laryngotrachéite infectieuse aviaire

496 Manuel terrestre de l’OIE 2008
CHAPITRE 2.3.3.
LARYNGOTRACHÉITE INFECTIEUSE AVIAIRE
RÉSUMÉ
La laryngotrachéite infectieuse aviaire (LTI) est une maladie respiratoire due à un Herpesviridae,
Alphaherpesvirinae, Gallid herpesvirus 1. Il s’agit principalement d’une maladie de la poule bien
que le faisan, la perdrix et le paon soient aussi affectés. Les symptômes et les lésions peuvent
varier d’une atteinte très sévère où certains oiseaux meurent d’asphyxie, à une forme très atténuée
difficile à différencier d’une autre maladie respiratoire bénigne chez des poulets. La lésion
principale est une trachéite. Chez les oiseaux infectés, le virus peut rester à l’état latent et être
excrété plus tard sans aucune manifestation clinique.
Le diagnostic au laboratoire correspond à l’isolement du virus, à la mise en évidence du virus ou de
l’antigène viral et de la détection des anticorps spécifiques dans le sérum. L’observation
d’inclusions intranucléaires dans la trachée lors d’un examen histopathologique permet également
le diagnostic.
Identification de l’agent pathogène : l’isolement du virus doit être effectué par l’inoculation du
matériel suspect sur la membrane chorioallantoïdienne d’œufs embryonnés ou sur cultures
cellulaires issues d’embryon de poulet. Ces méthodes demandent du temps mais sont sensibles.
Les méthodes rapides sont l’examen direct en microscopie électronique d’un exsudat trachéal, une
immunofluorescence sur exsudat trachéal ou coupes congelées de trachée, l’immunodiffusion en
gélose (IDG) pour détecter les antigènes viraux sur des prélèvements de trachée ou sur du matériel
venant d’un œuf infecté, et la méthode immuno-enzymatique (ELISA) pour détecter l’antigène viral
dans les raclements de la muqueuse trachéale. L’amplification en chaîne par polymérase (PCR)
s’est révélée plus sensibles que l’isolement du virus pour l’examen des prélèvements et elle est à
l’heure actuelle largement utilisée. La caractérisation du virus et la différenciation entre les souches
sauvages et les souches vaccinales sont possibles grâce à une PCR suivie d’une analyse du
polymorphisme de longueur des fragments de restriction.
Épreuves sérologiques : les anticorps dirigés contre le virus LTI (ILTV pour infectious
laryngotracheitis virus) peuvent être détectés par les tests de séroneutralisation (SN) réalisés sur
œufs ou cultures cellulaires, ou par des réactions d’IDG, d’immunofluorescence indirecte, ou
ELISA. Cette dernière technique est préférée lors de campagnes de dépistage des élevages.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
les vaccins contre la LTI sont habituellement préparés à partir de virus vivant atténué. Les vaccins
commercialisés procurent un certain degré de protection, mais ne sont pas complètement
satisfaisants. Des études récentes sur l’efficacité de vaccins génétiquement modifiés ont donné des
résultats prometteurs.
A. INTRODUCTION
La laryngotrachéite infectieuse aviaire (LTI) est une maladie respiratoire de la poule due à un Alphaherpesvirus.
Elle peut aussi affecter le faisan, la perdrix et le paon. Dans sa forme virulente, cette maladie est caractérisée par
son historique, les symptômes et des lésions trachéales très sévères alors que la forme atténuée est difficile à
différencier des autres maladies respiratoires bénignes. Le diagnostic au laboratoire dépend de la mise en
évidence du virus ou d’antigènes viraux (9, 24, 29) ou encore des anticorps sériques spécifiques (1, 20).
Cliniquement, la maladie peut apparaître sous trois formes, dénommées suraiguë, subaiguë et chronique ou
bénigne. Dans la forme suraiguë, la maladie apparaît soudainement et se propage rapidement. Le taux de
morbidité est élevé et le taux de mortalité peut dépasser 50 %. Quelques oiseaux peuvent mourir subitement
(avec un aspect de bonne condition physique) avant l’apparition des signes cliniques caractéristiques comprenant
des difficultés respiratoires avec le cou restant tendu et de la suffocation lors des tentatives d’inspiration. On

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observe aussi des gargouillements, des râles et de la toux lorsque les oiseaux essaient d’expulser le matériel
obstruant la trachée. Des caillots sanguins peuvent être ainsi expulsés et retrouvés sur le sol ou les murs du
bâtiment. Les lésions sont limitées au tractus respiratoire supérieur et elles sont aussi caractéristiques, consistant
en une trachéite hémorragique avec des caillots sanguins, une rhinite mucoïde et du mucus teinté de sang le long
de la trachée.
