Mathieu SCHMITT UE : pharmacologie expérimentale Patch clamp : étude des canaux ioniques Le patch clamp est une technique d’électrophysiologie permettant l’étude biophysique et biomoléculaire des canaux ioniques. Les canaux ioniques sont des complexes protéiques transmembranaires insérés dans la bicouche phospholipidique par lesquels des ions inorganiques spécifiques peuvent diffuser en fonction de leur gradient électrochimique. Les études des phénomènes électriques des membranes ont mené à formuler l’hypothèse que les membranes sont perméables à certains ions en entrainant des différences de potentiel. 1. Concept du patch clamp Cette technique consiste à isoler électriquement un fragment de membrane en pressant contre la surface d’une cellule une pipette de verre dont la pointe est de l’ordre du micromètre. Il s’en suit une légère dépression à l’intérieur de la pipette qui permet une forte résistance (10G Ω) entre la membrane et la pipette permettant l’isolement du fragment membranaire par rapport au milieu extracellulaire. Ceci permettra d’imposer un potentiel à la membrane et d’enregistrer des courants d’intensité de l’ordre du picoampère. Cette technique permet l’étude d’un courant unitaire provenant d’un canal individuel ou de courants macroscopiques provenant de plusieurs de canaux. 2. Dispositif expérimental Il est nécessaire d’avoir une micropipette de 200-300 µm avec une tige d’argent chloruré dans son conduit qui sert d’électrode. La tige est reliée à un amplificateur permettant la mesure des courants de faible intensité. Une seconde électrode est située dans le milieu pour établir le potentiel de référence. Ces deux électrodes sont reliées à la chaine d’acquisition de données. Il faut avoir un micromanipulateur (dispositif extrêmement précis, permettant d'effectuer des opérations sur des objets observés sous un microscope) et une table anti-vibration sur cousin d’air. En effet, à l’échelle du µm chaque vibration de l’environnement se révèle inadaptée à la formation et le maintien du seal (scellement entre la pipette et la membrane). La préparation doit être placée dans une cage de faraday qui permet d’éviter les courants d’air. Elle isole aussi des rayonnements électriques qui proviennent des différents appareils électroniques (oscilloscope, câble, etc) et qui génèrent du bruit de fond. Ces derniers sont aussi diminués pendant l’enregistrement à l’aide de filtres électroniques comme le filtre de Bessel. 3. Techniques cellulaires Il est nécessaire d’isoler un type cellulaire (cultures cellulaires, possibilité d’expression de canaux par des cellules transfectées) pour simplifier l’analyse. Le seal est formé sur des cellules adhérentes au fond de la cuve. Il est aussi nécessaire d’éviter les adhésions intercellulaires pour ne pas fausser le potentiel de membrane et donc de travailler sur une cellule isolée. 4. Configurations membranaires (cf : figure.1) Une fois le seal formé, des manipulations permettent d’avoir quatre configurations membranaires. - Cellule attachée (cell-attached) : la membrane est scellée à l’orifice de la pipette tout en gardant la cellule. Cette configuration maintient au mieux l’environnement physiologique et permet l’étude d’un seul canal ionique ou de quelques canaux. - Membrane détachée (inside-out) : Apres formation du seal, la membrane est arrachée de la cellule par simple retrait de la pipette et il y a formation d’une microvésicule qui sera rompue à l’exposition à l’air. La face interne est exposée au milieu extracellulaire. - Cellule entière (whole-cell) : la membrane est rompue, ce qui crée une communication entre la pipette et le cytosol entrainant la diffusion du milieu intrapipette dans la cellule. Cette configuration permet l’étude macroscopique de l’activité de tous les canaux. - Membrane inversée (outside-out) : à partir de la configuration cellule entière, il faut effectuer le retrait de la pipette. Un morceau de membrane se détache et va reformer une hémivésicule. La face externe sera alors exposée au milieu extracellulaire. 