanche un stress plus sévère réduit ces deux paramètres. Ils ont aussi montré, comme cela avait été observé chez le Maïs (Sharp et al. 1988), qu’après plusieurs jours de stress modéré ou sévère, l’épaisseur de la racine diminuait par comparaison avec les témoins (van der Weele et al. 2000). Dans notre expérimentions Rhizobox, le suivi journalier de la croissance racinaire nous a permis d’observer le même type de résultat. Concernant nos travaux en hydroponie, la collaboration mise en place avec le laboratoire Xlim-SIC (Université de Poitiers, SIC, Signal, 163 CONCLUSION Image et Communication) sur l’étude de développement du réseau racinaire en 3D devait nous permettre de visualiser l’évolution de ce paramètre en condition de stress osmotique. L’architecture du système racinaire est un des facteurs cruciaux impliqué dans la survie de la plante car il contribue à l’efficacité d’acquisition de l’eau et des sels minéraux, ce qui permet son adaptation compétitive dans un environnement donné (Grime et al. 1986). Par exemple, la majorité des variétés de riz résistantes à la sécheresse possèdent un système racinaire très ramifié et très profond par rapport au espèces sensibles (Price et al. 1997). Cependant dans certains cas, il semblerait que ce ne soit pas l’architecture racinaire qui confère un avantage sélectif mais plus tôt la capacité du système racinaire à répondre à une signal provenant de l’environnement (Malamy 2005). Par exemple, l’étude de différents écotypes d’A. thaliana en réponse à la carence en phosphate du sol montre que l’écotype qui est capable d’augmenter la taille de son système racinaire et des poils racinaires, est celui qui survit le mieux à cette carence (Narang et al. 2000). 4.3 Transporteurs de sucre et transport de saccharose La culture en hydroponie et l’accès aisé aux racines a permis une première cartographie de l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines d’A. thaliana . La technique de macroarray utilisée pour mettre en évidence l’expression de ces gènes a permis de déterminer les gènes les plus fortement exprimés dans ce compartiment à savoir AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5, AtPLT5, AtPLT6 et AtSTP13. Les données existant sur l’expression des gènes de transporteurs de sucre dans les racines (littérature et données d’expression microarray Genevetigator ou Arex) peuvent être très différentes en fonction du système de culture utilisé (boite de Pétri, terre) mais aussi des conditions de culture des plantes. D’autre part, il apparaît que certains gènes qui avaient été décrits comme exprimés dans les racines (Buttner 2010 ; Sauer et al. 1991 ; Yamada et al. 2011) ne sont pas retrouvés dans nos analyses. Ceci peut s’expliquer dans la mesure où la technique de macroarray n’est certainement pas la plus sensible. Néanmoins, elle a permis l’analyse d’un grand nombre d’échantillons et correspondait à notre objectif d’identifier les gènes de transporteurs de sucre les plus exprimés dans les racines. Nous avons déjà discuté le fait que, dans les interprétations, nous avons considéré que le principal niveau de régulation était transcriptionnel et que le niveau d’expression d’un gène pouvait donner une bonne indication de l’activité de la protéine correspondante. Cette dernière 164 CONCLUSION affirmation est certainement à nuancer et nous indiquerons des pistes d’études dans les perspectives. Un des buts de cette thèse était de trouver des relations entre l’expression des transporteurs de sucre et certains phénomènes reliés au transport de ces sucres, à savoir la biomasse des organes, la teneur en sucre et en amidon, l’activité de transport à longue distance, avec une attention particulière portée sur les racines. En effet, le transport des sucres vers les racines est encore très mal connu, malgré l’importance d’un système racinaire fonctionnel pour la croissance et le développement des autres organes de la plante. Tout au long de la croissance de la plante, les racines représentent un organe puits qui doit être maintenu en état de capter l’eau et les minéraux jusqu’aux stades ultimes (remplissage des graines). Il était donc intéressant de suivre l’évolution des racines au cours du développement et au cours d’un stress osmotique, lorsque la compétition entre puits va être modifiée par un facteur externe. Nos résultats suggèrent que la force de puits des racines est diminuée lors de l’apparition des organes liés à la reproduction. Toutefois, il est à noter que le transport du saccharose, bien que diminué, est maintenu dans les racines jusqu’au dernier stade de développement des plantes, comme l’ont montré les expériences avec le saccharose radiomarqué. En effet, le