Les protéines non structurales des Alphavirus : rôle dans la
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revue Virologie 2013, 17 (1) : 31-45 Les protéines non structurales des Alphavirus : rôle dans la réplication et l’interaction du virus avec la cellule hôte Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Nadia Rabah1 , 2 Bruno Coutard1 Bruno Canard1 1 CNRS, universités d’Aix-Marseille-I et II, UMR 7257, architecture et fonction des macromolécules biologiques, ESIL Case 925, 13288 Marseille, France 2 Université du Sud Toulon-Var, laboratoire matériaux polymères interfaces environnement marin (MAPIEM-EA 4223), 83162 La Valette-du-Var cedex, France <[email protected]> Résumé. Les alphavirus (famille des Togaviridae) sont des virus émergents transmis principalement par les arthropodes. L’infection par des alphavirus conduit à des pathologies plus au moins sévères incluant fièvres, polyarthrites et encéphalites pouvant conduire à des séquelles neurologiques permanentes. Les alphavirus sont des virus enveloppés, dont le génome est un ARN simple brin de polarité positive. L’ARNm code pour deux protéines non structurales (P123 et P1234) maturées au niveau post-traductionnel en quatre protéines nsP1 à 4. Ces dernières vont assurer la transcription ainsi que la réplication du virus. Différentes études ont soulignées l’importance des nsP dans l’accroissement de la virulence mais également l’échappement viral. Cet article de revue retrace, d’une part, les différentes hypothèses concernant l’évolution ainsi que la propagation mondiale des alphavirus. D’autre part, il traite des découvertes récentes concernant le rôle des nsP dans la réplication virale ainsi que dans les interactions hôte/pathogène. L’élucidation et la compréhension de la fonction de chaque nsP reste un prérequis pour l’élaboration de composés antiviraux. Mots clés : alphavirus, évolution, replication, protéine non structurale, nsP, méthyltransférase, guanylyltransférase, hélicase, protéase, macro domaine Abstract. Alphaviruses (genus of the family Togaviridae) are emergent arthropod borne viruses. They can cause mild to severe diseases including fever, arthritis, and in certain cases encephalitis leading to neurological sequels. Alphaviruses are enveloped, single-stranded and positive-sense RNA viruses. The genomic RNA encodes for two non-structural proteins (P123 and P1234) ; which are cleaved post-translationally to generate four proteins nsP1 to 4. These nsPs perform viral replication and transcription. Studies on different viruses pointed out that nsPs are associated to increased virulence and are implicated in the shut off of host antiviral defense systems. The present paper reports the latest hypothesis regarding the evolution and the spread of alphaviruses. Moreover, it reviews the recent discoveries concerning the role of nsPs in viral replication and virushost interactions. The elucidation and the understanding of nsPs function is a prerequisite for the development of potent and selective antiviral drugs. Key words: alphavirus, evolution, replication, non structural protein, nsP, methyl transferase, guanylyltransferase, helicase, protease, macro domain doi:10.1684/vir.2013.0477 Introduction Les alphavirus (famille des Togaviridae) sont des arbovirus (arthropod-borne viruses) transmis principalement par les invertébrés. Les alphavirus ont été retrouvés sur tous Tirés à part : N. Rabah Virologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 les continents excepté l’arctique et regroupent actuellement 29 espèces (tableau 1). Ce sont des virus qui infectent différents types d’hôtes incluant les moustiques, les mammifères, les oiseaux, les rongeurs ainsi que les salmonidés [1]. Chez les arthropodes, les alphavirus causent une infection bénigne persistante, transformant les invertébrés en hôte d’amplification. Les virions infectieux accumulés au niveau des glandes salivaires des arthropodes sont ensuite 31 Pour citer cet article : Rabah N, Coutard B, Canard B. Les protéines non structurales des Alphavirus : rôle dans la réplication et l’interaction du virus avec la cellule hôte. Virologie 2013; 17(1) : 31-45 doi:10.1684/vir.2013.0477 revue Tableau 1 Taxonomie des alphavirus : Nomenclature, classification antigénique, isolation géographique, hôte et vecteur arthropodea . Les noms des virus sont donnés en français. Voir la figure 2 et sa légende pour les noms en anglais. Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Virus de Complexe antigénique Abréviation Localisation géographique Hôte Vecteur arthropode Référence La maladie du pancréas du saumon SPDV Aquatique Salmonidés (Salmo salar) Lepeophtheirus salmonus ? [19] La maladie du sommeil SDV Aquatique Salmonidés (Oncorhynchus mykiss) Lepeophtheirus salmonus ? [96] L’éléphant de mer austral SESV Aquatique Éléphant de mer austral (Mirounga leonine) Lepeophtheirus macrorrhini ? [18] BFV Australie Humain Moustique du genre Culex/Aedes [97] La forêt de Barmah BF Middelburg MID MIDV Afrique Humain Aedes [98] Ndumu NDU NDUV Afrique Humain Aedes [99] Sagiyama SF SAGV Japon Humain Culex/Aedes [100] Getah SF GETV Asie du Sud Est/Australie Bovins/Équidés Culex/Aedes [101] La rivière Ross SF RRV Australie Rongeurs Culex/Aedes [101] Bebaru SF BEBV Asie du sud est Culex [102] La forêt de Semliki SF SFV Afrique Humain/Primate/ Équidés Aedes [103] Mayaro SF MAYV Amérique du sud et Carraibes Humain Moustique du genre Haemogagus. [104] Una SF UNAV Amérique du sud Moustique du genre Psorophora/Aedes [105] Chikungunya SF CHIKV Afrique, Océan Indien et Asie. Humain/Primates Aedes aegypti/Aedes albopictus [106, 107] O’nyong nyong SF ONNV Afrique Humain Moustique du genre Anopheles [108] L’encéphalite équine du Venezuela VEE VEEV Amérique Centrale/Amérique du Sud Humain/Équidés/ rongeurs Culex/Aedes/ Psorophora [109] Everglades VEE EVEV Amérique Centrale Oiseaux Culex [110] Tonate VEE TONV Guyane Mucambo VEE MUCV Amérique du Sud Pixuna VEE PIXV Amérique du Sud Cabassou VEE CABV Guyane Rio Negro VEE RNV L’encéphalite équine de l’Est EEE EEEV Amérique du Sud/Amérique du Nord [111] Culex [112] [112] Culex portesi Rongeurs/Oiseaux [111] Culex [113] Culex/Aedes [114] Aura WEE AURAV Amérique du Sud Culex [105] Buggy Creek WEE BCRV Amérique du Nord Oiseaux Oeciacus vicarious [115] Fort Morgan WEE FMV Amérique du Nord Oiseaux Oeciacus vicarious [116] 32 Virologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 revue Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Tableau 1 (Suite) a Virus de Complexe antigénique Abréviation Localisation géographique Hôte Vecteur arthropode Référence Highlands J WEE HJV Amérique du Nord Oiseaux Culex [117] Sindbis WEE SINDV Tous les continents Oiseaux Culex/Aedes [118] Trocara WEE TROV Amérique du Sud Culex [119] L’encéphalite équine de l’Ouest WEE WEEV Amérique du Sud/Amérique du Nord Rongeurs/Oiseaux Culex/Aedes [120] Whataroa WEE WHAV Nouvelle Zélande Oiseaux Culex/Culiseta [121] Modifié de [17]. transmis par piqûre à des hôtes vertébrés chez lesquels l’infection est aiguë et conduit à des symptômes plus ou moins sévères [2]. Cliniquement, ces