Dossier_B-FR-03-02-05_depose_par_BIOGEMMA
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SOCIETE BIOGEMMA Demande d’autorisation auprès de la Commission d’Etude de la Dissémination des Produits issus du Génie Biomoléculaire Essais en champ pluriannuels de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain BIOGEMMA 5, rue Saint Germain l’Auxerrois 75001 PARIS janvier 2003 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. PREAMBULE Cette demande d’expérimentation est déposée dans le cadre de la réglementation européenne décrite dans la directive 90/220/CEE, transposée en droit français par la loi du 13 juillet 1992. Cette directive a été modifiée le 17 avril 2001 par la directive 2001/18/CE. Ces textes régissent la dissémination volontaire d’organismes génétiquement modifiés, que ce soit à des fins de mise en marché ou à d’autres fins et notamment à des fins de recherche. La demande qui fait l’objet de ce dossier concerne un essai dont les résultats attendus doivent permettre de valider une hypothèse (« preuve de concept »). Un événement de transformation a déjà été évalué au champ, tous ont fait l’objet de différentes expérimentations en serre. Il permettra de confirmer, dans les conditions agronomiques normales, le bon fonctionnement du caractère modifié dans plusieurs générations différentes de ces plantes. Conformément à la directive 2001/18, l’importance de la dissémination et les conditions de son déroulement prennent en compte le stade de développement du projet et l’information scientifique disponible. Les plantes ont été caractérisées par des études moléculaires ; la stabilité d’expression des caractères introduits dans les plantes a été observée durant plusieurs générations en serre. 2 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. SOMMAIRE Préambule 2 Introduction 6 A. Informations d’ordre général A.1 Nom et adresse du notifiant A.2 Qualification et expérience des scientifiques responsables A.3. Titre du projet 8 8 8 8 B. Informations concernant les plantes réceptrices B.1 Nom complet B.2 Information concernant la reproduction B.3 Capacité de survie B.4 Dissémination B.5 Distribution géographique de la plante B.6 Description de l’habitat naturel de la plante (espèces ne poussant pas habituellement en UE) B.7 Autres interactions potentielles avec des organismes dans l’écosystème habituel 8 8 8 9 9 10 C. Informations concernant la modification génétique C.1 Description des méthodes utilisées pour la modification génétique C.2 Nature et source du vecteur utilisé C.3 Taille, origine des organismes donneurs et fonction recherchée de chaque fragment constitutif de la région envisagée pour l’insertion 10 10 11 D. Information concernant la plante supérieure génétiquement modifiée D.1Description du ou des caractères ou des caractéristiques qui ont été introduits ou modifiés D.2 Informations sur les séquences réellement insérées ou délétées D.3 Informations concernant l’expression de l’insert D.4 Description des différences entre la plante génétiquement modifiée et la plante réceptrice D.5 Stabilité génétique de l’insert et stabilité phénotypique de la plante modifiée D.6 Modifications de la capacité de la plante modifiée à transférer du matériel génétique dans d’autres organismes D.7 Information concernant les effets toxiques, allergisants ou autres effets nocifs résultants de la modification génétique sur la santé humaine D.8 Information concernant la sécurité de la plante modifiée pour la santé des animaux, lorsque la plante est destinée à être utilisée dans l’alimentation des animaux D.9 Mécanisme d’interaction entre la plante modifiée et les organismes cibles D.10 Modifications potentielles des interactions de la plante modifiée avec les organismes non-cibles résultant de la modification génétique D.11 Interactions potentielles avec l’environnement abiotique D.12 Description des méthodes de détection et d’identification de la plante supérieure génétiquement modifiée 11 10 10 11 11 11 12 12 12 12 13 13 13 14 14 14 3 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. D.13 Informations, le cas échéant, sur les précédentes disséminations de la plante génétiquement modifiée 14 E. Informations concernant le site de dissémination E.1 Localisation et étendue des sites de dissémination E.2 Description de l’écosystème des sites de dissémination E.3 Présence d’espèces apparentées sauvages sexuellement compatibles ou d’espèces végétales cultivées sexuellement compatibles E.4 Proximité des sites de biotopes officiellement reconnus ou de zones protégées susceptibles d’être affectées 14 14 14 F. Information concernant la dissémination F.1 Objectif de la dissémination F.2 Date et durée prévues de l’opération F.3 Méthode de dissémination envisagée F.4 Méthode de préparation et gestion du site avant, pendant et après la dissémination, y compris les pratiques culturales et méthodes de récolte F.5 Nombre approximatif de plantes 15 15 16 16 G. Information sur les plans de surveillance, de contrôle et de traitement du site et des déchets après dissémination G.1 Précautions prises G.2 Description des méthodes de traitement du site après dissémination G.3 Description des méthodes de traitement après dissémination pour le matériel issu de plantes génétiquement modifiées, y compris les déchets G.4 Description des plans et techniques de surveillance G.5 Description des plans d’urgence G.6 Méthodes et procédures de protection du site 15 15 16 17 17 17 17 18 18 18 18 Annexe IID2 Conclusions concernant les incidence potentielles sur l’environnement de la dissémination 19 1. Probabilité que les plantes modifiées deviennent plus persistantes que les plantes parentales ou réceptrices dans les habitats agricoles ou se propagent plus rapidement dans les habitats naturels 2. Avantages ou inconvénients sélectifs conférés aux plante modifiées 3. Possibilité de transfert de gènes aux mêmes espèces ou à d'autres espèces végétales sexuellement compatibles dans les conditions de plantation des plantes modifiées et avantages ou inconvénients sélectifs conférés à ces espèces végétales 4. Incidences immédiates et/ou différées que les interactions directes ou indirectes entre les plantes modifiées et les organismes cibles, tels que prédateurs, parasitoïdes et agents pathogènes peuvent avoir sur l'environnement 5. Incidences immédiates et/ou différées que les interactions directes ou indirectes entre les plantes modifiées et des