production d`interleukine-2 et de "granulocyte

WILKINSON NARCISSE
EFFETS DES LIQUIDES ALLANTOÏDIENS PORCINS SUR LA
PRODUCTION D'INTERLEUKINE-2 ET DE "GRANULOCYTEMACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR" PAR DES
LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE EN CULTURE
Mémoire
présenté
à ta faculté des études supérieures
de IUniversité Laval
pour l'obtention
du grade de maître ès sciences (M-Sc.)
Département des sciences animales
FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
@WilkinsonNarcisse, 1998
1+1
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En periode de péri-implantation chez le porc, plusieurs pertes embryonnaires sont
observées. Pour des raisons tant économiques que scientifiques la compréhension des
mécanismes impliques est donc importante. L'objectif de cette étude est d'évaluer la
concentration de facteurs immunomodulateurs (PGE2, TGFB2) présents dans des liquides
embryonnaires prélevés en début de gestation et de corréler ces valeurs avec des marqueurs de la
réponse immunitaire. Des PBL humains furent récoltés et cultivés en présence de liquides
allantoïdiens. L'incorporation de [3H]thymidine ainsi que la production dTL-2 et de GM-CSF
ont été quantifiées. Les concentrations de PGE2 sont significativement plus élevées en jours 2224, comparativement au jour 30. Tous les échantillons de liquides allantoïdiens testh inhibent la
production d'IL-2, mais leur effet sur la production de GM-CSFest cependant très variable. Le
reaai t de la PGE2 réduit significativement I'effect inhibiteur des liquides dantoïdiens. En jours
22-24, une forte corrélation est observée entre les concentrations de PGE2 et les deux marqueurs
de la réponse immunitaire étudiés. Par contre, au jour 30, aucune corrélation n'a pu être
obtenue. Ces résultats suggèrent que le liquide allantoïdien porcin peut moduler la réponse
immune et que la PGE2 dans ces liquides embryonnaires (jours 22-24) est en partieresponsable
de cet effet.
Raymonü Lambert
AVANT-PROPOS
Je tiens tout d'abord à remercier le Dr. Raymond Lambert, mon directeur de recherche, qui
m'a si aimablement accueilli dans son laboratoire. Par sa grande disponibilité il a su gagner mon
respect et ma plus profonde admiration. Les judicieux conseils et les encouragements qu'il m'a
prodigués m'ont été très profitables pour la réalisation de mon projet de recherche. La passion
qu'il démontre pour son travail restera pour moi un modèle à suivre.
Ma reconnaissance s'adresse également à mon CO-directeur,le Dr. Jean-Paul Laforest, pour
sa grande disponibilité et le support apporté lors de la rédaction des articles scientifiques. De
plus, j'aimerais remercier le Dr. Jacques Matte pour nous avoir si généreusement fournis les
liquides allantoïdiens essentiels à la réalisation de ce projet et également pour ses pertinents
commentaires.
Je profite aussi de l'occasion pour remercier toute l'équipe du laboratoire et plus
particulièrement mes collègues de travail, Vincent Érnond qui par sa gentillesse a su rendre mon
séjour au laboratoire des plus agréable ainsi que Marylène Fortin qui a facilité la réalisation de
mon projet en me léguant ses techniques et ses derniers travaux de recherche.
J'exprime aussi mes remerciements à Mme Lise Lacouline pour l'aide apportée lors de la
réalisation des techniques d'ELISA et des différents dosages effectués durant cette étude ainsi
qu'à Grant Vandenberg pour la revue de mes articles scientifiques. Je m'en voudrais d'oublier
Mlle Annie Chamberland ma meilleure amie et confildente pour sa grande générosité et son
support moral.
CHAPïlXE 3: Effet modulateur de la PGE2 et du TGFh des liquides allantoïdiens
porcins prélevés en début de gestation. sur la production d'IL-2 et de GM-CSF par
les lymphocytes du sang périphérique.................................................... -22
3.1 Résumé ........................................................................... 23
3 . 2 Abstract ..........................., ................................................ 24
3.3 Introduction ..................................................................... -26
3.4 Materials and methods ......................................................... -27
3 .4.1 Animals .............................................................. -27
3.4.2 Collection of porcine allantoic fluid................................ 27
................28
3.4.3 Preparation of lymphocytes .....................
.
3.4.4 CeIf culture ............................................................ 30
3.4.5 Anti-PGE2 affinity column ........................................- 3 0
3.4.6 Fmrnunoassays ................................................... 3 1
3.4.7 Statistical analysis .................................................... 31
3.5 ResuIts ............................................................................ 32
3.5.1 Concentration of PGE2 and TGFp2 in porcine allantoic fluid ..32
3.5.2 Effect of pig allantoic fluid on IL-2 and GM-CSF production . 33
3.5.3 PGE2 in allantoic fluid is partly responsible for the inhibition of
...............................36
IL-2 and GM-CSF production ..........
.
3.6 Discussion ...................................................................... - 4 1
3.6.1 PGE2 and cytokine production ..................................... 41
3.6.2 PGE;!and embryonic quality ....................................... 43
3.7 Acknowledgments .............................................................-44
3.8 References ...................................................................... -45
4: Discussion générde ........................................................ 50
LISTE DES OUVRAGES CITÉS.......................................................... 54
ANNIEJE A .................................................................................. -67
LISTE DES ABRÉVIATIONS
OC:degré centigrade
Ci: curie (i.e., Ci/rnrnol)
C M . :complexe majeur d'histocompatibilité
Con A: concanavaline A
CPM: comptes par minute
CSF: colony stimulating factor
ELISA: enzyme linked imrnunosorbent assay
FBS: fetal bovine serum
FïîC: fluorescein isothiocyanate
GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor
GMG: granulated metriai gland cells
HBSS: Hank's balanced salt solution
HLA: human lymphocyte antigen
ICAM: Intracellular Cell Adhesion Molecule
INF:interféron
IL-2: interleukine-2
LAK: lymphokine activated M e r
LGL: large granular lymphocytes
jd: microlitre
p:
micromolaire
mM: miholaire
NK:natural killer
nm: nanomètre
NS : cellules non-stimulées
PBL: penpheral blood lymphocytes
pg: picograrnrne (i.e., pg/ml)
PG: prostaglandine (i.e., PGE2)
vii
SEM: standard error to the mean
TCR:récepteur des lymphocytes T
TGF: transforming growth factor (Le., TGFp2)
Th: cellule T auxiliaire
[3~]~hymidine:
thymidine marquée au tritium
TNF:tumor necrosis factor
viii
CISTE DES TABLEAUX
Table 1 Concentrations of PGE2 and TGFb2 in porcine allantoic fluid from
Day 22-24 and Day 30 of gestation. ...-..----......-.--........-.......................-.
32
LISTE DES FIGURES
Figure A Schéma des différentes phases de l'implantation.. ............................ - 4
Fimire 1 Effects of porcine allantoic fluid on [3H]thymidine incorporation
in homologous conditions as compared to heterologous conditions ..................-29
Figure 2 Effects of porcine allantoic fluid collected on Day 22-24 or Day
30 of gestation, on [3H]thymidine incorporation and production of IL-2
and GM-CSF by human lymphocytes in vitro. ......................................... .34
Figure 3 Inter-expenment variations of [3H]thymidine incorporation (A)
and IL2 (B)and GM-CSF(C) production by lymphocytes after treatment
with aLlantoic fluid (final concentration 22.2%, (v/v)). ................................-35
Figure 4 Treatrnent of lymphocytes with porcine allantoic fluid collected
on Day 22-24 of gestation (final concentration 22.296, (v/v)) adsorbed on
an anti-PGE2 flrnity colurnn. ............................................................ -37
Fimire 5 Conelation between PGE2 concentrations and [3H]thymidine
incorporation. ................................................................................ - 3 9
Figure 6 Correlation between PGE2 concentrations and IL-2 production
by human lymphocytes in vitro. .......................................................... -40
Annexe A
Fimire 1 Pre-treatment effects of porcine allantoic 8uid collected at Day
22-24, on [3H]thymidine incorporation and production of GM-CSFby
human lymphocytes in virro. .............................................................. .68
Figure 2 Effects of porcine dlantoic fluid on [3HJthymidineincorporation,
the percentage of CD4 positive cells was evaluated and on the CD4
membrane expression. ......................................................................
69
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Durant la gestation, les cellules trophoblastiques de I'embryon sont en contact intime
avec les cellules immunitaires présentes dans l'utéms. Les cellules trophoblastiques sont
exposées aux lymphocytes T, aux macrophages ou aux cellules "natural killer" (NK). Les
embryons ayant hérité autant d'antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH)
paterne1 que maternel, et étant en contact intime avec les tissus maternels utérins, sont donc
considérés comme des étrangers (semi-allogreffes) dans l'utérus gestant. Chez les animaux tout
comme chez l'homme, le non rejet automatique de l'embryon constitue un "paradoxe
reproductif" très fascinant. Cependant, plusieurs espèces animales démontrent de fortes
proportions d'avortements spontanés ou de mortalités embryonnaires (Gendron et Baine, 1988;
Baine et Gendron, 1993). Chez l'humain l'efficacité reproductive se situe entre 20 et 30% et il a
été estimé qu'entre 24 et 47% des conceptions échouent dans les premiers 28 jours de la
gestation (Wilcox, 1983). Chez le porc, une proportion de 30 2 40% de la mortalité
embryonnaire survient en début de gestation, soit avant le 30 i'm jour. Ces insuccès reproductifs
pourraient être expliqués par différents facteurs infectieux, endocriniens ou d'ordre génétique;
par contre, plusieurs recherches tendent à démontrer que la survie embryonnaire pourrait être
reliée à certaines anomalies des relations immunitaires materno-foetales pouvant survenir à tous
les stades de la gestation.
Ainsi, les pertes embryonnaires pourraient être reliées précocement, à une défaillance des
mécanismes de reconnaissances nécessaires à l'induction d'une irnmunoprotection locale qui se
manifesterait par une réaction immunitaire agressive contre l'embryon ou plus tardivement à un
défaut d'immunorégulation. Les réactions immunitaires impliquées pourraient être de type
cellulaire comme de type humorale. Malgré un rôle certain des réactions à médiation humorale
(phénomène de facilitation immunitaire) dans le maintien de la gestation, divers travaux semblent
attribuer à I'immunité à médiation cellulaire, la responsabilité des réactions immunitaires
maternelles indésirables. Ceci s'effectue, par le biais des lymphocytes T cytotoxiques
normalement responsables des rejets de tissus allogéniques (Billington, 1989). I1 a été démontré
que des neutrophiles, des macrophages et des lymphocytes colonisent largement la lumière
utérine après que des allogreffes cutanées aient été placees Di zitero (Beer et Billingham, 1976).
Les implications immunologiques de Ia colonisation leucocytaire furent décrites chez différentes
espèces à placentation hémochoriale (Hunt, 1994) comme les rongeurs et Ies humains, chez qui
les cellules trophoblastiques baignent dans le sang maternel et sont en contact direct avec les
cellules immunes. Par contre, très peu d'études parlent des implications immunologiques chez
les espèces à placentation épithéliochoriale comme le porc, chez qui le contact des cellules
trophoblastiques avec le sang maternel est beaucoup moins intime (Figure A).
Certains facteurs, dont la PGE2 et le TGFP2, retrouvés à l'interface foeto-maternelle et
possédant des propriétés immunosuppressives, furent largement étudiés dans la littérature. Des
études ont démontré que lorsque des cellules NK munnes activées à l'IL-2 étaient traitées à la
PGE2, elles cessaient de proliférer et devenaient plus granulaires et moins cytolytiques
(Linnemeyer et Pollack, 1993). De plus, il fut démontré que le liquide blastocoelique de lapin
occasionnait une réduction de l'activité cytolytique des cellules M( (Ouellette et al., 1997) et que
cette diminution est associée à la présence de PGE2. Une "down regulation" du pourcentage de
cellules CD4+ (lymphocytes T), ainsi qu'une diminution du nombre de récepteurs CD4+
(Ouellette et al., 1997) furent aussi observées et associées à la présence de TGFP;?dans le Liquide
blastocoelique de lapin. Finalement, le TGF$2 semble être un facteur immunosuppresseur
impliqué dans la survie foetale, puisque des études chez l'humain, révèlèrent que les cellules
CD56+ de la décidue produisaient du TGF$2 (Clark et al., 1994), et l'absence de production de
TGFp2 par ces cellules suppressives fut corrélée aux avortements spontanés récurrents (Lea et
aI., 1995).
