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AGREGATION
DE
BIOCHIMIE – GENIE BIOLOGIQUE
CONCOURS EXTERNE
Session 2005
TRAVAUX PRATIQUES
DE
BIOCHIMIE – PHYSIOLOGIE
ALCOOL ET FOIE
L’éthanol, psychotrope puissant, est absorbé passivement dans l’intestin puis emprunte la
veine porte vers le foie, siège principal de son métabolisme. L’espace de diffusion de l’alcool
est voisin de celui de l’eau, de l’ordre de 65% du poids corporel chez l’homme.
Le métabolisme de l’alcool se fait essentiellement (95%) au niveau du foie. Le métabolisme
extra-hépatique est réalisé par voies urinaire, alvéolaire, cutanée et salivaire.
La détoxification de l’éthanol chez les mammifères est assurée par les activités enzymatiques
« alcool déshydrogénase ». Dans le foie, il existe deux activités « alcool déshydrogénase »
principales, l’une prépondérante, cytosolique, est assurée par les isoformes de l’alcool
deshydrogénase, enzyme à zinc (ADH : Ethanol-NAD+-oxydoréductase (EC 1.1.1.1), et
l’autre, membranaire, par les cytochromes P450 (CYP2E1) dépendants du NADP+.
Le sujet propose lors de cette séance de travaux pratiques :
- l’étude du mécanisme réactionnel et de quelques aspects structuraux et fonctionnels de
l’ADH de foie de cheval ;
- la mise en évidence des effets sur la fonction « alcool déshydrogénase » hépatique après
une intoxication aiguë provoquée par cette molécule chez la souris.

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1. Thermodénaturation de l’ADH
1.1. Thermodénaturation de l’ADH en absence des substrats
Préparer quatre tubes à hémolyse avec bouchons contenant :
- 20 µL de solution d’ADH
- 1000 µL de tampon
Incuber 0, 3, 6 et 9 minutes en bain thermostaté à 75°C.
Transférer ces tubes en glace fondante.
Pré-incuber deux minutes à 30°C.
Ajouter 100 µL de solution de NAD+.
Démarrer la réaction par ajout de 100 µL d’éthanol
Après une minute exactement d’incubation à 30°C introduire 2 mL d’une solution d’urée
saturée et préchauffée à 75°C, puis transférer cinq minutes dans la glace.
Equilibrer en température dix minutes minimum à température ambiante, lire les absorbances
à 340 nm en cuve pour spectrophotométrie UV contre un témoin de compensation
convenable.
1.2. Thermodénaturation de l’ADH en présence des subtrats
1.2.1. Thermodénaturation de l’ADH en présence d’éthanol
Préparer quatre tubes à hémolyse avec bouchons contenant :
- 20 µL de solution d’ADH
- 1000 µL de tampon
- 100 µL d’éthanol
Incuber 0, 3, 6 et 9 minutes en bain thermostaté à 75°C.
Transférer ces tubes en glace fondante.
Pré-incuber deux minutes à 30°C.
Démarrer la réaction par ajout de 100 µL de solution de NAD+.
Après une minute exactement d’incubation à 30°C introduire 2 mL d’une solution d’urée
saturée préchauffée à 75°, puis transférer cinq minutes dans la glace.
Equilibrer en température dix minutes minimum à température ambiante, lire les absorbances
à 340 nm en cuve pour spectrophotométrie UV contre un témoin de compensation
convenable.
1.2.2. Thermodénaturation de l’ADH en présence de NAD+
Préparer cinq tubes à hémolyse avec bouchons contenant :
- 20 µL de solution d’ADH
- 1000 µL de tampon
- 100 µL de solution de NAD+

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Incuber 0, 3, 6 et 9 minutes en bain thermostaté à 75°C.
Transférer ces tubes en glace fondante.
Pré-incuber deux minutes à 30°C.
Démarrer la réaction par ajout de 100 µL d’éthanol.
Après une minute exactement d’incubation à 30°C introduire 2 mL d’une solution d’urée
saturée préchauffée à 75°C, puis transférer cinq minutes dans la glace.
Equilibrer en température dix minutes minimum à température ambiante, lire les absorbances
à 340 nm en cuve pour spectrophotométrie UV contre un témoin de compensation
convenable.
Réactifs
• Tampon Gly pH 8,8
ß - glycine 100 mmol.L-1
ß - EDTA 0,25 mmol.L-1
ß - KCl 40 mmol.L-1
• NAD+40 mmol.L-1 en solution aqueuse
• ADH Solution aqueuse d’ADH de foie de cheval
• Ethanol 174 mmol.L-1 en solution aqueuse
• Urée Solution saturée
1.3. Compte rendu
- Indiquer et justifier la composition du témoin de compensation.
- Présenter l’ensemble des résultats expérimentaux sous forme d’un tableau.
- Exploiter ces résultats à l’aide d’une représentation graphique.
- Déterminer la constante de vitesse de dénaturation dans chacun des cas.
- Analyser et interpréter l’ensemble des résultats.
2. ADH et spécificité de substrats
Tester successivement l’activité ADH sur les quatre substrats proposés selon le protocole ci-
dessous.
2.1. Mode opératoire
Introduire en tubes à hémolyse :
- 20 µL de solution d’ADH
- 1000 µL de tampon
- 100 µL de solution de NAD+
Pré-incuber deux minutes à 30°C.
Démarrer la réaction avec 100 µL de substrat.
Après une minute exactement d’incubation à 30°C, introduire 2 mL d’une solution d’urée
saturée préchauffée à 75°C, puis transférer cinq minutes dans la glace.

