Patch clamp : étude des canaux ioniques

Patch clamp : étude des canaux ioniques
Le patch clamp est une technique d’électrophysiologie permettant l’étude biophysique et
biomoléculaire des canaux ioniques. Les canaux ioniques sont des complexes protéiques
transmembranaires insérés dans la bicouche phospholipidique par lesquels des ions inorganiques
spécifiques peuvent diffuser en fonction de leur gradient électrochimique. Les études des phénomènes
électriques des membranes ont mené à formuler l’hypothèse que les membranes sont perméables à
certains ions en entrainant des différences de potentiel.
1. Concept du patch clamp
Cette technique consiste à isoler électriquement un fragment de membrane en pressant
contre la surface d’une cellule une pipette de verre dont la pointe est de l’ordre du micromètre. Il s’en
suit une légère dépression à l’intérieur de la pipette qui permet une forte résistance (10G Ω) entre la
membrane et la pipette permettant l’isolement du fragment membranaire par rapport au milieu
extracellulaire. Ceci permettra d’imposer un potentiel à la membrane et d’enregistrer des courants
d’intensité de l’ordre du picoampère. Cette technique permet l’étude d’un courant unitaire provenant
d’un canal individuel ou de courants macroscopiques provenant de plusieurs de canaux.
2. Dispositif expérimental
Il est nécessaire d’avoir une micropipette de 200-300 µm avec une tige d’argent chloruré
dans son conduit qui sert d’électrode. La tige est reliée à un amplificateur permettant la mesure des
courants de faible intensité. Une seconde électrode est située dans le milieu pour établir le potentiel de
référence. Ces deux électrodes sont reliées à la chaine d’acquisition de données. Il faut avoir un
micromanipulateur (dispositif extrêmement précis, permettant d'effectuer des opérations sur des objets
observés sous un microscope) et une table anti-vibration sur cousin d’air. En effet, à l’échelle du µm
chaque vibration de l’environnement se révèle inadaptée à la formation et le maintien du seal
(scellement entre la pipette et la membrane). La préparation doit être placée dans une cage de faraday
qui permet d’éviter les courants d’air. Elle isole aussi des rayonnements électriques qui proviennent
des différents appareils électroniques (oscilloscope, câble, etc) et qui génèrent du bruit de fond. Ces
derniers sont aussi diminués pendant l’enregistrement à l’aide de filtres électroniques comme le filtre
de Bessel.
3. Techniques cellulaires
Il est nécessaire d’isoler un type cellulaire (cultures cellulaires, possibilité d’expression de
canaux par des cellules transfectées) pour simplifier l’analyse. Le seal est formé sur des cellules
adhérentes au fond de la cuve. Il est aussi nécessaire d’éviter les adhésions intercellulaires pour ne pas
fausser le potentiel de membrane et donc de travailler sur une cellule isolée.
4. Configurations membranaires (cf : figure.1)
Une fois le seal formé, des manipulations permettent d’avoir quatre configurations membranaires.
- Cellule attachée (cell-attached) : la membrane est scellée à l’orifice de la pipette tout en
gardant la cellule. Cette configuration maintient au mieux l’environnement physiologique et permet
l’étude d’un seul canal ionique ou de quelques canaux.
- Membrane détachée (inside-out) : Apres formation du seal, la membrane est arrachée de la
cellule par simple retrait de la pipette et il y a formation d’une microvésicule qui sera rompue à
l’exposition à l’air. La face interne est exposée au milieu extracellulaire.
- Cellule entière (whole-cell) : la membrane est rompue, ce qui crée une communication entre
la pipette et le cytosol entrainant la diffusion du milieu intrapipette dans la cellule. Cette configuration
permet l’étude macroscopique de l’activité de tous les canaux.
- Membrane inversée (outside-out) : à partir de la configuration cellule entière, il faut effectuer
le retrait de la pipette. Un morceau de membrane se détache et va reformer une hémivésicule. La face
externe sera alors exposée au milieu extracellulaire.