L'étude des principales populations cellulaires présentes dans l'utérus gestant ainsi que
des différents facteurs qu'elles produisent, semble apporter quelques explications au phénomène
de mortalité embryonnaire. Cependant, les raisons pour lesquelles certains embryons sont plus
vulnérables que d'autres au rejet immunitaire demeurent toujours obscures. Cette étude visera
donc à déterminer les concentrations de facteurs immunosuppresseurs (TGFP2 et PGE2)
présents dans différents liquides ailantoïdiens porcins et cherchera à évaluer Les effets de ces
liquides embryonnaires sur la réponse immunitaire cellulaire maternelle. En fait, nous vérifierons
les effets des différents liquides embryonnaires sur certaines fonctions du lymphocyte T dont: 1)
la prolifération cellulaire; 2) la production d'IL-2; 3) la production de GM-CSF; ainsi que 4)
I'expression membranaire des récepteurs CD4; et 5) le pourcentage de cellules CD4+. De plus,
nous tenterons d'établir un lien entre la présence des facteurs immunosuppresseurs étudiés et
l'effet que pourraient avoir les liquides embryonnaires porcins sur les différentes fonctions
immunitaires à l'étude. Ainsi, l'objectif global de cette démarche de recherche est la
caractérisation des différents mécanismes irnmunologiques pouvant être impliqués lors de la
reproduction des truies nullipares, a f h de mieux comprendre le phénomène de mortalité
embryonnaire retrouvé en début de gestation chez cette espèce animale.
I
placenta EPfTHEUO-CHORIAL
Le disque embryonnaire est arbitrairlocaiist au pble oppose au sice
d'implanlarion. ** :Ce stade est la phase Ututte de I'implantotion dans les
espCces épithélw-chorides.
Figure A: Schéma des différentes phases de I'implantation (Guillomot et al., 1991).
CHAPITRE 2
REVUE DES TRAVAUX ANTÉRIEURS
Avant de présenter les types ceIlulaires ou Ies facteurs impliqués et /ou responsables des
différents phénomènes reliés aux avortements spontanés ou à la mortalité embryonnaire, voyons
les caractéristiques de l'embryon qui pourraient occasionner une induction de la réponse
immunitaire maternelle.
2.1 Antigénicité de I'embryon
De plus en plus d'études sont axées sur la compréhension des mécanismes à l'origine de
la tolérance du foetus. La compréhension de tels mécanismes devrait offrir des perspectives
intéressantes quant aux solutions à apporter aux problèmes de Ia mortalité embryonnaire. Nous
savons que le "conceptus" est protégé par le placenta, qui lui sert de barrière anatomique. Le
trophoblaste représente la portion du placenta ayant un contact étroit avec les tissus maternels. Le
trophoblaste pourrait-il être une barrière de protection neutre pour le "conceptus"? Cette
hypothèse a été soulevée il y a quelques années (1954) par Sir Peter Medawar, chercheur anglais
et gagnant du prix NobeI de médecine pour ses travaux sur la tolérance immunitaire (Chaouat,
1993). Depuis, plusieurs chercheurs se sont intéressés à la question. Tout comme n'importe
lequel individu, le foetus possède des marqueurs du soi à la surface de ses cellules. Ces
marqueurs sont très variables d'un individu à l'autre et viennent généralement de la mère comme
du père. Le foetus possèdera aussi à la surface de ses celIules des antigènes qui lui seront
propres ("Tissue-specific antigènes"). On appelle communément ces marqueurs, les antigènes
d'histocompatibilité (0
et ils sont en quelque sorte les empreintes du sujet. Il existe deux
types d'antigènes d'histocompatibilité; les antigènes de classe 1 (CMH I) et de classe II (CMH
II). Chez l'humain, les CMH 1 sont appelés HLA-A et HLA-B tandis que les CMH II sont
appelés HLA-DR. Chez le porc, le complexe est divisé égaiement en classe 1et IL Les classes 1
sont nommées SLA-A (Swine Lymphocyte Antigen-A), B et C et les classes II, SLA-D (Koch,
1985).
Ce sont ces marqueurs du soi qui deviennent la cible des anticorps ou des cellules
effectrices lors d'une réaction immunitaire initiée contre un tissu étranger (comme dans le cas
d'une greffe par exemple). Chez le rat, il a été démontré que des antigènes de classe 1 sont
exprimés à la surface des cellules trophoblastiques et ces dernières peuvent ainsi initier une
réponse immunitaire maternelle (Smith et al., 1982). Chez la souris, la présence d'antigènes de
classe 1( H-2K et D) fut observée sur les celluIes du spongiotrophoblaste du placenta. Ceux-ci
sont en contact direct avec la circulation maternelle (Ellington, 1987, Chaouat, 1993)-Une autre
étude, faites à partir d'anticorps monoclonaux, démontre que chez le porc, certains antigènes
spécifiques sont retrouvés sur les membranes des tissus trophoblastiques (Whyte et al., 1984).
Il est bien démontré que ces antigènes sont retrouvés sur le bord des microvilosités du
trophectoderme et qu'ils sont absents de nombreux autres tissus porcins aussi bien que des
trophoblastes d'autres espèces animales. Chez I'humain, le cytotrophoblaste extravilleux
exprime une fome particulière d'antigènes de classe 1 tronqués qui, contrairement aux antigènes
de classe 1 classiques, sont peu polymorphes. Ces antigènes ont 86% d'homologie avec les
CMH classique et sont communément appelés les "human leukocytes Antigen-G" ou HLA-G
(Billington et Burrows, 1986; Ellis, 1990). Le poids moléculaire de la chaîne lourde de cette
molécule est de 39KDa, comparativement aux antigènes de classe 1classique, qui ont un poids
de 44KDa.
Les celhIes foetales portent donc de toute évidence à leur surface, les structures cibles
requises à la réactivité du système immunitaire maternel. Par contre différents mécanismes
semblent présents afin de diminuer la réactivité des cellules foetales au système immunitaire
maternel. Un effet protecteur fut démontré lorsque l'expression de I'HLA-G est élevée sur les
cellules. Cette donnée est supportée par le fait que 1'IFNy peut induire, in vitro, l'expression
d'antigènes de classe I tronqués (HLA-G) sur des cellules trophoblastiques humaines normales
de même que sur la lignée JEG-3 (choriocarcinome), ce qui augmente leur résistance à l'activité
cytolytique des cellules déciduales activées à l'IL-2 (King et Lake, 1990). De plus, il y aurait
une régulation à la baisse de I'expression des antigènes de classe I et II classiques sur les cellules
placentaires ayant un contact direct avec la circulation matemelie. Ce contrôle de l'expression des
antigènes de classe I fut démontré sur les cellules cytotrophobIastiqueshumaines et semble être
d'ordre transcriptionnel ou post-transcriptionne1 (Kawata et al., 1984). Finalement, d'après une
étude chez le porc, différentes substances d'origine placentaire ou différentes macromolécules
d'origine maternelle (Koch, 1985), serviraient à réduire l'immunogénicité des marqueurs
antigéniques retrouvés à la surface des cellules trophoblastiques placentaires.
Malgré la présence de mécanismes, à l'interface foeto-maternelle servant à diminuer
l'immunoréactivité du système immunitaire face aux cellules embryonnaires, les phénomènes
d'avortements spontanés et la mortalité embryonnaire sont toujours très élevés, ceci chez
différentes espèces animales. L'antigénécité de l'embryon est donc bien présente et l'unité foetoplacentaire n'a donc nu1 autre choix que d'être conf?ontée aux cellules immunitaires maternelles.
2.2 Les cellules immunitaires présentes durant la gestation
Le système immunitaire des vertébrés est constitué de cellules ayant les caractéristiques
de reconnaître et détruire tout ce qui est considéré comme du non-soi par rapport à l'individu.
L'appareil reproducteur n'échappera donc pas à cette surveillance immune et on notera la
présence de nombreuses cellules hématopoïétiques, principalement des lymphocytes, des
macrophages ou des ceIluIes "naturd killer" (NK), dans le stroma utérin des mamrniferes. La
présence de ces cellules semble être une propriété générale de l'utérus non-gestant, gestant et
même pseudogestant (Hunt, 1994). Par contre certaines modifications au niveau des populations
cellulaires surviendront au cours du processus de gestation.
2.2.1 Les Lymphocytes
Il existe deux types de lymphocytes remplissant des fonctions distinctes: les celIules T et
les cellules B. Les cellules d'une troisième population de lymphocytes, encore mal connue, sont
appelées cellules "non-T, non-B" ou cellules nulles. En général, les lymphocytes sont
morphologiquement identiques et se distinguent par leurs fonctions et l'assemblage des protéines
de surface qui leur servent de carte d'identité. Les lymphocytes T quant à eux, jouent un rôle
particulièrement central dans l'initiation des réponses immunitaires spécifiques.
Les lymphocytes T sont considérés comme étant les chefs d'orchestre de la réponse
immunitaire. Ils seront les premiers à être activés, en réponse à un antigène présenté en
association avec une molécule du CMH d'une cellule présentatrice d'antigène (CPA). Plusieurs
récepteurs, contre-récepteurs ou molécules d'adhésion (LFA-ICAM) présents à la surface des
deux cellules seront alors nécessaires afin de permettre la stabilisation de L'interaction cellulaire,
qui déclenchera ensuite une cascade de seconds messagers impliqués dans la transduction des
signaux. La spécificité de reconnaissance de l'antigène par le lymphocyte T lui est conférée par
son récepteur communément appelé "T ce11 receptor" ou TCR,ayant un poids moléculaire
d'environ 80 kDa. La transmission de signaux intracellulaires qui suivra I'activation du
lymphocyte, induira I'activation des gênes responsables de la production de diverses cytokines
telles; l'IL-2, -3, -4, -5, -6 et -10. Les gènes reliés à certains facteurs de croissance comme le
"granulocyte-macrophage colony-stimulating factor" (GM-CSF) ou autres molécules telles le
"tumor necrosis factor a" (TNFu) et l'interféron y ( I W y ) , pounont aussi être exprimes suite à
I'activation du lymphocyte T. Ces cytokines serviront de messagers paracriniens et endocriniens
qui agiront sur d'autres leucocytes et même sur des tissus non immuns. Elles auront des effets
de contrôle de la prolifération cellulaire, la différenciation et la fonction de certaines cellules. Il
est à noter qu'une cytokine peut avoir des effets multiples sur une même cellule cible (action
pléiotrope) et que plusieurs cytokines peuvent avoir des fonctions identiques (effet redondant).
L'IL-2est une des cytokines clé de la communication intercellulaire. Elle pourrait être
considérée comme la baguette principale du chef d'orchestre puisqu'elle est produite par les
lymphocytes T et qu'elle est au centre de l'orchestration de la réponse immune. Cette
glycoprotéine de 15.5 kDa est associée à une foule d'activités du système immunitaire telles
l'auto-activation, I'activation et la prolifération des lymphocytes T, I'activation de cellules
"natural killer" (NK) en cellules "lymphokine-activated killer" (LM)(Drake et Head, 1989),
ainsi que l'expansion clonale et la différenciation des lymphocytes B. De plus, cette cytokine
peut agir sur de muItipIes cellules portant le récepteur à l'IL-2, pour permettre la synthèse
d'autres cytokines telles le TNFa, le facteur de croissance des cellules B (BCGF-1) et
l'interféron gamma m y ) .
Deux grands groupes de lymphocytes T effecteurs peuvent être activés lors d'une
stimulation antigénique: les lymphocytes T auxiliaires (T.& et les lymphocytes T cytotoxiques
CT,). Pour ce faire, les antigènes doivent être intemalisés par la cellule présentatrice d'antigènes
(CPA), réduits à l'état de peptides dans les lysosomes, et présentés à la surface de la CPA en
association avec la molécute du CMH. Les lymphocytes TH sont activés suite à la
reconnaissance par leur complexe récepteur (TCWCD3/CD4+), de I'association peptidemolécule de classe II. Cette reconnaissance conduira à la prolifération du lymphocyte T et à la
sécrétion de cytokines tel que décrit plus haut. Les TH représentent une sous-population
caractérisée par Ia présence du marqueur CD4 chez l'homme et L3T4 chez la souris (Male et al.,
1985). La molécule de CD4 se fixe à la molécule du CMH de classe II de la cel1ule présentah-ice
d'antigène afïm de renforcer les interactions entre les deux cellules. Les lymphocytes Tc quant à
eux, représentent le deuxième mécanisme effecteur majeur de la réponse immunitaire cellulaire.
Les cellules Tc, seront elles aussi activées par la reconnaissance du complexe peptide-molécule
du CMH. Par contre, l'interaction se fera avec une molécule du CMH de classe I et le complexe
récepteur impliqué dans la liaison sera TCR/CD3/CD8+ (Cresswell, 1994). Les lymphocytes Tc
seront impliqués lors d'interactions impliquant la présence de protéines virales ou d'antigènes
endogènes. On qualifiera la réaction immunitaire impliquée de "réponse à médiation cellulaire".
