(RTK) dans des Tumeurs Primitives et Métastases de Cancers
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Séquençage des Récepteurs Tyrosines Kinases (RTK) dans des Tumeurs Primitives et Métastases de Cancers Colorectaux (METACOLO) Etude Pilote Véronique Fafeur, Pierre Michel, Gérard Zalcman mai 2012 2009 Réunion CNO Facteurs de Croissance et Ciblage Thérapeutique 2010 Projet Mécanismes de résistance aux anti-EGFR dans Cancers et Métastases associées Human Kinome 23 000 genes 500 Protein kinases 58 Receptor Tyrosine Kinase (RTK) (Manning et al., Science, 2002) RTK families D’après Lemmon MA, Schlessinger J., Cell 2010 Mutations RTK et Cancer 623 genes, 188 adenocarcinomes pulmonaire 26 gènes fréquemment mutés 9 RTK (EGFR, PDGFRA, ERBB4, EPHA3, EPHA5, KDR, FGFR4, NTRK1, NTRK3) dont 7 RTK nouvellement identifiés Somatic mutations lung adenocarcinoma, Ding et al, Nature, 2008 1970 1980 Identification MET (HGFR) 1990 Cloning KO 2000 2010 2020 Drug Development Human Therapy Hepatocyte Growth Factor / Scatter Factor and MET • Effets marqués sur les cellules épithéliales Survie Prolifération • Dispersion Essentiel pour le développement embryonnaire HGF +/+ +/- -/E14.5 • Morphogenèse Régénération tissulaire chez l’adulte HGF/SF PY PY KINASE CBL P Y K MET PY PY GAB1 grb2 (Bertotti et al. 2009 Sci. Signal) (Birchmeier et al.,Nature Reviews, Molecular Cell Biology, 2003) HGF HGF/SF-MET system involvement in Tumorigenesis and Metastasis http://www.vai.org/met/ Birchmeier, Nat Rev, Molcellbio 2003, rev Giordano, Eur J of cancer 2008, rev HGF TK Sarcoma Hematopoietic Malignancies Other neoplasms HGF HGF TK TK TK TK TK TK Activated MET (1997) Surexpression HGF Carcinoma HGF MET + + + + + + + + + + + + Tumor Bladder Breast Cervical Colorectal Gastric Head and Neck Kidney Liver Lung Pancreas Prostate Thyroid … + + + + + + + + + + + + Rhabdomyosarcoma Osteosarcoma Kaposi’s sarcoma … + + + + + + + Multiple myelomas Lymphoma Adult T cell leukemia … + + + + + + Glioma/ Astrocytoma Mesothelioma Melanoma … + + + + + + + + Metastasis + amplif. amplif. + + + + + + + + amplif. MET mutations in human tumors MET α β 1 2 -V13L -G24E -V136I -Q142X -H150T -E168D -L211W -E221G -L229F -T230M -L238F -R266S -W540X -I638L -∆Exon10 -P791L -I852F 3 4 -I316M -S323G -A347T -E355K -M262T -V370D -N375S -C385T -M431V -N454I -V941L -N948S 1408 C-term -D1398N Boucle P+1 -Y1253D -G1260C -K1262R -M1268T/I -T1275I -V1290L -V1312I -V1333I juxtamembranaire -Q978L -∆Exon14 -G983S/V -R988C -R1000S -P1009S -T1010I -Y1021N -∆Exon15 -S1058P Boucle d’activation -D1246H/N -Y1248H/D/C Légende 1 5 10 Fixation de l’ATP -G1103X -V1110I -H1112L/Y/R/D -N1118Y -H1124D -A1126S -G1137V -Région d’articulation -M1149T -R1166Q -M1178I -T1191I -V1206L -A1209G -L1213V -V1238I MET mutations in human tumors « ALL TISSUES » V136 I SEMA LUNG D370V V136 I D370V E168D N375S E168D N375S L229F M431V L229F M431V S323G N454I S323G N454I IPT JM Kinase Q978L R988C R1000S P1009S T1101I G1137V V1206L Y1253D M1149T L1213V K1262R T1181I L1248C/H/D H1112R/L/Y M1268T/I H1124D V1110I 1390 Q978L R988C R1000S P1009S T1101I 1390 VADS (12%) > liver (5%) > kidney (4%)> lung (2%)> large intestine (1%) MET et Metastases Novel Somatic Mutations of the MET Oncogene in Human Carcinoma