5. Etudes des canaux ioniques
Pour étudier les canaux, le patch clamp offre plusieurs techniques. La plus exploitée est le
potentiel imposé qui maintien un potentiel de membrane permettant l’activité des canaux. La
deuxième est la technique du patch clamp perforé avec un potentiel imposé qui est obtenue en
ajoutant dans la pipette un antibiotique (nystatine, amphotericine B). L’antibiotique va former des
pores dans la membrane. Ces pores qui sont perméables à certains ions permettent un meilleur
Mathieu SCHMITT
UE : pharmacologie expérimentale

contrôle et stabilité intracellulaire. Il est possible de
changer le milieu extracellulaire entourant la
membrane en ajoutant par exemple certaines
substances pharmacologiques et de tester leurs effets
sur les canaux. Ces mêmes substances
pharmacologiques peuvent être mises dans le milieu
intrapipette. Ceci va permettre de savoir par exemple
si un récepteur membranaire est directement couplé
à un canal ionique en configuration inside-out.
6. Analyses des résultats
On enregistrera donc soit des courants unitaires soit
des courants macroscopiques selon la configuration.
Dans le cas des courants unitaires, on enregistre
l’activité d’un canal. Le tracé enregistré est sous
forme de crêtes qui est traité informatiquement pour
donner des événements en créneaux dits courants
idéalisés. Dans le cas des courants macroscopiques,
on enregistre l’activité totale de la cellule c'est-à-dire
celle de tous les canaux. Il faudra recourir ensuite à
une analyse statistique des probabilités d’ouvertures
ou de fermetures qui permettent de décrire les états
ouverts ou fermés des sous-unités protéiques des
canaux. Ces états seront analysés pour déterminer le
nombre d’états de conductance (nombre d’états ouverts et nombre d’états fermés) et la vitesse de
transition entre les états pour ainsi connaitre le modèle cinétique. Ceci nous permettra de conclure sur
le comportement moyen du canal.
7. Exemples d’applications
La protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) semble impliquée dans
la régulation de l’activité de canaux Cl- dont le dysfonctionnement serait une des causes de la
mucoviscidose. Celle-ci conduit à un épaississement du mucus des voies respiratoire. Des études de
patch clamp ont montré que le CFTR est un canal Cl- régulé par phosphorylation par la protéine kinase
A activée par l’AMPc ou l’ATP et que l’activation du canal CFTR permet l’activation d’un autre
canal Cl- (ORCC: Outward Rectifying Chloride Channel) de conductance plus élevée. Dans le cas de
la mucoviscidose de classe 4, il y aurait un manque d’activation par le CFTR muté.
Le gène SCN1A code pour la sous-unité α du canal sodique Nav1.1. La mutation de ce gène est
associée à 2 types d’épilepsie c'est-à-dire à l’épilepsie généralisée avec des convulsions fébriles
(GEFS+) et à l'épilepsie myoclonique grave de l'enfance (SMEI). Cette mutation entraîne des
modifications au niveau des segments 4 des domaines II et IV qui sont sensibles au voltage. Le patch
clamp révèle une activation et une inactivation plus rapides ainsi qu’une absence de courant résiduel.
La migraine hémiplégique familiale de type 1 serait due à une mutation du gène CACNA1A qui code
pour une sous-unité de Cav2.1 des canaux calciques de type P/Q. Le patch clamp a pu mettre en
évidence qu’une mutation d’une de ces sous-unités altère la cinétique d’inactivation du canal. Ceci
aurait pour conséquence d’engendrer les crises migraineuses.
Le patch clamp a mis en évidence que les canaux ioniques sont des protéines essentielles aux
fonctions cellulaires comme la contraction, l’exocytose, la transmission axonale, etc. Le potentiel de
membrane, le potentiel d’action et leurs variations au changement d’environnement chimique ont une
explication moléculaire.
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