2.2.1.2 Les Lymphocytes B
Les lymphocytes B sont les cellules qui représentent la mémoire imrnurijtaire puisqu'ils
ont la capacité de produire des anticorps, suite à une stimulation antigénique. Ces cellules portent
à la surface de leurs membranes, des récepteurs pour la portion Fc des irnrnunogIobulines (Ig),
plus communément appelés anticorps. Lorsque les lymphocytes B vierges (cellules développées
sans l'intervention d'Ag) sont stimulés par un antigène en présence du lymphocyte T et d'une
cellule présentatrice d'antigène, la maturation de la cellule B se poursuit, afin de former un clone
de cellules possédant les caractéristiques d'une véritable usine de fabrication d'anticorps (Ac),
les plasmocytes. On retrouvera dors différents types de plasmocytes soit ceux produisant des
IgA, des IgM, des IgD, des IgE ou des IgG, dépendarnment du type d'antigènes ayant initié la
réponse immunitaire. Les Ac produits seront ultérieurement excrétés dans le milieu environnant.
La demie vie des plasmocytes est de courte durée, soit quelques jours. Ainsi, afin d'assurer la
mémoire immunitaire, une partie des cellules B stimulées, après l'activation antigénique,
reviendront en phase de quiescence (en Go) pour constituer un "pool" de cellules mémoires
spécifiques à l'antigène. Ce type de réaction immunitaire sera qualifié de "réponse à médiation
humorale".
2.2.2 Les cellules
NK
et les macrophages
Les Cellules NK font partie d'une catégorie particulière de lymphocytes. Elles ont en fait,
I'ultrastructure de grands lymphocytes à granules. Tout comme les lymphocytes B, les NK
possèdent des récepteurs pour la portion Fc des immunoglobulines, le marqueur CD16.La
majorité de ces cellules NK sont donc semblables aux lymphocytes, mais comme elles ne sont ni
des lymphocytes T, ni des lymphocytes B, elles ont été surnommées cellules "nuIles".
Les NK sont d'importantes cellules effectrices de la réponse immunitaire à médiation
cellulaire. Ces cellules sont équipées d'un potentiel cytolytique très agressif. Elles produisent le
TNFa (Parr et al., 19951, et la perforine (ou cytolysine), une protéine présente dans leurs
granules et qui est caractéristique des cellules cytolytiques activées (Parr et al., 1990; Lin et al.,
1991; King et al., 1993; Rukavina et al., 1995). La présence des cellules NK ainsi que leurs
activités ont été étudiés chez différentes espèces animales en relation avec leurs rôles dans le
succès ou l'échec de la gestation. Leurs implications seront discutées un peu plus tard dans ce
manuscrit (section 2.3.2).
Quant aux macrophages, ils sont le produit des monocytes sanguins activés. Les
monocytes sont produits dans la moelle osseuse par les cellules souches myéloïdes pour ensuite
migrer dans les différents organes ou tissus
d'y devenir des macrophages. Elles sont de
grandes cellules à granules qui contiennent plusieurs hydrolases acides et une peroxydase,
essentielle à la destruction cellulaire des microorganismes. Les principales fonctions des
macrophages périphériques sont: 1) la phagocytose de microorganismes et des celluIes
tumorales; 2) la présentation d'antigènes aux lymphocytes spécifiques, puisque la plupart
d'entre-elles expriment le CMH de classe II. Cependant, cette fonction de présentation des
antigènes (immunorégulateur) ne semble pas être accomplie par les macrophages utérins in situ.
Durant la gestation, on leur attribuerait plutôt un rôle immunosuppresseur qu'immunorégulateur
(Tawfik et al., 1986; Mathews et Searle, 1987). Cette fonction des macrophages sera
développée la section 2.3.4. Finalement, l'activité des macrophages est grandement influencée
par des hormones stéroïdiennes, des lipides bioactifs, ou des facteurs de croissance,
abondamment retrouvés dans l'utéms gestant ainsi qu'au niveau du placenta.
2.3 Implication des cellules immunitaires durant la gestation
Les populations cellulaires colonisant I'utéms gestant ainsi que leurs différentes
implications immunologiques furent décrites chez différentes espèce à placentation hémochoriale
(Hunt, 1994). Cependant, les études sont un peu moins nombreuses chez les espèces à
placentation épithéliochoriale comme le porc (Yu et al., 1993). Chez l'humain, une espèce à
placentation hémochoriale, la proportion de leucocytes au sein des cellules stromales passe de
8.2% dans la phase proliférative du cycle menstruel à 3 1.7% dans la décidue en début de
gestation (Bulmer, 1993). De ces leucocytes, on retrouvera des lymphocytes, des macrophages
et des cellules NK. La présence de ces leucocytes, au sein des cellules endoméuiales, fut
souvent associée à l'état gestatif ou à la présence de l'embryon.
2.3.1 Implication des lymphocytes T
Durant la gestation, les lymphocytes, phculièrement les lymphocytes T, jouent un rôle
central dans l'initiation des réponses immunitaires. Les études semblent cependant conflictuelles
quant à la distribution, au nombre relatif, ainsi qu'aux différentes sous-populations
lymphocytaires présentes dans l'utérus durant la gestation (Carter, 1984). Des études effectuées
chez I'humain, démontrent qu'en début de gestation, les lymphocytes T représentent moins de
20% de la population leucocytaire totale et qu'environ 70%de ces derniers sont CD8+ (Bulmer
et al., 1991). Les lymphocytes T représenteraient Ia plus petite population leucocytaire, de la
décidue. La présence des TH est peu commune dans les tissus utérins. En fait, la majorité des
lymphocytes qu'on y retrouve sont soit membres d'une sous-population de cellules
cytotoxiques/suppressives (CD8+) atypiques ou faisant partie des grands Iymphocytes
granulaires ("Large Granular Lymphocytes"ou LGL) qui sont CD56f (marqueur des cellules
NK) (Noun et al., 1989 chez la souris; Lee et al., 1988 chez les ovins; Bulmer, 1993 chez
l'humain). Comparativement aux lymphocytes du sang périphérique, les cellules CD56+
utérines n'expriment pas la chaîne p55 de l'IL-2 (Bulmer et Johnson, 1986), par contre, elles
expriment la chaîne p75 (Starkey, 1991). Quant aux Lymphocytes T suppresseurs, on note une
augmentation de ce type cellulaire dans le sang périphérique après une exposition des leucocytes
à des cellules foetales portant des molécules de CMH II (Oksenberg et al., 1988).
Kabawat et al. (1985) rapportent que très peu de lymphocytes T sont présents au site
d'implantation chez I'humain. Chez le porc, quoique le nombre de lymphocytes intra-épithéliaux
par unité de membrane basale soit déjà très faible, une réduction significative des lymphocytes
intra-épithéliaux hit observée durant les 2ème et 3ème semaines (jours 10 et 19) de la gestation
(King, 1988),jours associés à la période de l'attachement chez le porc.
En 1986, Head et Billingham démontrent que les lymphocytes T nomalement retrouvés
en présence d'allogreffres conventionnelles, sont absents de Ia décidue humaine et murine (Head
et Billingham, 1986). Mincheva-Nilsson et al. (1992) ont par la suite caractérisé les populations
lymphocytaires de la décidue humaine et ont démontré que la majorité des lymphocytes présents
étaient TCRyW/CD56+. II sagit d'une population de cellules effectrices à cytotoxicité NK non
restreinte au CMH (Mincheva-Nilsson et al., 1992; Mani et al., 1993). Fait intéressant, des
lymphocytes TCRaP+ sont retrouvés normalement en majorité dans la périphérie. Ces
lymphocytes TCRy??/CD56* auraient un rôle à jouer dans I'immunoprotection du foetus ainsi
que dans la protection de l'utérus et du trophoblaste contre les infections.
2.3.2 Implication des cellules NK
Plusieurs études démontrent que les LGL sont les principales ceIlules retrouvées dans
l'utérus gestant responsables de l'activité NK chez l'humain et les rongeurs (Yu et al., 1993).
Chez le rat et la souris, on retrouve les "granulated metrial gland cells" (GMG) qui sont
phénotypiquement similaires aux LGL humains (Stewart, 1994), par contre elles possèdent un
profil antigénique différent. Les LGL et les GMG, possèdent des propriétés cytotoxiques
différentes des cellules NK périphériques et sont surnommées cellules "NK-like". Plusieurs
indications suggèrent que les LGL, isolées d'animaux gestants, peuvent lyser les cellules K562,
qui sont des cellules cibles pour les cellules NK périphériques classiques (King et al., 1989;
Ritson et Bulmer, 1989). Cependant, l'intensité de la lyse cellulaire serait plus faible que celle
observée pour les cellules NK. Elles développent en même temps un phénotype similaire aux
cellules NK périphériques, avec une proportion accrue de cellules exprimant le marqueur CD 16
(récepteur du fragment Fc des immunoglobulines) (King et ai., 1992). La présence de cellules
NK caractérisées en tant que LGL fut aussi démontrée chez le porc (Kim, 1980), une espèce à
placentation épithéliochonale (non-invasive). Cependant, la morphologie des cellules NK
porcines, diffère de celie des cellules d'autres espèces. Elles sont plus petites et possèdent un
nombre moins élevé de granules (Yang et al., 1987).
Des études démontrent que les LGL humains représentent 70% de la population
leucocytaire totale tant dans I'endomètre non gravide que dans la décidue (King et al., 1989).
Par contre, Bulmer (I993), rapporte que ces cellules se retrouvent au niveau intra-épithélial et
que leur nombre augmente en fin de phase sécrétoire du cycle menstruel humain pour atteindre
50% des lymphocytes intra-épithéliaux en début de gestation (Bulmer, 1993). Les facteurs
responsables du recrutement, de la prolifération, de la différenciation et de la distribution des
LGL ou des GMG dans l'endomètre ne sont pas vraiment connus. Chez Irhumainet la souris, la
présence de ces cellules dans I'endomètre ne semble pas être nécessairement liée à la présence de
l'embryon, puisqufon peut retrouver ces cellules dans l'endomètre durant le cycle (Bulmer,
1993). Par contre, une activité NK dans Ia décidue fut aussi démontrée chez des modèles
porcins (Yu et al., 1994) et chez cette espèce, le développement de I'activité NK est intimement
relié à la présence de l'embryon. Très peu de cellules "NK-Like" sont détectées chez la truie
durant son cycle, en pseudogestation ou après I'insémination avec du plasma séminal ou des
spermatozoïdes morts. Cependant, la présence de l'activité NK dans l'endomètre ne semble pas
constante durant toute fa gestation. King et al., en 1989, rapportent que les LGL prédominent
dans le stroma utérin et qu'ils sont très abondants durant la période de l'implantation (King et
al., 1989). Ceci fut plus tard confirmé par des études chez le porc, où l'activité NK endornétriale
fut détectée durant la période d'attachement, soit entre les jours 10 et 20 de la gestation, dors
qu'au jour 30, leur activité cytolytique déclinait à des niveaux indétectables (Yu et al., 1993).
Les résultats d'une étude de Croy et al. (1985), démontrent une activité accrue des
cellules NK au site d'implantation de l'embryon humain, durant la première moitié de la
gestation normale (Croy et al., 1985). Une étude plus récente démontre que les cellules NK
pourraient avoir un rôle majeur à jouer dans le maintien de la gestation. Cette étude effectuée
avec des souris transgéniques déficientes en cellules NK ( c l % de LGL) démontre que l'absence
de ces dernières occasionne des pertes foetales de 64% à la mi-gestation avec une réduction de la
taille des placentas (Guimond et al., 1998). Il a aussi été démontré que les LGL ainsi que les
cellules NK périphériques ne peuvent lyser les cellules trophoblastiques (King et al., 1989). Par
contre, une infiltration des ceIlules NK a été associée à des résorptions foetales ou à des
avortements spontanés (Clark et al., 1987; Gendron et Baines, 1988; Zheng et al., 1993). En
fait, il a été démontré que les LGL prolifèraient in vitro en réponse à l'IL-2 recombinante, et que
ces cellules acquierent un potentiel cytolytique caractéristique des cellules "lymphokine-activated
killer" ( L U )(King et Loke, 1990). Ces cellules LAK pourraient donc lyser les cellules
trophoblastiques in viîro (Drake et Head, 1989). Le trophoblaste murin est aussi sensible à la
lyse par les cellules M( périphériques activées à l'IL-2 (Drake et Head, 1989). Cependant, un
peu plus récemment, il fut rapporté que les cellules trophoblastiques d'embryons porcins
peuvent être reconnues et lysées par les cellules NK de I'endomètre gestant (Yu et al., 1994).
