Transmission per os du white spot syndrome virus - Archimer

UNIVERSITE DE MONTPELLIER II
Sciences et Techniques du Languedoc
Thèse
Pour obtenir le grade de docteur
Spécialité : Biologie des organismes
Formation Doctorale : Biologie de l’Evolution et Ecologie
Ecole Doctorale: SIBAGHE -Biologie des systèmes Intègres– Agronomie
Environnement
Etapes précoces de l’infection du WSSV chez la
crevette
présentée et soutenue publiquement
par
HERNANDEZ HERRERA Rosa Idalia
Soutenue le 21 Mai 2008 devant le jury composé de :
Mme BOURGOUGNON Nathalie, Professeur, Université de Bretagne Sud Rapporteur
M HAMEED Sahul, Professeur, Thiruvalluvar University Rapporteur
M BREUIL Gilles Ifremer Examinateur
M BADIGUIAN Stephen Directeur de Recherche Université de Montpellier II Examinateur
M MARQUES Adam Daniel Maître de conférences Université de Montpellier II Examinateur
M. BONAMI Jean Robert, Directeur de recherche, CNRS, Montpellier Directeur de Thèse

Remerciements
La réalisation de ces recherches a pu s’effectuer au sein du laboratoire Ecosystèmes
lagunaires grâce à M. Tang Do Chi et M. Marc Troussellier directeurs de l’unité, que je
remercie ici pour leur soutien.
Je tiens à remercier tout particulierment M. Jean Robert Bonami qui a dirigé mes recherches,
m’a guidé sans faille dans mon travail et pour la confiance qu’il m’a accordée.
Mes remerciements vont à tous les membres de mon jury de thèse qui malgré les distances et
leurs nombreuses occupations ont aimablement accepté de critiquer et d’évaluer ce
mémoire :
Mme BOURGOUGNON Nathalie, Professeur, Université de Bretagne Sud
M HAMEED Sahul, Professeur, Thiruvalluvar University, Inde
M BREUIL Gilles Docteur Vétérinaire Ifremer
M BAGHDIGUIAN Stephen Professeur Université de Montpellier II
M MARQUES Adam Daniel Maître de conférences Université de Montpellier II
M. BONAMI Jean Robert, Directeur de recherche, CNRS, Montpellier
Une pensée émue et chaleureuse est associé à ceux qui m’ont entouré avec leur diversité et
leurs multiples compétences et ont su s’impliquer efficacement dans l’aboutissement de mes
travaux- ici se reconnaîtront : M. Philipe Roch, M. Joannes Sri Widada, Mylène Toubiana,
Valerie Bonnichon, Eva Bidet, Donika Krasteva, Hui Li, Elodie Jublanc, Cinzia Cellura,
Shuyong Zhang, José Melena, Yenelli Cedano et Narjes Hihi.
Je rends hommage à M. Jorge de la Rosa Velez, trop tôt disparu, qui au Mexique m’a orienté
dans cette voie. Sa mémoire reste présente en moi et l’exemple de son action me guidera dans
mon futur professionnel.

Je remercie les membres du service commun de Microscopie Electronique de l’UMII et
particulierment Véronique Richards qui m’ont aide dans mes recherches ainsi que les
membres du plateau technique pour leur aide dans les techniques de Biologie Moléculaire et
de M. Bernard Romestand pour ses conseils sur les techniques d’immuno détection.
Je tiens à souligner que ces travaux ont été financés par une bourse CONACYT-SFERE
(Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexico 165256). Je remercie aussi tous les
membres de la promotion SFERE 2004, pour leurs conseils et les bons moments partagés.
Que ma famille ma mère Rosa Maria, mon frère José Antonio, ma tante Téofila, mon oncle
Pedro et mon cousin Ernesto, trouvent ici la concrétisation de leur soutien dans ce travail que
je leur dédie.
Enfin, ce séjour à Montpellier m’est apparu bien court grâce à la vie chaleureuse que j’y ai
trouvé. Ici le travail intense ne nuit pas à une généreuse convivialité et les différences
apportées par chacun sont un avantage partagé par tous, avec en plus de délicieuses
découvertes organoleptiques.
Si certaines personnes se croient oubliées, qu’elles sachent que cette faute, de ma part,
serait involontaire et que je les remercie au même titre que celles dont je viens de citer l es
noms.