virus peuvent être divisés en deux grandes catégories. La première regroupant les virus de « l’ancien monde » (tels que le virus de la Ross River, de la forêt de Barmah, du Chikungunya ou encore Sindbis) qui provoquent des myopathies, des polyarthrites, et ultimement des fièvres hémorragiques [3, 4]. La deuxième catégorie regroupe les virus du « nouveau monde » (tels que les virus de l’encéphalite équine de l’Est, de l’Ouest ou encore Vénézuélienne) qui vont déclencher des infections neurologiques conduisant à des encéphalites, des vomissements, des leucocytoses et des fausses couches chez les humains et les animaux domestiques [5]. De ce fait, ces virus représentent des risques épidémiques et épizootiques importants. De plus, bien que ces virus soient normalement transmis par des arthropodes, des incidents de laboratoire ont montré que le virus causant des encéphalites équines pouvaient être hautement infectieux par voie aérienne. Cela a d’ailleurs conduit, dans le passé, au développement de programmes militaires visant à les utiliser comme armes biologiques [6]. Le virion des alphavirus est petit (diamètre de 50 à 80 nm), sphérique et entouré d’une enveloppe lipidique (figure 1). L’enveloppe provient de la membrane plasmique de la cellule hôte et contient des complexes stables de deux glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2, organisés en trimères. Ces complexes trimériques interagissent avec les protéines de la capside et sont ordonnés en structure icosaédrique avec un nombre de triangulation T = 4. La capside renferme le génome qui est un ARN simple brin de polarité positive d’environs 11 à 12 kb [2]. Cet ARN, appelé ARN 42S, possède une coiffe en 5 ainsi qu’une queue de polyadénylation en 3 et est utilisable en tant qu’ARNm. L’ARN génomique des alphavirus contient deux cadres de lecture ouverts. Une fois libéré dans le cytoplasme, la machinerie cellulaire va traduire les deux premiers tiers du génome, à partir du preVirologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 mier cadre de lecture, en protéines P123 et P1234. Ces deux protéines vont être maturées en protéines non structurales nsP1 à nsP4 qui formeront, en association avec des facteurs cellulaires, la machinerie de transcription et de réplication du virus décrite plus bas [2, 7, 8]. Les protéines non structurales vont assurer la transcription de l’ARN génomique en ARN de polarité négative ARN(-) qui servira de matrice à la production de nouveaux ARN génomiques destinés à l’encapsidation. Cet ARN(-) va aussi permettre la synthèse de l’ARN sous-génomique de 26S qui est traduit en précurseur polyprotéique contenant les protéines structurales C, E3, E2, 6K et E1. Les glycoprotéines de l’enveloppe E1 et E2 vont intervenir dans la fusion du virion à la membrane plasmique de la cellule hôte. La glycoprotéine E3 semble faciliter la maturation posttraductionnelle du précurseur glycoprotéiques E1 et E2. Le peptide 6K intervient dans le ciblage cellulaire et la maturation post-traductionnelle de E1. La protéine C représente la protéine de la capside et contient des sites de fixation à l’ARN [9] (figure 1). La présente revue relate, d’une part, les découvertes les plus récentes concernant l’évolution ainsi que la propagation des alphavirus. D’autre part, elle se focalise sur les dernières découvertes visant à caractériser la machinerie de réplication des alphavirus, dans le but de mieux comprendre le rôle des protéines non structurales dans la réplication et l’interaction du virus avec la cellule hôte. La compréhension du rôle de ces protéines est cruciale pour l’identification de cibles pouvant être exploitées lors de la conception de molécules antivirales. Évolution et propagation des alphavirus La classification des alphavirus, comme pour les autres virus, a été initialement définie sur des déterminants antigéniques. Les deux glycoprotéines E1 et E2 étant utilisées comme cibles dans des réactions d’inter-réactivité 33 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue ARN SG (26S) 5´m7G nsP1 nsP2 nsP3 nsP4 C E3 E2 6K AAA...3´ E1 ARN SG (265) 5´m7G nsP1 nsP2 nsP3 nsP4 C E3 E2 6K E1 AAA...3´ 3´ 5´ARN - 5´m7G C E3 E2 ARN G (49S) 5´m7G nsP1 6K E1 AAA3´ ARN SG 26S ARN SG (26S) nsP2 nsP3 nsP4 C E3 E2 6K E1 AAA...3´ Figure 1. Cycle de réplication et génome des alphavirus. A. Les alphavirus sont des petits virus enveloppés présentant à leur surface les glycoprotéines de l’enveloppe E1 et E2, permettant l’internalisation du virus par endocytose. L’enveloppe entoure une capside icosaédrique avec un nombre de triangulation T = 4. La capside protège le génome à ARN simple brin de polarité positive. L’ARN génomique (ARN G) de 49S est libéré dans la cellule et agit en tant que ARN messager permettant la traduction des protéines P123 et P1234 maturées en protéines non structurales (nsP) 1, n2, 3 et 4. Les nsP vont dans un premier temps répliquer l’ARN génomique en un ARN de polarité négative (ARN (-)). L’ARN(-) sert de matrice pour la synthèse de l’ARN sous-génomique (ARN sous-génomique) de 26S, traduit en protéines structurales C, E3, E2, 6K et E1. Cet ARN(-) permet également la synthèse de nouvelles molécules d’ARN génomique, qui seront encapsidées et formeront les nouveaux virions après bourgeonnement à la membrane plasmique. antigéniques telles que la neutralisation, la fixation du complément ou encore l’inhibition de l’hémagglutination. Ces réactions sérologiques ont permis de classer les alphavirus en sept complexes antigéniques : WEE, VEE, EEE, SF, BF, MID et NDU [10] (tableau 1). Cependant, l’avènement des techniques de biologie moléculaire a permis d’établir des liens phylogénétiques entre les différents alphavirus, basés sur la comparaison des séquences complètes ou partielles des protéines non structurales, des glycoprotéines E1-E2 ainsi que de la protéine de la capside C. Ainsi, les premières études de comparaison de séquences partielles entre les virus SIN, EEE, VEE et WEE ont révélé des relations 34 phylogénétiques entre les virus du nouveau monde et de l’ancien monde en accord avec la classification antigénique, c’est-à-dire que chaque complexe antigénique appartient à un groupe monophylétique (figure 2). Ces études ont aussi mis en évidence la particularité du virus « nouveau monde » WEE. Ce dernier possède plus de 60 % de similarité de séquence avec les virus du nouveau monde (EEV et VEE) pour ce qui est de la séquence de nsP4 et des protéines de la capside. De plus, WEE présente plus de 70 % de similarité de séquence avec le virus SIN, basé sur la séquence des protéines non structurales. Par ailleurs, le virus SIN bien qu’étant originaire de l’ancien monde présente beaucoup Virologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 revue Poissons 10 % de divergence en a. a. SDV SPDV 100 Nouveau monde EEEV-IV EEEV-III EEEV-II 100 EEEV-I 91 100 PIXV VEEV EVEV 87 100 MUCV 93 100 96 TONV 100 100 71D1252V BFV MIDV SFV 100 97 100 88 CABV 78V3531V 100 SAGV Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. 