La présence des celluIes "NK-like", aussi bien que leur activité ont été rapportées dans la
littérature au site d'implantation. De plus, l'activation de ces cellules "NK-like" par {'IL-2,ou
comme pour les embryons porcins, la simple présence de ces cellules peut occasionner une lyse
des cellules trophoblastiques. Certain mécanismes immunosuppressifs localisés doivent
nécessairement être présents à l'interface foeto-matemelIe afin d'assurer la protection des
embryons, sans pour autant altérer le système immunitaire materne1 en général. Nous
discuterons donc de ces différents mécanismes d'immunosuppression localisés à la section 2.4.
2.3.3 Implication des lymphocytes B
Dans un utérus gestant, des anticorps maternels spécifiques peuvent être produits contre
les cellules trophoblastiques. En effet, certains antigènes trophoblastiques solubles ou des
celIules fœtales intactes peuvent être libérés de l'environnement utérin et passer dans la
circulation sanguine maternelle (Wood, 1994). Le passage des cellules embryonnaires dans le
sang maternel, mènera dors à la sensibilisation du système immunitaire de la mère, face aux
antigènes fœtaux et paternels (Voisin, 1990),ce qui stimulera une production d'anticorps. Par la
suite, le placenta formera une barrière qui adsorbera ces anticorps potentiellement dommageables
pour l'unité "foeto-placentaire". Il a été démontré que des IgG sont fixés sur les cellules du
syncytiotrophoblaste de toutes les gestations humaines menées à terme (Mowbray et al., 1993).
De plus, ces anticorps peuvent faciliter La tolérance d'une allogreffe paternelle lorsqu'ils sont
injectés à des souris receveuses de lignée maternelle (Voisin, 1990). Ce phénomène de transport
de cellules foetales vers la circulation maternelle peut être observé chez toutes les espèces
animales, indépendamment du type de placentation.
Malgré que le mécanisme de défense humoral de la mère ait sûrement un rôle à jouer dans
le maintien de la gestation, il serait pour plusieurs de moindre importance. Des expériences
effectuées sur des souris ayant subit une déplétion fonctionnelle des lymphocytes B, démontrent
que ces dernières peuvent très bien se reproduire normalement (Rodger, 1985). De plus, très
peu de lymphocytes B sont observés au niveau du stroma utérin. Ainsi, peu d'études furent
effectuées sur ce type cellulaire et sur le rôle que pourrait avoir Zijouer ce type de cellules durant
la gestation.
2.3.4 Implication des macrophages
Les macrophages sont abondants dans le stroma de l'utérus cyclique et gestant. Chez
l'humain, il fut démontré que les macrophages sont présents au niveau du stroma endornétrial et
que leur nombre augmente en début de gestation pour atteindre une proportion de 40% des
leucocytes de la décidue (Bulmer, 1993). Il fut par la suite démontré, chez la souris et chez le
rat, que les macrophages présents deviennent dispersés au site d'implantation (Wunt, 1994).
Les travaux de Hunt et Pollard (1992), démontrent que les macrophages de I'utéms
gestant ainsi que ceux retrouvés dans le placenta, auraient des fonctions bénéfiques à la gestation
dont la phagocytose, l'immunorégulation et la production de facteurs de croissances (Hunt et
Pollard, 1992). De plus, il semblerait que le rôle de ces cellules durant la gestation pourrait être
relié à l'immunosuppression locale. En effet, les macrophages synthétisent de grandes
concentrations de prostaglandine E2 (Parhar et al., 1989). qui inhibent la prolifération des
lymphocytes en inhibant la synthèse d'interleukin-2 (Mathews et Searle, 1987) et en diminuant
l'expression des récepteurs à la transferrine (Chouaib et al., 1985). Les macrophages utérins
produisent, de plus, certaines cytokines comme l'IL-6 ou certains facteurs de croissance à
I'interface foeto-maternelle comme du TGF-P ou le CSF-1. Aussi, il semblerait que les
macrophages puissent aussi avoir un rôle à jouer dans la croissance et le développement
placentaire (Hunt, 1989).
2.4 Mécanisme d'immunosuppression localisé
L'immunosuppression à l'interface foeto-materneHe implique la mise en place de
mécanismes diversifiés dont I'accumulation de cellules aux fonctions suppressives. Ceci
survient au site dlimpIantation,dans la décidue (Clark et al., 1987; Bulmer et al., 1991) ou dans
I'endornètre gestant, pour les espèces sans décidualisation (Croy et al., 1987). Considérant que
durant la gestation, les femelles gestantes sont en mesure de répondre efficacement aux
infections extérieures ou à des allogreffes expérimentales, les substances immunosuppressives
impliquées doivent nécessairement exercer leur action de façon locale à l'interface foetomaternelle (Koch, 1985). Plusieurs études démontrent que des cellules déciduales ainsi que des
rnacrqhages utérins isolés par digestion enzymatique ont un rôle de cellules suppressives de par
les substances qu9eIles produisent (Tawfik et al., 1986; Mathews et Searle, 1987). Les
substances impliqués sont d'origine variées, telles que les hormones, des protéines d'origine
placentaires, d'origine foetale ou autres.
La progestérone est une des hormones reconnue pour son action irnmunosuppressive à
l'interface foeto-maternelle. Lorsqu'administrée localement, la progestérone peut retarder le rejet
de greffe cutanée placée dans la lumière utérine (Hansen et al., 1986). De plus, un rôle de
régulation de la migration ainsi que la prolifération des lymphocytes CD45+ à activité NK de
I'endomètre, a été associé à la progestérone chez la brebis (Gottshall et Hansen, 1992) et la
souris (Liu et Hansen, 1993). Cependant, l'effet inhibiteur de la progestérone sur la réponse
immunitaire serait plutôt due à l'induction de la sécrétion de facteurs irnmunosuppressifs dans le
liquide utérin plutôt qu'à une action directe sur les cellules lymphocytaires (Hansen et al., 1989).
Chez le porc, une composante des protéines utérines luminales possédant une activité
immunosuppressive a été isolée au jour 15 de la gestation (Segerson et d., 1991). Son activité
irnmunosuppressive est maximale au jour 9 de la gestation (Segerson et Gunsett, 1993) et serait
essentielle afin de neutraliser l'activité NK de I'endomètre retrouvé durant cette période (Croy et
al., 1988). De plus, d'autres facteurs utérins ou protéines sécrétoires possédant des propriétés
immunorégulatrices furent observés chez les vaches (Segerson et al., 1984; Segerson et
Gunsett, 1990), les ovins (Segerson, 1988) et les humains (Nakayama et al., 1985).
Une glycoprotéine de 66 kD fut purifiée à partir des embryons porcins durant la période
d'attachement du blastocyste (jour 16) (Murray et al., 1987). Cette glycoprotéine a été reconnue
comme possédant une activité immunosuppressive in vitro. De plus, d'autres facteurs solubles,
comme la prostaglandine E2 (PGE2) ou le "transforming growth factor-$y (TGFp2) sont bien
connus pour leur action immunornodulatrice. En effet, ces molécules furent proposées comme
étant des messagers embryonnaires responsables de la modulation de la réponse immunitaire
maternelle (Ouellette et al., 1997; Fortin et al., 1997; Ernond et al., 1998). La PGE2 tout comme
le TGFj32 sont retrouvés dans les liquides embryonnaires de plusieurs espèces animales. On
retrouve la PGE2 dans les embryons d'humains (Holmes et al., 1990), de cheval (Weber et al.,
1991), de lapin (Dey et al., 1980; Pakrasi et Dey, 1982), et de porc (Lewis et Waterrnan, 1983).
Chez le porc, on remarque que les prostaglandines peuvent être produites et métabolisées in vitro
par les blastocystes au jour 16 de la gestation (jour associé à la période d'attachement du
blastocyste) W w i s et Waterrnan, 1983). De plus, la PGE2 inhibe l'activité lytique des cellules
NK et LAK retrouvées dans l'endomètre gestant (lala, 1989; Linnemeyer et Pollack, 1993;
Bergeron et al., 1996). Elle inhibe également la production d'IL-2par les lymphocytes (Parhar
et ai., 1989), et est responsable d'une augmentation de la production du GM-CSF produit par
les lymphocytes (Fortin et al., 1997). Le GM-CSF est un facteur de croissance produit par
différents types cellulaires et est impliqué dans la croissance du trophoblaste (Szito et al., 1993.
On discutera de ce facteur dans la section suivante). Chez le porc. de très faibles concentrations
de PGE2 inhibent substantiellement I'activité lytique des cellules MC de l'endomètre gestant (Yu
et al., 1994) et des études de Kraeling et ai. ( l985), démontrent que I'indométhacine (inhibiteur
de la synthèse des prostaglandines) administré par voie orale à des truies en début de gestation,
provoque l'échec de la gestation.
La production ainsi que I'expression génique du TGFp2, un facteur de croissance de
nature peptidique, furent observés durant le développement embryonnaire murin (Heine et al.,
1987; Miller et al., 1989), ovin (Doré et al., 1995) et porcin (Gupta et al., 1996). Le TGFp2 est
aussi retrouvé dans le liquide blastocoelique de lapin (Ouellette et al., 1997). Chez l'humain, il
fut démontré que le TGF$ peut diminuer I'activité cytolytique des LGL en culture (Rook et al.,
1986) et l'absence de TGFp2 fut corrélée avec des avortements spontanés récurrents (Lea et d.,
1995). Il fut aussi démontré que TGFB2 stimule la production de GM-CSF par les lymphocytes
(Fortin et al., 1997) et occasionne une "downregulation" de I'expression membranaire des CD4
retrouvés sur les lymphocytes du sang périphérique (Ouellette et al., 1997). Chez le porc, la
présence de TGFp ainsi que son action immunosuppressive sur des lymphocytes porcins furent
observés à partir de sécrétions utérines luminales au jour 15 de gestation (Segerson, 1995). De
plus, l'expression des trois isoformes du TGFP (TGFPI, TGF$2, TGFP3) fut observée dans les
embryons porcins en période de péri-implantation, grâce à une étude immunohistochimique, et
I'expression de ces isofonnes ainsi que leurs récepteurs diminuent avec l'avancement de la
gestation, soit du jour 12 au jour 14 (Gupta et al., 1996).
2.5 Réactions immunitaires favorables au développement foetal
Jusqu'à maintenant, nous avons vu que différents types cellulaires se retrouvent dans
l'utérus lors de la gestation et que différents mécanismes sont présents à l'interface foetomaternelle, impliquant différents facteurs solubles7 afin de supprimer les effets délétères que
pourrait avoir la réaction immunitaire matemelle. Cependant, certains faits nous emmènent à
penser que la réaction immunitaire peut être favorable au développement du "conceptus".
Plusieurs études effectuées sur les avortements spontanés chez l'humain attribuent ceuxci à un manque d'anticorps bloquants dans le sérum maternel (McIntyre et Faulk, 1983). Chez la
souns, les grossesses de type dogéniques donnent des portées ainsi qu'un poids placentaire
plus élevés que les portées de souris obtenues de grossesses syngéniques (James, 1965; Beer et
al., 1975). De plus, chez des souris ayant de haut taux de résorption (CBNJ X DBA/2T),
l'immunisation de la femelle contre des leucocytes de souns mâles possédant le même haplotype
que les souns DBA/2J (souris BALBk), ramène les taux de résorption à la normale avec en
plus, une augmentation du poids fœtal et du placenta (Baines et Gendron, 1993). Il a aussi été
démontré que les performances reproductives des truies de premières gestations (nullipares)
peuvent être améliorées par exposition de ces dernières aux antigènes de la semence mâle avant
la conception (Murray et al., 1983). Chez la rate, une immunisation intra-utérine avec des
spermatozoïdes a permis d'observer un plus grand nombre d'embryons dans la come utérine
immunisée comparativement à la come contrôle non-immunisée (Beer et Billingham, 1976).
Ainsi, lors d'une immunisation, la disparité antigénique menant à la sensibilisation et à La
production d'anticorps bloquants par le système immunitaire maternel semble bénéfique aux
mécanismes impliqués dans les processus de reproduction. Mais, outre la production d'anticorps
bloquant, la stimulation immunitaire de l'utérus maternel semble aussi stimuler la production
accrue de cytokines dans I'utérus telles l'IL-3, le "macrophage colony-stirnulating factor" (MCSF) et le "colony-stimulating factor" (CSF- I), qui mènent à une meilleure différentiation des
tissus utérins et embryonnaires (Wegmann, 1988; Robertson et Seamark, 1992).