organismes non-cibles, notamment les incidences sur les niveaux de population des concurrents, herbivores, symbiotes, parasites et agents pathogènes 6. Effets immédiats et/ou différés éventuels sur la santé humaine résultant 19 19 20 20 20 4 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. des interactions directes ou indirectes potentielles entre les plantes modifiées et les personnes travaillant ou entrant en contact avec la ou les plantes modifiées disséminées ou se trouvant à proximité 7. Effets immédiats et/ou différés éventuels sur la santé des animaux et conséquences pour la chaîne alimentaire résultant de la consommation de la plante modifiée ou de tout produit dérivé s'il est destiné à être utilisé en tant qu'aliment pour animaux 8. Incidences immédiates et/ou différées sur les processus biogéochimiques résultant des interactions directes et indirectes potentielles de la plante modifiée et des organismes cibles et non-cibles à proximité du ou des OGM disséminés 9. Incidences immédiates et/ou différées, directes ou indirectes, que les techniques spécifiques de culture, de gestion et de récolte utilisées pour les plantes modifiées peuvent avoir sur l'environnement lorsqu'elles sont différentes de celles utilisées pour des plantes supérieures non génétiquement modifiées 21 21 22 22 5 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. INTRODUCTION Les animaux monogastriques et l’homme ne synthétisent que dix acides aminés sur les vingt qui sont nécessaires à leur développement et sont donc tributaires d’un apport exogène qui se fait par l’alimentation. La qualité nutritionnelle d’une plante est déterminée non seulement par son apport énergétique sous forme de sucres (amidon, saccharose et sucres simples), mais également par la composition en acides aminés de ses protéines de réserves et donc par son apport en acides aminés. Malgré des efforts considérables de la part des sélectionneurs, les plantes fourragères (légumineuses et céréales) possèdent des teneurs insuffisantes en acides aminés essentiels et la ration doit être complémentée par des acides aminés synthétisés artificiellement ou produits dans des fermenteurs. Toutefois, il a pu être montré que l’introduction dans des plantes (lupin, luzerne, trèfle) de protéines de réserve spécifiques, riches en certains acides aminés, peut conduire à une augmentation de la quantité de ces acides aminés dans le régime alimentaire. Les graines des plantes, en particulier du maïs et du soja, sont une source concentrée de protéines, et représentent la base de la ration de nombreux animaux d’élevage. L’essentiel des apports protéiques se fait par les légumineuses où les protéines de réserves représentent de 25 à 40 % du poids total de la graine, les graines de céréales ne possédant que 7 à 14 % de leur poids en protéines. Les graines de légumineuses (sous forme de farines ou de tourteaux) qui constituent une source abondante de protéines, sont souvent rajoutées aux ensilages verts et fourrages ou mélangées aux graines de céréales, riches en glucides. Cependant, ces graines sont déficientes en acides aminés essentiels (la lysine pour les céréales et les acides aminés soufrés - cystéine et méthionine - pour les légumineuses) dont la teneur est insuffisante pour satisfaire les besoins nutritifs des animaux. La complémentation par des acides aminés, issus de synthèse ou de fermentation, augmente les coûts de l’élevage. Les protéines de réserve des plantes peuvent être groupées en 4 classes différentes : prolamines, albumines, glutélines et globulines, possédant chacune des propriétés physicochimiques propres. La majeure partie des protéines de réserves des céréales est constituée par les prolamines qui ont été nommées en fonction du nom générique en latin de l’espèce végétale (exemple : zéines α, β, γ et δ pour le maïs). Les prolamines du maïs (zéines) sont pauvres en lysine, et peuvent même en être totalement dépourvues (ex : les γ-zéines). Les mutants opaque-2 du maïs possèdent une teneur plus élevée en lysine que les variétés non mutées. La mutation touche un facteur de transcription nécessaire à la synthèse de certaines zéines (essentiellement les α-zéines et certaines γ-zéines). Cette réduction de la teneur en zéines est associée avec une accumulation plus ou moins accrue d’autres protéines qui, comportant plus de résidus lysine dans leurs séquences, conduisent ainsi à une augmentation de la teneur en lysine des graines de ces mutants. Les prolamines ont pu être caractérisées par la présence de trois domaines protéiques riches en résidus cystéine et nommés A, B, et C. Toutefois, cette organisation en domaines A, B et C a également pu être démontrée pour les protéines de réserves comme les albumines 2S. 6 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. Chez certaines plantes dicotylédones telles que le tournesol, la noix du Brésil, le colza, la moutarde et le lupin, les protéines de réserve que sont les albumine 2S sont riches en méthionine et cystéine. L’albumine 2S du tournesol, possède ainsi 16 % de résidus méthionine et 8 % de résidus cystéine. Ces protéines ne possèdent aucune activité enzymatique et ont donc uniquement un rôle de protéines de réserve. Les protéines 2S de la noix du Brésil, du colza, de la moutarde et du lupin sont constituées de 2 sous-unités reliées entre elles par des ponts disulfures, alors que la protéine 2S du tournesol n’est constituée que d’une seule sous-unité. Cette protéine est synthétisée au niveau du réticulum endoplasmique rugueux puis est accumulée dans la vacuole de la cellule. Cependant, l’addition d’une séquence d’acides aminés KDEL, séquence de rétention dans le réticulum, à l’extrémité Cterminale de la protéine permet de retenir cette protéine dans le réticulum où elle s’accumule. Il a été montré que cette protéine de tournesol est stable, non dégradée dans le rumen des animaux par la flore microbienne, et pourra de ce fait être digérée et absorbée dans le tractus gastro-intestinal de l’animal. Des études nutritionnelles et de toxicologie effectuées sur des rats alimentés avec des graines obtenues à partir de lupins transgéniques exprimant l’albumine 2S du tournesol ont montré que cette protéine ne possédait pas de pouvoir allergène et que les rats atteignaient un poids plus important. De même des moutons alimentés avec du lupin exprimant l’albumine 2S de tournesol prennent plus de poids et produisent plus de laine (une