100 100 96 97 100 100 RRV AG80V 100 MAYV 100 WHATV ONNV 100 CHIKV SINV Vieux monde SINV (Ockelbo) AURAV SESV Mammifères marins Figure 2. Arbre phylogénétique des alphavirus. L’arbre (non raciné, obtenu par la méthode « neighbor joining ») représente les principaux alphavirus discutés dans la revue, rassemblés dans leur groupe antigénique respectif, à l’aide de la séquence complète des protéines structurales (polyprotéine). L’arbre illustre la séparation des virus du nouveau monde et de l’ancien monde. L’inclusion des alphavirus aquatiques permet de souligner la diversité du genre alphavirus. Les abréviations sont : SPDV : salmon pancreatic disease virus ; SDV : sleep disease virus ; EEE : eastern equine encephalitis virus ; PIXV : pixuna virus ; VEEV : venezuelan equine encephalitis virus ; EVEV : Everglades virus ; MUCV : mucambo virus ; TONV : tonate virus ; 71D1252 V, 78V3531 V, AG80 V : souches dérivées du VEEV ; CABV : Cabassou virus ; WHATV : Whataroa virus ; SINV : Sindbis virus ; AURAV : Aura virus ; SESV : southern elephant sea virus ; CHIK : Chikungunya virus ; ONNV : O’nyong nyong virus ; MAYV : Mayaro virus ; SAGV : Sagiyama virus ; RRV : Ross River virus ; SFV : Semliki Forest virus ; MIDV : Middelburg virus ; BFV : Barmah Forest virus. Figure modifiée et adaptée de [16], préparée d’après [1]. plus d’homologie de séquence avec le virus EEE que SF. Les virus MAY et UNA ont été isolés en Amérique du Sud et dans les Caraïbes, pourtant ils possèdent des complexes antigéniques de type SF (tableau 1) et provoquent des polyarthrites sévères, signes cliniques caractéristiques des virus de l’ancien monde. Dans les arbres phylogénétiques établis à partir des séquences de E1 ou de nsP4, ces deux virus se retrouvent toujours dans le groupe des virus de l’ancien monde tels que SF, ONN et CHIK (figure 2). Ces différents résultats ont suggéré une recombinaison entre les virus du nouveau monde et de l’ancien monde au cours de l’évolution [10-13]. La découverte de nouvelles espèces virales ainsi que l’accumulation de données sur les séquences nucléotidiques des différents virus ont permis de formuler trois hypothèses quant à l’origine et l’évolution des alphavirus. La première hypothèse propose que les alphavirus soient apparus dans Virologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 le nouveau monde et dérivent d’un virus de plante adapté aux insectes. Ce virus ancestral aurait traversé l’atlantique au moins trois fois conduisant dans un premier temps à l’introduction dans l’ancien monde de l’ancêtre des virus possédant les complexes antigéniques BF, MID, NDU et SF. Une deuxième expatriation aurait permis l’introduction dans l’ancien monde de l’ancêtre des virus exhibant le complexe antigénique WEE (WHA et SIN). Finalement, des ancêtres de MAY et UNA (complexe antigénique SF) auraient été importés dans le nouveau monde. L’hypothèse de l’origine « nouveau monde » a été renforcée par les études de séquences de la « structure avale » (downstream loop [DLP]) de l’ARN 26 S qui suggère une origine « nouveau monde » des alphavirus [14]. La deuxième hypothèse prône l’apparition du virus ancestral dans l’ancien monde qui aurait subi trois flux migratoires permettant d’introduire l’ancêtre des virus à encéphalites en Amérique. Ce virus, après avoir divergé en différents complexes antigéniques (WEE, EEE et VEE), aurait été réintroduit dans l’ancien monde (SIN et WHA). Le troisième voyage aurait permis d’introduire les ancêtres de MAY et UNA dans le nouveau monde. Les différentes vagues de migration auraient été assurées par les oiseaux migrateurs ainsi que les échanges commerciaux et migratoires développés depuis la découverte du nouveau monde. Aux travers de ces flux migratoires, les ancêtres des différents complexes antigéniques se seraient adaptés à de nouveaux habitats et surtout à des hôtes très variés (rongeurs, mammifères et oiseaux), ce qui aurait permis la diversification des espèces et favorisé les recombinaisons [1, 10-13, 15, 16]. Très récemment, l’étude de Forrester et al. [17], basée sur la comparaison des génomes entiers (excluant le domaine hypervariable C terminal de nsP3 et N-terminal de la capside) des 29 espèces répertoriées, couplée à l’analyse des résidus conservés de l’hétérodimère E1-E2, a permis d’affiner le positionnement de certains virus et notamment des virus aquatiques (SPD et SES). Ces deux virus ont été longtemps considérés comme très éloignés génétiquement des autres du fait qu’ils n’avaient pas besoin d’hôtes invertébrés pour se répliquer. Cependant, la découverte de poux marins, pouvant infecter certains salmonidés (Lepeophtheirus salmonus) ou encore de mammifères marins (Lepeophtheirus macrorrhini), porteurs de virus, suggère la présence éventuelle d’un réservoir aquatique [18, 19]. Ces découvertes couplées aux résultats de Forresters et al. 2012, qui replacent SPD et SES comme étant ancestraux par rapport aux autres, mettent en avant une troisième hypothèse sur l’origine et la propagation des alphavirus (figure 2). Selon cette hypothèse (dite aquatique), les alphavirus terrestres seraient d’origine marine. Les ancêtres marins auraient été transmis à des invertébrés terrestres et à des insectes. Après adaptation à différent hôtes, divergence et éventuelle recombinaison, ces 35 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue prédécesseurs se seraient propagés à travers le globe suivant un scénario similaire à celui décrit par les deux hypothèses initiales. L’étude et la compréhension de phénomènes évolutifs inhérents aux alphavirus s’étendent au-delà d’intérêts purement fondamentaux. Toutes les analyses phylogénétiques soulignent la remarquable adaptation des alphavirus à de nouveaux habitats et hôtes dans la diversification des espèces des alphavirus. Cette adaptabilité est même visible à notre échelle de temps et permet d’établir des corrélations directes entre l’adaptation à un nouveau vecteur, l’apparition de mutations dans les protéines virales et la survenue de nouvelles flambées épidémiques. Ainsi, l’émergence et la ré-émergence du virus du CHIK dans les années 2005-2006 traduite par des flambées épidémiques sans précédent en Afrique, en Asie et même en Europe serait due à son adaptation aux moustiques urbains du genre Aedes, Aedes aegypti ainsi que Aedes albopictus. Les nouvelles souches, isolées à partir de zones pandémiques, ont révélé la présence de mutations dans les glycoprotéines E1-A226 V et E2-L201Q favorisant l’adaptation et la dissémination dans le vecteur Aedes albopictus [3, 20, 21]. Rôle des protéines non structurales dans la réplication du virus et l’interaction avec l’hôte Synthèse et maturation des protéines non structurales Les polyprotéines P123 et P1234 sont des protéines à multiples domaines produites sous forme de précurseurs de haut poids moléculaire. Ces précurseurs subissent deux ou trois clivages auto-catalytiques générant les protéines non structurales nsP1 à nsP4. Chez un grand nombre d’alphavirus, la séquence nucléotidique codant pour les protéines non structurales contient un codon stop OPAL entre nsP3 et nsP4. Ce codon stop est permissif dans 5 à 20 % des traductions et permet de