2.5.1 Concept de I'immunotropisme
L'immunotropisme est une hypothèse mise de l'avant par Athanassakis et al. (1987)
d'expliquer les effets bénéfiques que pouvait avoir I'alloimmunisation sur la gestation
(Wegmann, 1993). D'après ce concept, la présence d'embryons allogéniques, induit l'activation
d'une réponse immunitaire à médiation cellulaire favorable au développement foetal, par la
production de cytokines ou facteurs de croissance embryotrophiques. Ceux-ci viendraient des
lymphocytes T. Parmi ces facteurs, l'IL-3, le GM-CSF, et le CSF-I, sont produits par les
lymphocytes T activés et seraient responsables de la prolifération des cellules placentaires in
vitro (Athanassakis et al. 1987; Armstrong et Chaouat, 1989; Loke et al., 1992). En effet,
l'expression du récepteur du CSF-1 (c-fms) par les cellules du trophoblaste et Ia sécrétion du
CSF-1 par l'épithélium utérin coïncident avec la croissance placentaire (Arceci et al., 1989). Les
cellules trophoblastiques humaines au premier trimestre de la gestation produisent également du
GM-CSF, ce qui suggère une régulation paracrine et/ou autocrine du développement placentaire
(Jokhi et al., 1994). De plus, en réponse à une exposition avec de la semence ou du plasma
séminal, le contenu en GM-CSF du liquide utérin augmente de façon très importante (Robertson
et Seamark, 1990; Robertson et al., 1992). La présence de l'IL-3 a aussi été rapportée dans les
sumageants de culture de ceIlules placentaires murines (Lin et al., 1993).
2.5.2 L'hypothèse Th2/Thl
L'interface foeto-maternelle se voit donc imprégnée de cytokines et de facteurs de
croissance bénéfiques (type Th2) au développement foetal incluant les cytokines IL-3,4, -5 et
-10, ainsi que d'un certain nombre de cytokines qui sont moins favorables à la gestation (type
Thl), incluant l'IL-2, Ie TNFa et 1'INFy. Ces dernières cytokines sont produites par les
lymphocytes de type T helper- 1 (Th1) et activent la réponse immunitaire à médiation cellulaire.
Quant aux cytokines bénéfiques, elles sont produites par les lymphocytes de type T helper-2
(Th2) favorisant la réponse immunitaire à médiation humorale- L'hypothèse Th2/Th 1 suggère
donc un certain équilibre entre les deux types de cytokines: bénéfiques et délétères.
En effet, l'administration d'IL-2, de TNFa et d'IFNy à des croisements de souris CBA
X DBN2 augmente les taux de résorption foetale (Chaouat et al., 1990). De plus, I'expression
du gêne de l'IL-2 ainsi que celui d'autres cytokines de type Th1 telles le TNFa,et 1'INFy fut
fortement observée dans le placenta de croisement de souris à haut taux de résorption (CBA X
DBA/2), comparativement à l'expression de ces mêmes gênes dans les placentas de croisements
normaux (CBA X BALBk) (Tangri et Raghupathy, 1993). Il fut aussi démontré que la
prolifération et la différentiation des cellules trophoblastiques humaines, tout comme celles des
cellules trophoblastiques murines, sont régulées par certains facteurs de croissance produits par
les macrophages comme le GM-CSFet le CSF-1 (cytokines Th2). L'injection de diverses
cytokines Th2 telles le GM-CSF, l'IL-3, ou l'IL-IO, occasionne une réduction considérable du
nombre de résorption foetale avec une augmentation du poids foetal et placentaire dans le
croisement murin de souris à haut taux de résorption CBAU X DBA/2J (Wegmann et al., 1989;
Chaouat et al., 1990). Il fut aussi démontré que L'IL-IO,cytokine Th2, pouvait inhiber la
production d'IL-2 et de TNFa, considérées comme des cytokines abortives (Fiorentino et al.,
1989; Mosmann et Moore, 1991). De plus, l'IL-4 en association à l'IL-1 O inhibe l'immunité
cellulaire cytotoxique in vivo (Powrie et al., 1993) et l ' M y , une cytokine Thl, peut, en plus
de promouvoir le développement des lymphocytes cytotoxiques et des cellules NK (Drake et
Head, 1989), inhiber la prolifération des clones Th2 in vitro (Gajewski et Fitch, 1988). On voit
donc que les cytokines Th1 et Th2 forment un réseau complexe de cytokines mutuellement
antagonistes.
Des études plus récentes démontrent que des liquides embryonnaires prélevés en début
de gestation (jour 12) chez le lapin, occasionnent une stimulation de production de cytokines de
type Th2 tel le GM-CSF par les PBL, contrairement à un effet inhibiteur observé sur la
production d'IL-2, cytokine de type Th1 (Fortin et al., 1997). Par contre. I'hypothèse Th lm2
a quand même ses faiblesses, puisqu'une autre étude démontre que lorsque des LGL sont
isolées de la décidue au premier trimestre de la gestation, elles produisent du GM-CSF, et leur
production de GM-CSF peut être augmentée par une CO-cultureavec des cellules déciduales
stromales ou par stimulation avec de l'IL-2 (Jokhi et al., 1994)' qui est généralement considéré
comme une cytokine abortive. Cette contradiction ne peut que nous emmener à conclure que
I'hypothèse Thl/Th2 est peut-être un peu simpliste et que dans les faits, les mécanismes
impliqués sont beaucoup plus complexes. D'autres études devront inévitablement être mises de
l'avant afin de mieux caractériser les mécanismes impliqués, pour éventuellement mieux
comprendre ce qui se passe réellement à l'interface foeto-maternelle.
2.6 Hypothèse et objectifs
La mortalité embryonnaire étant un phénomène important chez les truies en début de
gestation, la présente étude cherchera à caractériser les mécanismes immunologiques pouvant
être impliqués dans ce processus. Pour ce faire, nous tenterons d'identifier et de quantifier
certains facteurs embryonnaires pouvant influencer la réponse immunitaire maternelle. La
présence des molécules PGE;! et TGFP2 au niveau des "conceptus" de diverses espèces animales
ainsi que leurs propriétés irnrnunomodulatrices bien connues en font d'excellents candidats.
Nous avons formulé les hypothèses suivantes soit: 1) les facteurs immunomodulateurs PGE2 et
TGFP2 sont présents dans le liquide allantoïque porcin et 2) chaque embryon peut moduler la
réponse immunitaire maternelle de façon autonome afin de favoriser sa propre survie. Nous
évaluerons la réponse immunitaire maternelle en termes de prolifération cellulaire (incorporation
de thymidine tritiée), production de cytokines (IL-2 et GM-CSF), pourcentages de cellules
C D ~ +et, nombre de récepteurs membranaires CD4.
L'objectif de la présente étude est donc de tester la capacité des embryons porcins de
modifier le phénotype des lymphocytes et/ou d'influencer la production de cytokines in vitro par
les PBL. Nous tenterons par la suite d'établir un lien entre les concentrations de facteurs
immunomodulateurs présents dans les embryons porcins et les effets sur la réponse immunitaire
maternelle. Pour ce faire, nous utiliserons un système de culture hétérologue dans lequel des
lymphocytes préparés à partir du sang périphérique humain sont incubés en présence de liquide
dantoique porcin. Par la suite, les réponses aux traitements seront évaluées par cytofluonmétrie
3 technique
,
d'ELISA (dosage des
(pourcentage de cellules et nombre de récepteurs ~ ~ 4par
cytokines IL-2 et GM-CSF) ou par comptage radioactif (prolifération cellulaire). La
quantification des facteurs immunomoduIateurs PGE2 et TGFp2 présents dans les différents
liquides embryonnaires sera aussi évaluée par une technique d'ELISA.
CHAPITRE 3
EFFET MODULATEUR DE LA PGE?
- ET DU TGFp7- DES LIOUIDES
ALLANTOÏDIENS PORCINS PRÉLEVÉS EN DÉBUT DE GESTATION. SUR
LA PRODUCTION D'IL-2 ET DE GM-CSF PAR LES LYMPHOCYTES DU
SANG PERIPKÉRIOUE.
3.1 Résumé
PROBLÈME: Des pertes embryonnaires élevées sont généralement associées à la période
de péri-attachement. La compréhension des mécanismes impliqués durant cette phase du
développement est donc particulièrement importante, puisque les causes de ces pertes
embryonnaires sont encore inconnues. Les pertes embryonnaires peuvent être reliées à différents
facteurs dont un mauvais contrôle local de la réponse immunitaire maternelle. La prostaglandine
E2 (PGE2) et le "transforming growth factor" (T.GFB2), deux facteurs immunomodulateurs,
sont associés au succès de la gestation chez différentes espèces animales. L'objectif de cette
étude est d'évaluer la concentration de PGE2 et de TGFP2 prisente dans des liquides
allantoïdiens porcins pélevés aux jours 22-24 et 30 de la gestation chez le porc et de corréler ces
valeurs avec des marqueurs de la réponse immunitaire maternelle.
MÉTHODE: Des échantillons de liquides allantoïdiens ont été prélevés aux jours 22-24 et
30 de la gestation. Les concentrations de PGE2 et de TGFj32 ont été évaluées par des techniques
d'ELISA. Des lymphocytes du sang périphérique (PBL) humain furent récoltés et cultivés en
présence de liquides allantoïdiens. L'incorporation de [fH]thymidine ainsi que la production
d'interleukine-2 (IL-2) et de "grariulocyte-macrophage colony stimulating factor" (GM-CSF) ont
été quantifiées.
RÉSULTATS: Sous les conditions expérimentales utilisées durant cette étude, 15% et
17.9% des pertes embryonnaires surviennent en jours 25 et 50 de la gestation respectivement.
Les concentrations de PGE2 sont significativement plus élevées (pc0.000 1) aux jours 22-24
(n=61), comparativement au jour 30 (n=171). Tous les échantillons de liquides allantoïdiens
testés inhibent la production d'IL-2par des lymphocytes stimulés à la concanavaline-A (ConA).
Les effets des liquides allantoïdiens sur la production de GM-CSFsont très variables; certains
échantillons démontrent une inhibition significative tandis que d'autres n'ont aucun effet. De
plus, le retrait de la PGE2 par chromatographie d'affinité réduit significativement l'effect
inhibiteur des liquides allantoïdiens. En jours 22-24, une forte corrélation est observée entre les
concentrations de PGE2 des liquides allantoïdiens et l'inhibition d'incorporation de
[3H]thymidine (R:-0.7; pc0.01) ainsi que l'inhibition de la production d'IL-2 ( R 4 . 7 ;
p=0.0002). Une telle corrélation n'a pu être obtenue lorsque les PBL sont traités avec des
liquides allantoïdiens prélevés en jour 30 de la gestation.
CONCLUSION: Ces résultats suggèrent: 1) que le liquide allantoïdien porcin peut
moduler la réponse immune; 2) que la PGE2 présente dans les liquides allantoïdiens aux joua
22-24 est impliquée dans I'inhibition de la prolifération des lymphocytes, ainsi que dans
l'inhibition de la production d'IL-2 et de GM-CSF et finalement; 3) que la nature des facteurs
immunorégulateurs retrouvés dans les liquides dlantoïdiens varie avec la progression de la
gestation.
3.2 Abstract
PROBLEM: Peri-implantation processes are critical for the control of litter size in several
polytocous species. Understanding these processes is particularly relevant to the swine
reproduction, as the exact causes for ernbryonic losses are not known. Embryonic losses might
be related to an ineffective intrautenne control of the immune response towards the conceptus.
Prostaglandin E2 (PGE2) and transforming growth factor 82 (TGFBz), two known
immunoregulators, have been associated with successful reproduction. The objectives of the
present study were to evaluate PGE2 and TGFp2 concentrations in porcine allantoic fluid taken
on Day 22-24 and Day 30 of gestation, and to correlate these values with markers of the
materna1 immune response.
METHOD: Porcine allantoic fluid were sampled either on Days 22-24 or Day 30 of
gestation. ELISA techniques were used to rneasure TGFp2 and PGE2 in these Buids. Human
peripheral blood lymphocytes (PBL)were isolated, [3H]thymidine uptake assessed, and the in
vitro production of interleukin-2 (IL-2) and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
(GM-CSF) tested by ELISA.
RESULTS: Under the experimental conditicns iised in the present study, 15% and
17.9% of the concephls had died by Day 25 and Day 50 of gestation respectively. PGE2
concentrations were significantly higher (p<0.0001)on Days 22-24 (n=61) than on Day 30
(n=l7 1). AU tested samples of allantoic fluid inhibited concanavalin-A (ConA) induced IL-2
production by lymphocytes. The effect of allantoic fluid on GM-CSF production was highly
variable, with some samples showing a significant inhibition while others having no effect.
