Analyse des tétrades
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Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Analyse génétique Table des matières I. Les bactéries .................................................................................................................................... 3 A. Croissance en liquide ................................................................................................................... 3 B. Croissance sur boite .................................................................................................................... 4 C. Caractéristiques de la croissance sur bactéries........................................................................... 4 1. Recherche des mutants ........................................................................................................... 4 II. La recombinaison chez les bactéries ............................................................................................... 6 III. Le facteur F présent dans les cellules donneuses ....................................................................... 8 A. Découverte des Hfr...................................................................................................................... 9 1. Origine des Hfr......................................................................................................................... 9 2. Quand une Hfr rencontre une F- ............................................................................................. 9 3. La cartographie génétique des bactéries par les expériences de conjugaison interrompue. 10 I. la transformation bactérienne ...................................................................................................... 14 II. Transfert de gènes : la transduction.............................................................................................. 15 I. Le cycle du phage T4 ..................................................................................................................... 17 II. Génétique des phages ................................................................................................................... 18 A. Les travaux de Benzer : détermination de la structure fine du gène ........................................ 19 B. Seymour Benzer : le test cis-trans ............................................................................................. 20 I. L’analyse des tétrades ................................................................................................................... 21 A. Cycle haplodiplobiontique de la levure ..................................................................................... 21 B. Cycle haplobiontique de Neurospora ........................................................................................ 21 II. Ségrégation digénique dans le cas de la liaison physique ............................................................. 23 A. Origine des différentes tétrades : ............................................................................................. 24 B. Pour déterminer la distance entre 2 gènes ............................................................................... 24 III. Ségrégation digénique dans le cas d’indépendance physique .................................................. 24 A. Origine des différents tétrades ................................................................................................. 24 B. Analyse des tétrades ................................................................................................................. 26 I. La liaison génétique ....................................................................................................................... 27 II. Les cartes génétiques .................................................................................................................... 28 A. Exemple des tests 2 points ........................................................................................................ 28 1 Analyse génétique B. Daniel Locker Semestre 5 Cartographie à partir d’un croisement avec trois marqueurs ................................................... 28 1. Détermination de l’ordre des gènes...................................................................................... 28 I. Différents cas de dominance ......................................................................................................... 30 II. Allèles multiples ............................................................................................................................ 31 A. Le classement des différents types d’allèles ............................................................................. 31 B. Classement des différents types d’allèles: La nomenclature de Müller ................................... 34 III. Pléiotropie ................................................................................................................................. 38 IV. Epistasie ..................................................................................................................................... 38 I. Hérédité autosomique dominante ................................................................................................ 40 A. Pénétrance incomplète ............................................................................................................. 41 B. Expressivité variable .................................................................................................................. 41 C. Mutations récentes ................................................................................................................... 41 D. Mosaïque germinale .................................................................................................................. 42 II. Hérédité autosomique récessive ................................................................................................... 42 III. Hérédité récessive liée au chromosome X ................................................................................ 44 A. Caractéristique de l'hérédité RLX .............................................................................................. 44 B. Inactivation du chromosome X ................................................................................................. 44 IV. Hérédité dominante liée au chromosome X ............................................................................. 45 V. Hérédité liée à l’Y .......................................................................................................................... 45 VI. Hérédité mitochondriale ........................................................................................................... 45 VII. Cartographie et études de liaison chez l’homme ...................................................................... 47 A. Il faut fixer une fraction de recombinaison θ ............................................................................ 49 B. Calcul de la probabilité de liaison.............................................................................................. 49 I. Effet maternel................................................................................................................................ 51 A. Un exemple d’effet maternel : l’enroulement dextre ou senestre de la coquille de la limnée 51 B. Autre exemple d’une mutation à effet maternel : la mutation dorsal chez la drosophile. ...... 52 II. Hérédité mitochondriale ............................................................................................................... 53 I. Les inversions ................................................................................................................................ 60 II. A. Paracentriques........................................................................................................................... 60 B. Péricentriques ........................................................................................................................... 60 Utilisation des inversions : les souches létales balancées ............................................................. 