Dans la forme subaiguë, le début de la maladie est plus lent et les symptômes respiratoires peuvent évoluer sur
quelques jours avant l’observation d’une mortalité. Le taux de morbidité est élevé, mais celui de la mortalité est
plus faible que dans la forme subaiguë, entre 10 % et 30 %. Les lésions sont moins sévères et correspondent à
un exsudat mucoïde avec ou sans présence de sang dans la trachée. On peut observer des membranes
diphtéroïdes caséeuses jaunâtres adhérentes au larynx et à la muqueuse trachéale en partie supérieure.
La LTI chronique ou bénigne peut être observée chez les oiseaux survivants de l’une des formes précédentes de
la maladie, bien que quelques foyers puissent apparaître d’emblée uniquement bénins. L’incidence de la LTI
chronique dans un élevage peut n’être que de 1 à 2 %, avec la plupart des oiseaux mourant de suffocation. Les
symptômes comprennent des accès de toux et des difficultés respiratoires, avec des écoulements par le nez et la
bouche, et une diminution de la production des œufs. L’infection est contractée via les voies respiratoires
supérieures et la transmission se réalise le plus facilement à partir des oiseaux en phase aiguë d’infection,
cependant des infections inapparentes peuvent persister longtemps avec des ré-excrétions intermittentes de
virus ; les oiseaux guéris mais porteurs du virus constituent également une source potentielle de transmission de
la maladie (12). Les lésions observées sont localisées à la trachée, le larynx et la cavité buccale, avec la
présence de dépôts nécrotiques caséeux et diphtéroïdes en plaques ou en amas. La survenue d’une LTI bénigne
peut atteindre un grand nombre d’oiseaux simultanément avec pour seules lésions majeures une conjonctivite,
une sinusite et une trachéite mucoïde. Etant donné que la transmission de la LTI s’effectue par contact étroit, la
transmission est plus lente dans les cages que dans les élevages en liberté et la progression de l’infection dans
un bâtiment avec cages peut être évidente. Des travaux récents ont confirmé les variations considérables qui
existent entre les souches de ILTV en ce qui concerne leur tropisme pour la trachée ou la conjonctive ; les
souches ayant une affinité particulière pour la conjonctive peuvent entraîner de sévères pertes de poids (18).
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l’agent pathogène
Le virus peut être isolé sur cultures de cellules de foie (19) ou de rein (6) d’embryon de poulet ou encore de reins
de poulet (26). Parmi celles-ci les cultures de cellules embryonnaires hépatiques sont les plus sensibles (11). Le
virus peut aussi être cultivé par passage sur la membrane chorioallantoïdienne (MCA) d’embryons de poulet
exempts d’agents pathogènes spécifiques (EAPS) âgés de 10 à 12 jours (14).
Le virus causal peut être mis en évidence directement dans un exsudat trachéal par microscopie électronique
(26). Les antigènes viraux peuvent être détectés par immunofluorescence (4, 28), immunodiffusion en gélose
(IDG) (15), ou une méthode immuno-enzymatique (ELISA), sur des raclements de la muqueuse trachéale (30).
L’examen histopathologique de la trachée avec l’observation des inclusions intranucléaires caractéristiques des
herpèsviroses peut être aussi utile (3, 23). Les méthodes utilisant l’amplification en chaîne par polymérase (PCR)
pour détecter le LTIV ont été décrites, la PCR étant considérée généralement plus sensible que l’isolement du
virus (2, 16, 19, 29).
a) Isolement du virus
Lorsque les prélèvements sont effectués sur des oiseaux vivants pour l’isolement viral, les écouvillons
trachéaux sont préférables aux écouvillons oropharyngés ou conjonctivaux. Ils doivent être placés dans un
milieu de transport additionné d’antibiotiques. Lorsque la maladie est chronique, le choix des prélèvements
pour l’isolement du virus doit être effectué sur un animal euthanasié au début des signes cliniques plutôt que
de tenter cet isolement chez un oiseau mort à la suite d’une asphyxie après une longue évolution. La qualité
du prélèvement est meilleure si l’oiseau est tué par injection de barbituriques ou autres produits plutôt que
par dislocation cervicale. Il faut prélever la tête entière et le cou des animaux morts ou seulement la trachée
et le larynx après leur prélèvement en évitant au maximum toute contamination. Les trachées doivent être
transportées dans un milieu additionné d’antibiotiques, mais emballées dans un papier humide si elles sont
destinées à la microscopie électronique. Tout stockage prolongé des tissus infectés doit être réalisé à
-70 °C ou moins pour limiter une perte du titre viral. Il faut éviter les congélations et décongélations répétées
qui diminuent l’infectiosité du virus.
