Utilisation de l`épreuve immuno-enzymatique ELISA-NS3 pour

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1999,18 (3), 618-626
Utilisation de l'épreuve immuno-enzymatique
ELISA-NS3 pour différencier les chevaux infectés
par le virus de la peste équine des chevaux
vaccinés
S. Idrissi Bougrine(1) 0. Fassi Fihri (1). El Harrak(2) &
M.M. Fassi Fehri(1)
(1 ) Institut agronomique et vétérinaire Hassan II, Département de microbiologie, immunologie et maladies
contagieuses, B.P. 6202,10101 Rabat-Instituts, Maroc
(2) Laboratoire Biopharma, Km 2, Route de Casablanca, B.P. 4569, Rabat-Akkari, Maroc
Soumis pour publication le 19 mai 1998
Accepté le 19 février 1999
Résumé
Un protocole de vaccination de trois chevaux, par cinq injections répétées du
vaccin à virus équipestique inactivé sérotype-4, a été entrepris afin de déterminer
un éventuel seuil d'apparition des anticorps contre la protéine non structurale
NS3.
L'épreuve immuno-enzymatique (ELISA) indirecte utilisant la protéine
recombinante NS3 comme antigène, a permis de détecter une réponse vis-à-vis
de NS3 dès la deuxième injection pour le premier cheval et après quatre
injections pour le deuxième cheval. Aucune réponse vis-à-vis de NS3 n'a été
détectée pour le troisième cheval.
Ce résultat montre que le vaccin inactivé n'est pas suffisamment purifié pour
éliminer la protéine non structurale NS3. Il ne pourrait permettre, en l'occurrence,
de différencier les chevaux vaccinés des chevaux infectés en utilisant la protéine
NS3 comme marqueur.
Mots-clés
Chevaux - Épreuve immuno-enzymatique - Peste équine - Protéines - Vaccins à virus
inactivé.
Introduction
La peste équine est une maladie virale des équidés, transmise
par des arthropodes hématophages, les Culicoides
principalement (4). Elle sévit, actuellement, à l'état enzootique
en Afrique tropicale. Récemment, le Maroc, l'Espagne et le
Portugal ont connu des epizooties sévères (1987-1991) qui
ont entraîné des pertes économiques considérables pour
l'élevage équin (11, 12).
Le virus de la peste équine est un membre du genre Orbivirus
dans la famille des Reoviridae. Son génome est composé de
dix segments d'ARN double brin, codant chacun pour au
moins une protéine : sept protéines structurales forment la
double capside de la particule virale, et au moins quatre
protéines non structurales sont synthétisées dans les cellules
infectées (3,9).
La vaccination joue un rôle important dans le contrôle et
l'éradication de la peste équine. Des vaccins à virus vivant
modifié ainsi que des vaccins à virus inactivé sont
actuellement disponibles pour lutter contre cette virose.
Jusqu'en 1992, seuls les vaccins vivants modifiés étaient
utilisés ; ils conféraient une protection solide et durable.
Cependant, l'absence de moyens permettant de différencier
les anticorps post-vaccinaux des anticorps post-infectieux ne
permet pas aux Services vétérinaires officiels de différencier
les chevaux infectés des chevaux vaccinés. De ce fait, le