augmentation estimée à 8%, cf. http://ccr.ucdavis.edu/biot/html/biot/biot-5.shtml). Pour obtenir des grains de maïs possédant une qualité nutritive améliorée, nous avons introduit, par génie génétique, une séquence d’ADN complémentaire codant pour : - un gène de zéine de maïs dont la séquence a été modifiée et enrichie en résidus lysine - et proline par remplacement d’une séquence interne par une autre séquence comportant 10 résidus supplémentaires. Il est mis sous le contrôle de son propre promoteur qui dirige son expression dans l’albumen. un gène de protéine de réserve : albumine du tournesol modifiée par la présence de la séquence peptidique KDEL de rétention dans le réticulum endoplasmique. L’expression de cette protéine a été ciblée vers les graines de maïs par utilisation d’un promoteur de blé, spécifique des cellules des graines. L’évènement de transformation contenant ce gène a déjà fait l’objet d’essais au champ en 2000 et 2001. Ces deux caractères ont ensuite été associés par croisements entre les événements de transformation exprimant indépendamment les gènes de zéine modifiée et d’albumine afin de mesurer l’effet de la co-expression de ces gènes dans une même plante. 7 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. A. INFORMATIONS D’ORDRE GENERAL A.1. Nom et adresse du notifiant Le notifiant est : Société BIOGEMMA S.A.S. 5, rue Saint-Germain l’Auxerrois 75001 PARIS A. 2. Qualification et expérience des scientifiques responsables L’ensemble des responsables scientifiques de ce dossier et leurs équipes de chercheurs et de techniciens ont déjà conduit différents essais au champ depuis plusieurs années. Ces essais, sur plusieurs espèces végétales, portaient aussi bien sur des caractères de types agronomiques que des caractères relatifs à la qualité des produits récoltés. A. 3. Titre du projet Essais au champ pluriannuels de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain B . INFORMATIONS CONCERNANT LES PLANTES RECEPTRICES B. 1. Nom complet Nom de famille : Genre : Espèce : Sous-espèce : Lignée : Nom usuel : Graminae Zea mays mays A188 maïs L’origine géographique supposée de cette plante est le Mexique et l’Amérique centrale B.2. Information concernant la reproduction B.2. a) Information concernant la reproduction du maïs i) Mode de reproduction Le maïs est une plante monoïque à fleurs mâles et femelles portées sur la même plante mais séparées. Les fleurs mâles, regroupées au sommet de la tige en une inflorescence terminale appelée panicule, ne portent que des étamines entourées de glumelles. Elles apparaissent les premières (phénomène de protandrie). Les fleurs femelles, groupées en un ou plusieurs épis à l’aisselle des feuilles, n’apparaissent que par leurs longs styles appelés "soies" sortant des 8 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. bractées ou spathes entourant chaque épi. Chaque fleur contient un ovaire unique, chaque épi comprend de 300 à 500 fleurs environ. ii) Facteurs spécifiques affectant la reproduction La reproduction de cette plante est assurée par la libération du pollen contenu dans les étamines (organes de la panicule) par ouverture des sacs polliniques ou anthères. Le mode de reproduction du maïs est dit allogame (pollinisation par une autre plante de maïs) anémophile (pollinisation par le vent). La pollinisation du maïs en conditions naturelles se réalise principalement par fécondation croisée (allofécondation supérieure à 95%). Un faible taux d’autofécondation est néanmoins possible (inférieur à 5%). iii) Temps de génération Le maïs est une plante à cycle biologique court : le temps de génération du semis à la récolte des grains est d’environ 7 à 8 mois. Le semis, en France, a lieu à partir du mois d’avril et la récolte en octobre - novembre. B. 2. b) Compatibilités sexuelles avec d’autres espèces sauvages ou cultivées Il n’y a pas d’hybridation interspécifique possible en France du fait de l’absence d’espèces voisines ou apparentées se développant spontanément sur le territoire français. B. 3. Capacité de survie B.3. a) Capacité à former des structures de survie ou de dormance Le maïs est une plante annuelle qui se reproduit par graine et ne présente pas de moyens de reproduction végétative en condition naturelle. Les semences sont nombreuses mais leur viabilité est fortement limitée. Les semences sont en effet très sensibles aux maladies et au froid. Il n’y a en général pas de repousses à la suite d’une culture de maïs, seuls les épis non battus peuvent permettre au grain de conserver éventuellement une capacité de germination l’année suivante. B.3. b) Facteurs spécifiques affectant la capacité de survie Les graines ne présentent pas de dormance. Les conditions climatiques hivernales de manière générale ne permettent pas la repousse de cette plante. Les pratiques agricoles courantes conduisent également à la destruction des graines. B. 4. Dissémination B.4.a. Voie et étendue de la dissémination Le maïs en Europe n’est qu’une espèce de grande culture, sa dissémination n’intervient que dans les espaces agricoles par semis. 9 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. B.4.b Facteurs spécifiques affectant la dissémination La dissémination de gènes du maïs peut s’effectuer par l’intermédiaire du pollen et des graines : - le pollen provenant de l’inflorescence mâle est dispersé par gravité et par le vent. Le début de la libération du pollen a lieu généralement deux ou trois jours avant l’apparition des soies des épis femelles. La durée de floraison des fleurs mâles est de 6 à 10 jours. - la viabilité des semences est fortement limitée car elles sont sensibles aux maladies et surtout au froid hivernal. C’est pourquoi il n’y a en général pas de repousse de maïs. B. 5. Distribution géographique de la plante Le maïs est dépendant de l’homme pour sa dispersion géographique. Le maïs est utilisé, soit comme ensilage, soit pour sa production de grains. Il s’agit de la première culture céréalière du monde en terme de production. B. 6. Description de l’habitat naturel de la plante (espèce ne poussant pas habituellement en UE) Le maïs, originaire d’Amérique centrale, n’a pas d’habitat naturel en Europe. Il ne se développe pas en dessous de 9-10°C et a une température optimale de croissance de 30 à 33°C. En climat continental (Canada, URSS), le maïs est cultivé jusqu’au 60ème parallèle. Le maïs est sensible à de nombreux parasites et ravageurs. Les plus importants