12/11/15 GONCALVES Salomé L2 CR : Clémentine

GENETIQUE MEDICALE – Principe des études moléculaires en génétique médicale :
Méthode d'analyse des micro-lésions du génome
12/11/15
GONCALVES Salomé L2
CR : Clémentine PAYRASTRE
Génétique médicale
Dr. Martin Khran
16 pages
PRINCIPE DES ETUDES MOLECULAIRES EN GENETIQUE MEDICALE :
METHODE D'ANALYSE DES MICRO-LESIONS DU GENOME
Rappels et généralités :
Introduction :
L’un des objectifs majeurs dans le domaine des anomalies génétiques est de mettre en évidence ces
anomalies qui peuvent être soit causales , maladies génétiques mono-factorielles, soit à effets modificateurs
(« prédisposition génétique »), dans ce cas les maladies sont diverses on retrouve la cancérologie, les
maladies cardio-vasculaire et les maladies métaboliques. L’élément causal primaire n’est pas génétique, les
variations génomiques auront un effet soit protecteur soit aggravant sur le développement de ces pathologies.
En génétique médicale on s’intéresse surtout aux anomalies causales, responsables de la maladie.
Il n’est actuellement pas réalisable d’effectuer en routine une analyse simultanée de tous les gènes
d’un individu même si on y arrive de plus en plus. Cela va se développer dans les prochaines années.
Il faut donc choisir les techniques à utiliser en fonction de l’anomalie génétique recherchée et ceci restera
vrai même avec le séquençage à haut débit.
Démarche diagnostic dans les maladies génétiques :
Lors de la consultation diagnostique, la démarche consiste à l'interrogatoire et l’examen clinique qui
vont donner tous les éléments qui vont permettre de cerner les caractéristiques du patient. En ce qui concerne la
génétique il faut connaitre l’histoire de la maladie, réaliser un arbre généalogique afin d'évaluer le mode de
transmission, réaliser un examen clinique ciblé sans oublier un examen clinique général.
Il y a également des examens complémentaires à réaliser pour confirmer les hypothèses de diagnostic
qui peuvent être des analyses biologiques selon le contexte, de l'imagerie, des examens ciblés selon
l'orientation.
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Plan :
Rappels et généralités
A. Techniques courantes d'analyse de micro-lésions du génome
I. Notion de diagnostic direct et indirect
II. PCR
III. Séquençage direct
IV. Le pré-criblage
V. Diagnostic direct, stratégies
VI.Microarrays
VII. Techniques d'études de l'expression des gènes
B. La nouvelle ère de la génétique moléculaire
I. Principe et enjeux du séquençage à haut débit

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Méthode d'analyse des micro-lésions du génome
Ex : lorsque l'on suspecte une myopathie, on va réaliser une biopsie musculaire sur laquelle on va rechercher un
certains nombre de signes spécifiques qui permettent d'orienter vers le sous types particulier de myopathies.
Le diagnostic clinique va conduire à la prescription d'une analyse génétique afin d'avoir un diagnostic de
certitude pour le patient.
Matériel d'étude : types d'échantillons
Le matériel est essentiellement génomique. Il existe aussi des techniques qui s'effectuent à partir de
l'ARNm. On parle dans ce cas d'une analyse du génome à l’échelle du transcriptome. Les molécules d’ARN
sont instables, il y a donc possibilité de les rétro transcrire en cDNA par technique de PCR inverse ou reverse
transcription pour les analyser.
Les analyses biochimiques sur les protéines sont également importantes pour les conclusions d'anomalies
génétiques.
L’ADN au niveau des cellules est à priori identique, on peut donc travailler sur n’importe quel échantillon
le plus souvent sur un prélèvement sanguin et sur des lymphocytes. Au niveau du transcriptome et du
protéome, c’est différent, il y a une expression spécifique en fonction des cellules. On obtient donc des
chromosomes, de l'ADN, des ARN messagers / des cDNA.
Tout ceci doit se faire avec le consentement de l’individu.
Il est possible de travailler sur d’autres prélèvements, notamment dans le cadre du DPN (diagnostic pré
natal) : tissus embryonnaires/fœtaux ( liquide amniotique ou villosités choriales). On peut aussi par une simple
prise de sang chez la mère récupérer des informations du fœtus, grâce à de l'ADN foetal circulant dans le sang
maternel, cela diminue les risques de fausses couches.
A. Techniques courantes d’analyse de micro-lésions du génome
I. Diagnostic moléculaire des maladies génétiques.
L’objectif est d’établir un diagnostic précis par l’identification de l’anomalie génétique. Le diagnostic le
plus précis en génétique est l'identification précise de la maladie causale. L’intérêt est d'obtenir un diagnostic
certain, de permettre une prise en charge adaptée et de fournir des conseils génétiques (risque de récurrence
au niveau de la famille).
Ex : dans les myopathies il y a des centaines de sous types différents, chacune avec une évolution différente,
l'analyse génétique permet d'identifier telle ou telle myopathie. Il y a des myopathies avec atteinte cardiaque
d'autre non, en fonction du diagnostic génétique nous serons si on doit mettre en place une surveillance
cardiaque .