générer les deux précurseurs P1234 et P123 [2]. L’abondance respective de ces deux précurseurs régule la synthèse du brin d’ARN de polarité négative (ARN(-)) et semble être impliquée dans l’établissement d’une infection chronique chez les arthropodes. La mutation de ce codon OPAL en codon Ambre, Ocre ou encore en Arginine a montré qu’une diminution de la réplication virale peut être corrélée avec une augmentation de l’infectivité et de la dissémination virale. Ce codon OPAL n’est pas présent chez toutes les espèces virales, il peut être remplacé par d’autres codons tels que l’Arginine ou encore la Glycine [22, 23]. Le clivage des deux précurseurs P1234 et P123 est assuré par le domaine protéase de nsP2, décrit plus bas, et se fait de façon séquentielle. La première protéine libérée est 36 nsP4, qui forme un complexe avec P123 pour synthétiser l’ARN(-) à partir de la matrice génomique. Le second clivage s’opère entre nsP1 et P23 générant un complexe nsP1-P23-nsP4 assurant la synthèse d’ARN(-) et d’ARN(+) génomique. Le dernier clivage conduit à la formation d’un complexe de réplication mature contenant les quatre nsP. Ce dernier permet la synthèse exclusivement des ARN à polarité positive (génomique et sous-génomique) [2, 24]. Diverses études de mutagenèse visant à abolir les sites de clivages entre les nsP ont révélées que l’absence de sites de clivage n’affectait pas la fonction de chaque domaine des nsP. En revanche, la disparition de ces sites est directement corrélée à une diminution de la réplication et du titre viral. La production sous forme de précurseur est nécessaire à l’établissent d’interactions entre les nsP qui seront conservées dans le complexe de réplication mature affectant l’affinité de la polymérase pour les différents ARN (ARN (-), ARN génomique ou sous-génomique). Ainsi, l’absence de clivage conduit à un changement d’abondance respective des ARN génomique, ARN (-) et sous-génomique défavorable à l’encapsidation et donc à la multiplication virale [22, 25-27]. Ces informations suggèrent qu’au sein de chaque complexe formé d’entités maturées différentes, les protéines non structurales vont avoir un rôle particulier et bien défini. Protéine non structurale 1 (nsP1) La protéine nsP1 des alphavirus porte des activités méthyltransférase et guanylyltransférase (figure 3), probablement impliquées dans l’ajout de la coiffe aux ARNm viraux. Les premières expériences démontrant la présence d’une nsP1 MTase- Gtase? nsP2 Domaine Hélicase Protéase nsP3 Macrodomaine Alpha-spécifique nsP4 Non structuré 2´-O-Mtase? Hypervariable Polymérase Figure 3. Structure des sous domaines des protéines non structurales. Les nsP sont des protéines à multiples domaines assurant différentes fonctions. nsP1 comporte l’activité méthyl- et guanylyltransférases du virus. Une hélice ␣ interne ainsi que des sites de palmitoylation assurent l’association de nsP1 aux membranes. nsP2 contient un domaine hélicase, un domaine protéase et une domaine à repliement 2 -O-méthyl transférase. nsP3 possède une macrodomaine en N-terminal, un domaine alphavirus-spécifique ainsi qu’un région C-terminale hypervariable. nsP4 présente un domaine N-terminal non structuré suivi d’un domaine polymérase. Figure modifiée et adaptée de [16], préparée d’après [1]. Virologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue coiffe de type « cap-0 » sur l’ARN sous-génomique 26S du virus SIN datent des années 1970. En effet, l’action de ribonucléases sur l’ARN 26S isolé à partir de cellules traitées par de l’actinomycine D (inhibition de la synthèse d’ARN cellulaire) a permis d’isoler de la guanosine méthylée. L’analyse par spectrométrie de masse des bases isolées a montré qu’il s’agit du m7 G, du m2,7 G ainsi que du m2,2,7 G. La forte association de l’ARN m7 G aux polysomes a indiqué que cette forme était préférentiellement traduite. Les deux formes hyperméthylées sont moins bien traduites et pourraient représenter un moyen de régulation post-traductionnel de cet ARN [28, 29]. La localisation cytoplasmique de la réplication virale ainsi que l’obtention de mutants du virus SIN ont indiqué la présence d’une méthyltransférase propre au virus. Cette observation a été confortée par des analyses de séquences [30, 31]. La réaction catalysée par nsP1 se décline en deux étapes. La première consiste à méthyler du GTP en présence d’un donneur de méthyl, S-adénosylmethionine (AdoMet) pour générer du 7-méthyl-GTP (m7 GTP) et du S-adénosylhomocystéine (AdoHcy). La seconde consiste à complexer le m7 GTP à nsP1 par un lien phosphoamide (m7 GMP-nsP1) pour transférer ensuite le m7 GMP sur l’ARN par une activité guanylyltransférase et former une structure de type cap-0 (m7 GpppNpARN). Le transfert du groupement méthyl sur du GTP a été confirmé par de nombreuses expériences utilisant de la nsP1 produite sous forme recombinante. Ces expériences soulignent la spécificité de l’enzyme vis-à vis du GTP et son caractère unique permettant de méthyler le nucléotide avant le transfert de la coiffe sur l’ARN. Cette dernière réaction n’a pas encore été démontrée chez les alphavirus. Elle est cependant déduite d’expériences mettant en évidence : – la formation d’un complexe m7 GMP-nsP1, qui peut être aboli par la mutation de résidus conservés au niveau de nsP1 ; – la découverte de virus SIN mutants pour nsP1 et résistants aux variations de concentrations de GTP [30-32]. Par ailleurs, des études sur le virus Mosaïque du Bamboo, virus de plante apparenté aux alphavirus (superfamille « Alphavirus-like »), ont confirmé la réaction de guanylyltransfert. De plus, pour ce virus l’utilisation d’ARN synthétiques correspondant à l’extrémité 5 du génome ont révélé l’importance de la longueur de la séquence ainsi que des structures secondaires en 5 pour la fixation de la coiffe [33]. Le rôle de nsP1 dans la réplication virale ne s’arrête pas à la mise en place de la coiffe. La protéine est fortement liée aux membranes et se retrouve majoritairement dans la fraction membranaire cytoplasmique [30, 31]. Cela a été confirmé par des études d’immunofluorescence montrant que nsP1 est associée à la face membranaire interne et fait partie de structures vacuolaires s’étendant aux endoVirologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 somes et lysosomes [34-36]. L’association aux membranes est assurée par la présence d’un peptide d’ancrage aux lipides (lipid-binding peptide) présent au centre de la protéine (résidus 245-264 de SFV). L’abolition ou la mutation de ces résidus conduit à une absence de l’association aux membranes mais également à une réduction de l’activité méthyltransférase. Des analyses de résonnance magnétique nucléaire indiquent que le peptide d’ancrage adopte une structure secondaire en hélice ␣ concentrant les résidus chargés positivement sur une surface de l’hélice. Cette surface permettrait l’association de nsP1 aux groupements anioniques des phosopholipides membranaires par des interactions polaires [34, 37]. L’interaction de nsP1 membranes assurerait via des interactions protéines/protéines une localisation membranaire à la machinerie de réplication. Le