sont les parasites fongiques (Fusarium sp., Ustilago maydis, Sphacelotheca reliana,etc) et les insectes (taupins, chrysomèle, pyrale et sésamie). B. 7. Autres interactions potentielles avec des organismes dans l’écosystème habituel Durant sa culture, le maïs peut être en interaction avec des ravageurs, présents dans le sol (taupins, vers gris), dans ses propres tissus (pyrales, sésamies) ou à sa surface (pucerons). Il est également en interaction avec des organismes pathogènes, essentiellement des champignons (Fusarium, Helminthosporium, Ustilago, etc). C. INFORMATIONS CONCERNANT LA MODIFICATION GENETIQUE C.1. Description des méthodes utilisées pour la modification génétique Les plantes de maïs faisant l’objet de ce dossier ont été obtenues grâce à la technique de transformation par Agrobacterium tumefaciens. La transformation par Agrobacterium tumefaciens est basée sur les propriétés naturelles de cette bactérie et sur l’utilisation de vecteurs « désarmés ». Des embryons immatures d’une lignée de maïs sont mis en co-culture in vitro avec les cellules d’Agrobacterium, puis, après quelques jours, les embryons sont transférés et cultivés sur un milieu de sélection contenant un herbicide (glufosinate ou phosphinothricine). Les cals qui se développent alors sont 10 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. constitués de cellules transformées. Des plantes transgéniques sont ensuite régénérées à partir de ces cals. C.2. Nature et source du vecteur utilisé Les vecteurs utilisés pour la transformation du maïs par Agrobacterium tumefaciens est un plasmide appelé vecteur binaire. C.3. Taille, origine des organismes donneurs et fonction recherchée de chaque fragment constitutif de la région envisagée pour l’insertion Deux gènes différents ont été introduits indépendamment dans le maïs : un premier, codant pour une protéine de réserve du maïs, modifiée par remplacement d’une séquence interne par une séquence riche en acides aminés lysine et proline et un second codant pour une protéine de réserve du tournesol, riche en méthionine et cystéine. Ces gènes sont placés sous le contrôle de promoteurs qui dirigent leur expression uniquement dans la graine. Des croisements entre ces deux types de plantes transgéniques ont ensuite permis d’obtenir des plantes co-exprimant les deux gènes. Un gène marqueur conférant la résistance à l’herbicide glufosinate a également été introduit afin de permettre la sélection des plantes transformées lors des étapes de culture in vitro. Ce gène est exprimé dans l’ensemble de la plante. D. INFORMATION CONCERNANT LA PLANTE SUPERIEURE GENETIQUEMENT MODIFIEE D.1. Description du ou des caractères et des caractéristiques qui ont été introduits ou modifiés Les plantes transgéniques de maïs qui seront cultivées au champ sont issues de 4 événements de transformation différents. Trois événements expriment dans la graine une protéine de maïs modifiée pour être plus riche en lysine et proline, un événement exprime une protéine de tournesol riche en méthionine et cystéine ; trois événements sont issus de croisements entre les deux types d’événements décrits ci-dessus et expriment les deux protéines. Toutes ces plantes expriment le caractère de résistance à l’herbicide glufosinate. A l’exception de ces trois caractères, les plantes transformées ne diffèrent pas des plantes de maïs nontransgéniques. D.2. Informations sur les séquences réellement insérées ou délétées Les résultats des analyses moléculaires (analyses de type Southern portant sur l’ADN des plantes transformées) de l’ensemble des événements de transformation proposés pour ces essais ont été présentés aux experts scientifiques chargés de l’évaluation de ce dossier. Ces résultats permettant de déterminer le nombre de copies et de loci d’ADN-T intégrés, ont également permis de montrer que les gènes à transférer ont été intégrés dans le génome d’une manière stable. Aucune région n’a été délétée. 11 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. D.3. Informations concernant l’expression de l’insert L’expression des protéines du maïs et du tournesol a été mise en évidence par électrophorèse des protéines présentes dans le grain de maïs, puis d’une coloration spécifique des protéines et éventuellement suivie d’une analyse Western, grâce à l’utilisation d’un anticorps spécifique de la protéine codée par le gène transféré. Ces protéines sont exprimées uniquement dans le grain de maïs. L’expression du gène de résistance à l’herbicide glufosinate est visualisée par l’observation du phénotype après application locale, sur une feuille, d’une solution de cet herbicide. Cette expression a lieu dans tous les organes de la plante. Tous les événements de transformation expriment les deux caractères. D.4. Description des différences entre la plante génétiquement modifiées et la plante réceptrice A priori aucun changement n’est attendu dans le mode et la vitesse de reproduction des plantes transgéniques suite à l’expression dans la graine des gènes codant pour des protéines de réserve du maïs de type zéine modifiée ou albumine de tournesol. Cette capacité de survie ne semble pas devoir être affectée : la tolérance au glufosinate (phosphinothricine), conférée aux plantes transgéniques, ne présente pas d’avantage sélectif en dehors des pressions de sélection induites par l’application de l’herbicide. Or cet herbicide n’étant pas utilisé sur les cultures de maïs, les lignées faisant l’objet de ce dossier ne présenteront donc pas d’avantage par rapport aux variétés conventionnelles. Les différentes générations de plantes transgéniques cultivées en serre présentaient une fertilité et un cycle de reproduction semblables aux plantes de maïs non transgéniques. Les capacités de dissémination des plantes restent a priori inchangées par rapport aux plantes de maïs non transgéniques. D.5. Stabilité génétique de l’insert et stabilité phénotypique de la plante modifiée De nombreuses analyses moléculaires et génétiques de plantes transformées obtenues par la technique de transformation par Agrobacterium tumefaciens ont montré que l’intégration de l'ADN-T se fait dans le génome nucléaire de la plante. Dans les plantes qui font l’objet de ce dossier, les transgènes présentent une expression et une héritabilité stables de type mendélien. Cette stabilité d’insertion et d’expression a été observée sur plusieurs générations de plantes cultivées en serre. L’expression des gènes