Metastases Activating Cell Motility and Invasion Lorenzato,et al, CANCER RESEARCH 62, 7025–7030 (2002) Table 1 Mutation scanning of the MET gene tyrosine kinase domain (tissus congelés) Metastasis Tumor Ovarian carcinoma samples Colorectal carcinoma samples HNSCC samplesb Oral squamous cell carcinoma samples b Papillary thyroid carcinoma samples Medullary thyroid carcinoma samples b Musculo-skeletal tumor samples b 0/48 a 0/6 a 0/15 a 0/12 a 0/12 a 0/20 a 0/40 a 0/ 153 tumors (0 %) Lymph node metastases of HNSCC b Liver metastases of colorectal carcinomas Lung metastases of colorectal carcinomas Liver metastases of breast carcinomas Lung metastasis of an urinary bladder carcinoma Lung metastasis of a clear cell kidney carcinoma Lung metastasis of a squamous cell carcinoma Lung metastasis of a germ cell tumor Lung metastases of fibrosarcomas Lung metastases of melanomas 4/15 0/2 1/2 0/3 0/1 0/1 1/1 0/1 0/2 0/3 d e e e e e e e e e 4/ 15 lymph node metastases (27 %) 2/ 14 lung metastasis (14 %) a Examined by RT-PCR and DS of mRNA corresponding to MET exons 16–19. b These samples have been in part reported in 4 previous studies d Mutated MET sequences found in 10 metastatic nodes from 4 of 15 cases examined by RT-PCR and DS of mRNAs corresponding to exons 16–19. e Examined by both SSCP and PCR followed by DS of SSCP bands. MET Y1253D-activating point mutation and development of distant metastasis in advanced head and neck cancers Pirus Ghadjar, et al .Clin Exp Metastasis 26:809–815 (2009) Méthode: Bloc paraffine, Séq, primers from exon 15, validation FISH Advanced squamous cell carcinoma head and neck cancers (HNSCC) SEMA 152 patients HNSCC (+/-radio/chimio thérapies, 1994-2000) : -> 21 patients ont mutation Y1253D pour MET (14 %) 29 patients (19%) JM ont développé métastases (os, poumon, plèvre) dans les 5 ans de l’étude à distance -> 8 patients ont mutation Y1253D pour MET (28%) Kinase Y1253D 1 0 9 3 Conclusion : MET Y1253D est un facteur indépendant de risque génétique pour le développement de métastases après radiothérapie, pour le cancer HNSCC c-Met gene amplification is associated with advanced stage colorectal cancer and liver metastases. Zhao-Shi Zeng a, et al. Cancer Letters 265 :258–269 (2008) Méthode: tissu congelé, c-MET amplification par PCR-LDR/ exon 15, validation FISH 247 Patients, cancer colorectal 9 patients amplif MET > 3 x (3,6 %) 147 Patients, métastases hépatiques 26 patients amplif MET > 3x (17,7 %) MET et Métastases ? Peu de travaux publiés (6 jusqu’en 2011) métastases de ganglions lymphatiques métastases du cancer colorectal métastases de cancers des voies aérodigestives (VADS ou HNSCC) cancers/métastases d’origine inconnue Peu de tissus étudiés (bien moins que les tumeurs primaires) Séquençages très ciblés (domaine Tyr Kinase) Cependant, MET est souvent retrouvé plus altéré dans les métastases … Strategies to inhibit HGF/SF - MET signaling N K1 K2 K3 K4 anti HGF anti MET L267, AV299 (phase 1), TAK701 AMG102 (phase 2) 0A-5D5, DN30, Onartuzumab (phase 2) Uncleavable proHGF Decoy HGF NK2, NK4 1 Decoy MET SEMA 2 3 4 TK Inhibitors Crizotinib (phase 3) ARQ197 (phase 3) GSK1363089-XL880 (phase 2) Su11274 K252a PHA-665752 Cabozantinib (phase 3) http://www.vai.org/metclinicaltrials/ 