ciblage membranaire permettrait, entre autre, au virus de cacher les intermédiaires de réplication double brin à l’intérieur de petites sphérules afin d’éviter le déclenchement d’une réponse cellulaire visant à contrer l’infection virale [38]. De plus, il a été montré que nsP1 est palmytoylée sur des résidus cystéines (Cys 418-420 pour SFV). Cette palmytoylation permettrait d’accentuer l’ancrage aux membranes et serait indispensable à la formation de filopodia (structures filamenteuse émanant des cellules infectées) dont le rôle est encore obscur mais qui semblent être indispensables à la réplication et l’infectivité virale. Par ailleurs, la palmytoylation de nsP1 serait importante pour l’interaction avec nsP4, la polymérase virale (décrite plus bas), puisque la mutagenèse des sites de palmytoylation conduit à l’apparition de mutations compensatoires au niveau de nsP4 [39, 40]. Cette interaction expliquerait le rôle de nsP1 dans la synthèse du brin ARN(-). Par ailleurs, la caractérisation de mutants possédants des UTR altérées a permis de mettre en évidences des éléments de séquence conservés (CSE) agissant en cis à l’extrémité 5 incluant un CSE de 51 nt dans la séquence codante de nsP1 mais également à l’extrémité 3 représentant les 19 nt avant la queue polyA. Les régions non traduites (5 UTR et 3 UTR) ont un rôle essentiel dans la réplication des alphavirus. Elles ne sont pas toujours conservées en séquence mais vont adopter des structures secondaires similaires. Ces CSE interagissent entre eux et représentent les promoteurs des ARN sous-génomique, génomique, et de l’ARN(-). De plus, le CSE de 51 nt dans nsP1 représente un signal d’encapsidation pour l’ARN génomique. Toutes ces données suggèrent que les UTR représentent donc des sites de fixation importants pour des protéines cellulaires et virales [41-43]. Protéine non structurale 2 (nsP2) La protéine nsP2 des alphavirus est également une protéine multi-fonctionnelle. Elle possède plusieurs domaines 37 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue enzymatiquement actifs et indispensables au bon déroulement de la réplication virale. Le domaine N-terminal de la protéine contient un domaine hélicase qui permettrait de dérouler les intermédiaires de réplication double brin (ARNdb) formés lors de la réplication. Le domaine C-terminal contient deux sous-domaines : – un repliement cystéine protéase, apparenté à la famille des papaïnes, impliqué dans la maturation de la polyprotéine P1234 ; – un repliement apparenté aux méthyl transférases (MTase) (figure 3) [2, 44-46]. Les différentes études sur le domaine N-terminal ont montré que ce dernier possède un repliement nucléoside triphosphatase (NTPase) et hélicase à ARN. L’activité nucléoside hydrolase peut se faire pour les groupements adénylate et guanylate. L’analyse de la séquence de l’extrémité Nterminale révèle la présence de deux motifs de fixation de nucléotides de type Walker A (GXXXXGK(T/S)) et Walker B (DEAD box). Des mutations au niveau de ces sites abolissent la fixation des nucléotides et révèlent l’importance de la lysine K192 au niveau du site actif NTP hydrolase [45, 47]. De plus, ces études indiquent que ces deux sites sont importants dans la fixation de la protéine à l’ARN. L’interaction nsP2/ARN ne semble pas être séquence spécifique et permet l’hydrolyse du phosphate en ␥ de l’ARN. L’activité ARN triphosphatase permet de retirer un groupement phosphate de l’extrémité 5 de l’ARN naissant (pppARN → ppARN). Ce processus est requis pour le transfert de la coiffe (m7 GMP) sur l’ARN et la formation de la structure cap-0 (m7 GpppNpARN), décrite plus haut [45, 48]. L’hydrolyse de l’ATP permet de générer l’énergie nécessaire à l’activité hélicase proprement dite (déroulement de l’ARNdb) qui a été démontré pour SFV sur des substrats d’ARN db [44]. L’extrémité C-terminale de nsP2 s’étend entre les résidus ∼450 et 801 de la protéine. La structure tridimensionnelle de la protéase de VEEV a été élucidée [46] et a permis de classer le domaine protéase dans le clan CN et la famille C9, regroupant les endopeptidases virales utilisant le groupement thiol d’une cystéine pour médier l’attaque nucléophile sur le lien peptidique. Cette étude a également permis de mettre en évidence les particularités de ce type de protéases. D’une part, elle possède deux sous-domaines : le premier possède un repliement cystéine protéase et porte la signature catalytique qui se positionne à l’interface du second sous domaine. Ce dernier possède un repliement apparenté aux méthyltransférases (figure 3). D’autre part, contrairement aux enzymes de type papaïne, les deux résidus de la diade (Cys et His) sont portés par le même sous-domaine, la cystéine faisant partie de l’hélice ␣ terminale et l’histidine se trouvant dans une micro-extension de cette hélice formant une petite structure secondaire particulière (figure 4). Les études biochimiques visant à caractériser des mutants 38 A B Figure 4. Structures tridimensionnelles du domaine protéase de nsP2 et du macrodomaine de nsP3 de VEEV. A) Représentation en « cartoon » de nsP2 de VEEV : le domaine N-terminal (en saumon) porte les deux acides aminés catalytiques (en vert), le domaine Cterminal (en cyan) possède un repliement méthyltransférase [46]. B) Représentation en « cartoon » du macrodomaine (acides aminés 1-160) de nsP3 de VEEV en présence d’ADP-ribose [65]. Figure modifiée et adaptée de [16], préparée d’après [1]. de nsP2 engendrant un phénotype viral thermosensible ont permis de mettre en évidence les résidus clefs du site actif représentant une diade catalytique formée par les résidus Cys 481 et His 558 (virus du SIN). La comparaison des trois sites de clivage, P123-4, P1-23 et P2-3, a permis de définir l’affinité de la protéase vis-à-vis de ces sites. Cette affinité est assurée par les résidus de part et d’autre du lien scissile et corrobore avec la chronologie de coupure décrite pour le polypeptide. Le clivage entre P1-23 permettrait de libérer le domaine N-terminal de la protéase qui jouerait un rôle dans l’augmentation de l’affinité de l’enzyme pour le lien P2-3 [26, 46, 49-51]. Le domaine apparenté aux MTases présente une structure tertiaire similaire aux méthyltransférases Sadénosylméthionine (SAM) dépendantes telles que la NS5 du virus de la Dengue ou encore la FtsJ d’Escherichia coli. Ces dernières sont apparentées à la famille des 2 O-MTases assurant l’ajout d’un méthyl sur le OH en 2 du ribose du premier nucléotide de l’ARN et formant une structure coiffe de type 1. Cependant, les résidus correspondant au site de fixation du SAM ne sont pas conservés chez les alphavirus et aucune activité MTase n’a été en évidence à ce jour pour ce domaine [46]. Par ailleurs, l’introduction de mutations a révélé l’importance de ce domaine dans la maturation du précurseur P123 et par conséquence l’équilibre réplication/transcription du virus (synthèse du brin(-), ARN génomique et ARN sousgénomique), mais également dans le détournement de la machinerie de synthèse protéique cellulaire au profit du virus. En effet, la substitution R615A, par