introduits et qui sont placés sous le contrôle de promoteurs eucaryotes, renforce la preuve de l’insertion nucléaire et de sa stabilité. D.6 Modifications de la capacité de la plante modifiée à transférer du matériel génétique dans d’autres organismes Les études menées jusqu’à présent n’ont pas permis de mettre en évidence un transfert de gène dans la nature entre eucaryotes et bactéries. En ce qui concerne le transfert horizontal, 12 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. aucune donnée ne laisse supposer que les transgènes puissent avoir un comportement différent d’un gène endogène pour les plantes cultivées au champ. Des informations supplémentaires sont disponibles sur le site http://europa.eu.int/comm/research/quality-of-life/gmo/index.html. Les transferts interspécifiques et intergénériques ne sont pas possibles dans le cas du maïs cultivé en France car aucun genre et aucune espèce autre que Zea mays ne peut être fécondé par le pollen de maïs. La castration, l’ensachage des panicules de plantes transgéniques durant la période de production de pollen ou la mise en place d’une distance d’isolement réduira très fortement le risque de dissémination accidentelle vers d’autres cultures via le pollen. D.7 Informations concernant les effets toxiques, allergisants ou autres effets nocifs résultant de la modification génétique sur la santé humaine A ce jour, nous ne disposons d’aucune indication sur une toxicité éventuelle pouvant résulter de l’introduction de ces gènes. La modification génétique confère aux plantes transgéniques la résistance au glufosinate (ou phosphinotricine ; herbicides Basta ou Liberty) et la capacité à produire deux nouvelles protéines de réserve dans la graine. Ces protéines, riches en lysine, proline, méthionine et cystéine permettent d’augmenter la teneur de la graine en ces acides aminés Les gènes introduits responsables de ces caractères ne présentent pas de risque de toxicité particulier. La protéine de tournesol est consommée par l’Homme et les animaux et n’a pas montré de toxicité. Des plantes transgéniques contenant ce gène ont été produites en Australie et utilisées expérimentalement en nutrition animale sans présenter de toxicité. Les protéines de réserve utilisées ne semblent pas présenter de caractère allergisant ; la comparaison, à titre prédictif, de sa séquence avec des séquences de protéines allergènes ne montre pas d’homologie. Une étude a montré que la phosphinotricine acétyltransférase, enzyme produite à partir du gène marqueur qui a été introduit et détoxifiant la phosphinotricine ou glufosinate (principe actif des herbicides Basta et Liberty) est dégradée en quelques secondes par les sucs gastriques. Cette protéine, exprimée de façon constitutive dans les plantes, ne semble pas pouvoir entraîner de réponse allergique après ingestion. Les plantes et produits végétaux de cet essai ne seront pas consommés par l’Homme ; ils seront soit détruits, soit ramenés au laboratoire à des fins d’analyse. D.8 Informations concernant la sécurité de la plante modifiée pour la santé des animaux, lorsque la plante est destinée à être utilisée dans l’alimentation animale Aucun effet toxique n’a été mis en évidence suite à l’expression des protéines de réserve zéine de maïs et albumine de tournesol (voir les paragraphes 6 et 7 ci-dessus). D.9 Mécanismes d’interaction entre la plante modifiée et les organismes cibles Non applicable. 13 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. D.10 Modifications potentielles des interactions de la plante modifiée avec les organismes non cible résultant de la modification génétique Aucune interaction particulière n’est attendue avec des organismes non cibles. La protéine phosphinothricine acétyltransférase n’est pas connue pour présenter de toxicité. L’expression des protéines de réserve : zéine de maïs modifiée ou albumine de tournesol ne semble pas devoir modifier ces éventuelles interactions. D.11 Interactions potentielles avec l’environnement abiotique Aucune interaction de cet ordre est envisagée. D.12 Description des méthodes de détection et d’identification de la plante supérieure génétiquement modifiée Les plantes transgéniques retenues pour cet essai sont très facilement identifiables par leur phénotype de tolérance au glufosinate (tolérance aux herbicides Basta® et Liberty®). Des techniques moléculaires peuvent également être utilisées telles que la technique de Southern blotting ou l’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) sur les séquences introduites. Ces dernières permettent alors une identification fiable des plantes de maïs transgéniques faisant l’objet de ce dossier. D.13 Informations, le cas échéant, sur les précédentes disséminations de la plante génétiquement modifiées Il s’agit de la première demande d’essais en champ pour les évènements exprimant la zéine de maïs modifiée et l’association zéine modifiée-protéine de tournesol. L’événement exprimant la protéine de réserve du tournesol a déjà fait l’objet de deux disséminations antérieures en France, en 2000 et 2001. E. INFORMATION CONCERNANT LE SITE DE DISSEMINATION E. 1. Localisation et étendue des sites de dissémination Les sites de dissémination pour l’année 2003 se situent dans la région Auvergne et dans la région Midi-Pyrénées. La surface totale de chacun de ces essais sera d’environ 2 500 m2 (bordures agronomiques de maïs non transgéniques et allées comprises) avec une surface d’environ 1800 m2 couverte par les plantes transgéniques. E. 2. Description de l’écosystème des sites de dissémination Les agrosystèmes concernés par l’expérimentation sont dédiés à la polyculture (céréales à paille, tournesol, pois, maïs). Toutes les parcelles seront situées à proximité de stations d’expérimentation ou de production de semences. 