L’exsudat et les cellules épithéliales raclés de la trachée sont dilués au 1/5 dans un milieu nutritif contenant
de la pénicilline et de la streptomycine, le mélange étant agité vigoureusement. La suspension obtenue est
centrifugée à faible vitesse pour enlever les débris, puis 0,1 ml du liquide surnageant est inoculé sur la MCA

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d’au moins 3 œufs embryonnés de poulet âgés de 10 à 12 jours. Les œufs sont obturés avec de la paraffine
et mis à incuber à 37 °C pendant plus de 7 jours. Ils sont mirés tous les jours puis l’on recherche les foyers
nécrotiques typiques sur les MCA des embryons morts ou survivants au-delà de 7 jours. Alternativement, on
peut utiliser des cultures cellulaires de foie ou de rein d’embryon de poulet. Lorsque le tapis cellulaire est
complet, le milieu est éliminé puis les cellules sont inoculées et mises en contact pour adsorber le virus
pendant 1 à 2 h. Puis les cultures sont recouvertes d’un nouveau milieu et mises en incubation jusqu’à
7 jours en étant examinées tous les jours au microscope dans le but de mettre en évidence un effet
cytopathogène (ECP) caractérisé par l’apparition de cellules syncytiales.
Dans chaque cas, 3 passages de matériel biologique au moins sont nécessaires avant de considérer qu’un
prélèvement est négatif. L’isolement d’un virus LTI peut être confirmé par un test de séroneutralisation (SN)
sur œufs ou sur culture cellulaire en utilisant un antisérum LTI hyperimmun. Alternativement, des particules
virales peuvent être identifiées rapidement dans le liquide de cultures cellulaires ou sur les foyers
nécrotiques des MCAs par microscopie électronique et l’antigène viral peut être détecté par
immunofluorescence sur des cultures cellulaires infectées fixées avec de l’acétone ou sur des coupes
congelées de MCA ; l’acide nucléique du virus peut être détecté par PCR.
b) Microscopie électronique
Le virus peut être mis en évidence par microscopie électronique à partir d’un raclage de trachée ou d’un
exsudat trachéal étalé et mélangé avec quelques gouttes d’eau distillée sur une lame pour microscopie. Une
goutte de cette suspension est placée sur un carbone et une grille porte-objet préalablement enduite d’un
film continu de formvar, laissée pendant 2 min puis l’excès de liquide est retiré avec du papier filtre. Une
goutte d’acide phosphotungstique à 4 % de pH 6,4 est ajoutée puis, après 3 min, l’excès de liquide est
éliminé. La grille est séchée minutieusement puis examinée au microscope électronique à un grossissement
de ! 30 à 45 000 pour les particules caractéristiques des herpesvirus (100 nm de diamètre avec une
symétrie icosahédrique).
c) Immunofluorescence
Pour les épreuves d’immunofluorescence pour les antigènes viraux, les cellules épithéliales obtenues par
raclage de trachée sont étalées sur une lame de verre. Alternativement des coupes de trachée d’une
épaisseur de 5 µm obtenues par congélation rapide avec de l’azote liquide sont fixées dans l’acétone à la
température du laboratoire pendant 10 min. Ces prélèvements peuvent être colorés directement en utilisant
des immunoglobulines anti-ILTV marquées par de l’isothiocyanate de fluorescéine (ITCF) appliquées
pendant 1 h, suivi d’un rinçage pendant 15 min dans un bain d’une solution physiologique tamponnée au
phosphate (PBS) à pH 7,2, sous agitation magnétique. Sinon, ils peuvent être colorés indirectement en
utilisant un sérum de poulet anti-ILTV de dilution appropriée appliqué pendant 1 h. La lame est rincée
minutieusement avec du PBS pendant 15 min comme ci-dessus et les immunoglobulines anti-ILTV
marquées par de l’ICTF sont appliquées pendant 30 min. Après un dernier rinçage, la préparation est
recouverte d’une lamelle avec un milieu de montage non coloré. Les préparations sont examinées à l’aide
d’un microscope à fluorescence sous lumière ultra-violette pour rechercher une fluorescence spécifique
intranucléaire dans les cellules épithéliales. Des témoins appropriés sont effectués en utilisant du matériel
de référence non infecté et, pour les méthodes indirectes, du sérum de poulet négatif. Des précautions
particulières doivent être prises lors de la lecture des préparations pour l’immunofluorescence car des IgG
endogènes de poulet dans la trachée peuvent provoquer une fixation non souhaitée des immunoglobulines
anti-virus LTI marquées par de l’ICTF.