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On retrouve deux types de diagnostics à l’échelle des gènes
–Diagnostic direct : qui consiste à rechercher de manière précise l’anomalie génétique au niveau des
gènes
–Diagnostic indirect : qui consiste en l'utilisation de marqueurs génétiques qui sont des polymorphismes
du génome, l’intérêt est d'avoir une grande variabilité individuelle ce qui permet de suivre indirectement
la transmission des mutations à l’intérieur d'une famille . ( il y aura un ED sur cette approche) . Cette
approche est également utilisée en médecine légale.
Le diagnostic direct consiste en la recherche de l'anomalie génétique primaire.
Celui-ci permet l'identification de mutations constitutionnelles délétères. Cette approche est utilisée de
préférence et permet un diagnostic de certitude mais pose certains problèmes dont les principaux sont que
celle-ci est parfois lourde sur le plan technique (difficulté à étudier les gènes de grande taille), parfois non
concluante, et il faut également savoir différencier les polymorphismes des mutations constitutionnelles
délétères.
Génétique moléculaire
L'objectif de la génétique moléculaire est l'identification d’anomalies à l‘échelle du gène. Les différentes
mutations peuvent être des substitutions d'1 nucléotide, des insertions, délétion de 1 à quelques nucléotides
ou des insertions/délétions de quelques dizaines ou quelques centaines de nucléotides.
La majorité des mutations pathogène est localisée en séquence codantes, ce qui justifie l’analyse
préférentielle des exons codons. A l'échelle d'un gène, la séquence comporte 100 à 200 000 paire de base. La
séquence codante en elle même est au alentours de 1000 à 3000 paire de base. ( il y a un facteur 10 entre le gène
et la séquence codante, il est donc préférable de regarder en priorité les exons codants).
II. Polymerase Chain Reaction PCR
C’est une technique centrale, souvent utilisée en association avec d’autres. Lorsque l'on cherche à
identifier une anomalie génétique on est souvent confronté au problème d'une faible quantité de matériel pour
une étude au niveau moléculaire.
L’intérêt est donc de pouvoir amplifier de manière très importante une région d’intérêt présente en faible
quantité. Il est possible d’augmenter la quantité de prélèvement pour avoir plus de matériel mais on utilise de
manière préférentielle la PCR.
Elle est basée sur 2 éléments principaux :
–de courts fragments d’ADN synthétiques (les Amorces : environ 20 paires de bases) complémentaires et
spécifiques de la région d’intérêt (appariement)
–d’une enzyme ADN polymérase (Taq) qui permet d’amplifier/ copier de manière fidèle un ADN cible à
partir de régions doubles brins (zones d'appariement AND cible-amorces)
Il y a trois étapes:
1. Dénaturation : étape de séparation des brins pendant 30 seconde à 1min à 95°.
2. Hybridation : les amorces spécifiques se fixent au niveau de la région
d’intérêt.
3. Elongation : l'ADN polymérase incorpore les nucléotides correspondants.
Tout ceci est répété un certains nombre de fois environ une 30 de fois. A
chaque cycle on aura une amplification exponentielle à partir de notre région
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d’intérêt de départ.
L'analyse de la région d'intérêt amplifiée comprend l'analyse de la séquence principalement (recherche
de mutations dans la région d'intérêt ) et l'analyse de la taille qui a des applications diverses (analyse de
microsatellites...)
L’analyse de la séquence consiste à regarder au niveau du gène quel est l’enchainement des nucléotides surtout
au niveau des exons codants.
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III. Séquençage direct
Le séquençage direct est basé sur la méthode de Sanger qui utilise des ddNTP (didéoxyribonucléotides),
analogues structuraux des dNTP mais incapables de réaliser une liaison phosphodiester. Cette méthode consiste en
l'incorporation au hasard de ddNTP marqués (au fluorochrome rouge, bleu, vert ou jaune) qui stoppent à chaque fois
l'élongation.
Etapes du séquençage direct :
On a notre matrice (amplifiée par la PCR), de nouveau on utilise des amorces et une ADN polymérase,
avec des Déoxyribonucléotidestriphosphates des dNTP normaux et des didéoxyribonucléotides triphosphates,
des ddNTP couplés à des fluorochromes différents pour chaque base.
A chaque fois l’arrêt est marqué par le nucléotide et le fluorochrome associé.
CR :On a des molécules de tailles différentes car au hasard de l'incorporation des ddNTP, la réaction s'arrête
en différents endroits de la chaîne. 300 à 500 paires de bases peuvent être alignées au maximum avec cette
technique.
On fait migrer ces molécules par électrophorèse capillaire sur un automate : un tube très fin dans lequel il y a un
gel qui permet de ralentir la migration. Les molécules les plus petites migrent plus facilement et arrivent donc
les premières. Une par une on aura la détection de la fluorescence qui permet de reconstituer la séquence.
Le prof a conseillé ces deux documents pour mieux comprendre :
Illustration VIDEO (2min30) www.genome.gov/25019885
- Réaction d’élongation avec incorporation de ddNTP fluorescents
- Production de fragments amplifiés de toutes les tailles
- Séparation des fragments par Electrophorèse
- Lecture par un système laser: pics de fluorescence
- Traitement informatique: reconstitution de la séquence Séquençage direct
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