5. Etudes des canaux ioniques Pour étudier les canaux, le patch clamp offre plusieurs techniques. La plus exploitée est le potentiel imposé qui maintien un potentiel de membrane permettant l’activité des canaux. La deuxième est la technique du patch clamp perforé avec un potentiel imposé qui est obtenue en ajoutant dans la pipette un antibiotique (nystatine, amphotericine B). L’antibiotique va former des pores dans la membrane. Ces pores qui sont perméables à certains ions permettent un meilleur contrôle et stabilité intracellulaire. Il est possible de changer le milieu extracellulaire entourant la membrane en ajoutant par exemple certaines substances pharmacologiques et de tester leurs effets sur les canaux. Ces mêmes substances pharmacologiques peuvent être mises dans le milieu intrapipette. Ceci va permettre de savoir par exemple si un récepteur membranaire est directement couplé à un canal ionique en configuration inside-out. 6. Analyses des résultats On enregistrera donc soit des courants unitaires soit des courants macroscopiques selon la configuration. Dans le cas des courants unitaires, on enregistre l’activité d’un canal. Le tracé enregistré est sous forme de crêtes qui est traité informatiquement pour donner des événements en créneaux dits courants idéalisés. Dans le cas des courants macroscopiques, on enregistre l’activité totale de la cellule c'est-à-dire celle de tous les canaux. Il faudra recourir ensuite à une analyse statistique des probabilités d’ouvertures ou de fermetures qui permettent de décrire les états ouverts ou fermés des sous-unités protéiques des canaux. Ces états seront analysés pour déterminer le Figure.1 http://btler.cc.tut.fi/~malmivuo/bem/bembook/04/04x/0427x.gif nombre d’états de conductance (nombre d’états ouverts et nombre d’états fermés) et la vitesse de transition entre les états pour ainsi connaitre le modèle cinétique. Ceci nous permettra de conclure sur le comportement moyen du canal. 7. Exemples d’applications La protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) semble impliquée dans la régulation de l’activité de canaux Cl- dont le dysfonctionnement serait une des causes de la mucoviscidose. Celle-ci conduit à un épaississement du mucus des voies respiratoire. Des études de patch clamp ont montré que le CFTR est un canal Cl- régulé par phosphorylation par la protéine kinase A activée par l’AMPc ou l’ATP et que l’activation du canal CFTR permet l’activation d’un autre canal Cl- (ORCC: Outward Rectifying Chloride Channel) de conductance plus élevée. Dans le cas de la mucoviscidose de classe 4, il y aurait un manque d’activation par le CFTR muté. Le gène SCN1A code pour la sous-unité α du canal sodique Nav1.1. La mutation de ce gène est associée à 2 types d’épilepsie c'est-à-dire à l’épilepsie généralisée avec des convulsions fébriles (GEFS+) et à l'épilepsie myoclonique grave de l'enfance (SMEI). Cette mutation entraîne des modifications au niveau des segments 4 des domaines II et IV qui sont sensibles au voltage. Le patch clamp révèle une activation et une inactivation plus rapides ainsi qu’une absence de courant résiduel. La migraine hémiplégique familiale de type 1 serait due à une mutation du gène CACNA1A qui code pour une sous-unité de Cav2.1 des canaux calciques de type P/Q. Le patch clamp a pu mettre en évidence qu’une mutation d’une de ces sous-unités altère la cinétique d’inactivation du canal. Ceci aurait pour conséquence d’engendrer les crises migraineuses. Le patch clamp a mis en évidence que les canaux ioniques sont des protéines essentielles aux fonctions cellulaires comme la contraction, l’exocytose, la transmission axonale, etc. Le potentiel de membrane, le potentiel d’action et leurs variations au changement d’environnement chimique ont une explication moléculaire. JOFFRE, Michel 2001. Electrophysiologie moléculaire I : la technique du patch clamp. Paris: HERRMANN. Pages 1-145. ISBN 2-4056-6416-5 DUPRAT, Fabrice. Electrophysiologie : principes et technique. Nice sophia-antipolis : Inserm, 29 pages. LOSSIN,Christophe, 2003. Epilepsy-Associated Dysfunction in the Voltage-Gated Neuronal Sodium Channel SCN1A. New-York : the journal of science. ISSN : 11289-11295 SKACH, William 2002. Cystic Fibrosis Methods and Protocols. Springer : Humana Press. Pages 49-55. ISBN 0896038971 WEISS, Norbert and al, 2007. Rôle du canal calcique P/Q dans la migraine hémiplégique familiale. Inserm Grenoble, éd Médecine science. ISSN : 0767-0974