61 2 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Chapitre 1 : La génétique bactérienne Jacob et Moneau ont démontré qu’il existe des gènes chez les bactéries. Ils ont eu un prix Nobel pour avoir montré qu’il y avait des gènes de régulation. La génétique bactérienne permet la mise en place de l’ingénierie des bactéries, pour leur faire produire des molécules, par exemple pour faire des vaccins. On est aujourd’hui capable de modifier l’ADN des bactéries pour leur faire produire la molécule voulue. I. Les bactéries Elles sont partout, aérobies et anaérobies, leur taille est de 1µm, les cellules animales font entre 10 et 100 µm (La plus grosse cellule naturelle est l’œuf d’autruche). On peut regarder les bactéries en milieu liquide ou étalées en colonies sur des boites de Pétri. Elles peuvent vivre dans des conditions extrêmes, en s’adaptant. C’est cette adaptation que l’on utilise pour faire des amplifications d’ADN. Ces organismes ont un génome circulaire. Celui d’E. coli mesure 4,5.106 paires de bases. Le génome humain mesure 3,3.109 paires de bases. Le nombre de gènes d’un génome de mammifères fait 20 à 25 000 gènes. E. coli en fait 4 000. Le point essentiel de la manipulation d’E. coli est que sa croissance est rapide. Le doublement de population se fait en 20 minutes. Une bactérie en redonne un million en moins de 7 heures. La croissance peut se faire en haute densité, jusqu’à 109 à 1010 bactéries par mL. A. Croissance en liquide La croissance en liquide est utilisée pour la production de biomasse, dans un fermenteur. La croissance peut être suivie en utilisant un spectrophotomètre. L’étalonnage entre DO et nombre d’individus peut se faire en utilisant la dilution en série et des étalements sur boite. La croissance présente 3 phases : 1) Phase de latence 2) Phase exponentielle : c’est là que les bactéries sont en bonne santé 3) Phase stationnaire : milieu épuisé, les bactéries s’arrêtent de croitre, plus assez de nutriments 1 2 3 3 Analyse génétique B. Daniel Locker Semestre 5 Croissance sur boite L’intérêt est que l’on peut étudier des millions de bactéries, et on peut le faire en 12 heures. On ne peut pas, par exemple, faire ça avec des mouches. On dit que seule la génétique bactérienne est capable de mettre en place les cribles les plus puissants. Une colonie représente environ 107 cellules. On fait des clonages. C. Caractéristiques de la croissance sur bactéries 2 termes à retenir : Prototrophe : apte à croitre sur un milieu minimum Auxotrophe : apte à croitre sur un milieu supplémenté par des substances non requises pour la croissance du sauvage. Le taux de mutation des gènes est variable d’un gène à l’autre. En générale, on a 1 mutant pour 105 individus à 1 pour 107. Mais il existe aussi des cas particuliers, qui mutent à 1/100. Pour isoler des mutants, la technique la plus souvent employée est la technique des répliques. - 1. Recherche des mutants Crible négatif : pour la plupart des auxotrophies, les mutants d’auxotrophie nécessitent quelque chose pour croitre. On n’a pas les moyens de sélectionner le mutant. Crible positif : opposé au crible négatif. Par exemple, la résistance aux antibiotiques. Ici, on sélectionne le mutant, qui résiste aux antibiotiques Exemple : on cherche des mutants résistants à la streptomycine. Classiquement, la population est sensible. Donc de bactéries sensibles on veut aller vers des résistantes. De plus, on étudie des bactéries qui nécessitent de l’arginine pour croitre, et on veut des bactéries qui n’en ont pas besoin. Le premier est un crible positif, le second est négatif. En effet, pour la streptomycine, on met 108 bactéries sur boite de pétri, et on rajoute de la streptomycine. Seuls les mutants résisteront, et donc on les aura directement. Pour le second, on prend une boite avec milieu minimal + arginine, et on met des bactéries. On met du velours là dessus, pour prendre quelques bactéries de chaque colonie, puis on les réplique sur milieu minimum sans arginine. On va obtenir des colonies, et pour chaque colonie du milieu minimum, on prendra son homologue sur la première boite, elle sera arginine-. 2ème exemple, on a des Gal+, on cherche des Gal-, par un crible négatif. On va faire une culture en milieu minimal + Glu, et on réplique sur milieu minimal + Gal. Puis idem, homologues. On essaie de favoriser le crible positif car il est plus facile à utiliser. 4 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 ADN Double membrane 5 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 90% de l’ADN représente des régions codantes (Chez les eucaryotes, environ 1% est codant). Les nombres du schéma sont les minutes d’un protocole. Les bactéries sont bourrées de petits ADN circulaires, qui font de 4000 à 100 000 paires de bases, leur réplication se fait par des protéines de cellule hôte. On note que c’est lui qui contient les gènes de résistance aux antibiotiques. La résistance permet de suivre un antibiotique. On peut retracer l’histoire d’un plasmide par ses gènes, ils peuvent sauter d’une espèce à l’autre. II. La recombinaison chez les bactéries Comment les gènes sont-ils organisés chez les bactéries ? Expérience de Laderberg et Tatum (1946) Le mélange a des bactéries qui poussent, et donc on a des bactéries prototrophiques. Il y a donc eu un échange d’informations entre A et B. 6 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Y a-t-il besoin d’un contact physique ? Il n’y a rien qui pousse avec seulement échanges, pas de contact, donc les contacts sont nécessaires. W. Hayes montre que le transfert de l’information est unidirectionnel. Pour ça, il reprend le même système que Laderberg, puis il l’inverse. Ensuite il mélange. Il traite alors à la streptomycine, tuant la souche A, et gardant la souche B. Il obtient des prototrophes. Après inversion et traitement, il n’y a pas de prototrophes. Donc la souche A ne fait que donner les informations, alors que la souche B ne le fait pas. A a donné l’info avant de mourir, et les souches B sont devenues prototrophes. Dans le 2ème cas, B ne donne pas l’information, meurt, et donc pas il n’y a pas de prototrophes. A est donc donneur, et B receveur. Il y a de grandes différences entre donneur et receveur. Le donneur, mâle est recouvert de poils, et quand il rencontre une E. coli non poilue, femelle, il forme un pont cytoplasmique et transmet l’information. 7 Analyse génétique III. Daniel Locker Semestre 5 Le facteur F présent dans les cellules donneuses Les bactéries donatrices contiennent un épisome, un plasmide nommé le facteur F. Il est impliqué dans une différenciation male/femelle, il est responsable de l’échange, il est autonome en réplication (Il ne va pas se dupliquer en même temps que la bactérie). Il peut donc être perdu lors de la réplication. Il contient une origine de réplication, et une seule, il est donc autonome en réplication (ne pas l’oublier sur un dessin), il porte les gènes de transfert de matériel génétique, des gènes qui permettent la différenciation des pilis, et la « pairing region » (= région d’appariement), c’est une région du facteur F qui se retrouve sur les chromosomes. Le chromosome est circulaire, le plasmide est circulaire, et donc on peut intégrer le plasmide dans le chromosome. On peut se demander ce qu’il se passe quand on a ce pont cytoplasmique. Quand la F+ rencontre la F- : c’est le transfert du facteur F. F+ rencontre F-, l’agrippe, et forme le pont cytoplasmique. A ce moment, le facteur F va envoyer une copie dans la bactérie réceptrice. Le facteur F est donc répliqué, transféré dans un seul sens, il se referme, et on obtient au final 2 bactéries F+, la F- devient F+. Le pont est rompu, l’ancienne F- a les poils qui poussent. Pourquoi existe-t-il encore des F- ? Parce que : - La F+ correspond à un épisome sexuel, qui peut se répliquer de lui-même, et qui peut donc être perdu. Il peut y avoir des isolats, sans F+ 8 Analyse génétique A. Daniel Locker Semestre 5 Découverte des Hfr Hayes a découvert des souches qui transfèrent à haute fréquence les marqueurs génétiques (plus que les F+). Ces souches transfèrent seulement certains gènes à haute fréquence (1000x), ces souches ne transfèrent pas le donneur aux réceptrices. - 1. Origine des Hfr Intégration du facteur F dans le chromosome bactérien. Le facteur F étant circulaire, un simple crossing-over permet de l’intégrer dans le chromosome Il s’intègre à un endroit bien précis, mais on peut modifier la zone d’appariement. Le système peut aussi sortir facilement du chromosome, par un simple crossing over. 2. Quand une Hfr rencontre une FHfr et F s’associent, mise en place du système de réplication et injection de l’ADN de Hfr dans la bactérie F. On commence à envoyer à proximité de l’épisome. Le pont cytoplasmique se coupe avant que tout l’ADN ne soit envoyé, car la copulation est beaucoup plus longue. C’est pourquoi les parties sexuelles de l’ADN ne sont pas envoyés, il n’y a donc pas de changement de sexe. Il peut y avoir des échanges d’ADN, la F- acquiert de l’ADN chromosomique de l’Hfr. - Chromosome (partie) de l’Hfr Chromosome récepteur Pour qu’il y ait échange, il faut 2 crossing over, il faut donc des échanges pairs. Les recombinés sont donc dû à des échanges pairs. D’où la différence avec le plasmide. 