exemple, n’inhibe pas la synthèse des protéines cellulaires qui doit être parachevée pour initier la production des protéines structurales [49, 52, 53]. Virologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue L’inhibition de la transcription et de la traduction des protéines de la cellule hôte marque le début du développement de l’effet cytopathogène du virus. L’implication de nsP2 dans ces deux processus a été révélée par de nombreuses études dans lesquelles des mutations au niveau du domaine MTase a conduit à la génération de virus moins infectieux, à l’induction d’infections persistantes dans les cellules de mammifères ou encore à l’incapacité d’inhiber la transcription et/ou la traduction de l’hôte [25, 26, 49, 5456]. Ces résultats ont été renforcés par les données sur la distribution intracellulaire de nsP2. En effet, la protéine existe sous deux formes dans la cellule : une forme associée au complexe de réplication et une forme libre qui circule entre le cytoplasme et le noyau où elle va promouvoir l’arrêt des fonctions cellulaires mais également l’inhibition de la production d’interférons de type I, déclenchée par la cellule hôte pour protéger les cellules non infectées [25, 26, 49, 5456]. La translocation dans le noyau a été largement étudiée chez SFV. La séquence de nsP2 contient deux sites de localisation nucléaire, NLS1 et NLS2, situés dans le domaine hélicase et MTase, respectivement. La mutation de ces sites abolit la translocation de nsP2 dans le noyau et réduit son effet cytotoxique [57, 58]. Il est intéressant de noter que les deux NLS ne sont pas bien présents dans les séquences de toutes les espèces. De plus, la mutation de ces sites chez SIN et VEE n’abroge pas le transport de nsP2 dans le noyau indiquant que la localisation nucléaire n’est probablement pas dépendante uniquement d’importines. Des mutations en dehors des NLS peuvent interférer avec la translocation dans le noyau, et la fusion de ces sites à des protéines cytoplasmiques n’est pas suffisante pour induire leur translocation dans le noyau [55, 58, 59]. La caractérisation de la translocation dans le noyau de nsP2 de VEE a montré que la karyophérine-␣1 serait l’importine participant à l’import nucléaire de la protéine et que celle-ci possède, par ailleurs, un signal d’export nucléaire (NES), dépendant de l’exportine 1, au niveau des résidus 525 à 530. L’altération des résidus hydrophobes au niveau de ce site abolit l’infection virale [59]. Ces résultats soulignent pour les virus du nouveau monde l’importance de la localisation nucléaire de nsP2 dont le rôle exact au niveau du noyau reste à définir. De plus, contrairement au virus de l’ancien monde, nsP2 des virus du nouveau monde ne semble pas être impliquée dans l’inhibition des polymérases cellulaires ni engendrer un effet cytotoxique qui serait plutôt assuré par la protéine de la capside [60]. Protéine non structurale 3 (nsP3) La fonction et le rôle de nsP3 restent mal connus car c’est la nsP la moins caractérisée. L’analyse de la réplication Virologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 des virus mutants pour nsP3 indique que la protéine est impliquée dans la synthèse du brin (-) et de l’ARN sousgénomique. Le site de clivage entre nsP2 et nsP3 est le dernier à être clivé, suggérant que P23 ainsi que nsP3 ont un rôle de commutateur dans la spécificité de la polymérase pour les promoteurs (ARN(-), ARN génomique et ARN sous-génomique). Même si une récente étude a montré le rôle crucial de nsP3 dans la régulation de l’activité protéase de nsP2 sur le site P23 [26], le mécanisme exact de cette permutation reste à définir [24, 61]. La protéine contient trois domaines distincts (figure 3) : – un macrodomaine en N-terminal ; – un domaine spécifique des alphavirus dans la région centrale riche en cystéine ; – un domaine hypervariable situé en C-terminal. Le domaine « Macro », appelé initialement domaine X, est très ubiquitaire puisqu’il existe aussi chez eucaryotes supérieurs, les bactéries et même les archéobactéries. Le macrodomaine est aussi présent chez d’autres virus à ARN de polarité positive tels que le virus de l’hépatite E, le virus de la rubéole et chez les coronavirus [62, 63]. Il possède un repliement typique des domaines Macro des histones, tel que macro-H2A, impliqués dans la régulation de l’expression génique et l’inactivation du chromosome X ainsi que d’autres régions de l’hétérochromatine [64]. La structure tridimensionnelle du macrodomaine des virus VEE et CHIK a été élucidée. Le macrodomaine est constitué de quatre hélices ␣ entourant un feuillet composé de six brins  délimitant une poche contenant le site actif de l’ADP-ribose 1 -phosphate phosphatase (figure 4) [65]. Les macrodomaines possèdent un site de fixation pour différents dérivés de l’ADP-ribose tels que le mono-ADPribose, ou le poly-ADP-ribose (PAR). La caractérisation biochimique des nsP3 de SFV, CHIK et VEE couplée à l’analyse structurale des deux dernières protéines a révélé que la protéine possède une affinité variable pour l’ADPribose selon les virus. Par contre, elle fixe efficacement le PAR ainsi que l’ARN par des modules contenant plusieurs patchs électrostatiques positifs [62, 65, 66]. La différence entre les virus étudiés réside dans l’activité ADP-ribose 1 phosphate phosphatase qui est présente chez CHIK et VEE mais serait à peine détectable chez SFV, indiquant que le macrodomaine pourrait jouer plutôt un rôle de module de fixation aux dérivés de l’ADP-ribose que de phosphatase proprement dite. Au vu de la localisation purement cytoplasmique de nsP3, il est difficilement envisageable qu’elle soit directement impliquée dans la régulation de l’expression des gènes de l’hôte de la même manière que les protéines à macrodomaines cellulaires. Toutefois, il a été montré que l’infection par les alphavirus conduit à l’activation de l’ADPribose polymérase (PARP-1) cellulaire. Celle-ci ajoute 39 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue des groupements ADP-ribose à différentes protéines de la machinerie réplicative et transcriptionnelle de la cellule (ADN polymérases, ARN polymérases, topoisomérases. . .) conduisant à leur inactivation et finalement au déclenchement du processus apoptotique. L’infection de cellules PARP-1 -/- ainsi que l’utilisation d’inhibiteurs de PARP1 indiquent que l’apparition des signes apoptotiques au niveau des cellules infectées est retardée et que la PARP1 n’est pas absolument requises pour la réplication des alphavirus ou encore seraient déclenchés par d’autres PARP [67]. Le recrutement de la PARP-1 est indépendant du macrodomaine puisqu’il semble se faire via le domaine C-terminal de nsP3 [68]. Chez les coronavirus, il a été montré dernièrement que le macrodomaine est impliqué dans l’échappement viral et permet au virus d’entraver la réponse innée de l’hôte en contrant l’effet des interférons de type I [69]. Un tel scénario pourrait être conservé chez les alphavirus puisque les mutations dans le macrodomaine diminuent de façon drastique la virulence du virus in vivo [68]. La protéine nsP3 fait partie de complexes