système racinaire fournit un apport constant d’eau et de nutriments, permettant le développement et la croissance de tous les organes de la plantes, et ce jusqu’au dernier stade de développement. Des travaux réalisés par Gersani et collaborateurs (2001) sur le soja ont d’ailleurs montré une corrélation directe entre l’augmentation de la biomasse racinaire et l’augmentation du nombre de graines produites par la plante. La racine doit par conséquent être constamment alimentée en matière carbonée pour assurer son bon fonctionnement, impliquant le maintien d’une certaine force de puits dans ce compartiment. Le maintien de cette force de puits au niveau des racines pourrait faire intervenir plusieurs transporteurs de sucre. Les résultats ont montré l’expression constante de 3 gènes de transporteurs de saccharose, AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5, tout au long du cycle de vie de la plante. Il est possible de penser que ces trois transporteurs de saccharose ont un rôle à jouer dans le maintien de la force de puits en permettant le déchargement phloème dans le compartiment racinaire. De la même façon, deux gènes de transporteurs d’hexoses, AtPLT5 et AtPLT6, sont aussi exprimés régulièrement dans les racines au cours du cycle de vie d’A. thaliana . Ces deux transporteurs pourraient eux aussi participer à l’augmentation de la force de puits des racines en permettant l’import dans les cellules des hexoses issus de l’hydrolyse du saccharose. En effet, les quantités de saccharose retrouvées dans les racines sont toujours 165 CONCLUSION beaucoup plus faibles que les quantités de glucose et de fructose, ce qui laisse supposer une hydrolyse importante du saccharose importé. Ceci est en accord avec les travaux de Freixes et collaborateurs (2002), qui ont montré que la croissance et la ramification des racines ont lieu dans les zones de forte concentration en hexoses, et ceux de Wang et collaborateurs (2010) qui ont relié l’activité de l’invertase vacuolaire avec l’élongation racinaire. L’absence de quantité d’amidon conséquente dans les racines indique également la nécessité de maintenir un import continu de sucres dans les racines. Il faut d’ailleurs noter que dans les expériences sur le stress osmotique, nous avons observé une diminution systématique de l’expression de certains gènes de transporteurs de sucre (AtSUC1, AtSUC5…) qui est en accord avec la diminution de la croissance relative des racines par rapport aux feuilles. Cet arrêt de la croissance des racines lié à un maintien de l’import du saccharose (même s’il est réduit par rapport aux plantes témoins, comme l’on montré les expériences avec le 14 C saccharose) pourrait conduire dans certains cas à une accumulation de sucres solubles (Campagne « stress » et « réhydratation »). Afin de déterminer la fonction de tous ces gènes de transporteurs de sucre et leur implication dans la régulation du transport des sucres, l’étude des plantes présentant une mutation sur ces derniers devra être réalisée (voir perspectives). 4.4 Les sucres La mise en place du protocole d’application du stress osmotique avec le PEG en culture hydroponique a aussi permis l’étude de quelques paramètres liés au métabolisme carboné de la plante en condition de stress osmotique. En ce qui concerne le dosage des sucres solubles il a été mis en évidence une accumulation systématique de saccharose, glucose et fructose dans les feuilles en condition de stress. Ce phénomène est probablement dû à un arrêt de la croissance des feuilles, et donc à un arrêt de la consommation des sucres (Hummel et al. 2010 ; Muller et al. 2011). L’accumulation de ces sucres permettrait ainsi de participer à l’ajustement osmotique des feuilles mais permettrait aussi de constituer un pool de sucres directement disponible pour la cellule en fin de stress. Toutefois, il faut noter que dans nos expériences la quantité d’amidon dans les feuilles ne diminue pas en cas de stress osmotique, ce qui confirmerait que l’accumulation de sucres solubles observés serait due à l’arrêt de croissance des feuilles. De plus, dans tous les cas, on observe une diminution importante du potentiel osmotique des feuilles, ce qui pourrait laisser supposer que l’augmentation des sucres solubles participe de façon importante à la diminution du potentiel osmotique. 