9 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 3. La cartographie génétique des bactéries par les expériences de conjugaison interrompue. Croisement Hfr x F-, enlever un aliquot de la culture, Agiter dans un waring blender pour séparer les conjugants et étaler sur du milieu sélectif. Croisement: Hfr thr+str S aziR tonR gal+ lac+ x F- thr- strR aziS tonS gal- lacJe vois que les marqueurs entrent à des moments différents dans la bactérie réceptrice. Je peux donc faire une carte, en temps. Pourquoi ne va-t-on pas à 100% ? Il y a des séparations même sans action du blender. Transfert des gènes: - Les gènes les plus proches de l’origine sont transférés en premier Les gènes les plus éloignés ne sont transférés qu’à une petite partie de la population 10 Analyse génétique Daniel Locker Chapitre 2: conjugaison Semestre 5 Cartographie par Cartographie à haute résolution ex : le croisement Hfr leu+met+arg+sms x F-leu-met-arg-smr leu+met-arg- 50 leu+met+arg- 80 leu+met+arg+ 370 leu+met-arg+ 0 Leucine est le marqueur distal par rapport au point d’entrée. Pourquoi prendon un marqueur distal ? Parce qu’on ne s’intéresse qu’à ce qu’il s’est passé après l’entrée de leucine. La sélection est faite pour le marqueur leu+ qui pénètre en dernier dans la réceptrice sur un milieu contenant de la streptomycine. Hfr leu+ 0 Leu- met+ arg+ 1 2 met- arg- 3 leu+ arg+ met+ 0 1 2 leu- arg- met- 01 : leu+ met- arg- 01 : leu+ arg- met- 02 : leu+ met+ arg- 02 : leu+ arg+ met- 03 : leu+ met+ arg+ 03 : leu+ arg+ met+ 0123 : leu+ met- arg+ 0123 : leu+ arg- met+ 3 Les effectifs sont compatibles avec l’hypothèse que méthionine est le marqueur central. La distance leu+ met+ est plus petite que la met+ arg+, car les valeurs sont plus petites, ce qui nous donne une distance. Représentation des croisements 11 Analyse génétique Daniel Locker Leu+ Met+ Arg+ Semestre 5 Hfr CO pairs : 2 ou 4 Leu- Arg- Met- F- Les crossing over (CO) mesurent la distence entre leu et met, et entre met et arg. Calcul des distances : Leu-Met : 50/500 = 0,1 10 maps units Met-Arg : 80/500 = 0,16 16 maps units Leu Met 10 unités Arg 16 unités On mesure des rapports de recombinés, ce sont des unités de distance. Pas de rapport de recombinaison. Pas de centimorgans. La sexduction va permettre d’obtenir des bactéries partiellement diploïdes. Intégration du facteur F dans Hfr (voir diapos). C’est un système réversible. Il rentre est sort par crossing over au niveau de zones d’homologie. Dans 1 cas pour 10 000, il y a un décalage dans l’échange. L’échange conduit à un épisome sexuel qui a remplacé une partie de son génome par du chromosome bactérien. Si il n’a pas perdu la séquence permettant de donner l’épisome, il va transmettre son épisome appelé F’ maintenant. (Schéma sexduction) Exconjugants capables de métaboliser le lactose comme source de carbone. Avec les bactéries on ne peut pas faire de test dominance-récécivité, car il n’y a pas d’état diploide. Dans le cas d’une sexduction il y a diploidie partielle, et on peut donc faire des tests dominancerécécivité. Toute analyse génétique qui demande un état diploide, il faut passer par la sexduction. C’est par ce type d’analyse formelle que Jacob et Moneau ont réussi à comprendre comment se faisait la régulation de l’opéron lactose et ont postulé que les gènes ne codaient pas qu’une seule enzyme (gène de structure), mais qu’il existe des gènes de régulation. L’opéron lactose, à l’époque, pour utiliser le lactose, la bactérie a besoin de 2 choses : - Une perméase : qui permet de faire pénétrer le sucre dans la bactérie Une enzyme qui permet de couper le dioside lactose : le galactose et le glucose : la β-gal 12 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Vient se superposer la dessus une 3ème chose dont on ne connaît pas le rôle actuellement : la transacétylase. Jacob et Moneau montrent que ces 3 produits sont soumis à une co-régulation, c'està-dire que si l’on n’a pas de lactose dans le milieu, les 3 produits ne sont pas exprimés. Si l’on rajoute du lactose, cette fois les 3 produits sont exprimés. Ils découvrent un système économique pour la cellule : quand ça ne sert pas, les molécules ne sont pas exprimées. On parle de répression sans lactose, et d’induction en présence de lactose. En tant que généticien, Jacob cherche des mutants capables de fabriquer les 3 produits en l’absence de lactose. Il va donc chercher des mutations qui conduisent à une expression constitutive de ces 3 produits. Il va en trouver, et localiser les 3 produits et les mutations qui conduisent à ces expressions constitutives. Il va s’apercevoir que les gènes qui codent ces 3 produits sont en continuité. β Gal (Z) OC I- perméase (Y) unité de régulation = opéron X = mutation constitutives : - transacétylase (a) OC Mutations I- Super réprimés + lac - lac - - Voir diapos « Phénotypes » Pour connaître la dominance, il a fallu faire de la sexduction. Les mutations OC agissent uniquement en cis, c'est-à-dire sur les gènes associés. Cette analyse permet de dire que ces mutations O sont des mutations qui agissent en cis. I- est une mutation constitutive. Ici, contrairement à O, la mutation I agit en trans, donc le gène I doit agir par un produit diffusible (I+ agit sur le gène alors qu’il n’est pas dessus). Le mutant est thermosensible, c’est donc certainement une protéine. Le super répresseur donne - tout le temps, et IS est dominant sur I+. Donc on obtient la hiérarchie suivante : IS > I+ > I-. Faire exercice test IS et OC. Donc en résumé : - O agit uniquement en cis I agit en trans et en cis On a des I thermosensibles (donc I correspond sans doute à une protéine) O n’a pas de thermosensibilité IS > I+ > I- Jacob et Moneau vont donc proposer le model de l’opéron : le I code pour une molécule appelée répresseur : R Elle présente 2 sites : - Un pour l’interaction avec le lactose Un pour l’interaction avec la région O 13 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 ARN pol P β Gal (Z) OC I- R perméase (Y) transacétylase (a) activation / répression L (Voir diapos) L’intégration ou l’excision (voir diapos) I. la transformation bactérienne C’est une très vieille histoire, elle commence en 1920 avec le pneumocoque, on a toujours une bactérie qui va agir comme donneuse, donc qui va transférer son matériel génétique. Si on extrait son ADN, ou si elle se lyse spontanément, il y a des bactéries qui sont dans un état tel qu’elles sont capables d’intégrer cet ADN et de recombiner leur ADN avec celui qui a été capté. Ca se fait naturellement avec une fréquence très faible, mais on peut augmenter la fréquence en labo en jouant sur la compétence de la bactérie. On peut donc aider cette fragilisation en traitant les bactéries au phosphate de calcium. C’est cependant toujours un évènement rare. Ca ressemble à de la Hfr x F-. A+ B+ B+ A+ Extraction ADN Fragments aléatoires 105 pb 4,6.106 pb Lyse bactérienne C+ C+ BAIDEM CO avec A+ et B+ liés CC+ 14 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 On obtient 4 classes : - A- B- C+ A+ B+ CA+B- CA- B- C- On conclue donc : - II. Il n’y a pas de A+ B+ C+, donc les 3 marqueurs ne sont pas liés On a des A+ B+, donc les 2 marqueurs sont liés. Transfert de gènes : la transduction La bactérie donneuse est infectée par un bactériophage transducteur. Le lysat transducteur contient des bactériophages non virulents ayant encapsidé de l’ADN de la bactérie donneuse. Infection de la bactérie réceptrice par un des bactériophages non virulents. L’ADN injecté peur porter le gène responsable de StrR. Le bactériophage ne fait pas la différence entre les ADN. C’est un évènement rare, le bactériophage emmène ici l’ADN de la bactérie, plutôt que de l’ADN de phage. Encore une fois, il faut faire de la sélection, pour avoir la possibilité de voir cette transduction. Tous les phages ne sont pas transducteurs, certains reconnaissent les ADN. Pas le phage P1, il est transducteur. Dans des systèmes comme subtilis, on n’a pas de sexualité, donc pour faire de la cartographie génétique, on a utilisé ce système de transduction généralisée (chez P1) ou de transduction spécialisée (pour le phage λ). On les appelle respectivement Lytique et tempéré, et le phage λ peut amener à la lyse ou à la lysogénie. ADN λ 50kb GAL Réplication Lysogénie Chr. Bactérien Lyse 15 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 (Voir schéma « évènement pouvant se produire lorsque le prophage sort du chromosome bactérien » diapos) On obtient encore une fois une diploïdie partielle. On peut obtenir de très nombreux phages, en faisant entrer un helpeur. A retenir : différence en spécialisée et généralisée. Apprendre résumé des 3 types d’analyse génétique chez les bactéries diapos. 