protéiques regroupant des protéines du cytosquelette (myosine, tubuline, vimentine, actine), des chaperonnes (Hsc70) ainsi que de nombreuses protéines impliqués dans la liaison à l’ARN (hnRNPs, G3 bp, Rps. . .). Ces complexes s’organisent en deux fractions distinctes : – une fraction associée aux membranes formant le complexe de réplication contenant une forte proportion de nsP1, 2 et 4 ; – une fraction cytosolique associée aux endosomes [25, 70]. Le domaine C-terminal de nsP3 est très variable en séquence et en longueur. Il contient des éléments de virulence car les mutations ou les délétions au niveau de ce domaine affectent la neurovirulence chez la souris [71, 72]. La suppression des derniers 30 résidus de nsP3 affecte la localisation cellulaire de la protéine, qui n’arrive plus à s’associer aux protéines du cytosquelette et ne peut plus former le complexe de réplication affectant ainsi la synthèse des ARN(-) et sous-génomique suggérant que le domaine C-terminal de nsP3 joue un rôle clef dans l’interaction avec le complexe de réplication mais également avec des acteurs cellulaires recrutés durant le cycle de l’infection [73]. Ce domaine est riche en résidus Ser et Thr phosphorylables mais également en résidus acides et en prolines qui pourraient éventuellement avoir un rôle dans l’activation de la transcription [74, 75]. Les motifs riches en prolines présents à l’extrémité C-terminale du domaine pourraient recruter des protéines à domaine SH3 (domaine d’homologie 3 Src). La mutation de ces motifs indique que l’amphiphysine I, protéine impliquée dans l’endocytose et le trafic vésiculaire, peut être recrutée, via son domaine SH3, par nsP3 aux sphérules, siège du complexe de réplication. Cela permettrait au virus de déclencher les remodelages membranaires 40 nécessaires à la formation des structures vésiculaires et à la protection des intermédiaires de réplication double brins [38, 76]. Protéine non structurale 4 (nsP4) Des analyses de séquences indiquent que nsP4 possède un motif GDD conservé qui est caractéristique d’une polymérase virale. Le rôle de polymérase attribué à nsP4 s’appuie initialement sur l’identification de mutations au niveau du domaine polymérase (figure 3) qui pouvaient soit abolir totalement la synthèse de l’ARN viral, soit bloquer la production d’ARN(+) conduisant à une accumulation d’ARN(-). Des études de marquage métabolique indiquent que la protéine est très instable et rapidement dégradée dans les cellules infectées. Ce phénomène est dû à la présence d’une tyrosine en N-terminal de la protéine qui conduit à la dégradation de celle-ci par une voie, dite du N-terminal, dépendante de l’ubiquitination. L’instabilité de nsP4 expliquerait la viabilité des virus dont le site de clivage entre P123 et nsP4 a été aboli. La présence d’un résidu aromatique en N-terminal semble crucial non seulement pour la stabilité mais également pour le positionnement de l’enzyme au sein du complexe de réplication. La substitution de la tyrosine N-terminale ou encore de résidus clefs de la polymérase conduit à l’apparition de révertants ayant acquis une mutation compensatoire dans nsP1, suggérant un lien étroit entre ces deux protéines [77, 78]. La caractérisation de la protéine a principalement été limitée par l’absence d’un système robuste de production de la protéine recombinante. L’expression de la protéine tronquée pour les 97 acides aminés en N-terminal (97), correspondant à la région non structurée, a permis d’améliorer la stabilité de la protéine recombinante et observer l’activité terminal-adénylyltransférase de nsP4 [79]. L’expression de la protéine avec une étiquette SUMO a confirmé cette activité, qui est 30 fois plus importante pour la protéine totale comparée à la forme 97. La protéine complète, produite de cette manière, n’arrive pas à synthétiser d’ARN(+) (génomique et sous-génomique) et ne synthétise le brin (-) qu’en présence de fractions membranaires contenant le polypeptide P123 [80]. Ces résultats contrastent avec les données publiées par Thal et al. [81] qui montrent clairement que nsP4, isolée par ultracentrifugation de cellules infectées, peut synthétiser le brin(-) et l’ARN génomique indépendamment des nsP et que ces dernières sont requises pour la synthèse de l’ARN sous-génomique. Les études confirment, néanmoins, que la reconnaissance par nsP4 du promoteur de l’ARN sous-génomique nécessite la présence d’autres nsPs. La reconnaissance par nsP4 des promoteurs pour l’ARN génomique et sous-génomique impliquent des interactions alternatives puisque différents résidus arginine, au sein de Virologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue nsP4, sont sollicités pour la synthèse de ces deux types d’ARN [82]. Des analyses de comparaison de séquences couplées à des expériences de mutagenèse ont mis en évidence l’importance d’éléments régulateurs agissant en cis pour la réplication du virus. La région située en 5 du génome est hautement structurée et contient un agencement de quatre structures en « tige boucle » bien conservées malgré la faible similarité de séquence entre les espèces. Ces structures ne sont pas toujours interchangeables entre espèces, tel que cela a été démontré dans des expériences de substitution entre SIN et SFV. De plus, il a été montré que la première structure en tige boucle en 5 était cruciale pour l’interaction de la matrice avec la tyrosine conservée en N-terminal de nP4. Les autres tiges boucles agissent en tant qu’éléments activateurs (enhancer). Ces structures sont retrouvées au niveau du brin(-) (côté 3 ) mais requièrent la présence de la queue poly-A ainsi que d’une séquence conservée de 19 nucléotides pour la transcription du brin(-), suggérant une différence dans la reconnaissance des promoteurs en 5 et en 3 [42, 78, 81, 83]. Le domaine N-terminal de nsP4 n’adopte pas de structure définie mais joue un rôle décisif dans la régulation de l’activité de nsP4 et du choix des promoteurs. La substitution dans ce domaine de résidus chargés ou flexibles indique que les acides aminés sollicités lors de la synthèse du brin(-) et de l’ARN sousgénomique sont distincts. Le caractère désordonné de ce domaine lui assurerait une flexibilité lui permettant d’agir en tant qu’adaptateur entre le domaine polymérase, les différentes séquences régulatrices ainsi que le complexe de réplication constitué d’autres nsP (et changeant au cours de l’infection) [42, 79, 84]. Par ailleurs, ces mutations ont révélé l’apparition de révertants présentant des substitutions dans nsP2 et nsP3. Bien que les expériences de co-immunoprécipitations n’ont pu révéler une interaction directe entre ces deux protéines avec nsP4, il existe un partenariat entre ces trois protéines (via nsP1 ou des facteurs cellulaires) permettant d’activer la synthèse de l’ARN sous-génomique et de réguler la machinerie de traduction de l’hôte [78, 84]. Interactions hôte virus Les interactions entre les alphavirus et l’hôte vont avoir deux conséquences principales : – le virus interfère avec la machinerie de transcription et de réplication de la cellule pour détourner la synthèse d’ARN