1970 1980 Identification Cloning 1990 2000 KO 2010 2020 Human Therapy HER (EGFR) Identification MET (HGFR) Cloning KO Drug Development Human Therapy HER/ ErbB Preferred Low kinase Co-receptor activity Cancer HER Antibodies Cetuximab (erbitux) Pratuzumab (phase 3) Trastuzumab (herceptin) Pertuzumab Vectibis TK Inhibitors Erlotinib (Tarceva) Tykerb Tykerb Canertinib (phase 3) Canertinib (phase 3) EKB 569 (phase 2) Gefitinib (Iressa) 1970 1980 Identification Cloning 1990 2000 KO 2010 2020 Human Therapy HER (EGFR) Patient Resistances Lung Cancer : MET amplification (Engelman J, Science, 2007) EGFR Inhibitor (Gefitinib) Resistance and MET amplification in lung cancers EGFR HGF MET Clinical relevance: Amplification of MET in 22% (4/18) patients with resistance to TKI of EGFR Engelman J, Science, 2007 Anti-EGFR resistance in colorectal cancer EGF EGF RAS PI3K K K PTEN RAF V600E PTEN RAF MEK AKT RAS PI3K ERK Downstream effectors activation -> Resistance anti-EGFR MEK AKT ERK Resistance anti-RAF -> need combination therapy with anti-EGFR Prahallad et al, Nature 2012 Anti-EGFR resistance in colorectal cancer EGF EGF RAS PI3K K K PTEN RAF V600E PTEN RAF MEK AKT RAS PI3K ERK Downstream effectors activation -> Resistance anti-EGFR MEK AKT ERK Resistance anti-RAF -> need combination therapy with anti-EGFR Prahallad et al, Nature 2012 2011 Etude-pilote Séquençage des RTK dans des Tumeurs Primitives et Métastases de Cancers Colorectaux (METACOLO) TISSUS ? Février 2011 Métastases hépatiques issues du cancer colorectal, non annotées : 476 (Tumorothèques : F. Galateau-Sallé, Caen, MC Copin, Lille, JC Sabourin Rouen) Tissus congelés provenant d’un même patient et naïf de traitement Trio Sain: Intestin Cancer: Adénocarcinome colorectal Métastases: Hépatiques issues du cancer colorectal Recrutement attachée de recherche clinique, ARC : Charline Frandemiche/ 6 mois TISSUS Juin 2011 Tissus congelés provenant d’un même patient et naïf de traitement Trio Sain: Intestin Cancer: Adénocarcinome colorectal Métastases: Hépatiques issues du cancer colorectal -Trios Stricts : 8 -Trios Non Stricts : 8 dont 3 cas avec traitement adjuvant avant chirurgie de la métastase ( folfox+ avastin, folfiri+ avastin, xelox+ erbitux) 16 trios (48 échantillons) Liste de gènes : 58 RTK et 4 contrôles RTK COSMIC, Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/: Colorectal cancer MACC1 : Metastasis-associated in colon cancer-1 (Stein, Nature, 2009) Séquençage des exons des 62 gènes M. Figeac, plate-forme de séquençage du CNO, Lille Extraction de l'ADN (réalisées par les 3 tumorothèques) 62 gènes : séq. de 200 kb, design et commande des oligonucléotides (Agilent) Fragmentation de l'ADN Ligation des adaptateurs tronqués Sélection des fragments par la taille Enrichissement par hybridation en solution (SureSelect Agilent MP1) Amplification des fragments obtenus Pool des ADN Séquençage haut débit sur le SOLiD 4 , Applied Biosystem (couverture de 500x). Perspectives Analyses de séquençage : Statut des mutations de RTK dans les cancers vs les métastases Thème fédérateur pour les cliniciens, anatomopathologistes et chercheurs des sites de Rouen, Caen et Lille Mise en place de cohorte prospective pour l’étude de mécanismes de résistance aux anti-EGFR