16 Analyse génétique Daniel Locker Chapitre 3 : bactériophages La Semestre 5 génétique des Les bactériophages sont des virus infectant des bactéries. Ils ont une structure en 2 parties : une tête icosaédrique, et une queue contractile qui permet d’intégrer son matériel génétique dans la bactérie. A la base de la queue on a la plaque basale qui sert à la spécificité d’hôte des bactériophages. On trouve aussi des fibrilles qui servent à fixer le reste sur la membrane bactérienne. Les bactériophages, ou plus simplement les phages, sont des virus ayant pour hôte des bactéries. Ils ne peuvent pas se répliquer seuls, comme les virus qui infectent les cellules eucaryotes. Ils contiennent un matériel génétique (ADN ou ARN) qui codes les protéines nécessaires à leur multiplication. Les phages peuvent être virulents ou tempérés. Les phages virulents ont un cycle lytique, celui-ci implique la réplication du matériel génétique, la production de nouvelles particules phagiques et la lyse des bactéries hôtes. Les phages tempérés infectent la cellule et s’intègrent dans le génome de la réceptrice sous la forme d’un prophage. C’est la lysogénie. On peut passer directement de la lysogénie à la phase lytique. Au niveau du cycle des phages, ce sont vraiment des programmes qui se mettent en route. On a un ordre d’instruction qui doit se mettre en route pour que les phages puissent se multiplier. I. Le cycle du phage T4 (voir diapos) 1) 2) 3) 4) Adsorption, injection de l’ADN Expression des protéines précoces du bactériophage, qui vont être synthétisées Réplication de l’ADN et expression des fonctions tardives (tête, queue, fibrilles, lame basale) Assemblage : les ADN dans les têtes, les queues avec fibrilles et lames basales, et rassemblement du tout 5) Lyse et re-largage de la particule mûre On reconnaît les bactériophages par le fait qu’il lyse les bactéries. Tapis bactérien Plage de lyse (105 phages) 17 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Les phages restent en plages car quand ils sont trop nombreux, ils se gênent pour infecter une bactérie, et arrêtent leur expansion. Plusieurs types de plages en fonction des génotypes, par exemple : - II. h+r+ = plage trouble ; petite h r+ = plage claire ; petite (voir diapos) Génétique des phages Il existe des souches mutantes de phages. Les principales mutations affectent : la dépendance de la croissance vis-à-vis de la température (mutant conditionnel, parmi tant d’autres), la morphologie des plages de lyse, la dépendance de la croissance vis-à-vis d’une souche bactérienne (mutant conditionnel). Les mutations peuvent être cartographiées grâce à des infections mixtes des bactéries. Il faut utiliser une multiplicité d’infection élevée. Conséquence : les bactéries sont infectées par de nombreux phages. La cartographie est faite comme chez les procaryotes. Distance = phages recombinés x 100 / total des phages T4+ T4 r E. coli B + + K + - r1 x r2 Bactéries (B) Lyse = phages B Totale de phages K phages T4+ Distance r1 à r2 : (phages sur K) x 2 x 100 / phages sur B Si l’on a un phage qui a sur son ADN AB et un qui a ab, les 2 mêmes phages doivent infecter une même bactérie pour mélanger leurs génomes. La multiplicité d’infection (m.i.) doit être élevée pour 18 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 être sûr que 2 phages différents vont infecter la bactérie. On a affaire à une probabilité. Il y aura donc toujours une partie des bactéries qui ne sera infectée que par exemple par AB. Donc dans le premier cas, l’un infecte son génome AB, et l’autre le sien ab. Dans la bactérie, il y aura des échange, il y a possibilité de mélange, recombinaison, et suite à la réplication, on se retrouve dans la bactérie avec des ADN parentaux, et des recombinés. Suite à la lyse de la bactérie, 4 types de particules seront émises : - AB AB Ab aB Les 2 premiers sont des phages parentaux, les 2 autres sont des phages recombinés. La probabilité d’échange sera plus grande si l’écart entre les 2 gènes est plus grand. On peut alors calculer le pourcentage de recombinaison : %recombinés = (Nombre de recombinés/total) x100 Les produits de la lyse sont appelés la récolte des phages. Il faut que l’on ait la possibilité de distinguer ces différents types de phages obtenus, et pour cela, il faut les remettre sur des bactéries. Il suffit alors de connaître une classe pour connaître l’ensemble. Par exemple, si l’on connaît le nombre de aB, on peut connaître tout le reste. Le pourcentage de recombinaison varie à partir 0%, si les 2 gènes sont très proches, mais on n’atteint pas les 50% en cas de grande distance, car de l’infection de la bactérie, une part des molécules n’ayant jamais rencontré l’autre type de molécules, donc on n’atteint au maximum que 30% environ. A. Les travaux de Benzer : détermination de la structure fine du gène Benzer fut le premier dans les années 60 à donner une définition stratégique du gène, il a donc déterminé beaucoup d’unités. Pour cela, il a utilisé le bactériophage T4, qui ne fait que lyser, avec une phase lytique. On conserve l’analyse de mutation dans un phénotype, le phénotype rII, car sur les bactéries B, on a croissance de celui-ci et du sauvage, alors que sur des bactéries K, seul le sauvage croit. Il va donc chercher l’unité de recombinaison, si l’on peut avoir des recombinaisons à l’intérieur d’un gène, ce qu’est l’unité de mutation. On a à l’époque une vague idée de la structure, on pense encore au collier de perles. Pour la recombinaison, il a prit une mutation 1 du rII (rII1 rII2+) et une mutation 2 du rII (rII1+ rII2). On les met dans une cellule d’E. coli, et l’on obtient la récolte : - rII1 rII2+ rII1+ rII2 rII1 rII2 rII1+ rII2+ phénotype rII phénotype rII phénotype rII phénotype sauvage 19 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Ils croissent alors tous sur des bactéries de type B, et seule la dernière, le type sauvage, pousse sur une bactérie de type K. On a donc ici la moitié des recombinés qui vont croitre sur ce type de bactéries. B. Seymour Benzer : le test cis-trans C’est le test de complémentation : il demande un état diploïde. On a 2 molécules d’origine différente qui se retrouvent dans la bactérie, donc on a un état qui peut être considéré comme diploïde. La complémentation se fait quand un génome apporte une fonction correcte et une mutée, et un autre qui en apporte une mutée et une correcte. On prend l’exemple des téléviseurs : l’un a l’image et pas le son, et l’autre a le son et pas l’image, la complémentation se fait en mettant les 2 dans une même pièce, on a l’image et le son. C’est la complémentation. La recombinaison serait si l’on mettait les atouts de l’un dans l’autre, et on obtient une télé avec son et image, et une avec rien. On a complémentation si l’on a production d’une récolte après avoir mis les 2 phages sur la bactérie. S’il n’y a pas de complémentation, on n’a pas de récolte, c’est ce qu’il se passe si sur les 2 phages, on a le même gène qui ne permet pas la croissance dans la bactérie. Cis-trans vient de cistron, trans de transversal. On fait donc un test contrôle en cis, un test contrôle pour voir si les allèles sont récessifs, et un contrôle pour voir si les allèles sont en position trans. A partir de là, Benzer définit l’unité de fonction, par le test cis-trans, toutes les mutations incapables de complémenter se retrouvent dans la même unité de fonction, cette unité de fonction définissant le cistron, et à l’époque, c’est ce qui définit le gène. Pour aller plus loin, Benzer définit 2 unités de fonction : rIia et rIIb, qui seront 2 gènes différents, mais en continu. Il conclue que le gène est sécable, on peut recombiner dans les 2 gènes, et donc la structure en collier de perles ne convient plus. Conclusion sur les travaux de Benzer : - Le gène est sécable, on peut faire de la recombinaison intragénique Le cistron est l’unité fonctionnelle qui définit le gène, par l’intermédiaire du gène cis-trans Le muton est l’unité de mutation, ça correspond à un nucléotide Le recon est l’unité de recombinaison, c’est l’espace entre 2 bases continues Il a donc compté suffisamment de phages pour avoir des mutés entre 2 paires de bases continues. Ces études ont permis de déterminer que le code génétique s’écrit en 3 nucléotides, qui forment les codons. 20 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Chapitre 4 : Génétique des haploïdes On s’intéresse à des organismes sont de type purement haploïde. Ça se passe chez les algues, chez les champignons. Le système a été beaucoup utilisé pour la génétique formelle, et les retombées ont été très importantes. I. L’analyse des tétrades L’analyse des tétrades est utilisée pour localiser des gènes chez les champignons et des algues unicellulaires. Ces organismes sont haploïdes et présentent un cycle de développement haplobiontique ou haplodiplobiontique. A. Cycle haplodiplobiontique de la levure Voir schéma diapos. L’asque contient 4 spores, qui ne sont pas orientées, ce sont donc des asques non orientées. On ne sait pas comment s’est déroulée la méiose. Les levures ont un site sexuel, et pour la fécondation, il faut que a rencontre α. La spore a va germer, cette germination se fait par bourgeonnement, le bourgeon sera formé (cellule fille), et ce système peut rester ainsi tant de temps qu’on veut. De l’autre coté, c’est la même chose pour α. On peut alors induire les facteurs qui permettent la conjugaison. On passe alors en cycle diploïde. On peut y rester tant qu’on veut. En affaiblissant le milieu, on revient au point de départ, on a provoqué la séparation. On peut ici faire du test de complémentation, avoir de la dominance et de la récessivité. B. Cycle haplobiontique de Neurospora C’est différent du précédent, voir diapos. Ici, on a un signe sexuel A ou a. Un seul gène détermine le sexe. Dans ce système, en partant de l’asque, on a un asque à 8 ascospores, 4 a et 4 A. On a une mitose qui suit la méiose. Ces haploïdes vont faire le mycélium. Dessus va se produire une multiplication végétative. Le mycélium est haploïde. Quand les conditions extérieures changent, on peut avoir rencontre de 2 mycélium. Les noyaux de 2 cellules fusionnent, les noyaux fusionnent, et les asques à 4 spores sont produits. Il n’y a pas de vrai stade diploïde, et donc pas de dominance ou de récessivité, et les asques sont orientés, donc on peut