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mouvement de ces derniers à partir des régions infectées est
interdit, entraînant ainsi l'arrêt des compétitions sportives et
des échanges internationaux. L'idée de mettre au point un
vaccin qui permettrait de distinguer entre chevaux vaccinés et
chevaux infectés a toujours représenté un grand intérêt. Le
premier vaccin qui semble permettre cette discrimination est
le vaccin à virus inactivé récemment commercialisé par le
laboratoire Mérial et qui a été utilisé en partie au Maroc et en
Espagne lors des récentes épizooties qu'ont connues ces deux
pays. En effet, Laviada et coll. (9, 10) ont montré que les
chevaux ayant reçu une à deux injections de ce vaccin ne
développaient pas d'anticorps contre la protéine non
structurale NS3 et ont suggéré d'utiliser cette protéine comme
marqueur pour différencier les animaux vaccinés des animaux
infectés. Néanmoins, 2 % à 5 % des sérums qu'ils ont testés
ont présenté une réponse faible mais positive à NS3. De
même, une faible réponse à NS3 a été détectée par Western
blot chez les chevaux ayant reçu deux à trois injections de ce
vaccin (8). Cette réponse serait due à la présence de quantité
résiduelle de NS3 dans le vaccin, et qui n'est développée
qu'après vaccinations répétées.
Afin de vérifier cette observation et de déterminer un éventuel
seuil d'apparition des anticorps anti-NS3 après des
vaccinations répétées avec le vaccin à virus inactivé, un
protocole de vaccination de chevaux par injections répétées
de ce vaccin a été entrepris. La réponse à NS3 a été évaluée par
une épreuve immuno-enzymatique (ELISA) indirecte utilisant
la protéine recombinante NS3. Comme contrôles positifs, un
test de séroneutralisation pour la détection des anticorps
neutralisants et une épreuve ELISA indirecte-VP7 (détection
des anticorps anti-VP7) ont été utilisés pour vérifier que les
chevaux étaient effectivement immunisés.
Matériel et méthodes
Vaccin
Il s'agit du vaccin à virus équipestique inactivé sérotype-4
(Equipest, Mérial), provenant du lot n° OO D 04101.
Vaccination
Trois chevaux (A, B et C) séronégatifs vis-à-vis de la peste
équine ont reçu cinq injections intramusculaires successives
du vaccin à virus inactivé, selon la dose prescrite par le
fabricant, aux jours J0, J31, J66, J124 et J194. Des
échantillons sanguins ont été prélevés aux jours J0, J7, J20,
J27,J31,J38,J45,J52,J59,J66,J75,J82,J89,J95,J102,J124,
J131, J138, J145, J152, J159, J194, J201, J208 et J215. Les
sérums ont été testés par séroneutralisation et par ELISA
indirecte (VP7 et NS3).
Sérums
Trois groupes de sérums ont été testés :
- un groupe de 4 sérums de chevaux convalescents (Cl à
C4);
- un groupe de 35 sérums de chevaux vaccinés avec le vaccin
à virus vivant atténué sérotype-4 produit au Maroc (VI à
V35) ;
- un groupe de 6 sérums de chevaux indemnes (NI à N6).
Séroneutralisation
Le test de séroneutralisation a été effectué sur cellules Vero sur
microplaques. Le titre des anticorps neutralisants est exprimé
en log10 de l'inverse de la dilution qui protège 50 % des
cupules contre une suspension virale titrant 100 DCP50
(doses cytopathogènes 50 %) par cupule.
Épreuve immuno-enzymatique indirecte
L'ELISA indirecte est effectuée selon le protocole décrit par
Laviada et coll. (10) et en utilisant les protéines recombinantes
VP7 et NS3 aimablement fournies par le Docteur
J.M. Sánchez-Vizcaíno. La protéine VP7 est exprimée dans les
cellules d'insectes Spodoptera fruglperda par un baculovirus
recombinant contenant le gène correspondant ; c'est une
protéine hautement purifiée. La protéine NS3 est exprimée
dans Escherichia coli sous forme de protéine fusion insoluble.
Son degré de purification est estimé à 70 %.
Des plaques de 96 cupules sont sensibilisées avec 100 pl des
dilutions optimales des protéines recombinantes NS3 et VP7
respectivement, pendant une nuit à 4 °C. Ces deux antigènes
sont dilués dans le tampon carbonate 0,05 M (pH 9,6)..
Le lendemain, les plaques sont lavées trois fois au tampon PBS
(phosphate-buffered saline). Les sites non spécifiques sont
saturés pendant une heure à 37 °C avec 100 pl de tampon de
blocage (5 % de lait écrémé dans la solution tampon PBS
contenant 0,05 % de Tween-20). Cent microlitres des
différents sérums dilués cent fois dans le tampon de blocage
sont ajoutés et les plaques sont ensuite incubées à 37 °C
pendant une heure. Après cinq lavages au tampon PBS, 100 pl
de conjugué (anticorps de lapin marqués à la peroxidase et
dirigés contre les immunoglobulines G de cheval) sont ajoutés
à la dilution optimale (1/4 000e dans le tampon de blocage), et
les plaques sont incubées à 37 °C pendant une heure. Au bout
de ce temps, les plaques sont lavées cinq fois au PBS, puis
développées à l'o-phényl-diamine. La réaction est arrêtée
après 15 minutes avec 1,25 M H2S04. La lecture est faite à
492 nm à l'aide d'un lecteur ELISA.
Résultats
Séroneutralisation
La Figure 1 montre la cinétique des anticorps neutralisants
pour les trois chevaux. Des anticorps sont apparus dès la
première injection dans les sérums des chevaux A et B, pour
atteindre des titres en anticorps neutralisants de 1,86 log10 le
vingtième jour. Après le premier rappel vaccinal, ces chevaux
montrent une réponse secondaire rapide (deux semaines) et
intense (3,18 log10).