14 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. Les parcelles utilisées pour la mise en place de ces essais seront selon le cas : - non nécessairement isolées dans le cas où les panicules de plantes transgéniques seraient castrées et/ou les panicules empochées, - isolées de 200 m de toute culture commerciale de maïs si les plantes transgéniques ne sont pas castrées ou si leur panicule n’est pas empochée. Par ailleurs, quatre rangs de bordure agronomique de maïs non transgénique seront implantés autour des parcelles et pourront être utilisées comme piège à pollen et/ou comme pollinisateur. Les climats dans les diverses régions de culture sont variables, avec un climat de type océanique pour la région Midi-Pyrénées, et un climat continental dans la région Auvergne. E. 3. Présence d’espèces apparentées sauvages sexuellement compatibles ou d’espèces végétales cultivées sexuellement compatibles Aucune espèce sauvage sexuellement compatible avec le maïs n’est présente à proximité des différents sites de dissémination. Aucun risque de dissémination de la modification génétique n’est attendu par hybridation interspécifique. Des champs de maïs peuvent être présents à proximité des sites d’expérimentation. Cependant, les précautions sont prises (présence d’une bordure faisant office de piège à pollen, respect d’une distance d’isolement et/ou castration ou mise sous poche des panicules) pour éviter toute dissémination de gènes via le pollen à partir des plantes transgéniques en culture. E.4. Proximité des sites de biotopes officiellement reconnus ou de zones protégées susceptibles d’être affectées Il n’y a pas de biotope officiellement reconnu ou de zone protégée à proximité des essais. Les informations sur ces sites ont été contrôlées auprès des DIREN. F. INFORMATION CONCERNANT LA DISSEMINATION F. 1. Objectif de la dissémination L’objectif est d’évaluer les modifications de la teneur et la composition en acides aminés du grain de l’expression d’une protéine de réserve du maïs : la zéine modifiée (enrichie en résidus lysine et proline) et de l’expression d’une protéine de réserve du tournesol : l’albumine (riche en résidus cystéine et méthionine). Ces conséquences seront également recherchées sur des plantes issues de croisements entre les deux types de modifications. Les plantes faisant l’objet de cette dissémination ont déjà fait l’objet de multiplication en serre et l’expression des protéines de réserve introduites confirmée. Il est maintenant indispensable de produire des grains dans les conditions agronomiques de culture du maïs pour pouvoir évaluer l’influence de ces modifications sur la teneur en acides aminés des grains. Les conditions de l’environnement influent très fortement sur le développement et la composition 15 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. des plantes. Les essais préalablement menés en serre ne peuvent que donner des indications préliminaires sur le caractère étudié. Les facteurs physiques de l’environnement (température, éclairement, disponibilité en eau et teneur en soufre du sol) peuvent notamment influencer la physiologie de la plante et, par conséquence, sur la teneur et la composition en acides aminés de la plante et des graines. Les essais proposés pour 2003 ont comme objectif de produire des graines qui seront analysées pour leur teneur et leur composition en acides aminés. Les semences produites au cours de ces essais seront utilisées uniquement à des fins de recherche : semis en serre, prochaines campagnes de culture, analyses de composition. En aucun cas ces semences seront commercialisées ou utilisées à d’autres fins que celles décrites ci-dessus. F. 2. Date et durée prévues de l’opération L’essai est prévu d’avril à novembre 2003. Les autres campagnes de cultures se dérouleront d’avril à novembre 2004, 2005 et 2006. Les semis seront effectués entre mi-avril et fin mai, les récoltes de fin septembre à minovembre environ. Ces dates sont indicatives et peuvent être modifiées en fonction des conditions climatiques. F. 3. Méthode de dissémination envisagée Les semis seront effectués manuellement ou à l’aide d’un semoir mécanique. F. 4. Méthode de préparation et gestion du site avant, pendant et après la dissémination, y compris les pratiques culturales et méthodes de récolte La préparation du sol sera effectuée selon les pratiques agricoles courantes. Après un labour et une préparation du lit de semis, les traitements du sol seront réduits aux traitements herbicides (par un herbicide homologué sur cette culture), insecticides ou anti-limaces sur les sites d’expérimentations. Les traitements en cours de culture seront adaptés au type d’expérimentation. Un desherbage chimique ou manuel pourra être appliqué selon les besoins. La récolte des épis sera soit manuelle soit mécanique. Ces épis seront rapatriés au laboratoire où les graines seront conservées jusqu’à leur semis ou analyse. Les résidus végétaux (épis non récoltés, tiges et feuilles) seront broyés sur place mécaniquement. Les résidus broyés seront ensuite enfouis par un travail superficiel du sol. Un labour d’hiver sera ensuite effectué. Aucune culture commerciale de maïs ne sera implantée sur les parcelles d’essai l’année suivante ; les éventuelles repousses de maïs seront détruites avant floraison. 16 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. F. 5. Nombre approximatif de plantes Le nombre total de plantes transgéniques cultivées n’excédera pas 10 000, sur une surface de 1 800 m² environ, hors bordures et allées. G. INFORMATION SUR LES PLANS DE SURVEILLANCE, DE CONTROLE ET DE TRAITEMENT DU SITE ET DES DECHETS APRES DISSEMINATION G. 1. Précautions prises G. 1. a) Distance d’isolement des autres espèces sexuellement compatibles Les plantes transgéniques faisant l’objet de cette demande d’essai en champ seront castrées ou leur panicule mise sous poche, aucune contrainte d’isolement avec d’autres cultures de maïs ne sera mise en œuvre. Cependant, si les plantes étaient laissées, pour les besoins de l’expérimentation, en pollinisation libre, une distance d’isolement de 200 mètres de toute autre culture de maïs à vocation commerciale sera mise en place. En Europe, il n’existe pas d’espèce végétale sexuellement compatibles avec le maïs. G. 1. b) Mesures minimisant la dissémination du pollen et des graines Les risques de dissémination de pollen transgénique sont très réduits puisque les plantes de la parcelle d’expérimentation ne produiront pas de pollen (castration ou mise sous poche) ou seront isolées de toute culture commerciale de maïs. De plus la présence de 4 rangs de bordure agronomique, constituée de plantes de même précocité que les plantes transgéniques, servira de piège à pollen. En fin d’essai, ces plantes seront broyées sur place puis enfouies par un travail superficiel du sol qui sera réalisé dès que possible en fonction des conditions climatiques et l’état du sol à la récolte. La préparation des lots de semis est réalisée au laboratoire. Chaque lot de graines est conditionné dans un emballage (sachet de papier couramment utilisé par les sélectionneurs) ouvert uniquement lors du semis. Après semis, le surplus éventuel de graines présentes dans le semoir est récupéré et rapatrié au laboratoire pour destruction. Ces précautions réduisent les risques de dissémination des graines en dehors de la parcelle d’expérimentation. G. 2. Description des méthodes de traitement du site après dissémination Les bordures non transgéniques de maïs seront détruites par broyage puis enfouissement sur la parcelle lors de la destruction finale de l’essai. Les parcelles feront l’objet d’une surveillance régulière l’année suivant l’essai afin d’éliminer toute éventuelle repousse de maïs avant la floraison. 