166 CONCLUSION Toutefois les travaux de Hummel et al. (2010) sur A. thaliana , indiquent que ce sont les acides organiques et le K+ qui sont les principales molécules responsables de l’ajustement osmotique. Nous n’avons pas noté d’augmentation significative de K+ dans les feuilles de plantes stressées dans nos conditions expérimentales, ce qui laisse penser qu’il n’aurait pas un rôle majeur dans nos conditions. Lors de l’étude du stress osmotique, deux expérimentations différentes ont été réalisées : l’étude d’une cinétique de stress et l’étude d’un stress suivi d’une réhydratation. De façon surprenante, à la fin de la cinétique de stress, les paramètres estimant l’état hydrique des plantes stressées sont revenus à des valeurs témoins tout comme ce qui est observé en fin de réhydratation. De la même façon, l’expression des gènes de transporteurs de sucres ainsi que les gènes marqueurs du stress est retournée à un profil témoins dans les racines stressées. Cependant, deux phénomènes bien distincts sont à l’origine de la récupération des plantes : dans un cas les plantes se sont acclimatées au stress osmotique, probablement grâce à un ajustement osmotique au niveau des feuilles rétablissant une certaine homéostasie de l’eau (Gagneul et al. 2007) ; dans l’autre cas, c’est la disponibilité nouvelle de l’eau pour la plante qui permet de rétablir l’homéostasie de l’eau dans les tissus. Dans les deux cas, les résultats confirment l’application d’un stress modéré sur les plantes, permettant d’une part l’acclimatation des plantes, et témoignant d’autre part de la réversibilité du stress appliqué (Bray 2004 ; Martre et al. 2002). Il est a noté que lors de l’acclimatation des plantes au stress, la teneur en sucre des feuilles semble ne pas évoluer entre les deux points de stress. Comme nous avons pu le voir précédemment, le stress osmotique appliqué entraine une inhibition de la croissance des feuilles, pouvant résulter en une forte accumulation de sucres solubles. La forte quantité de sucres solubles retrouvée après acclimatation laisse penser que ces derniers ont un rôle à jouer dans l’ajustement osmotique des plantes. Cette hypothèse est de plus supportée par la mesure de la biomasse sèche des feuilles qui ne montre pas d’évolution entre les deux points de stress. Ces résultats semblent corréler les travaux de Harb et collaborateurs (2010) qui montrent que lors du dernier stade d’acclimatation d’A. thaliana en réponse à un stress hydrique, les plantes ont établi une nouvelle homéostasie, en ralentissant la croissance foliaire et la consommation d’énergie, reproduisant ainsi le métabolisme et la physiologie d’une plante bien irriguée. 167 PERSPECTIVES 5 PERSPECTIVES 168 PERSPECTIVES La première perspective que l’on doit envisager est la répétition de certaines expériences de type « Campagne ». La campagne « réhydratation » a été répétée mais les valeurs de certains paramètres (RWC notamment) ont été trop contradictoires avec les résultats présentés dans la thèse pour pouvoir être inclus. Dans la répétition de ces expériences, un soin particulier devra être apporté aux mesures (RWC, potentiel osmotique) qui renseignent sur l’état hydrique des plantes. Nous pensons ajouter la mesure du potentiel hydrique dans une chambre à pression, via un adaptateur nouvellement acquis au laboratoire. Une autre perspective que l’on peut envisager est bien évidemment d’étudier les mutants d’insertion sur les gènes de transporteurs que nous avons identifiés. Les mutants à étudier en premier seront suc1 et suc5, pour comprendre le rôle de ces transporteurs dans la croissance racinaire. Ces mutants ont déjà été caractérisés (Sivitz et al. 2008 ; Baud et al. 2005), mais les auteurs n’ont pas cherché un phénotype particulier au niveau des racines. C’est pourquoi nous pensons qu’il sera intéressant d’utiliser les différents systèmes de culture mis au point dans cette thèse. Une première tentative sur le mutant suc1 a permis de constater une croissance normale en hydroponie. Il pourrait donc être intéressant de réaliser des doubles mutants y compris entre un transporteur de saccharose et d’hexose (AtPLT6 et AtSTP13). Nous n’avons pas prévu de travailler sur le mutant suc2 car sa croissance est trop réduite (Gottwald et al. 2000, Srivastava et al. 2008). En revanche, il pourrait être intéressant de travailler sur ce mutant complémenté pour l’expression d’AtSUC2 dans les feuilles mais pas dans les racines (Srivastava et al. 2008) pour étudier la croissance racinaire alors qu’AtSUC2 ne sera plus exprimé dans cet organe. De plus, un autre type de matériel végétal aurait pu être utilisé dans notre étude. En effet, il pourrait être intéressant de tester la réponse de différents écotypes existant chez A. thaliana à un stress osmotique en hydroponie ou à un stress hydrique dans les rhizobox. Ceci nous permettrait d’isoler des écotypes présentant d’une part des adaptations différentes aux conditions de stress appliqué et d’autre part des tailles de réseaux racinaires contrastées leur permettant une adaptation à ces milieux. Il