suivre la division. a A N N a Fécondation : cellule 2N A Prophase de méiose I : - Appariement des homologues 21 Analyse génétique - Daniel Locker Semestre 5 Doublement des chromatides Pas de fission des centromères Echanges entre les chromatides possibles (crossing over) a a A A Mitose a a A Fission des Centromères ½a ½A A Fin de la première division Fin de 2ème division a a A A Mitose a A a Fission des Centromères ½a ½A A Fin de la première division Fin de 2ème division Rien ne change au niveau quantités, mes les tétrades étant ordonnées, on a des tétrades qui ont changé. Dans un cas, la demi-tétrade est homogènes (aaAA), et dans l’autre cas, la demi-tétrade est hétérogène (aAaA). Donc si l’on obtient une tétrade hétérogène, on sait qu’il y a eu des crossing- 22 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 over. Une séparation à la 1ère division est appelée pré-division, à la 2ème division, c’est une postdivision. Ce système permet de mesurer la distance entre le gène et le centromère, puisque cet échange sera d’autant plus grand que le gène sera éloigné du centromère. La distance est liée au pourcentage de post-réduction, donc on va chercher le nombre de tétrades post-réduites, et la tétrade étant formée de 4 chromatides, et les échanges se faisant entre 2 chromatides, on divise le pourcentage par 2. Distance gène - centromère = %post-réduction/2 Le pourcentage de post-réduction varie entre 0 et 66%. En effet, si a part à un pole, il lui reste a, A et A. Il a 2 fois plus de chances d’avoir A que a. Cette distance varie donc entre 0 et 33 centimorgans. Si l’on nous demande la distance d’un gène qui a 66% de post-recombinés, il faut répondre que l’on ne peut donner la distance, le gène ségrégant indépendamment du centromère. Voir différences pré-réduction et post-réduction diapos. Chaque asque a une probabilité d’1/6, et donc les post-réduits ont une possibilité de 2/3. Voir : « pour déterminer la distance gène-centromère » II. Ségrégation digénique dans le cas de la liaison physique Les différents types de spores obtenues dans le croisement ab x a+b+ : a a+ b N x b+ N Génotypes des différentes spores : ab Parentaux a+ b+ a+ b a b+ Recombinés Si P > R Gènes liés Si P = R Gènes indépendants a b a a+ b b+ a+ b+ 23 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 La tétrade tétratype mesure la distance entre les 2 marqueurs. (Voir diapos) A. Origine des différentes tétrades : Les règles : - La recombinaison méiotique est réciproque Les DP proviennent de l’absence de crossing over … (Voir diapos) Si l’on a 2 crossing over qui touchent les mêmes chromatides, on a annulation, DP. Si l’on a 2 crossing over avec 3 chromatides, on a des tétratypes. Si l’on touche 4 chromatides avec 2 crossing over, on a DR. Nombre de crossing over Type B. 0 DP 1 IV (= T) 2 ¼ DP ; ½ IV ; ¼ DR Pour déterminer la distance entre 2 gènes Les tétratypes contiennent ½ de spores recombinantes et ½ de spores parentales. Les DR ne contiennent que des spores recombinées. Les DP ne contiennent que des spores parentales. (1/2 T + DR)/Total asques = recombinants / total On multiplie par 100 pour exprimer le résultat en %. III. Ségrégation digénique dans le cas d’indépendance physique Ségrégation e 2 gènes sur des chromosomes différents, avec : Allèle j = Allèle b = Croisement : j b+ x j+ b Génotype et phénotypes des spores obtenues : j b+ j+ b j+ b+ jb Les différents types de tétrades sont : // (Voir diapos), refaire grand tableau 36 cases A. Origine des différents tétrades 2 gènes sur le même chromosome : 24 Analyse génétique Daniel Locker DP > DR liaison génétique DP = DR indépendance génétique, liaison physique Semestre 5 (((2xIV)+(4xDR))/(4xtétrades))x100 2 gènes sur 2 chromosomes différents : DP aB aB Ab Ab DR ab ab AB AB IV ab Ab aB AB Ségrégation 1) 2) a B a A B b A b 1 3 2 4 1 4 2 3 DP DR Toujours DP = DR Ségrégation des centromères 1 C.O. : Ségrégation des centromères 1 C.O. 1 3 2 4 aB AB ab ab IV 1 4 2 3 ab Ab aB AB IV DP = DR IV dépend des distances gène-centromère. Pré = 1 – q a A a A A a A a Pré = 1 - p b b B B DR DP B B b b DP DR Post, 1 C.O. b-centro = p B b B b b B b B IV b B B b B b b B post = q A a A a a A a A a A A a A a a A IV DR DP DP DR IV DR DP DP DR IV 25 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 p = fréquence des recombinés gène b – centromère q = fréquence des recombinés gène a – centromère fréquence IV = (1 – q)p + (1 – p)q + pq/2 fIV = p + q – 3/2 pq attention, p et q sont exprimés en fréquence de post-réduction Si l’on est sur des chromosomes différents, voir au dessus. Si p et q sont égaux à 0, il n’y aura jamais de tétratype, et donc on pourrait avoir la fréquence (DP ; DR ; IV) : ½ ; ½ ; 0. Dans le cas inverse, on aura les fréquences suivantes : 1/6 ; 1/6 ; 2/3. Dans ce cadre, on est au niveau de l’indépendance physique. On a toujours DP = DR. Le système que l’on peut avoir dans le cas d’une liaison de 2 gènes très proches est le suivant : 1 ; 0 ; 0. Ici, DP > DR, c’est ce qui détermine le cas de la liaison physique ou s’applique la formule : Distance ((IV/2 + DR)/T) x100 Il y a cependant une partie des résultats pour lesquels on ne peut pas savoir. Conclusion DP = DR IV = 2/3 B. 1) Indépendance génétique, liaison physique 2) indépendance physique, au moins 1 des 2 gènes indépendants du centromère Analyse des tétrades Poser les questions dans le bon ordre : 123323- Est-ce que DP = DR Oui indépendance, le rapport DP/DR/T est-il 1/1/4 ? Oui T = 2/3, indépendance génétique Non T < 2/3, indépendance physique Non DP > DR, liaison, y a-t-il des tétratypes ? // finir avec diapos 26 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Chapitre 5 : Analyse génétique chez les diploïdes et établissement des cartes génétiques I. La liaison génétique La liaison génétique : des proportions qui s’éloignent des 9/3/3/1 de Mendel dans le cas de la ségrégation de 2 gènes. Observation de Bateson: [Pourpre ; long] x [rouge ; rond](PP,LL) x (rr, ro ro) F1 [pourpre; long] (Pr x Lro) F2 (F1xF1) Pourpre ; long Pourpre ; rond Rouge ; long Rouge ; rond Total observés 4831 390 393 1338 6952 attendu en 9/3/3/1 3911 1303 1303 435 6952 C’est comme si l’association parentale était gardée pour la 1ère division de méiose, association parentale favorisée. Il faut faire un test de χ2 = (o – t)2/t dll = degré de liberté = classes – 1. Si χ2 = 0,511, dll = 3, et risque de 5%, la table de χ2 donne 7,81. Notre chiffre est en dessous, on le considère comme bon, s’il est au dessus, il faut changer d’hypothèse. F1 P = pourpre r = rouge L = Lisse ro = rond P1 = P P Pourpre/Long Pourpre/rond rouge/Long rouge/rond P=1–p R=p Mâle\femelle PL r ro P ro rL P r L ro L L x r r ro ro = P2 4831 390 393 1338 Parentaux = 1 - p PL r ro [PL] [PL] [PL] [r ro] [PL] [P ro] [PL] [r L] Recombinés = p P ro rL [PL] [PL] [P ro] [r L] [P ro] [PL] [PL] [r L] 27 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 On a ici, au niveau des gamètes, P > R. On se demande donc quelle est la distance entre les gènes en jeu dans ce système. frecombinaison = p (chez l’homme, ce n’est pas p mais θ) On se pose la question des r ro : fr = r ro = 1338/6952 = (1 – p)2/4 Donc (1 – p)2 = 4 x 1338/6952 1 – p = √(4x1338/6952) II. Les cartes génétiques Concept des cartes génétiques : - Les gènes occupent des emplacements (locus) fixes sur les chromosomes Plus deux gènes sont proches moins ils recombinent. Le pourcentage de recombinaison doit mesurer la distance entre les gènes % recombinaison = recombinants/total des descendants multiplié par 100 % recombinaison = unité de la carte génétique = cM (centi Morgan) - A. Exemple des tests 2 points Bridges et Morgan : carte avec 2 facteurs Femelle pr pr vg vg x pr+ pr+ vg+ vg+ male F1 pr pr+ vg vg+ x pr pr vg vg male femelle F2 //voir diapos % recombinaison = (recombinés / total)//diapos « F2 + + / pr vg 1/4 1195 + vg / pr vg 1/4 151 pr + / pr vg 1/4 154 pr vg/ pr vg 1/4 1339 Attendu si observé non-lié % recombinaison = recombinés/total = 305/2839 = 10.7% 10% recombinaison = 10 centiMorgans (cM) » B. Femelle pr pr+ vg vg+ Cartographie à partir d’un croisement avec trois marqueurs pr pr+ b b+ vg vg+ x pr pr b b vg vg 1. b b+ Détermination de l’ordre des gènes vg pr b pr vg+ pr+ b+ pr+ male b b+ vg vg+ 28 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 On recherche alors l’évènement le plus rare. C’est le cas du double C.O.. On compare alors à nos résultats, et on peut éliminer les ordres qui ne correspondent pas. Pour décrire toute la démarche, on peut écrire le croisement, avec le bon ordre. Femelle vg vg+ pr pr+ b b+ C.O.1 = distance vg pr = vg pr+ b+ vg+ pr b C.O.1 vg 12,3 pr x vg vg pr pr + vg pr+b vg+ pr b+ C.O.1 + C.O.2 b b male = (241 + 252 + 13 + 9) /4197 b 6,4 Les croisements à 3 facteurs sont très utiles pour organiser la carte génétique. Le phénotype parental est le plus abondant, la classe du double crossing over est le plus rare. On peut ne considérer que 2 gènes à la fois. Pour déterminer le gène central, il suffit de comparer le phénotype de la classe due au double C.O. aux phénotypes parentaux. Pour plus de facilité, écrivez les différents ordres possibles. 