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Fig. 1
Cinétique des anticorps neutralisants pour les chevaux A, B et C lors du protocole de vaccination contre le virus de la peste équine
Après primovacciriation, le titre maximum en anticorps
neutralisants atteint pour le cheval C n'est que de 0,66 log10.
Après rappel vaccinal, il passe à 2,45 log10 le 21e jour.
L'effet de rappel est beaucoup plus rapide (une à deux
semaines) après les trois derniers rappels vaccinaux pour les
trois chevaux.
Épreuve immuno-enzymatique
Le seuil de négativité a été déterminé en additionnant trois
déviations standards à la densité optique (DO) moyenne des
sérums négatifs. Pour la protéine VP7, les sérums négatifs
utilisés sont les sérums N1 à N6 (sérums de chevaux
indemnes) et les sérums qui correspondent aux JO des
chevaux A, B et C. Pour la protéine NS3, les mêmes sérums
négatifs sont utilisés à l'exception du sérum correspondant au
JO du cheval C (en raison de sa réaction non spécifique avec
NS3). Les valeurs de DO obtenues sont indiquées dans le
Tableau I.
Tableau I
Valeurs obtenues en densité optique des sérums négatifs pour les
protéines VP7 et NS3
Sérums DO (VP7) DO (NS3)
N1 0,099 0,143
N2 0,13 0,100
N3 0,128 0,224
N4 0,179 0,126
N5 0,179 0,126
N6 0,144 0,193
A(J0) 0,171 0,187
B(J0) 0,145 0,152
C(J0) 0,103 0,369
Le seuil de négativité est de 0,23 pour la protéine VP7 et de
0,28 pour la protéine NS3.
Le Tableau II représente les valeurs de DO obtenues pour
VELISA-NS3 et l'ELISA-VP7 ainsi que les titres en anticorps
neutralisants des sérums de chevaux convalescents et de
chevaux vaccinés avec le vaccin à virus vivant atténué. On
note, en général, une corrélation entre les titres en anticorps
neutralisants et les valeurs de DO obtenues pour VP7 et NS3.
Tableau II
Évaluation de la réponse immunitaire contre les protéines VP7 et NS3
chez les chevaux convalescents et les chevaux vaccinés avec le
vaccin à virus vivant atténué
Numéro des sérums VP7
DO +/-
NS3
DO +/-
Titre en anticorps
neutralisants
C1 0,902 + 1,534 + 3,18
C2 1,596 + 1,695 + 3,42
C3 1,592 + 1,448 + 3,3
C4 1,484 + 1,412 + 3,18
V1 1,469 + 1,059 + 2,46
V2 1,429 + 1,56 + 1,98
V3 1,586 + 1,028 + 2,22
V4 1,627 + 1,294 + 2,58
V5 1,405 + 1,103 + 2,22
V6 1,593 + 1,062 + 2,46
V7 1,294 + 1,154 + 2,34
V8 1,156 + 0,606 + 1,98
V9 1,302 + 0,936 + 2,10
V10 1,418 + 0,846 + 2,10
V11 0,935 + 0,961 + 1,38
V12 0,749 + 0,779 + 2,94
V13 0,722 + 0,71 + 3,3
DO : densité optique
C : sérum de cheval convalescent
V : sérum de cheval vacciné
D0 : densité optique

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 18 (3] 621
Néanmoins, pour certains sérums, il y a une absence ou une
faible réponse à NS3, bien que la réponse à VP7 soit forte et
que le titre en anticorps neutralisants soit élevé (par exemple,
les sérums VI6, V25 etV33).
Évaluation de la réponse à la protéine VP7 chez les
chevaux vaccinés
Après primovaccination, on note une réponse à VP7 qui
atteint son maximum le 20e jour pour les chevaux A et B, et le
27e jour pour le cheval C (Fig. 2, 3 et 4). La deuxième
injection induit un effet de rappel rapide (une semaine) et
intense, surtout pour le cheval C, mais moins important pour
les deux autres chevaux. Après la troisième injection, on note
une diminution de la réponse à la protéine VP7 pour les
chevaux A et C ; ceci est vraisemblablement dû au fait que les
injections sont trop rapprochées. Par conséquent, l'effet de la
dose vaccinale est réduit par les anticorps circulants. La
quatrième injection induit un effet de rappel divisé en deux
« 1
S 0,5
0 27 38 52 66 82 95 124 138 152 201 215
Jours
î î î î î
1rE 2e 3e 4e 5e vaccinations
Fig. 2
Évaluation de la réponse à là protéine VP7 pour le cheval A vacciné contre la peste équine et soumis à l'épreuve immuno-enzymatique
e 2
27 38 52 66 82 95 124 138 152 201 215
Jours
î î î î
2e 3e 4e 5e vaccinations
Fig. 3
Évaluation de la réponse à la protéine VP7 pour le cheval B vacciné contre la peste équine et soumis à l'épreuve immuno-enzymatique
Fig. 4
Évaluation de la réponse à la protéine VP7 pour le cheval C vacciné contre la peste équine et soumis à l'épreuve immuno-enzymatique

622 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 18 (3)
temps chez les trois chevaux. Après le dernier rappel vaccinal,
on note une diminution de la réponse à VP7 pour les
chevaux A et B. Le cheval C, lui, montre une augmentation de
la réponse à VP7.
Évaluation de la réponse à la protéine NS3 chez les
chevaux vaccinés
Les Figures 5, 6 et 7 représentent l'évolution de la réponse à
NS3 pour les trois chevaux. Pour vérifier s'il y a une éventuelle
Fig. 5
Évaluation de la réponse à la protéine NS3 pour le cheval A vacciné contre la peste équine et soumis à l'épreuve immuno-enzymatique
Fig. 6
Évaluation de la réponse à la protéine NS3 pour le cheval B vacciné contre la peste équine et soumis à l'épreuve immuno-enzymatique
Fig. 7
Évaluation de la réponse à la protéine NS3 pour le cheval C vacciné contre la peste équine et soumis à l'épreuve immuno-enzymatique