d) Immunodiffusion en gélose
Les antigènes du ILTV peuvent être mis en évidence sur un exsudat trachéal, les MCAs infectées et des
cultures cellulaires infectées en utilisant de l’antisérum hyperimmun anti-ILTV. La gélose est préparée avec
de la gélose Noble agar (1,5 %) contenant du chlorure de sodium (8 %) et de l’azide de sodium (0,02 %)
- en tant que conservateur - dans de l’eau distillée. Les ingrédients sont autoclavés à 2,4 bars pendant
15 min ; 5 ml de la gélose liquide sont versés dans une boîte de Petri de 5 cm de diamètre. Quand la gélose
est figée, une série de puits sont réalisés dans la gélose. Les puits ont habituellement 8 mm de diamètre et
4 mm d’intervalle. Le sérum hyperimmun est placé avec une pipette dans le puits central alors que les puits
qui l’entourent sont remplis avec les prélèvements suspects d’être virulents à tester, à l’exception d’un puits
témoin positif contenant l’antigène viral. Les disques sont ensuite mis en incubation en atmosphère humide
à la température du laboratoire ou à 37 °C, puis examinés 24 à 48 h plus tard en lumière oblique pour
identifier les lignes de précipitation. Les tests doivent aussi comporter un témoin antigène négatif avec du
matériel non infecté et un antisérum témoin négatif. Pour des raisons économiques, ce test peut être réalisé
sur une lame de microscope recouverte d’une fine couche de gélose où les trous ont 4 mm de diamètre et
2 mm d’intervalle.

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e) Méthode immuno-enzymatique
La méthode ELISA utilisant les anticorps monoclonaux (AcM) peut être employée pour mettre en évidence
les antigènes viraux (16). L’exsudat trachéal est mélangé avec un même volume de PBS contenant
1 % (v/v) de détergent comme le Nonidet P40 (BDH Chemicals, Poole, Royaume-Uni), puis mixé pendant
30 s et centrifugé à 10 g pendant 1 min. Le liquide surnageant est distribué sous un volume de 50 µl dans
les cupules des microplaques préalablement recouvertes d’IgG de lapin anti-ILTV diluées au 1/200 dans
0,05 M de tampon carbonate/bicarbonate, de pH 9,0 ; et mis en incubation pendant 1 h. Puis 50 µl d’AcM
dirigés contre les principales glycoprotéines du ILTV, dilués au 1/50 dans du PBS, sont ajoutés dans chaque
cupule, suivis par 50 µl d’une dilution au 1/1 000 d’IgG anti-souris purifiée d’origine caprine conjuguée à de
la peroxydase de raifort. Le substrat, l’acide 5-aminosalicylique (6,5 mM), est ajouté dans les cupules au
volume de 100 µl. Après 30 min, les plaques sont lues à l’aide d’un spectrophotomètre à 450 nm et la
lecture de l’absorbance pour chaque cupule est corrigée par la soustraction de la lecture obtenue avec les
cupules témoins contenant du tampon dilué au lieu de l’exsudat trachéal. La limite positif/négatif est
déterminée par la valeur moyenne de l’absorbance obtenue avec plusieurs prélèvements négatifs (matériel
trachéal sans virus LTI) plus 3 écart-types.
f) Histopathologie
Les trachées destinées à un examen histologique doivent être placées dès leur prélèvement sur les oiseaux
dans une solution de formol et incluses dans des blocs de paraffine. Les paupières et les poumons sont
parfois examinés. Des inclusions Intranucléaires peuvent être observées dans les cellules de l’épithélium
trachéal sur des coupes longitudinales colorées par l’hématoxyline et l’éosine. Il s’agit des inclusions
classiques de type A de Cowdry des herpesviroses, mais elles peuvent n’être présentes que pendant les 3 à
5 jours suivant l’infection. Dans les cas sévères où la plupart des cellules infectées se sont détachées de la
trachée, les inclusions seront visibles sur les cellules intactes dans les débris cellulaires présents dans la
lumière trachéale. Des coupes longitudinales de la trachée sont préférables à des coupes transversales car
elles permettent d’examiner toute la longueur de l’organe.