29 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Analyse génétique chez les diploïdes I. Différents cas de dominance Pas de dominance réelle, on a des roses à partir de rouge et de blanc, donc on a semi-dominance. C’est un mélange entre les 2 allèles. La dominance et la récessivité sont donc liées au trait, au caractère que l’on observe. Ce n’est pas le gène ou l’allèle qui est dominant, c’est le caractère. La dominance n’est pas une caractéristique intrinsèque du gène. Les individus S/S présentent une forte anémie, qui la plupart du temps se traduit par décès des individus en bas âge. L’hétérozygote est parfaitement normal, et A/A aussi. Le caractère normal de la maladie est dominant sur le caractère malade. C’est une dominance totale, puisque l’hétérozygote est normal. 30 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Le caractère gouverné par βS est récessif par rapport au caractère gouverné par βA. Au niveau des hématies, 100% de celles du βS son déformés. Chez βA, 100% des hématies sont normales. L’hétérozygote a 80/20. On parle alors de dominance partielle, l’allèle βA présente une dominance partielle par rapport à βS. Au niveau des chaines, les 2 allèles s’expriment de même façon, en même quantité. Il y a alors codominance. On trouve d’autres exemples dans le groupe sanguin AB. Quand on parle d’allèle dominant ou de gène dominant, le terme est impropre, il faut parler de gène qui gouverne le caractère est dominant/récessif. II. Allèles multiples Exemple de la coloration de l’œil chez la drosophile: De l’œil rouge du type sauvage à l’œil blanc du mutant white, on a des colorations dues à des allèles différents: - w+ wa we w œil rouge œil abricot œil éosine œil blanc trouvé dans la nature absence de pigmentation Il y a environ 300 allèles observables. L’allèle w+ transporte les pigments dans l’œil. S’il fonctionne parfaitement, on a un œil rouge, s’il ne fonctionne pas du tout, on a un œil blanc. A. Le classement des différents types d’allèles Comment déterminer que deux mutations correspondent à deux allèles différents d’un même gène ? Le test d’allélisme Test réalisé chaque fois que l’on établie une F1. Il est aussi appelé le test de complémentation fonctionnelle. Il faut des allèles qui correspondent à des traits récessifs. L’allèle utilisé doit donc être récessif, et que ce soit prouvé. Il faut alors faire le test en mettant le gène en position cis ou en position trans. Si m1 et m2 sont deux allèles de deux gènes différents : m2+ et m1+ peuvent-ils reconstituer un sauvage ? 31 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Si l’on isole des souches mutantes de drosophiles qui ont les [yeux rouge-vif]. Femelle [r vif] x F1 [+] [r vif] mâle [r vif] Complémentation Pas de complémentation Il existe des phénomènes qui sont de la complémentation intra-génique. On a étudié l’αcomplémentation des bactéries, qui sert à faire du clonage. Elle a lieu dans le gène de la βgalactosidase. C’est une très grosse molécules, et son activité est facilement identifiable grâce à du bleu-X-gal qui devient bleu s’il est coupé par la β-galactosidase. Cette enzyme coupe le lactose. NH2 α COOH 32 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Si dans une bactérie, il n’y a pas le peptide α, il n’y a pas d’activité β-galactosidase. S’il y est, il y a activité β-galactosidase. C’est une complémentation intra-génique. Ce type de complémentation est utilisé pour le clonage. En effet, en clonant la partie désirée, elle est coupée, et donc ne colore plus, contrairement aux cellules qui ne sont pas clonées. Absence de complémentation entre des allèles de gènes différents : - Gène Amut/+ = + Gène Bmut/+ = + Amut/+ Bmut/+ = phénotype mutant !!! Explication : Problème possible de quantité de produit 33 Analyse génétique Daniel Locker Génotype Semestre 5 phénotype +/+ ; +/+ quantité de protéine 200 + Amut/+; +/+ quantité de protéine 150 + +/+; Bmut/+ quantité de produit 150 + Amut/+; Bmut/+ quantité de produit 100 mutant Comment tester ? Le même résultat est attendu avec les allèles en cis et en trans B. Classement des différents types d’allèles: La nomenclature de Müller La mutation nulle, c’est ce qu’on appelle un amorphe, et la mutation partielle, c’est ce qu’on appelle hypomorphe, il lui reste un peu d’activité. On différencie les deux par des tests de dominancerécessivité. Voir au dessus. Hypomorphe, c’est un phénomène d’additivité, que l’on n’observe pas dans le cas de la mutation nulle. 34 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 On fait systématiquement de l’élimination de gène dans le cas des mutations nulles. Les mutations gain de fonction sont divisés en 3 catégories : - Plus d’activité que la situation normale : hypermorphe Activité anormale : néomorphe Activité antagoniste : antimorphe 35 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Gain de fonction (souvent dominant): - Hypermorphe : l’allèle conduit à la production d’une plus grande quantité de la protéine fonctionnelle Antimorphe : l’allèle code une protéine qui interfère avec la protéine + Néomorphe : l’allèle code une protéine ayant une nouvelle fonction 36 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 37 Analyse génétique III. Daniel Locker Semestre 5 Pléiotropie Un gène affecte plusieurs caractères. Un gène détermine une protéine ou un ARN. C’est la base d’un certain nombre de phénotypes. Exemple phénylcétonurie: acide phényl-pyruvique dans les urines, phénylalanine en excès dans le sang, retard mental, défaut de pigmentation … On a supposé, vu les ségrégations au niveau des pédigrées, que cette maladie est un caractère récessif, et Garodes dans les années 1905 à 1910 qui a posé l’hypothèse que c’était un gène qui gouvernait tous ces caractères, avant d’obtenir le prix Nobel. Tout gène doit intervenir dans plusieurs caractères différents IV. Epistasie C’est le fait qu’un gène peut intervenir et affecter le phénotype gouverné par un autre gène. Exemple d’épistasie : Croisement oignon rouge x oignon blanc F1 tous rouges - Le caractère rouge est le dominant, le blanc est le récessif Les F2 sont rouges, jaunes et blancs en rapport 9/3/4 Analyse : modification de la ségrégation 9/3/3/1, donc du dihybridisme Les deux dernières classes sont indifférenciables (3+1). Le fait d’être c cache le fait d’être R ou r. Rouge = RR/CC, blanc = rr/cc - R_/C_ = rouge rr/C_ = jaune __/cc = blanc 38 Analyse génétique i Daniel Locker r I R I R x i r I r I R Semestre 5 i = gène inhibiteur de la coloration i/i [blanc] 4/16 i/i = [blanc] 9/16 I/R = [rouge] 3/16 I/rr = [jaune] Les différentes possibilités d’interactions entre des allèles indépendants - - - Sans interaction : o 9 AB o 3 Ab o 3 aB o 1 ab Avec interactions et 3 phénotypes o 9:4:3 o 12 : 3 : 1 o 9:6:1 o 10 : 3 : 3 Avec interactions et 2 phénotypes o 15 : 1 o 13 : 3 o 9:7 o 10 : 6 Su a pour rôle d’éliminer l’effet de b. 39 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Introduction à la génétique humaine I. Hérédité autosomique dominante - Les gènes impliqués dans les maladies transmises sur le mode autosomique dominant (AD) sont localisés sur les autosomes. L'allèle muté responsable de la maladie est dominant sur l'allèle "sauvage" : la maladie s'exprime chez l'hétérozygote. En pathologie humaine, les situations où l'on observe des homozygotes pour les allèles mutés responsables de pathologies dominantes sont rares; cette situation peut conduire à un phénotype identique ou plus sévère. Les deux sexes sont atteints avec la même fréquence. On observe des transmissions père-fils. Tout porteur d’un allèle morbide AD a un risque de 50% de le transmettre à ses enfants. 40 Analyse génétique A. Daniel Locker Semestre 5 Pénétrance incomplète Un individu muté peut ne présenter aucun signe de l'affection. Le gène morbide est dit alors avoir une pénétrance incomplète. Un sujet apparemment sain peut donc être porteur du gène muté et transmettre la maladie à sa descendance donnant lieu ainsi à un "saut de génération". Pénétrance incomplète ! La pénétrance d'un allèle morbide est définie par le rapport suivant : nombre hétérozygotes malades/nombre total hétérozygotes. En pratique, une pénétrance de 80% signifie qu'un sujet porteur de la mutation a 80% de risque d'être malade. Ce phénomène est expliqué par l'interaction de l'allèle morbide avec des gènes modificateurs ou des facteurs de l'environnement. La pénétrance d'un gène morbide peut aussi varier en fonction d'autres paramètres dont l'âge ou le sexe (la pénétrance de la mutation responsable de la chorée de Huntington est de 0 à la naissance, de 50% vers 40 ans et de 100% vers 70 ans). B. Expressivité variable Un allèle morbide peut s'exprimer par des signes cliniques différents d'un individu à l'autre. C'est le cas, par exemple, de la neurofibromatose de type I dont les signes peuvent varier en nature et en gravité chez les membres d'une même famille. C. Mutations récentes Il arrive qu'un sujet malade naisse de deux parents sains et non porteurs de la mutation. Ce phénomène est expliqué par l'apparition de l'allèle muté dans l'un des gamètes parentaux; il s'agit d'une mutation de novo ou néomutation. Dans la descendance du sujet porteur de cette nouvelle mutation on retrouve les caractéristiques de transmission de l'hérédité AD. Pour certaines maladies, la proportion de néomutations est très élevée; c'est le cas, par exemple, pour l'achondroplasie (80%), pour NF1 (50%) et pour la maladie de Marfan (50%). 