Furthemore, removal of PGE2 by affinity chromatography significantly reduced these
inhibitory effects. On Day 22-24 a highly significant correlation is found between PGE2
concentrations in allantoic fluid and inhibition of either [îwthymidine uptake (R:-0.7;pc0.01)
or IL-2 production (R:-0.7; p=0.0002). No such correlation could be demonstrated when PBL
were tested with Day 30 dantoic fluid.
CONCLUSION:These findings suggest that: 1) porcine dlantoic auid can regulate the
immune response; 2) PGE2 in Day 22-24 allantoic fluid is involved in the inhibition of
lymphocyte proliferation, and in IL-2 and GM-CSF production and 3) nature of the
immunoregulatory factors found in allantoic fluid is evolving with progression of gestation.
3.3 Introduction
Prenatal rnortality has been a problem for many yean in farm animals. In prolific sheep
and pigs, it generdly occurs early in gestation and leads to a reduction of Iitter size (Wilmut et
ai., 1986). Embryonic death also increases the time interval between successive births in animais
having only one ovulation per estrus (Wilmut et al., 1986). In both cases the economic loss is
substantial. A number of factors can influence prenatal survival; environmental factors such as
nutrition and stress, genetic factors such as chromosomal aberration, and physiological factors
such as insufficient luteal development, utenne space, and fertilization failure (Wilmut et al.,
1986).
Numerous reports in the literature suggest that embryo survival can also be related to the
proper local modulation of the immune response. Recently, prostaglandin E2 (PGE2) and
transforming growth factor P2 (TGFP2) have been proposed as embryonic messengers
rnodulating the materna1 immune response thus leading to the creation of a uterine environment
advantageous to the developing conceptus (Ouellette et al., 1997; Fortin et al., 1997; Emond et
al., 1998). Prostaglandin E2 (PGE2) is found in the allantoic fluid of several animal species,
including the horse (Weber et al., 1991), the rabbit (Dey et al., 1980; Pakrasi and Dey, 1982),
the human (Holmes et al., 1990), and the pig (Lewis and Waterman, 1983). It suppresses the
lytic activity of natural killer (NK) cells and lymphocyte-activated killer (LAK) ceils (Lala, 1989;
Linnemeyer and Pollack, 1993; Yu et al., 1994; Bergeron et al., 1996). PGE2 also inhibits the
production of IL-2 by lymphocytes (Parhar et al, 1989), and causes an increase in the
production of granulocyte-macrophagecolony stimulating factor (GM-CSF) (Fortin et al., 1997;
Emond et al., 1998).
TGFP2 gene expression or antigen production has been observed during murine (Heine
et al., 1987; Miller et al., 1989), ovine (Doré et al., 1995), porcine (Gupta et al., 1996), and
bovine (Munson et al, 1996) embryonic development. It is found in rabbit (Ouellette et al.,
1997) and cow (unpublished data) allantoic fluid. TGFP2 deficiency correlates with human
recurrent spontaneous abortions (Lea et al., 1995). It stimulates GM-CSF production (Fortin et
al., 1997) and downregulates CD4 membrane expression on human peripheral blood
lymphocytes (Ouellette et al., 1997). Given that in pigs: 1) the number of potential offsprings is
reduced by 35 to 45 % during gestation (Pope and First, 1985); 2 ) the exact causes of these
losses are not known, and; 3) it is an animal species of economic interest, the pig has been
chosen for the curent study.
The specific objectives were: 1) to evaluate PGE2 and TGFBz concentrations in allantoic
fluid of porcine embryos taken on Days 22-24 and 30 of gestation; 2) to rneasure the effects of
alIantoic fluid on proliferation of peripheral blood lymphocytes (PBL),and IL-2 and GM-CSF
production, and; 3) to correlate PGE2 concentrations to [3H]thymidine incorporation and
interleukin-2 (IL-2) production by peripheral blood lymphocytes (PBL). Our results show that
PGE2 concentrations are highly variable from one embryo to another and that on Days 22-24,
PGE?contents of the allantoic fluids are highly correlated with the inhibition of DHJthyrnidine
incorporation and IL-2 production by PBL.Results suggest that pig embryos can promote their
survival by leading irnmunological cells to produce less of deûimental cytokines such as IL-2.
3.4 Materiais and methods
Cycling nulliparous pigs, weighing approximately 100 kg, were housed individually and
given Free access to food and water. The gilts were checked daily with a boar to determine the
onset of estrus. The first day of estms was designated as Day O. On that day, the gilts were
inserninated once with fresh pooled semen (Centre d'insémination Artif~cielledu Québec, inc.).
3.4.2 Collection of porcine aIIantoic fluid
On Days 22-24 or 30 of pregnancy, the pigs were sacrificed (by stunning and
exsanguination) and allantoic fluid was taken individually from al1 embryos present. On Day 2224 the uterine w d l was dissected near each of the embryos and the allantoic duid was aspirated
with a syringe. On Day 30, a needle was introduced through the utenne waI1 at the apparent
location of each of the embryos and allantoic fluid was aspirated with a vacutainer. Allantoic
fluids from each embryo were individually fiozen and kept at -20°C.
3.4.3 Preparation of lymphocytes
It has already been demonstrated in the rabbit that, under heterologous conditions, the
dlantoic fluid prevents [3HJthymidine uptake by lymphocytes upon a Concanavalin A (ConA)
stimulation (Pandian et al., 1988; Lambert e t aL, 1989). Since the enzyme-linked
immunoadsorbent assay (ELISA) kits used in the present study could not detect porcine
cytokines, the feasibility of working in heterologous conditions (human lymphocytes and
porcine allantoic fluid) was tested. Under these conditions, human lymphocytes treated with
porcine allantoic fluid collected on Day 22-24 or Day 30 of gestation, showed high viability, and
the cells maintained their ability to proliferate in response to Con A after removal of the allantoic
fluid (results not shown). Results of the heterologous Pmthymidine incorporation versus the
homologous situation are shown in Figure 1. Given these results on viability of celIs and
lymphoproliferative effect, the heterologous condition (Fig. 1B)was choosen for the rest of the
study.
Cmtrol: 13261 +/- 238.6 CPM
Figure 1. Effects of porcine allanroic fluid on P~lthymidineincorporation in homoIogous
conditions (A) as compared to heterologous conditions (B).Results are expressed as the mean f
SEM of the percentage of the control (ConA) for 4 samples in homologous and heterologous
conditions. *** pSO,001, significantly different from control (no allantoic fluid).
Lymphocytes were obtained from blood of healthy human volunteers. The biood was
collected in sterile tubes containing heparin and diluted two-fold with sterile Hank's balanced
salt solution (HBSS) in 50 ml conical tubes (Falcon VWR Scientific, Toronto, Ontario).
Peripheral blood lymphocytes (PBL)were obtained from this blood with an Kistopaque 1077
density gradient (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO). Estopaque (10 ml) was added to the
bottom of the tube with a sterile Pasteur pipette and the bibe was centrifuged at 800 x g for 20
minutes at room temperature. The PBL were then collected from the interface and washed twice
with H B S S . Finally, the PBL were resuspended (4 x 106 celIs/ml) in RPMI 1640 containing
glutamine (Gibco), streptomycin ( 100 nghl), penicillin ( 1 0 IU/ml) (dl nom ICN Biomedicals,
Costa Mesa, CA), and 10% fetal bovine serum (Fl3S) (HyClone Laboratorïes, inc. Logan, UT).
3.4.4 Ce11 culture
Aliquots of 50 pl of cell suspensions (2 x 105 cells per well) were placed in tissue culture
plates with 96 Bat-bottom wells (Falcon) dong with 25 pl of ConA at a final concentration of 5
p g / d (Sigma). The allantoic fluid was allowed to thaw at room temperature and was filtered
using a sterile Millipore filter (0.45 pm) to remove debris. Aliquots of 50 or 100 fl of allantoic
fluid (22.2 or 44.4% (vlv) final concentration) or RPMI 1640 (negative control) were then
added. Finally, RPMI containing 6.7% FBS was added to reach a total volume of 225 pI. Plates
were incubated at 37°C in humidified atmosphere and 5% CO2, for the appropriate periods of
time to allow maximal production of cytokines. Maximum production occured at 12 h for IL-2
and 72 h for GM-CSF(Fortin et al, 1997). [%Jthyrnidineincorporation was measured to v e n e
the proliferation of lymphocytes upon Con A stimulation. After a 48 h incubation period, ten
microliters of 0.02 mCi/ml of [3H]thyrnidine (2.0 Ci/mmol, NEN Research Products,
Mississauga, Ontario) was added, and the incubation was continued for an additional 18 to 24 h.
Cells were harvested on glass fiber filters (Fisher Scientific) with a multiple ceIl harvester
(Fisher Scientific), and filter discs corresponding to each well were placed into scintillation vials
with 3 ml of scintillation fluid (Amersham, Ontario). Incorporated radioactivity was then
evaluated by a liquid scintillation counter.
3.4.5 Anti-PGE2 affinity column
PGE2 in allantoic fluid was removed by &nity chromatography, using agarose
conjugated sheep anti-PGE2 (generously provides by Dr. J.M. Moutquin, Laval University).
The affinity column was constructed using 2 mg of anti-PGE2 coupled to 2 ml of agarose. To
remove PGE2 from the ailantoic fluid, 1 mi of the fluid was mn twice through the anti-PGEz
column.
3.4.6
Irnmunoassays
Incubation media from the treated or control cells was coliected at appropriate time
intervals and kept frozen at -20°C until analysed. IL-2and GM-CSF were assayed according to
the manufacturer's guidelines using a double antibody sandwich in an ELISA kit for the
detection of human cytokines (Biosources, Montreal). TGFBz measurements in heat-activated
fhids were perfomed by a double antibody sandwich in an ELISA kit detecting human TGFp2
(R&D Systems, Minneapolis). In order to activate TGFB2, samples were heat-treated at 80°C for
10 minutes before being used. For PGE2 determination, 50 pl of allantoic fluid was placed in a
96-well microtiter plate coated with goat anti-rabbit (PGE2). Volumes of 50 pl of
acetylcholinesterase-linked PGE2 (tracer) and 50 pl of rabbit anti-PGE2 were added to each
sarnplePlates were incubated overnight at room temperature. Al1 wells were then washed with
10 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing Tween 20 (0.05%) at pH 7.4. Ellman's reagent
(200 pl) (69 m . acetylcholine and 54 rnM 5, 5'-dithio-bis [2-nitrobenzoic acid] in lOmM
phosphate buffer, pH 7.4) was added to each well, and the samples were incubated in the dark
on a shaker at room temperature before being read with a microplate reader at 410 nm. The interand intra-assay coeff~cientsof variation were 16% and IO%, respectively.
3.4.7 Statistical anaiysis
Pearson correlation was performed between PGE2 and TGFP2 concentrations in ailantoic
fiuid. Analysis of variance and Dunnet multiple comparison test were performed to detect
statistical differences among treatments (InStat 2.1, Graph Pad Software). Pearson correlation
was also performed between PGE2 concentration in dlantoic fluid and ~~Hlthyrnidine
incorporation and I L 2 production by lymphocytes. To calculate linear regression, PGE2 was
defined as the independant variable and Super Anova software (ABACUS Concepts inc.
Berkeley, CA) was used.
3.5.1 Concentration of PGE2 and TGFP2 in porcine allantoic fluid
Under the housing conditions used in the facilities at the Agriculture and Agrifood
Canada Research Centre in Lennoxville, Qc., Canada, the typicd embryo mortdity, based on
the number of corpora lutea, for nulliparous sows at Day 25 and Day 50 of gestation is 15%
(Guay et al.. unpublished data) and 17.9% (Matte et al., 1993) respectively. Based on this
observation, allantoic fiuids were coilected at Day 22-24 and Day 30 of gestation for this study.
PGE2 concentrations were evaluated in allantoic fluids from 61 Day 22-24 embryos and from
171 Day 30 embryos. TGFP2 concentrations were also evaluated from 17 Day 22-24 and 8 Day
30 embryos (Table 1). TGFP2 concentrations were highly correlated with PGE2 concentrations
in porcine allantoic fhids (pcû.000 1;r=0.875)on Day 22-24 of gestation. Interestingly, TGFp2
concentrations in allantoic fluid collected on Day 30 of gestation were ofien under the detection
lirnit of the assay (4pg/ml). Concentrations of PGE2 were significantly lower on Day 30 than
on Day 22-24 of gestation (p4.001).
Table 1 : Concentrations of PGE2 and TGFPz in porcine allantoic fluid from Day 22-24 and
Day 30 of gestation.
immunosupressive
factors
AUantoic
fluid
Sarnple
size
-X+/-S.E.
(P~/W
apearson correlation test on Day 22-24 for PGE;!vs TGFP2 concentrations, r=0.875;
***p<o.ooo 1.
bPGEz concentration of D-22-24 vs D-30, pcO.001.