serait alors intéressant d’étudier l’expression des transporteurs de sucre sur les écotypes présentant les architectures racinaires les plus contrastées. De plus, il a déjà été montré qu’il existait une variabilité naturelle dans la taille du système du réseau racinaire chez A. thaliana (Armengaud et al. 2009). Afin de mieux comprendre le rôle de ces gènes, la localisation de leur expression par hybridation in situ sera également réalisée sur les racines. Cela permettra de localiser leur expression dans les différents types de racines et dans les différentes zones de la racine 169 PERSPECTIVES (Derbyshire et al. 2008). De façon complémentaire, à moyen terme, la localisation des protéines sera également envisagée à l’aide d’anticorps spécifiques, ce qui permettra de vérifier s’il y a une bonne corrélation entre l’expression d’un gène et la quantité de protéines correspondantes. Une autre perspective consistera à approfondir les résultats déjà obtenus avec les rhizobox. Comme nous l’avons indiqué, l’avantage de ce système est de pouvoir visualiser et quantifier la croissance en 2 D des racines. Le protocole d’application de la contrainte hydrique pourra être amélioré et nous envisageons également de réaliser des expériences de transport à longue distance de 14 C saccharose. Ceci permettra d’avoir une image de la répartition de la radioactivité entre les différentes zones du système racinaire. En conclusion, cette thèse a permis de jeter les bases de l’étude des échanges carbonés entre feuilles/source et racines/puits, et de suivre l’évolution de ces échanges au cours du développement et lors d’un stress osmotique. De nombreuses données, assez exploratoires, ont été collectées et permettront de concevoir de nouvelles expériences. Les résultats sur les transporteurs de sucre exprimés dans les racines sont importants dans la mesure où ils permettent de dresser une première cartographie de ces transporteurs. De même l’étude de la réponse à un stress osmotique modéré a permis de montrer que les racines, même si leur croissance est globalement réduite, sont toujours approvisionnées en saccharose, tout au long de l’application du stress. Ces résultats permettront de mieux comprendre l’adaptation des plantes à la contrainte hydrique. 170 BIBLIOGRAPHIE 6 BIBLIOGRAPHIE 171 BIBLIOGRAPHIE Afoufa-Bastien, D., Medici, A., Jeauffre, J., Coutos-Thevenot, P., Lemoine, R., Atanassova, R. and Laloi, M. (2010) The Vitis vinifera sugar transporter gene family: phylogenetic overview and macroarray expression profiling. BMC Plant Biol, 10, 245. Aguirrezabal, L., Bouchier-Combaud, S., Radziejwoski, A., Dauzat, M., Cookson, S.J. and Granier, C. (2006) Plasticity to soil water deficit in Arabidopsis thaliana: dissection of leaf development into underlying growth dynamic and cellular variables reveals invisible phenotypes. Plant Cell Environ, 29, 2216-2227. Alberte, R.S., Thornber, J.P. and Fiscus, E.L. 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(A) : Photographie du brunissement des racines de l’écotype C24 un jour après l’application de 0,5% de PEG dans le milieu de culture (J29). (B) : Photographies des rosettes de l'écotype C24 un jour après l’application des concentrations PEG de 1%, 2%, 3%, 4% et 5% soit respectivement à J 31, J35, J39 J43 et J46 (C) : Photographies des rosettes de l'écotype C24 après l’application de 5% de PEG à J46, J48, J50 et J52 et après 5h d'application de la dose 6% (J53). La mise en place du stress osmotique a été effectuée sur l’écotype C24 d’A. thaliana (« Essai stress C24 » ; Figure 107). Le début du stress a été effectué après 28 jours de culture (J28) et la concentration en PEG a été augmentée de 0,5% en 0,5% tous les 2 jours jusqu’à atteindre une concentration finale de 5% à J46. Les plantes sont laissées 5 jours à cette concentration jusqu'à J53, puis la concentration en PEG dans le milieu de culture a été augmentée de 1%, pour atteindre la concentration finale de 6%. L'évolution phénotypique des plantes a été observée tout au long de l'application du stress (Figure 108). La première modification phénotypique des plantes stressées a été observée un jour après l’application de 0,5% de PEG (J29) dans le milieu de culture. En effet, pour cette concentration de PEG, un brunissement des racines stressées a été constaté sur l'ensemble des plantes stressées alors que les racines des plantes témoins restent blanches. L’aspect des rosettes a aussi été observé au cours de l'application de PEG. Aucun symptôme n’est observé sur les rosettes avant l’application de la dose de 5% de PEG (J46). En revanche un jour après l'application de cette concentration de PEG aux plantes (J 47), un flétrissement des feuilles