g) Méthodes moléculaires
Différentes méthodes moléculaires pour identifier l’ADN du ILTV dans les prélèvements ont été rapportées,
mais la PCR s’est révélée la plus utile. Un test d’hybridation Dot Blot avec des fragments ADN de virus
cloné s’est révélé très sensible pour la détection du virus alors que l’ELISA était négatif (16, 17). Humberd et
al. (13), ont montré que l’ADN du ILTV pouvait être détecté grâce à une PCR nichée dans des tissus inclus
dans de la paraffine, en présence ou non de cellules syncytiales, d’inclusions intra-nucléaires ou des deux.
La PCR s’est révélée plus sensible que l’isolement viral dans les prélèvements, en particulier lorsque
d’autres contaminants viraux comme les adénovirus sont présents (29). Alexander et Nagy (2) ont montré
que la PCR et l’isolement viral présentent la même sensibilité du milieu de la phase d’infection jusqu’à la fin
de celle-ci, alors que la PCR se révèle supérieure pendant la phase de guérison.
Jusqu’à présent, le problème avec la PCR était qu’elle ne pouvait pas différencier les souches du terrain des
souches vaccinales. Cependant la combinaison de la PCR et de l’analyse du polymorphisme de longueur
des fragments de restriction (RFLP) d’un ou de plusieurs gènes ou régions du génome viral a permis la
caractérisation de souches différentes dans un pays ou une région (5). Plusieurs études ont montré que si
certaines souches de terrain sont étroitement apparentées aux souches vaccinales et qu’il est probable
qu’elles dérivent de ces dernières, d’autres sont « d’authentiques types sauvages » (21). Les gènes
habituellement analysés par différents auteurs comprennent ICP4, TK (thymidine kinase), gG (glycoprotéine
G), gE (glycoprotéine E) et UL47. Oldoni & Garcia (22) ont utilisé 36 enzymes de restriction tandis que
d’autres auteurs en ont utilisé que 4.
i) Protocole de la PCR
Dans un protocole classique de PCR pour l’ILTV, l’ADN viral est extrait d’échantillons cliniques (écouvillons,
fragments de tissu), de lésions de la membrane chorio-allantoïque, de surnageants de culture ou de vaccins
à l’aide de kit d’extraction d’ADN. Les amorces qui peuvent être utilisées ont été indiquées dans des travaux
précédemment publiés ou peuvent être construites sur la base des séquences de ITLV inscrites dans la
base de données internationale Genbank. Les amplifications sont faites en utilisant la Taq ADN polymérase.
Les réactions d’amplification classiques commencent par une étape initiale de dénaturation à 94 °C pendant
1 min suivie par 35 cycles d’amplification à 94 °C pendant 1 min avec des températures d’hybridation
comprises entre 54 °C et 60 °C pendant 30 s. L’étape d’élongation peut être réalisée à 68 °C pendant des
durées variant selon la taille de la région cible qui est amplifiée, et une phase finale d’élongation à 68 °C
pendant 7 min. Le produit de la PCR est visualisé après une électrophorèse sur un gel d’agarose à 1 %,
coloration au bromure d’éthidium et exposition aux rayons ultraviolets.

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ii) PCR en temps réel
Une épreuve de PCR en temps réel a récemment été décrite pour l’ILTV (7). Elle présente l’avantage, d’être
réalisable en moins de 2 h (amplification et analyse compris). Comparée aux autres techniques telles que
l’isolement du virus ou la PCR classique suivie d’une électrophorèse en gel, elle donne donc des résultats
très rapidement.
iii) Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP)
Plusieurs endonucléases de restriction ont été décrites pour réaliser des analyses RFLP des produits de
PCR de l’ITLV, et plusieurs gènes ont été ciblés par les digestions. Il s’agit des gènes ICP4, TK (thymidine
kinase), UL15, UL47, Gg (glycoprotéine G) et ORF-BTK. Les produits d’amplification sont digérés
séparément avec 10 u d’une endonucléase de restrictions pendant 3 h. Les fragments digérés sont séparés
dans des gels de polyacrylamide à 15 %. Ces fragments sont observés après coloration argentique de
l’ADN et analysés dans une boîte lumineuse. Les différences de profils sont enregistrées pour chaque
enzyme et les résultats sont présentés sous forme de dendrogrammes. La combinaison de la PCR et de la
RFLP ont permis de différencier les souches de terrain de ILTV des souches vaccinales (7, 10, 21, 26).