CTGFB2 concentration of D-22-24 vs D-30, p>0.05.
3.5.2 Effect of pig allantoic fluid on IL-2 and GM-CSF production
Since high PGE2 concentrations were observed in porcine allantoic fiuid and since PGE2
is known to modulate PBL production of cytokines, the effect of allantoic fluids on the
production of IL-2 and GM-CSF by human PBL was tested. A dose-dependent inhibition was
observed for [ 3 ~ ] t h ~ m i d i nincorporation
e
(Fig. 2A), production of IL-2 (Fig. 2B), and
production of GM-CSF (Fig. 2C). At the concentration of 22.2% (v/v) porcine allantoic fluid,
either from Day 22-24 (Fig. 2D-F) or Day 30 (Fig. 2G-I) conceptuses, significantiy inhibited
[3H]thymidine incorporation (Fig. 2D, G), IL-2 production (Fig. 2E, H), and GM-CSF
production (Fig. 2F, I). In order to verify reproducibility of the data, five samples collected on
Day 22-24 of gestation were tested against three different preparations of PBL and production of
I L 2 and GM-CSF were measured. Although the suppressive capacity of the fluids varied from
one sample to another and although the PBL were not from the sarne donors, for al1 samples
tested, results were highly comparable (Fig. 3). The general trend is that the inhibition of IL-2 is
more pronounced than the inhibition of GM-CSF. AI1 samples inhibited IL2 production (Fig.
3B) whereas the effect on GM-CSF production was highly variable, some samples showing a
significant inhibition and others having no effect (Fïg. 3C).
Allantoic fiuid (%,
v/v)
Figure 2. Efiects of porcine allantoic fluid collected at Day 22-24 (A-F) or Day 30 (G-1). on
[3HJthymidine incorporation (A, D, G) and production of IL-2 (B. E,H) and GM-CSF (C, F.
1) by human lymphocytes in vitro. NS: negative control, non-stimulated celIs; ConA: positive
control, ConcmavaIin A stimulated cells. * p10.05; ** plO.O1; *** pS0.001, significantly
different from the controI (no allantoic fluid); ns, not significantly different from the control.
PGE2 concentrations
9 (11)
so (IO)
100 (11)
138 (3)
138 (7)
Figure 3. Inter-expenment variations of [3~]thymidineincorporation (A) and IL-2 (B) and GMCSF (C) production by lymphocytes after treatment with allantoic fluid (final concentration
22,24, (v/v)). PGE2 concentration in each of the five samples being tested are indicated in the
upper panel. Each bar represent the mean f SEM of the three repetitions. ** p10,01,
significantly different from control (no allantoic fluid); ns, not significantly different from the
control.
3.5.3 PGE2 in allantoic fluid is partly responsible for the inhibition of
IL-2 and GM-CSF production
In an attempt to test whether PGE;?
could be involved in these inhibitory activities, PGE2
was removed from six samples of allantoic fluid using an anti-PGE2 agarose chromatography
affinity coiumn. These samples were selected for their particulary strong properties to inhibit
[3H]thyrnidine incorporation, and the production of IL-2 and GM-CSF (Fig.4A and 4B).
Affinity adsorption removed 88% of the PGE2 content (results not shown), decreased the
inhibitory effect of the allantoic fluid on DNA synthesis (Fig. 4A), and significantly reduced the
inhibitory effects on the production of IL-2 and GM-CSF (Fig. 4B). Furthermore, addition of
PGE2 in a dose-dependent fashion, dlowed the PGE2 affinity adsorbed ailantoic fluid to regain
the ability to inhibit IL-2 and GM-CSFproduction by lymphocytes (results not shown).
-
+
-
-
+
lntact allantoic fluid
Anti-PGE2 a f f i n e adsorbed
allantoic fluid
Figure 4. Treatment of lymphocytes with porcine allantoic fluid collected on Day 22-24 of
gestation (final concentration 22,2%,(v/v)) adsorbed on an anti-PGE;! affinity column. Each bar
represents the mean percentage of control f SEM (n=6). [3~thymidineuptake was measured
(A) and the concentrations of I L 2 and GM-CSF (B).The [3~]thymidineuptake of the control
(100%) was 11413+/-3005 CPM. Control cytokine production of IL-2and GM-CSF were
746.41+/-100 pglml and 790.28+/-89.56pg/ml respectively. * p10,05; *** pSO,001,
significantly different from the control (no allantoic fluid); ns, not significantly different from the
control; pS0,05;
p50,01, significantly different from intact allantoic Buid.
The role of PGE;! in these inhibition was fiuther confirmed when correlation analysis
were performed on 37 samples from Day 22-24 and 163 samples from Day 30 concepnises. On
Day 22-24, PGE2 concentrations were inversely correlated with either [3H]thymidine uptake
(Fig.5A,pc0.01) and IL-2 production (Fig.6A, pd.0002). Conversety, neither inhibition of
[3H]thyrnidine uptake (Fig. SB), nor inhibition of IL-2 production (Fig.6B) were correlated
with PGE2 content in allantoic fluid coliected at Day 30 of gestation.
Figure 5. Correlation between PGE2 concentrations and [3mthymidine incorporation. Results
on 37 and 163 samples of allantoic fluid taken on Day 22-24(A)and on Day 30 (B) of gestation
respectively, are expressed as percentage of the control (ConA).
PGEZ
pg/ml
Figure 6. Correlation between PGE2 concentrations and IL-2 production by human lymphocytes
in vitro. Results are illustrated for 37 samples of allantoic fluid taken on Day 22-24 (A) and 163
samples taken on Day 30 (B) of gestation. Results are expressed as percentage of the control
(ConA).
3.6 Discussion
3.6.1 PGE2 and cytokine production
This research reveals that allantoic fluid collected from pig embryos can modulate the
production of cytokines by PBL.Although this result was predictable from the PGE2 content in
porcine allantoic fluid, and from the known effects of PGE2 on cytokine production (Ouellette et
al., 1997; Emond et al., 1998), this paper is showing for the first tirne that the mode1 of
conceptus-utenne intertalk proposed for the bovine (Emond et al., 1998) might also apply to the
porcine species. Al1 samples of allantoic fluid inhibited the production of IL-2 and
[3mthymidine incorporation in a dose-dependant fashion, but several exceptions were observed
with the effect on the production of GM-CSF-
IL-2plays a crucial role in the clonal expansion of lymphocyte populations. It is
considered as a rejection cytokine because it can induce detrimental effects on trophoblastic cells
(Lala et al., 1990; King and Loke, 1990; Tangri and Raghupathy, 1993). For example, IL-2activated decidual NK cells destroying murine trophoblastic cells in vitro (Drake and Head,
1989). On the other hand, GM-CSF is beneficial to the pregnancy. Trophoblastic ceils of the
ecto-placental cone of the mouse (Days 7.5 to 8.5) as wefl as mature placental cells (Days 11.5
to 13.5) proliferate in the presence of purified GM-CSF(Athanassakis et al., 1987; Armstrong
and Chaouat, 1989). In the same way, human trophoblastic cells proliferate in vitro in reponse
to GM-CSF (Loke et al., 1992). Similar data were recently reported with the bovine embryos
(de Moraes and Hansen, 1997). These data are in agreement with the observation that injection
of GM-CSF improves the chance of fetal survival in the CBA X DBAI2 matings (Chaouat et al.,
1990; Chaouat et al., 1995).
Recently, it has been demonstrated that production of GM-CSF by peripheral blood
lymphocytes could be increased in the presence of rabbit blastocœlic fluid and that both PGE2
and TGFP2 were involved in this process (Fortin et al., 1997). This induction of GM-CSF
production was obtained following pretreatrnent of lymphocytes (Fortin et al., 1997). Such
stimulation was not demonstrated in the present study (results not shown). A mean TGFp2
concentration of 0.5 n g h l in pig allantoic fluid on Day 22-24 of gestation, and a 100 fold
decrease at Day 30 are reported in the present study. These levels are not sufficiently high to
stimulate GM-CSF production. In agreement with the tremendous decrease of TGF& levels
with conceptus development, a group that investigated the immunohistochemical localization of
TGF$s isoforms (TGFBl, TGFp2 and TGFp3) and their receptors in porcine concepnises,
reported that expression of TGFBs varied as gestation progresses. TGFBs and their receptors
declined frorn day 12 to 14 of gestation (Gupta et al., 1996). Since the mean concentration of
TGFP2 in the porcine allantoic fluid strongly decreases from Day 22-24 to Day 30, it is likely
that the peak of TGFB2 production, and therefore its effect on the immune cells, occurs before
Day 22-24. This requires funher investigation.
Along with their regulation of GM-CSF production, PGE2 and TGFp2 have been
identified in other animal species (Bergeron et al., 1996; Ouellette et al., 1997; Fortin et al.,
1997; Emond et al, 1998) as the molecular messengers responsible for the effects of allantoic
fluid on ce11 proliferation, ce11 phenotype and cytokine production. These same messengers
rnight be involved in the pig. Indeed, once PGE2 is removed, the inhibitory effect of porcine
allantoic fluid on the production of IL-2 and GM-CSF is considerably reduced. Furthemore, the
addition of PGE2 to PGE2-depleted aIlantoic fluid restored the inhibitory activity (results not
shown). Finally, PGE2 concentrations in allantoic fluid are correlated with inhibition of IL-2
production. Taken together, these results support the hypothesis that PGE2 in the allantoic fluid
from porcine embryos at Day 22-24 is an important inhibitor of IL-2 production by PBL in
vitro. There are very large variations among sarnples in the concentrations of PGE2. These
variations cannot account solely for the differences in the inhibitory effects of porcine allantoic
fluids. Firstly, elution of porcine allantoic fluid on an anti-PGE2 afinity column, while
eliminating most of the PGE2, does not completely abolish the inhibitory effects. Secondly,
allantoic fluid #138(7) (Fig. 3) is the strongest inhibitory sample, but contains low
concentrations of PGEz. Therefore, PGE2 from allantoic fluid is only partly responsible for the
inhibitory effect. Other substances present in the Buid (Ball and Day, 1982; Cross and Roberts,
1989; Hamey and Bazer 1989) coufd also be involved. Those substances could possibly have an
additional effect or act in concert with PGE2 to potentiate its effect. The absence of correlation
between PGE2 concentrations in Day 30 samples and inhibition of [3H]thymidine uptake or
inhibition of IL-2 production is in agreement with this possibility.
3.6.2 PGE2 and embryonic quality
Relevance of the present data to reproductive success might be high. Studies in pigs have
demonstrated that prenatal mortdity cm be divided into embryonic mortality (before Day 30) and
fetd mortality (after Day 30) (Lambert and Williams, 1991). In this species, after correcting for
fenilization failure, it is generally accepted that 20 to 30% of the embryos die dunng the first 30
days of gestation, with an additional 10 to 20% dying from days 40 to 100 (Zavy and Geisert?
1994). A 20% increased (from 15%to 17.9%) in embryo mortality has k e n observed from Day
25 to Day 50 of gestation according to data collected in Our laboratory (Guay et al., unpublished;
Matte et al., 1993). Since at Day 22-24 and Day 30 of gestation a wide variability in PGE2
concentrations was obtained between embryos even within a same sow, it can be hypothesized
that the healthiest ernbryos are producing more PGE2, leading to larger concentrations within the
allantoic fluid. Recent data collected in Our laboratory have shown correlations between PGE2
concentrations in the allantoic fluid on Day 30 of pregnancy and the weight (rd.36) and length
(r=0.38) of the embryos (Laforest et al., 1997). It has not been possible to perform a sirnilar
study with Day 22-24 conceptuses. Nevertheless, the capacity for producing or inducing the
production of PGE2 by the embryo could be related to the survival and the growth potential
within the uterus.
At the onset of the normal porcine gestation, it is known that an increase of MC activity
in the endometrium occurs and has been associated with the presence of the conceptus (Croy et
al., 1988; Yu et al., 1993). The maximal NK lytic activity is reached at Day 10 and 20 of
gestation and becomes almost undetectable by Day 30 (Yu et al., 1993). There is therefore a
parallelisrn between the NK activity observed in pregnant pig uterus and the concentrations of
PGE2 - TGFP2 found in pig allantoic fluids. Knowing that PGE2 is a factor which induces NK
cells to ddifferentiate into NK cells exhibiting reduced cytolytic activity (Linnerneyer and Pollack,
1993; Linnemeyer, 1996), and knowing that the cytotoxic activity in vitro of NK-like
endornetrial cells isolated from the porcine uterus can be inhibited with PGE2 (Yu et al., 1994),
it is proposed that the high PGE;! concentrations found in pig allantoic fluids at Day 22-24
induces functional transformation of NK cells and results, later on in gestation, in much less
lytic NK cells such as observed at Day 30 by Yu et al. (1993). Secondly, knowing that each
embryo contains a distinct concentration of PGE2 within its own allantoic fluid, it is tempting to
speculate that conditioning of NK activity, as well as local modulation of cytokine production,
varies from one conceptus to an other and again that variations in the concentration of PGE2 are
associated with the growth and eventudly the survival of the conceptus.