Pa
g
es
Introduction 1
Chapitre I.- Les élevages de crevettes 4
1.- La production de crevettes dans le monde 4
2.- Les systèmes d'élevages 6
2.1.- Elevage extensif 6
2.2.- Elevage semi-intensif 7
2.3.- Elevage intensif 8
2.4.- Cycle de vie de la crevette 8
3.- Les maladies associées aux élevages 10
4.- Stratégies pour réduire la mortalité due au WSSV dans les systèmes de
production 15
4.1.- Sélection génétique 15
4.2.- Protocoles d'élevages 15
Chapitre II.- Les virus étudiés 17
1.- Le WSSV 17
1.1 Les signes cliniques de la maladie 18
1.2 Les hôtes 19
1.3 Distribution géographique 20
1.4 L'agent étiologique 21
1.4.1 Isolation du virus 22
1.4.2 Caractéristiques des virions 22
1.4.3 Les protéines et les gènes 25
1.5 Les méthodes de diagnostic 27
1.5.1 L'histologie 27
1.5.2 Méthodes sérologiques 28
1.5.3 Dot blot et Hybridation in situ (HIS) 29
1.5.4 La réaction de pol
y
mérisation en chaîne
(
PCR
)
30
1.5.5 Autres méthodes de diagnostic 31
1.6 Les voies de transmission de la maladie 32
1.7 Contrôle et prévention de la maladie 32
2.- Le nodavirus de Macrobrachium rosenbergii 36
2.1 La White Tail disease
(
WTD
)
36
2.2 Agents étiologiques de la WTD 37
2.3 L'hôte 38
2.4 Distribution géographique de la maladie 40
2.5 Signes cliniques 41
2.6 Voies de transmission de la maladie 41
2.7 Méthodes de dia
g
nostic 42
2.8 Cultures cellulaires / Développement viral dans les cellules en culture 43

Chapitre III.- Matériel et Méthodes 47
1.- Crevette hôte : Penaeus vannamei 47
2.- Cultures cellulaires 48
3.- Purification des virus 48
3.1 Purification du White Spot Syndrome virus WSSV 48
3.2 Purification du MrNv 49
4.- Infections expérimentales 50
4.1 Infections des crevettes / WSSV 50
4.2 Infection des cellules in vitro MrNv 51
5.- Microscopie 52
5.1 Histologie et coloration 52
5.2 Microscopie électronique à transmission 52
6.-Immunodetection 53
6.1 Immunofluorescence 54
6.2 ELISA (Dosage Immuno-Enzymatique) 54
7.- Techniques de biologie moléculaire 56
7.1 Analyses électrophorétiques 56
7.2 Gels d'agarose dénaturant 56
7.3 Extraction des acides nucléiques 58
7.4 Quantification des acides nucléiques 59
8.-
A
mplification des acides nucléiques 59
8.1 Réaction de pol
y
mérisation en chaîne PCR 59
8.2 RT-PCR 60
8.3 PCR en temps réel 62
9.- H
y
bridation 64
9.1 Marqua
g
e et préparation des sondes WSSV 64
9.2 H
y
bridation en Dot Blot 65
9. 3 H
y
bridation in situ 67
9.4 PCR in situ 69
Chapitre IV.- Susceptibilité de la lignée de poisson SSN1 à MrNv 72
1 Effet cytopathogène (ECP) du MrNV sur la culture cellulaire 73
2 Détection par immunofluorescence 73
3 Evolution des protéines virales 74
4 Evolution de l'ARN viral 75
5 Récupération des virions après infection 79
6 Discussion et conclusion 79
Chapitre V.- Premier stades de l'infection à WSSV 83
1.- Infections et cytopathologie du WSSV 85
2.- Ultrastructure du WSSV 86
3.- Premiers étapes de l'infection par le virus B2 88
4.- La morphogenèse du virus B2 90
5.- Hybridation par Dot blot entre le WSSV et le B2 91
6.- Discussion et conclusion 92
Conclusions générales 96
Publications 101
Bibliographie 102