2. Épreuves sérologiques
Les anticorps dirigés contre l’ILTV dans le sérum du poulet peuvent être détectés par SN, IDG,
immunofluorescence indirecte et ELISA (1).
a) Séroneutralisation
Les tests de SN sont réalisés sur des MCAs d’œufs embryonnés de poulets âgés de 9 à 11 jours, où les
anticorps spécifiques doivent neutraliser la formation des foyers nécrotiques dus au ILTV. Ces tests peuvent
également être effectués de manière alternative sur des cultures cellulaires où les anticorps spécifiques
neutralisent l’ILTV en prévenant l’ECP. Des dilutions de sérums de raison 2 sont ajoutées à un volume égal
d’une solution virale à concentration constante. Cette concentration peut être équivalente soit à 100 DIE50
(dose de virus infectant 50 % des embryons), soit à 100 DICT50 (dose de virus infectant 50 % de la culture
tissulaire). Ces mélanges sont mis en incubation à 37 °C pendant 1 h pour permettre la neutralisation virale.
Lorsque le test est réalisé sur des œufs, les mélanges virus/sérum sont inoculés par la voie
chorioallantoïdienne, avec l’emploi d’au moins 5 œufs par dilution. Les œufs sont obturés puis incubés à
37 °C pendant 6 à 7 jours. Le point limite est enregistré à la plus forte dilution du sérum où l’on n’observe
pas de foyers nécrotiques sur les MCAs. Quand les tests sont pratiqués sur des cultures cellulaires, les
dilutions de sérums sont préparées dans des microplaques à 96 cupules, puis le virus est ajouté. Après la
période nécessaire pour la neutralisation, des cellules fraîches de foie ou de rein d’embryon de poulet sont
ajoutées dans chaque cupule. Les plaques sont mises en incubation à 37 °C dans une atmosphère à 5 %
de CO2 et examinées tous les jours pour un ECP ; le point limite à 50 % est lu après environ 4 jours quand
le « témoin virus » indique que 30-300 DICT50 ont été utilisées dans ce test. Pour le test utilisant la culture
cellulaire, une neutralisation du virus au 1/8 (dilution initiale) ou plus est considérée comme positive.
b) Immunodiffusion en gélose
Pour les tests d’IDG, l’antigène est préparé à partir des MCAs infectées par le virus où des cultures
cellulaires infectées. Dans le premier cas, au moins 104 DICT50 du ILTV sont inoculées dans la cavité
allantoïdienne d’un groupe d’œufs embryonnés EAPS âgés de 10 jours. Les MCAs sont récoltées après
4 jours d’incubation et celles qui présentent de larges foyers nécrotiques sont homogénéisées puis
soniquées dans un faible volume de PBS à pH 7,1. Dans l’autre cas, des cultures cellulaires de foie ou de
rein d’embryon de poulet ou de cellules rénales de poulet, fortement infectées, sont mises en incubation à
37 °C jusqu’à l’obtention d’un ECP maximal. Toutes les cellules encore attachées sont grattées et récoltées
dans le milieu de culture. La récolte des cultures peut être concentrée jusqu’à 100 fois par dialyse contre du
polyéthylène glycol (PEG 20 000 ou PEG 30 000). Pour le test la gélose est préparée comme décrit
ci-dessus pour la détection de l’antigène, mais dans ce cas c’est l’antigène de la MCA ou de la culture
cellulaire qui est placé dans le puits central et les sérums à tester dans les puits périphériques. Des
antisérums témoins positif et négatif sont utilisés dans ce test qui est lu après 24 à 48 h d’incubation à la
température du laboratoire ou à 37 °C. Les tests d’IDG sont simples, économiques et utiles pour un
dépistage de la LTI dans l’élevage mais sont moins sensibles que les autres méthodes.
c) Épreuve d’immunofluorescence indirecte
Pour les épreuves d’immunofluorescence indirecte, l’antigène est préparé sur plusieurs microcultures
cellulaires infectées par le virus LTI et multipliées sur des lames multispot recouvertes de téflon. Quand
l’ECP apparaît, les cultures sont fixées dans l’acétone pendant 10 min. Les dilutions du sérum à tester sont
préparées dans du PBS et appliquées sur chaque microculture, les lames étant mises par la suite en
incubation pendant 1 h à 37 °C. Les lames sont rincées avec du PBS comme décrit ci-dessus, égouttées