Lastly, current data were obtained under heterologous experirnental conditions. The
rational for testing porcine bioIogicaI materiai on hurnan PBL has been indicated in section
Materid and Methods. Since PGE2 induces a similar pattern of cytokine production or gene
expression using either human PBL (Fortin et al, 1997) or bovine PBL (Emond et al, I998), it
is Iikely that the results of this study would have been sirniIar with porcine PBL.
In summary, a better understanding of the local immunmndocrine crosstalk between the
conceptus and the endometriurn may lead to new explanations regarding the causes of
penimplantation rnortality. The great variability in PGEz concentrations and the correlation
between PGE2 concentrations of Day 22-24 dantoic fluid and IL2 production by PBL, further
suggest that the control of the matemal immune response varies from one conceptus to anoîher
and might be reIated to the embryo quality.
3.7 Acknowiedgrnents
The authors wish to thank Lise Lacouline for her technical support and Grant Vandenberg for
prereviewing this manuscript. This work was supported by CORPAQ (# 3860)and NSERC.
45
3.8 References
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CHAPITRE 4
DISCUSSION GÉNÉRALE
La pérennité des espèces puise sa fécondité dans la reproduction des individus. Les
mécanismes biologiques, biochimiques, irnmunologiques et hormonaux générant la gestation et
le développement foetal, sont parmi les plus beaux, mais aussi parmi les plus complexes que la
nature nous offre. Plusieurs facteurs d'origine foetale et/ou maternelle semblent présents dans
l'environnement du foetus afin de créer un équilibre dynamique favorisant son développement et
son maintien. Plusieurs études suggèrent que lors de la gestation, différents mécanismes
immunosuppresseurs sont mis en place à l'interface foeto-maternelle, afin de réduire l'activité de
cellules effectrices cytotoxiques pouvant avoir des conséquences néfastes pour la survie du
"conceptus". Les résultats présentés dans ce mémoire viennent appuyer cette hypothèse et nous
démontrent que l'embryon porcin peut avoir un rôle actif à jouer dans son propre maintien et
développement, en exerçant un contrôle sur la réponse immunitaire maternelle.
En effet, les résultats cette recherche montrent une inhibition de la prolifération cellulaire
ainsi qu'une inhibition de la production d'IL-2, par les lymphocytes, lorsque du liquide
embryonnaire prélevé en début de gestation (J-22-24) est mis en contact avec des lymphocytes
du sang périphérique. On sait que l'IL-2 est impliqué dans l'expansion clonale des lymphocytes
T et dans l'activation des cellules LGL (King et Loke, 1990). L'IL-2pourrait donc avoir des
effets délétères sur l'embryon. On peut supposer qu'en début de gestation chez le porc,
l'inhibition de la prolifération cellulaire et de la production de cytokines par les lymphocytes
seraient en quelque sorte une stratégie utilisée par les embryons, afin d'empêcher le rejet
immunitaire matemel qui est généralement associé à la mortalité embryonnaire. De plus, les
résultats démontrent que le contrôle exercé sur la réponse ûnmunitaire maternelle est relié à la
présence du facteur immunomodulateur PGE2, présent dans les liquides embryonnaires.
Effectivement, les inhibitions observées sont corrélées de façon très significative aux
concentrations de PGE2 présentes dans les liquides embryonnaires porcins. Ces derniers
résultats viennent confirmer les premiers résultats obtenus par chromatographie d'affinité à
l'effet que le retrait de la PGE2 des liquides embryonnaires induit une réduction de l'effet
inhibiteur des liquides allantoïdiens porcins sur les lymphocytes. Ainsi, d'après l'étroitesse de la
relation qui existe entre les concentrations de PGE2 des liquides embryonnaires et les effets
inhibiteurs observables sur les lymphocytes, nous serons tentés de conclure que chaque
embryon possède bien ses propres concentrations de facteurs immunosuppresseurs afin de lui
permettre son propre contrôle, donc sa propre survie dans l'environnement matemel utérin,
potentiellement hostile. Ces résultats sont aussi en accord avec des études effectuées chez la
souris et l'humain à l'effet que la PGE2 occasionne une suppression locale de l'activité des
cellules NK deciduales (Lala, 1989; Linnerneyer et Pollack, 1993) et LAK (Bergeron et al.,
1996). Ces conclusions sont aussi en accord avec une autre étude effectuée dans nos laboratoires
et qui démontre que les concentrations de PGE2 présentes dans les liquides allantoïdiens porcins
au jour 30 sont corrélées aux poids (R= 0.36) ainsi qu'à Ia longueur (R = 0.38) des embryons
(Laforest et al., 1997).
Cette étude démontre aussi clairement que certains embryons sont plus efficaces que
d'autres dans l'exercice de ce contrôle de la réponse immunitaire maternelle. En effet, nos
résultats (chapitre 3, figure 3) montrent que certains embryons inhibent très efficacement la
production d'Il-2, une cytokine Thl, avec en plus, une inhibition très significative de la
production de GM-CSF, une cytokine Th2 pouvant avoir des effets bénéfiques sur la croissance
foetale. On remarquera, cependant, qu'une plus grande majorité des embryons inhibe la
production d'IL-2, sans pour autant avoir d'effet inhibiteur signifkatif sur le production de GMCSF. Cette observation peut nous emmener à penser que seuls les embryons qui réussissent à
influencer de façon négative la production d'IL-2, sans affecter significativementla production
de GM-CSF,auront de meilleures chances de survie dans l'environnement utérin. Ces données
vont dans le même sens que l'hypothèse de l'immunotropisme, qui propose que la production
locale de certaines cytokines ou facteurs de croissance peut avoir des effets bénéfiques sur le
développement embryonnaire (Wegmann, 1993). Un déplacement de l'équilibre des cytokines
ThîlTh 1 favoriserait ainsi un environnement utérin propice au développement foetal.
Des études effectuées antérieurement dans nos laboratoires ont permis de démontrer une
augmentation de la production de GM-CSFpar Les lymphocytes, lorsqu'ils sont incubés en
présence de liquides embryonnaires de lapin (Fortin et al., 1997). Cette augmentation fut
obtenue après un pré-traitement des lymphocytes et fût associée à la présence de PGE2 et de
TGFp2 dans les liquides embryonnaires. Dans la présente étude, effectuée à partir d'embryons
porcins, des expériences en pré-traitement n'ont pu permettre l'observation d'une telle
augmentation de production de GM-CSF(annexe, Figure 1). De plus, d'autres études chez le
lapin démontrent que le liquide blastocoelique entraîne une "downregulation" de l'expression
membranaire des CD4 ainsi que du pourcentage des cellules CD$+(Ouellette et al., 1997). Cette
diminution a été associée à la présence de TGFp2 dans les Iiquides embryonnaires. La présente
étude sur les cellules C D ~ +
n'a pu permettre de mettre en évidence une diminution de
l'expression membranaire ou du pourcentage de cellules CD4+ (annexe, Figure 2). Pour
expliquer ces observations, nous croyons que la modulation de la réponse immune ou du
phénotype des leucocytes peut varier d'une espèce à l'autre, dépendamment de leur type de
placentation. Cette spécificité d'espèce pourrait être reliée au contenu en facteurs
immunomodulateurs, présents dans les Liquides embryonnaires. En effet, la présente étude nous
démontre de très faibles concentrations de TGFP2 dans les liquides porcins soit d'environ 0.5
n g h l (chapitre 3, tableau l), comparativement à des concentrations beaucoup plus élevées (2.5
n g / d ) dans les Liquides embryonnaires de lapins (Oueuette et al., 1997).
Cette étude aura également permis de constater, qu'en plus des variations interembryonnaires existantes en termes de concentrations de facteurs immunomodulateurs dans les
liquides aliantoïques porcins, il existe aussi des variations reliées au jour de gestation. Cette
donnée est très intéressante puisque contrairement au jour 22-24 de la gestation, on remarque
qu'au jour 30, il n'y a pas de corrélation entre les concentrations de PGE2 des liquides
embryonnaires et les effets inhibiteurs sur la réponse lymphocytaire. Ce résultat nous amène à
croire que de plus grandes concentrations de PGE2 sont nécessaires lors de la période
d'attachement de l'embryon à l'endomètre maternel et lors du début du développement
placentaire, afin de favoriser ces processus. Chez le porc, le début de la période d'attachement et
de placentation se situe entre les jours 13 et 20 (King et Loke, 1990), ce qui est en accord avec
nos résultats qui démontrent de plus fortes concentrations de PGE2 en jour 22-24,
comparativement au jour 30 de la gestation. D'autres études seront cependant nécessaires afin de
comprendre le rôle exact de la PGE2 dans le processus d'implantation du "conceptus", et dans le
développement embryonnaire durant la gestation.
Des différences dans le développement embryonnaire ont déjà été associées a la survie
embryonnaire (Pope et First, 1985). Les résultats de la présente étude viennent donc confirmer,
mais de façon immunologique cette hypothèse, à l'effet que les embryons les plus développés
auraient de meilleures chances de survie dans un environnement potentiellement hostiIe. Ainsi,
les résultats présentés dans ce mémoire confiurnent bien I'hypothèse de départ à l'effet que
chaque embryon exerce un contrôle autonome sur la réponse immunitaire maternelle.
Pour conclure, nous pouvons dire qu'en début de gestation. I'infkration cellulaire exige
la mise en place de différents mécanismes immunoréguIateurs localisés, stimulateurs et/ou
suppresseurs. L'équilibre de ces mécanismes à l'interface foeto-maternelle serait
vraisemblablement responsable de la survie ou de la mortalité des embryons dans un utérus
gestant. De plus, la présence de facteurs modulateurs de la réponse immunitaire maternelle au
niveau des liquides embryonnaires porcins, suggère la participation active des embryons à ces
mécanismes d'irnrnunorégulation locale, essentiels à la survie des embryons dans l'utérus. Les
très fortes variations inter-embryonnaires en termes de facteurs imrnunomodulateurs et les très
fortes corrélations entre les concentrations de ces facteurs et l'inhibition de la réponse
lymphocytaire maternelle suggèrent également, que chaque embryon peut exercer un contrôle sur
la réponse cellulaire maternelle, de façon indépendante.
D'autres expériences seront requises, afin de mieux caractériser les mécanismes à
l'origine de la tolérance de t'embryon par sa mère et af3n de comprendre davantage les
défaillances immunitaires pouvant être reliées aux avortements spontanés. Des études sur la
PGE2 et ses implications au niveau du maintien, du développement foetal ainsi que la découverte
d'autres facteurs pouvant être impliqués dans le contrôle de la réponse immunitaire maternelle,
permettront probablement un jour de développer une immunothérapie efficace, afin de prévenir
ou de diminuer les phénomènes de rejets immunitaires ou de mortalité embryonnaire. De telles
recherches permettront aussi de développer des techniques d'évaluation de la qualité
embryonnaire, afin d'améliorer les techniques de transfert embryonnaire, pour éventuellement
réduire les grossesses multiples causées par le transfert de plusieurs embryons.
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ANNEXE A
Liquide auantoique (%, vfv)
Figure 1. Pre-treatment effects of porcine allantoic fluid collected at Day 22-24, on
(A) and production of GM-CSF(B) by human lymphocytes in
[ 3 ~ ] t h ~ m i d i nincorporation
e
vitro. The lymphocytes were incubated with C o d or with ConA and allantoic fluid (final
concentration 22.2%, vlv) collected on Day 22-24 (n=5). ns, p>0,05,not signifcantly different
from the control (no allantoic fluid).
Control
AIIantoic Fluid
Allantoic Fluid
Figure 2: Effects of porcine aIIantoic fluid on [3~thymidineincorporation (A), the percentage of CD4 positive
cells was evaluated (B) and on the CD4 membrane expression (antibody binding capacity) (C). The lymphocytes
were incubated with RPMI (n=2; negative control, non-shulated (NS)), with ConA (n=2) or with ConA and
dlantoic fluid (final concentration 44.496, v/v) collected on Day 22-24 (n=3) and Day 30 (n-4) of gestation.
Analysis was perforrned with Beston Dickinson's LYSIS program on FACSort flowcytometer. *** pM.001. *
pSO.05. significantly different fmm the control (no allantoic fluid);ns, not significanlty different from the control.