41 Analyse génétique D. Daniel Locker Semestre 5 Mosaïque germinale Le mosaïcisme germinal est défini par la présence d'une double population de cellules germinales, certaines étant porteuses d'une mutation, d'autres étant sauvages. Par définition, le parent porteur d'une mutation germinale en mosaïque peut la transmettre à sa descendance. Si cette mutation est absente des cellules somatiques, la maladie ne s'exprimera pas chez le parent porteur mais pourra être transmise à sa descendance. Ce concept est d'une grande importance en conseil génétique puisqu'il signifie que des parents indemnes peuvent avoir plus d'un enfant porteur d'une apparente néomutation. II. Hérédité autosomique récessive Les gènes responsables des maladies transmises sur le mode autosomique récessif (AR) sont localisés sur les autosomes. L'allèle muté responsable de la maladie est récessif sur l'allèle sauvage; les hétérozygotes sont sains et la maladie ne s'exprime que chez l'homozygote. 42 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Les deux sexes sont atteints avec la même fréquence. Les parents sont généralement sains mais sont obligatoirement hétérozygotes. Un couple d’hétérozygotes a un risque de 25% d’avoir un enfant atteint à chaque nouvelle conception. On observe un excès d’unions consanguines chez les parents des sujets atteints. N/d N/d N/d N/d d/d d/d Probabilité d’être malade Calcul : ¼ x Enfant d/d 2/3 x 1/50 = 1/300 Mère N/d Homme\Femme N d (1/100) N N/d (1/100) d (1/100) N/d (1/100) d/d (1/10 000) Si consanguinité : ¼ x 2/3 x 2/3 = 1/9 Consanguinité : Le terme d'union consanguine est incorrect : on doit parler d'union entre sujets apparentés, c'est à dire entre deux individus ayant au moins un ancêtre commun. Dans cette situation, l'homme et la femme ont un risque plus grand d'avoir reçu de leur ancêtre commun, à un locus donné, un allèle identique et d'avoir des enfants homozygotes. Le coefficient de consanguinité définit la probabilité que les enfants de cette union reçoivent effectivement deux fois le même allèle. 43 Analyse génétique III. Daniel Locker Semestre 5 Hérédité récessive liée au chromosome X Dans ce mode d'hérédité, l'allèle morbide se comporte comme un caractère récessif. Les femmes hétérozygotes ne sont pas atteintes mais peuvent transmettre la maladie; elles sont dites conductrices de la maladie. La maladie ne se manifeste que chez les sujets de sexe masculin (XY) ne possédant qu'une seule copie du gène (sujets hémizygotes). A. - Caractéristique de l'hérédité RLX Seuls les garçons sont atteints. Dans les formes familiales, les sujets mâles atteints se retrouvent uniquement dans la lignée maternelle. Il n'y a aucun sujet atteint dans la lignée paternelle et l'on n'observe jamais de transmission père-fils. Les risques pour une femme conductrice sont les suivants : - Un garçon sur deux est atteint. Une fille sur deux est conductrice. Si un homme atteint se reproduit, aucun de ses enfants n'est malade mais toutes ses filles sont conductrices. B. Inactivation du chromosome X Dans chacune des cellules somatiques des femmes, les allèles d'un seul chromosome X sont fonctionnels; ceux portés par l'autre chromosome X sont pratiquement tous inactivés. L'inactivation d'un des chromosomes X se fait au hasard, à un stade précoce de l'embryogenèse. Chez une femme hétérozygote pour une maladie RLX, l'inactivation peut toucher soit le chromosome porteur de l'allèle muté soit celui porteur de l'allèle sain. La répartition aléatoire des X actifs dans tous les tissus explique la variabilité d'expression de l'allèle muté qui peut entraîner des anomalies biologiques (voire cliniques) chez les conductrices. Translocations réciproques : cassure gène DMD Femme malade//[DMD] Xt XN SN ST 44 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 L’individu est malade parce que l’inactivation de l’X inactive toujours le X normal, le système de reconnaissance de l’inactivation ne reconnaît que le X normal. Elles expriment donc uniquement l’X mutant. IV. Hérédité dominante liée au chromosome X Dans la transmission DLX, l'allèle morbide se comporte comme un caractère dominant et se manifeste aussi bien chez les garçons hémizygotes que chez les filles hétérozygotes (souvent à un degré de gravité moindre). Caractéristiques de l’hérédité DLX : - V. Les deux sexes peuvent être touchés par la maladie. En général, les filles hétérozygotes sont moins sévèrement malades que les garçons. Les femmes atteintes peuvent transmettre leur maladie aux enfants des deux sexes avec un risque de ½. Dans la descendance d'un homme atteint toutes les filles reçoivent le gène muté; en revanche, il n'y a jamais de garçon atteint (pas de transmission père-fils). Hérédité liée à l’Y La transmission se fait en père/fils. Les facteurs de fertilités sont liés au chromosome Y par exemple. VI. Hérédité mitochondriale Les maladies mitochondriales résultent de défauts au niveau des mitochondries (présentes dans toutes les cellules du corps à l’exception des globules rouges). Les cellules les plus affectées sont celles du cerveau, du cœur, du foie, des muscles, du rein et du système respiratoire (les tissus ayant le plus grand besoin énergétique). En fonction des cellules qui sont affectées, les symptômes peuvent être très différents. Les mitochondries sont exclusivement d‘origine maternelle. Si l’ensemble des mitochondries d’une cellule sont anormales, on parle d’homoplasmie. Si seules quelques mitochondries sont anormales dans une cellule, on parlera d’hétéroplasmie. L’âge de déclenchement de la pathologie, sa sévérité et les symptômes observés dépendent du pourcentage de mitochondries anormales dans un tissu donné. 45 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 A : Autosomique dominante : tous les sexes sont touchés, ½ de chance d’être touché. B : Autosomique récessive C : Récessive liée au sexe D : Dominante liée à l’X E : Liée à l’Y F et G : Lié aux mitochondries 46 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 VII. Cartographie et études de liaison chez l’homme Les familles du CEPH Les familles du CEPH (Centre d’études du polymorphisme humain). Banques de cellules humaines dont on peut extraire l’ADN. Il faut des grandes familles, dont on peut avoir l’ADN des parents, et des grands parents, avec beaucoup d’enfants. LOD (Logarithm of the odds) SCORE (Z) C’est une valeur déterminée dans le cadre d’une Analyse de liaison génétique. Il s'agit d'une mesure statistique. C'est le logarithme du rapport des probabilités entre l'hypothèse proposée (liaison génétique) et l'hypothèse contraire (pas de liaison). Z = log10 LR LR = liaison / non liaison 47 Analyse génétique Femelle A B a b Daniel Locker Male a a fréquence de recombinaison : θ b b Méiose Male\Femelle ab Indépendance Liaison Semestre 5 1–θ AB [AB] 1/4 (1 – θ)/2 θ ab [ab] 1/4 (1 – θ)/2 Ab [Ab] 1/4 θ/2 aB [aB] 1/4 θ/2 4 descendants [P] 1 descendant [R] ((1 – θ)4 x θ) / (1/2)5 Si le lod score est supérieur à 3 (c'est-à-dire que la liaison est mille fois plus probable que la nonliaison) on tranche, en général, dans le cas des maladies monogéniques autosomiques, en faveur de la liaison génétique. 48 Analyse génétique Femelle A1 n A3 P Daniel Locker Male A5 A6 n n Semestre 5 n = normal Gamètes parentaux (f = 1 – θ) Mâle\Femelle A. A1 n A3 P P = maladie Gamètes recombinés (f = θ) A3 n A1 P Il faut fixer une fraction de recombinaison θ Si on suppose que le gène responsable et le marqueur sont au même endroit, elle sera égale à0. Sinon, on fixe une fraction de recombinaison : par exemple 5% Cette valeur s’appelle θ (théta). θ varie entre 0 (identité de position) et 0,5 (non liaison). θ = 5% signifie que le gène responsable et le marqueur considéré resteront liés dans 95 % des méioses observées. Une recombinaison sera observée dans 5% des méioses. B. Calcul de la probabilité de liaison Probabilité de liaison (non recombinaison) entre gène et marqueur = parentaux Si θ= 0.05 = fréquence des parentaux = 0,95 Si indépendance fréquence des parentaux = 0,5 Rapport des probabilités (LR) avec les deux hypothèses = 0.95/0.5 = 1,9 donc un lod score : Z = log10(LR) = 0,279 Résumé de l’analyse par Lod score L (θ< 0.5) Lod score (θ) = log10 L (θ= 0.5) Lod > 3 : évidence de la liaison Lod < -2 : exclusion de la liaison On recherche le maximum obtenu au niveau de cette fonction. Si le maximum est égal à 3, l’hypothèse liaison est 1000 fois plus vraisemblable que l’indépendance, et s’il est négatif, on exclue la liaison. Exemple : Calcul de Lod score Exemple d’un test cross chez la souris qui a donné28 descendants recombinants et 64 descendants non recombinants. 