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Equilibrer en température dix minutes minimum à température ambiante, lire les absorbances
à 340 nm en cuve pour spectrophotométrie UV contre chacun des témoins de compensation
convenables.
Réactifs
• Tampon gly pH 8,8
ß - glycine 100 mmol.L-1
ß - EDTA 0,25 mmol.L-1
ß - KCl 40 mmol.L-1
• NAD+40 mmol.L-1 en solution aqueuse
• ADH Solution aqueuse d’ADH de foie de cheval
• Méthanol 174 mmol.L-1 en solution aqueuse
• Ethanol 174 mmol.L-1 en solution aqueuse
• Propanol-1 174 mmol.L-1 en solution aqueuse
• Propanol-2 174 mmol.L-1 en solution aqueuse
• Butanol-1 174 mmol.L-1 en solution aqueuse
• Urée Solution saturée
2.2. Compte rendu
Indiquer et justifier la composition des témoins de compensation.
Présenter les résultats sous forme de tableau.
Analyser et interpréter les résultats obtenus.
3. Influence de l’orthophénanthroline sur l’activité ADH
3.1. Mode opératoire
Préparer six tubes à hémolyse avec bouchons selon le tableau ci-dessous :
Tubes
1
2
3
4
5
6
Tampon gly (µL)
1000
1000
1000
1000
1000
1000
ADH (µL)
20
20
20
20
20
20
NAD+ (µL)
100
100
Ethanol (µL)
100
100
Orthophénanthroline (µL)
20
20
20
H2SO4 (µL)
20
20
20
Prévoir deux témoins de compensation, un témoin pour les tubes 1, 3, 5 et un témoin pour les
tubes 2, 4, 6.
Boucher hermétiquement les tubes.
Incuber chaque tube deux heures à 30°C.
Mesurer l’activité enzymatique résiduelle selon les protocoles ci-dessous.
Tubes 1 et 2
Ajouter 100 µL de solution de NAD+.

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Démarrer la réaction par ajout de 100 µL d’éthanol.
Après une minute exactement d’incubation à 30°C, introduire 2 mL d’une solution d’urée
saturée préchauffée à 75°C, puis transférer cinq minutes dans la glace.
Après dix minutes minimum à température ambiante, lire les absorbances à 340 nm en cuve
pour spectrophotmétrie UV contre un témoin de compensation convenable.
Tubes 3 et 4
Démarrer la réaction par ajout de 100 µL d’éthanol.
Après une minute exactement d’incubation à 30°C, introduire 2 mL d’une solution d’urée
saturée préchauffée à 75°C, puis transférer cinq minutes dans la glace.
Après dix minutes minimum à température ambiante, lire les absorbances à 340 nm en cuve
pour spectrophotmétrie UV contre un témoin de compensation convenable.
Tubes 5 et 6
Démarrer la réaction par ajout de 100 µL de solution de NAD+.
Après une minute exactement d’incubation à 30°C, introduire 2 mL d’une solution d’urée
saturée préchauffée à 75°C, puis transférer cinq minutes dans la glace.
Après dix minutes minimum à température ambiante, lire les absorbances à 340 nm en cuve
pour spectrophotométrie UV contre un témoin de compensation convenable.
Réactifs
• Tampon gly pH 8,8
ß - glycine 100 mmol.L-1
ß - EDTA 0,25 mmol.L-1
ß - KCl 40 mmol.L-
• NAD+40 mmol.L-1 en solution aqueuse
• ADH Solution aqueuse d’ADH de foie de cheval
• Ethanol 174 mmol.L-1 en solution aqueuse
• Orthophénanthroline 50 mmol.L-1 en solution H2SO4 à 50 mmol.L-1
• H2SO450 mmol.L-1 en solution aqueuse
3.2. Compte rendu
- Indiquer et justifier la composition des deux témoins de compensation utilisés.
- Interpréter l’ensemble des résultats expérimentaux et conclure.