17 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. G. 3. Description des méthodes de traitement après dissémination pour le matériel issu de plantes génétiquement modifiées y compris pour le traitement des déchets Les épis produits sur cet essai et destinés aux analyses ou à des semis futurs seront récoltés et rapatriés en laboratoire ; les autres plantes et résidus de la culture seront détruits par broyage puis enfouissement sur la parcelle d’essai. G. 4. Description des plans et techniques de surveillance Pendant la culture, l’apparition de mauvaises herbes sur la parcelle d’essai sera évitée par l’utilisation d’herbicides autorisés pour la culture du maïs ou par un désherbage manuel dans le cas d’enherbement localisé. Pendant les essais, des visites régulières seront effectuées (1 à 2 visites par semaine selon la phase d’avancement de l’essai) et plus fréquemment pendant la période de floraison. Après la destruction de l’essai, plusieurs visites des parcelles seront effectuées au printemps pendant la période de germination des graines. Les éventuelles repousses de maïs seront éliminées avant floraison. G. 5. Description des plans d’urgence Ces essais pourront être arrêtés en cas d’urgence (accident climatique majeur, vandalisme …). Les méthodes de destruction volontaire seront adaptées au stade de développement des plantes (traitement herbicide, broyage éventuellement après récolte des débris dispersés…). Elles seront appliquées dès que possible après la fin des constatations d’usage. G. 6. Méthodes et procédures de protection du site Aucune méthode et/ou procédure particulière de protection du site ne sera appliquée. 18 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. Annexe II D.2 CONCLUSIONS CONCERNANT LES INCIDENCES L’ENVIRONNEMENT DE LA DISSEMINATION POTENTIELLES SUR 1. Probabilité que les plantes modifiées deviennent plus persistantes que les plantes parentales ou réceptrices dans les habitats agricoles ou se propagent plus rapidement dans les habitats naturels Les plantes qui seront cultivées au champ sont de trois types : - des plantes exprimant dans le grain une protéine de réserve zéine de maïs modifiée riche en lysine et proline, - des plantes exprimant dans le grain une protéine de réserve du tournesol, - des plantes exprimant les deux protéines zéine modifiée et protéine de réserve du tournesol, issues du croisement des deux premiers types d’événements de transformation. Ces trois types de plantes sont résistants au glufosinate (phosphinothricine), matière active des herbicides Basta® et Liberty®. Le maïs est cultivé dans des agrosystèmes et n’est jamais présent en France dans des milieux naturels, ses capacités de dissémination et de repousse étant excessivement faibles. Sa propagation dans ces milieux n’est pas affectée par la modification génétique qui ne touche que la composition du grain. L’herbicide utilisé pour le repérage des plantes transformées en serre ou au champ – glufosinate ou phosphinothricine, herbicide total - n’est pas homologué en Europe pour des applications sur les cultures commerciales de céréales. Il ne sera appliqué éventuellement lors des essais que par "mouillage de la feuille", sur quelques cm² de chaque plante, ou en pulvérisation dirigée, dans le but de repérer les plantes porteuses de la ou des modifications génétiques. En l’absence d’utilisation de cet herbicide et donc en l’absence de pression de sélection, il est hautement improbable que les maïs faisant l’objet de cet essai deviennent plus persistants dans les habitats agricoles ou naturels. 2. Avantages ou inconvénients sélectifs conférés aux plantes modifiées Deux types de caractères sont présents dans les maïs qui font l’objet de cette expérimentation : - la tolérance aux herbicides Basta® et Liberty® (herbicides totaux) - l’expression de la protéine albumine de tournesol et/ou d’une protéine zéine de maïs enrichie en résidus lysine. Aucun avantage ou inconvénient sélectif ne semble devoir être conféré à ces plantes, dans les conditions de l’essai, car aucune pression de sélection ne sera appliquée.Il n’y aura pas de traitement par l’herbicide Basta® et Liberty®, si ce n’est par mouillage de la feuille afin de repérer les plantes transformées. Dans ces conditions de traitement, aucune plante, qu’elle soit sensible ou résistante, n’est détruite et la pression de sélection est quasi-nulle. L’expression des protéines de réserve dans la graine n’est pas de nature à induire de pression de sélection pouvant favoriser ou défavoriser ces plantes. 19 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. 3. Possibilité de transfert de gène aux mêmes espèces ou à d’autres espèces végétales sexuellement compatibles dans les conditions de plantation des plantes modifiées et avantages ou inconvénients sélectifs conférés à ces espèces végétales. La seule espèce sexuellement compatible en Europe est le maïs. Le transfert de matériel génétique via le pollen vers d’autres cultures de la même espèce sera peu probable étant donné les précautions prises (castration, mise sous poche ou établissement d’une distance d’isolement). La culture du maïs dans les agrosystèmes à partir de semences hybrides produites selon un cahier de charges rigoureux, la non-utilisation de "semences de ferme" rendent les possibilités d’obtenir des plantes descendantes d’inter-croisement suite à un flux pollinique très improbables. Combiné à l’absence d’avantage sélectif dans les conditions de culture du maïs, ce transfert peut être considéré comme un risque très minime. Il n’existe pas en Europe d’espèces apparentées au maïs qui pourraient être réceptrices pour ce pollen et aucun avantage ou inconvénient ne peut être conféré. 