et de protéines à son profit ; – le virus bloque la réponse immunitaire innée afin de finaliser sa réplication et d’assurer l’infection d’un nombre maximal de cellules. Virologie, Vol 17, n◦ 1, janvier-février 2013 La répression de la transcription de l’hôte est assurée principalement par nsP2, puisque son altération empêche l’inhibition transcriptionnelle de la cellule infectée. Chez les virus du nouveau monde, ce processus implique également la protéine de la capside suggérant une différence importante dans l’interaction avec l’hôte entre les virus de l’ancien monde et du nouveau monde. La protéine de la capside forme des complexes multimériques avec les récepteurs d’import (importines ␣/) et d’export (CRM) nucléaire obstruant ainsi le trafic à travers les pores nucléaires [55, 56, 60, 85]. Plusieurs études utilisant des techniques d’immunoprécipitation ou de double hybride couplées à la spectrométrie de masse ont permis d’identifier un certain nombre d’acteurs cellulaires interagissant avec nsP2, 3 et 4. Certains de ces acteurs cellulaires sont des protéines ayant une affinité pour l’ARN, telles que les ribonucléoprotéines nucléaires héterogènes (hnRNPs), la protéine ribosomale S6 (RpS6), les G3BPs (Ras-GTPase – activating protein SH3-domaine-binding protein). Ces protéines sont impliquées dans la traduction, la maturation et le transport des ARN [8, 25, 86, 87]. L’interaction de la forme libre de nsP2 avec RpS6 permettrait d’accroître la liaison aux ribosomes de l’ARN sous-génomique ou d’un ARNm cellulaire critique pour la réplication virale. Cette interaction est aussi présente dans les cellules d’insectes suggérant un mécanisme commun de détournement de la traduction. Il est de même pour les protéines de types G3BP, qui interagiraient avec nsP3/nsP4 et seraient impliquées dans la dégradation de l’ARNm et la formation de granules d’expression d’ARN. Au niveau transcriptionnel, il a été montré récemment que nsP2 pouvait induire la dégradation de Rpb1 (sous-unité catalytique de l’ARN polymérase I et II) de façon dépendante de l’ubiquitine dans les cellules de vertébrés, permettant au virus de bloquer rapidement la transcription de façon non sélective. De plus, nsP2 et nsP3 vont recruter différentes hnRNPs (hnRNP K et hnRNP A1) qui seront relocalisées dans le cytoplasme suite à l’infection virale. Ces dernières pourraient être impliquées dans la phosphorylation de nsP3, l’activation de la transcription de l’ARN SG ou encore la stimulation de la traduction par fixation aux régions non traduites (5 UTR) [7, 8, 87-90]. Cependant, il est important de noter que les descriptions ci-dessus concernant le rôle des protéines de l’hôte restent à confirmer, puisqu’elles sont basées essentiellement sur les rôles décrits dans la littérature pour ces différentes protéines. De plus, la spécificité des interactions identifiées par les méthodes citées ci-dessus restent à confirmer in vivo. Bien que certaines d’entre elles semblent réellement interagir avec le complexe de réplication viral, il est difficile de dire dans de nombreux cas, et sans ambiguïté, quelle est la nsP impliquée. De ce fait, le mécanisme exact par lequel les nsP modifieraient les ribosomes, les constituants 41 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue ribosomiques ou encore le complexe de réplication cellulaire restent à élucider. La seconde barrière importante pour le virus est celle de la réponse antivirale de l’hôte. L’infection par les alphavirus conduit à l’induction de sécrétion de cytokines, notamment des interférons de type I (IFN␣ et ) et II (IFN␥). La stimulation de la production d’IFN est dépendante du type cellulaire et du virus mis en jeu. Ainsi, le VEEV va induire une réponse beaucoup plus robuste que le SINV. L’importance de la production d’IFN dans la réponse antivirale aux alphavirus a été soulignée par les expériences utilisant des souris dont les récepteurs aux IFN, la RNase L, la protéine kinase R (PKR) ou d’autres acteurs de la signalisation des IFN (␣/) ont été mutées (expériences revues dans [91]). Le déclenchement de la réponse antivirale passe par la reconnaissance de motifs moléculaires pathogèneassociés (pathogen-associated molecular pattern [PAMP]) et par des récepteurs de reconnaissance de motifs (pattern recognition receptor [PRR]). Les PAMP présentés par les alphavirus ainsi que les PRR les reconnaissant restent à identifier. Cependant, il a été montré que la PKR ainsi que Melanoma Differentiation-Associated protein 5 (MDA5), protéine apparentée à RIG-I, sont impliquées dans l’induction d’IFN de type I. Ces deux protéines fixent l’ARNdb, suggérant que les intermédiaires de la réplication, sous forme double brin, présents dans les sphérules constituent un PAMP important [3, 92, 93]. L’IFN va agir de façon paracrine et autocrine pour activer les gènes stimulés par l’IFN (ISG) afin de prévenir les cellules non infectées de la présence du pathogène mais également de provoquer l’arrêt des processus cellulaires nécessaires à la poursuite de l’infection, en attendant la réponse immunitaire adaptée. La progression de l’infection repose sur la capacité du virus à contrer l’effet de l’IFN. Les nsP vont jouer un rôle crucial dans cette interférence qui est indépendante de l’inhibition de la machinerie de synthèse macromoléculaire de la cellule. L’expression des nsP, notamment de nsP2 de SFV et VEEV, conduit à la déphosphorylation de STAT1, qui agit en tant qu’activateur en association avec le facteur de régulation de l’IFN9 pour stimuler les ISG [54, 93, 94]. Finalement, des études sur RRV indiquent que ce dernier abroge l’activation d’IFN en empêchant la phosphorylation d’IFN3, facteur de transcription activé par les PRR et impliqué dans la transcription des IFN de type I. Toutes ces informations suggèrent que la suppression de la réponse antivirale est également dépendante de l’espèce [95]. Conclusion Malgré l’accumulation de données sur le complexe de réplication des alphavirus ces dernières années, de nombreuses 42 questions concernant la fonction des différents domaines des nsP restent à élucider. La résolution de la structure tridimensionnelle ainsi que la caractérisation biochimique des nsP sont des étapes clés pour comprendre les multiples mécanismes et interactions mis en jeu, ainsi que pour concevoir des inhibiteurs ciblant spécifiquement ces protéines. La compréhension des phénomènes moléculaires à la base des interactions entre les alphavirus et les cellules hôtes est un domaine actuellement en pleine effervescence, qui permettra bientôt de fusionner les approches de lutte antivirale directes, par l’inhibition d’enzymes virales, et indirectes, par la modulation/stimulation appropriée de l’immunité innée de la cellule infectée. Conflits d’intérêts : aucun. Références 1. Gould EA, Coutard B, Malet H, et al. Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging pathogens and progress towards their control. Antiviral Res 2010 ; 87 : 111-24. 2. Strauss JH, Strauss EG. The alphaviruses – gene-expression, replication, and evolution. 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