de rosettes est observé pour les plantes stressées (Figure 108B). Afin de déterminer combien de temps les plantes sont capables de tolérer cette dose de PEG, elles ont été maintenues à cette concentration pendant 5 jours. L'observation des rosettes montre une accentuation des symptômes de flétrissement des feuilles tout au long de cette période (Figure 108C). Cependant, cette dose de PEG n'entraîne pas pour autant la mort des plantes sur la période de stress étudiée, ce qui semble indiquer une certaine acclimatation des plantes à la contrainte osmotique induite par 5% de PEG. Les plantes tolérant la concentration de 5% de PEG, nous avons augmenté la dose de PEG de 1% pour obtenir une concentration de 6% (J53). L'application de cette dose a entraîné un dessèchement rapide de l'ensemble des feuilles dès les premières heures (5h) suivant son application. Dès le lendemain, l'ensemble des feuilles était complètement desséché ce qui semble indiquer que la dose 6% de PEG représente une dose létale pour les plantes de l'écotype C24 d'A. thaliana . Cette expérience a donc permis de montrer que les plantes étaient capables de tolérer sans problème une concentration en PEG de 5%. Etude du transport des sucres dans les racines d’Arabidopsis thaliana au cours de son cycle de développement et en réponse à un stress osmotique Au cours de la contrainte hydrique, l’allocation des sucres dans les différents organes de la plante va être profondément modifiée. Cette répartition requerrait l’activité spécifique de transporteurs membranaires : les transporteurs de sucres. En effet, ces protéines jouent un rôle aussi bien dans le transport des sucres à longue distance que dans leur répartition fine au sein d’un même organe. Parce que les racines sont des organes difficiles à étudier, peu de données sont disponibles sur le transport des sucres ainsi que sur les transporteurs de sucre dans les racines d’A. thaliana . Pour ce faire, il a été choisi de mettre en place la culture en hydroponie afin de récolter une grande quantité de matériel végétal non souillé par la terre. Dans le but de mimer un stress hydrique en culture hydroponique, un protocole d’application de stress osmotique par ajout progressif de polyéthylène glycol (PEG) a été mis au point. L’analyse par macroarray de l’expression des gènes de transporteurs de sucre des racines a révélé l’expression d’AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5, AtPLT5, AtPLT6, et AtSTP13 au cours du développement de la plante. Parmi les 6 gènes de transporteurs de sucres identifiés, 5 présentent une expression différentielle en condition de stress osmotique. Trois d’entre eux sont fortement réprimés : AtSUC1, AtSUC5 et AtPLT6 et 2 présentent une surexpression : AtSUC2 et AtSTP13. Parallèlement, il a été mis en évidence un ralentissement du transport de saccharose dans les racines des plantes en condition de stress. L’implication des gènes de transporteurs de sucres dans les modifications du transport des sucres dans les racines est discutée. Mots clés : Arabidopsis thaliana , racines, hydroponie, transporteurs de sucre, stress osmotique. Sugar transport in roots of Arabidopsis thaliana during its life cycle and in response to an osmotic stress During water stress, sugars allocation in the different organs of the plant will be strongly altered. This redistribution would require the specific activity of membrane transporter: sugar transporter. Indeed, these proteins play a role in both long distance sugar transport and fine distribution through different organs of the plant. Due to the difficulty of studying this compartment, few data are available on sugar transport and sugar transporter in the roots of Arabidopsis thaliana . In order to make it possible, hydroponic culture has been established to raise a large amount of plant material unsullied by the earth. To mimic water stress in hydroponics, an osmotic stress was developed by gradually adding polyethylene glycol (PEG) in the growth medium. Roots sugar transporters gene expression has been analyzed by macroarray and revealed the expression of AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5, AtPLT5, AtPLT6 and AtSTP13 during plant development. Among these six sugar transporters genes, 5 show differential expression in osmotic stress, 3 are strongly repressed: AtSUC1, AtSUC5 and AtPLT6 and 2, AtSUC2 and AtSTP13 are slightly up regulated. In parallel, a slow transport of sucrose to the roots of plants was maintained under osmotic stress. The involvement of these sugar transporters genes in changes of sugar transport in roots is discussed. Key words: Arabidopsis thaliana , roots, hydroponic, sugar transporter, osmotic stress.