4. Incidences immédiates et/ou différées que les interactions directes ou indirectes entre les plantes modifiées et les organismes cibles, tels que prédateurs, parasitoïdes et agents pathogènes peuvent avoir sur l’environnement Les plantes faisant l’objet de ce dossier n’ont pas vocation à agir directement sur des organismes cibles. Aucune interaction n’est attendue entre le produit du gène de résistance à l’herbicide et des organismes cibles. En l’absence d’application de l’herbicide sur la parcelle d’essai (hors mouillage ou pulvérisation localisée de la feuille afin de repérer les plantes transgéniques), aucun effet éventuel n’est attendu. Aucune interaction entre les protéines de réserve exprimées dans les graines et des organismes n’est attendue. L’incidence écologique de ces essais peut être considérée comme minime. 5. Incidences immédiates et/ou différées que les interactions directes ou indirectes entre les plantes modifiées et des organismes non cibles, notamment les incidences sur les niveaux de population des concurrents, herbivores, symbiotes, parasites et agents pathogènes. Aucune interaction n’est attendue entre le produit du gène de résistance au glufosinate et des organismes non-cibles. En l’absence d’application de l’herbicide sur la parcelle d’essai (hors mouillage de la feuille ou pulvérisation localisée, afin de repérer les plantes transgéniques), aucun effet éventuel n’est attendu. Aucune interaction entre les protéines de réserve exprimées dans les graines et des organismes non-cibles n’est attendue. 20 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. 6. Effets immédiats et/ou différés éventuels sur la santé humaine résultant des interactions directes ou indirectes potentielles entre les plantes modifiées et les personnes travaillant ou entrant en contact avec la ou les plantes modifiées disséminées ou se trouvant à proximité A ce jour et à ce stade de l’expérimentation, nous ne disposons d’aucune indication sur une toxicité éventuelle pouvant résulter des séquences introduites. Une étude a montré que la phosphinotricine acétyltransférase, enzyme qui détoxifie la phosphinotricine, est dégradée en quelques secondes par les sucs gastriques. Cette protéine, exprimée de façon constitutive dans les plantes, ne semble pas pouvoir entraîner de réponse allergique après ingestion. Aucune allergie de contact n’a été développée par les personnels de laboratoire qui manipulent depuis de nombreuses années des plantes transgéniques exprimant ce gène de sélection. La protéine zéine de maïs exprimée dans les plantes transformées est issue de la protéine endogène du maïs à laquelle a été substituée une partie riche en lysine par un motif alterné de 10 résidus lysine et proline. Aucune information ne permet de prévoir que la substitution effectuée conduise à un changement des caractéristiques sanitaires de la protéine originale du maïs et à priori aucune toxicité de cette protéine n’est attendue. La protéine de tournesol est couramment consommée par l’Homme et les animaux, cependant des comparaisons par bioanalyse informatique avec des séquences de protéines végétales connues pour être allergènes ont été effectuées. Aucune homologie significative n’a été observée. Les plantes et produits végétaux de cet essai ne seront pas consommés par l’Homme ; ils seront soit détruits, soit ramenés au laboratoire à des fins d’analyse. 7. Effets immédiats et/ou différés éventuels sur la santé des animaux et conséquence pour la chaîne alimentaire résultant de la consommation de la plante modifiée ou de tout produit dérivé s’il est destiné à être utilisé en tant qu’aliment pour animaux Les éléments qui ont été fournis ci-dessus au paragraphe 6, s’appliquent également aux animaux. Aucun effet immédiat ou différé n’est attendu, à ce stade de l’expérimentation, sur la santé des animaux. Aucune consommation des plantes génétiquement modifiées n’est prévue, les produits végétaux de cet essai ne seront pas consommés ; ils seront soit détruits, soit ramenés au laboratoire à des fins d’analyse. On ne peut exclure que de petits animaux puissent être présents sur l’essai et consommer de faibles quantités de feuilles. Cependant aucun effet n’est à priori attendu, les protéines de réserve ne s’exprimant qu’au niveau des graines et la protéine phosphinothricine acétyl transférase n’étant pas connue pour présenter de toxicité (voir ci-dessus les paragraphes 5 et 6). 21 Essais au champ de maïs génétiquement modifiés pour la composition en acides aminés du grain. 8. Incidences immédiates et/ou différées sur les processus biogéochimiques résultant des interactions directes et indirectes potentielles de la plante modifiée et des organismes cibles et non-cibles à proximité du ou des OGM disséminés Les interactions directes et indirectes, générées par la modification génétique des plantes de maïs qui font l’objet de ce dossier et les organismes cibles et non-cibles sont d’effets éventuels très limités (voir les paragraphes 4, 5 et 6). Les niveaux d’expression géniques du gène de résistance au glufosinate, le traitement des produits végétaux après la récolte, et le respect des conditions classiques de culture du maïs (façon culturale, fertilisation, irrigation, traitements herbicides, insecticides et fongicides) ne sont pas de nature, à priori, à modifier les incidences sur les processus biogéochimiques par rapport aux incidences de la culture de maïs conventionnel. 9. Incidences immédiates et/ou différées, directes ou indirectes, que les techniques spécifiques de culture, de gestion, et de récolte, utilisées pour les plantes modifiées peuvent avoir sur l’environnement lorsqu’elles sont différentes de celles utilisées pour des plantes supérieures non génétiquement modifiées Dans le cadre de cette expérimentation, aucune incidence n’est attendue. Cependant, si le développement de plantes de maïs sur-exprimant l’une ou l’autre ou l’une et l’autre des protéines devait se produire, il aurait pour effet, une amélioration de la teneur et de la composition en acides aminés du grain. Un tel développement aurait pour conséquence une meilleure qualité du grain utilisé en alimentation animale puisque ces acides aminés sont indispensables et ne sont pas synthétisés par les animaux. Cette modification conduirait à une réduction des coûts des additifs alimentaires. Un tel développement aurait à priori un effet favorable sur la santé humaine, sur la santé animale, et éventuellement sur la microfaune et sur la faune sauvage. 22