49 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Principe du calcul du LOD score On compare deux hypothèses: H1 les gènes sont liés et HO les gènes sont indépendants. Soit θ la fréquence de recombinaison qui varie de 0 à 0.5. le LOD score = Zθ1= LOG10 LH1/LHO (avec L = vraisemblance). Zθ1 est calculé pour toutes les valeurs de θ entre 0 et 0.5. Soit dans l’exemple: Zθ= LOG10 θr x (1-θ) nr 0.5nr+r Ce qui donne ce type de résultats : =LOG10 (((0,15^28)*(0,85^64))/ (0,5^92)) = 0,11 =LOG10 (((0,25^28)*(0,75^64))/ (0,5^92)) = 2,84 =LOG10 (((0,30^28)*(0,70^64))/ (0,5^92)) = 3,14 =LOG10 (((0,35^28)*(0,65^64))/ (0,5^92)) = 2, 95 La plus forte estimée de Zθ permet d’avoir deux informations: liaison ou pas et si liaison estimation de la fréquence de recombinaison. La meilleure estimation de la distance est 30 cM. LOD score >3 H1 est 1000 fois plus probable que HO. Autre manière plus classique procéder avec ce type de résultat: faire un test du χ2 HO indépendance recombinants 92/2 et non recombinants 92/2 χ2 = (28-46)2/46 + (64–46)2/46 = 14 χ2 > 3,8 avec 1 ddl au risque 5% on rejette HO on prend H1 soit hypothèse de liaison Calcul de θ= 28/92 = 0.30 50 Analyse génétique Daniel Locker Chapitre 8 : mendélienne La Semestre 5 génétique non La génétique non mendélienne - I. Effet maternel Hérédité mitochondriale Effet maternel A. Un exemple d’effet maternel : l’enroulement dextre ou senestre de la coquille de la limnée Si la mère était sénestre, la coquille sera sénestre. Si elle était dextre, la coquille serait dextre. On fait ensuite une autofécondation. Si la mère porte D, tous les enfants seront dextres, même si les génotypes sont dd. A la génération suivante par autofécondation, la mère qui porte D donne des enfants dextres, mais celle qui ne porte que dd, l’enfant aura un enroulement sénestre. 51 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 L’information apportée par la mère va gouverner l’enroulement de la coquille. Ceci est dû aux fuseaux de division de la cellule œuf. C’est le génome de la mère qui guide tout. B. Autre exemple d’une mutation à effet maternel : la mutation dorsal chez la drosophile. Femelle dl dl x dl dl+ Mâle dl dl Mâle Stérile Femelle dl dl+ x Fertile Quelque soit le mâle, il est incapable d’apporter l’information pour sauver la descendance. Donc si la femelle est destinée à être Stérile, il n’y aura pas de descendance, même si elle est croisée avec un mâle sauvage, fertile. Effet maternel cas de la mutation dorsal Femelle dl/+ x mâles dl/+ Femelles dl/dl stériles x mâles +/+ 52 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Mâles dl/dl fertiles x femelles dl/+ Males dl/dl fertiles Femelles dl/dl stériles Le phénotype ne dépend que du génotype de la mère quel que soit le génotype du père. La mutation conduit a une stérilité femelle. Dans tous les cas, des œufs sont pondus, mais ils n’ont pas d’axe dorso-ventral. Il n’y a pas de larve, la stérilité n’est pas liée à la formation des ovules, mais bien des embryons. II. Hérédité mitochondriale Elle a été la première fois étudiée chez la levure, par la mutation petites colonies. Exemple de la mutation petite colonie chez la levure 53 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 En faisant pousser la levure sur milieu respirable et fermentable, on obtient ces petites colonies. En effet, ces colonies ne peuvent que fermenter, pas respirer, elles n’utilisent que le carbone de la fermentation. Ces mutations qui conduisent à ces petites colonies sont appelées ρ-. Génotype nucléaire, ségrégation monogénique, gène de la voie respiratoire mutant, plus de respiration Atteinte des mitochondries. Celles de la ρ-, n’ont pas d’acide nucléique. Tirage au sort des mitochondries, le bourgeon emporte ρ+ ou ρ-. 54 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Les mitochondries ont un sexe, elles peuvent fusionner et échanger des informations génétiques. Avec des marqueurs de résistance à des antibiotiques, on a montré qu’il y avait des échanges de marqueurs entre mitochondries. Certaines d’entre elles sont des donneurs, et d’autres des accepteurs. On a pu cartographier l’ADN mitochondrial. 55 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 56 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Chapitre 9 : Structure et accidents chromosomiques Structure du chromosome métaphasique normal : 57 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Exemple : bande 5q22, veut dire bande 5, dans la partie q Bandes et chromosomes Des traitements chimiques des chromosomes colorent différentiellement certaines régions. - Bandes-C : colorent les centromères Bandes-R coloration inverse de C Bandes-G coloration avec le Giemsa Bandes-Q coloration avec la quinacrine. Résultat identique à celui obtenu avec le Giemsa. Ca dépend aussi de la compaction de l’ADN. Bande C : Giemsa : Bangde G : 58 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Les différents types d’accidents chromosomiques : Délétion; inversion; translocation; duplication Dans le cas de délétions, elle est létale suivant le phénomène d’haplo-insuffisance, ou si le chromosome homologue couvre cette délétion. Ici, les délétions ne sont pas létales, sauf dans le cas de cassure. Les inversions ne sont pas létales, sauf dans le cas où on casse un gène qui conduit à un phénotype dominant. Inversion et translocation conservent l’intégralité du génome, alors que la délétion le réduit, la duplication et l’insertion peuvent ajouter des gènes. Origines des accidents chromosomiques : Rupture réunion : Crossing over entre des séquences répétées : 59 Analyse génétique I. Daniel Locker Semestre 5 Les inversions A. Paracentriques Appariement d’une inversion paracentrique a b c d a b c d d c b a d c b a Méiose : b c a b c a d d boucle d’inversion a b c d a b c d d c b a a b c d N Ninv L’inversion inhibe le crossing-over en nombre impair. B. Péricentriques 60 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 II. Utilisation des inversions : les souches létales balancées l1 x l1+ l2 l2+ l1 l2+ l1+ l2 x lui même P l1 l2+ R l1+ l2 [+] l1 l2+ l1+ l2 l1+ l2+ l 1 l2 [+] Inversion bloque le système, donc pas de R, donc tableau simple : l1 l2+ l1 l2+ l1+ l2 l1+ l2 [+] [+] Si l’on a : l1 l2+ l1+ l2 Mâle\femelle l1 l2 inversion l1 Mort l1+/+l2 l2 +l1/l2+ mort Une lignée pure se reproduit toujours à l’identique, elle n’est pas forcément homozygote. Translocations C’est un échange de parties de chromosomes, entre des chromosomes. Si elles sont réciproques, elles sont viables. Attention aux oncogènes aux points de cassures. 61 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Translocation apparaît par gamètes anormaux, et donc déficience, chez un certain nombre d’individus. En fin de méiose, dans chaque cellule on a un chromosome transloqué, et un normal, mais on sera déficient dans une partie de chromosomes, donc la cellule ne sera pas viable. Il faut 2 normaux à un pôle, et 2 transloqués à l’autre pôle. Les ségrégations étant aléatoires, on aura la moitié de gamètes transloqué, et la moitié de normaux. Un autre exemple est la fusion robertsonienne : Certains chromosomes ont le centromère à l’extrémité. 1 13 21 2 3 13 21 62 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 On peut avoir plusieurs types de ségrégation : 13 21 1;2 21 21 13 13 21 3 13 13 21 1;3 21 13 21 13 Trisomie 21 Monosomie 21 = mort Normal 2 21 13 21 13 Normal mais transmission de la translocation 2;3 13 13 21 13 21 1 21 13 21 Trisomie 13 = mort Monosomie 13 = mort III. Utilisation des translocations : localisation chez l’homme du gène impliqué dans la DMD Le gène responsable de la DMD est localisé en position p21 du chromosome X. Il existe dans les populations humaines un petit nombre de cas où des filles sont atteintes de la dystrophie musculaire de Duchesne. Quand une fille est atteinte, c’est qu’un homme atteint a eu un enfant avec une femme hétérozygote. Cependant, c’est quasiment impossible, puisque les malades atteignent rarement la puberté. Il y a donc autre chose. Tous les chromosomes peuvent être atteints, n’importe où, mais chez le X, seule la partie p21 peut être cassée. L’explication est que dans ces translocations, on casse au niveau du gène de la DMD du chromosome X. On a un bout du gène qui reste, et un qui va dans un autosome. 63 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Dans une cellule féminine, on a un chromosome X actif, et un inactif. Ce choix est fait aléatoirement au stade 800 cellules. Dans le cas d’une translocation, le mécanisme qui inactive l’X reconnaît le X normal, et pas le transloqué. Donc le chromosome X qui fonctionne est celui avec le gène de la DMD anormal. Dans le cas, l’enfant de sexe féminin développe une myopathie de Duchesne importante. 64 Analyse génétique IV. Daniel Locker Semestre 5 Les délétions Suivant si la région délétée possède un gène haplo-insuffisant, le gène délété ne permettra pas la survie. Les délétions servent à faire très rapidement de la cartographie. 65 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Par irradiation, on fait des délétions, et on peut facilement savoir où elle est. m Région d’un chromosome Délétion 1 Délétion 2 Délétion 3 Une mutation récessive « m » donne un œil marron. On fait m sur les délétions 1, 2 et 3, et on obtient réciproquement des yeux marrons, marrons, et l’allèle sauvage. Résumé des applications des accidents chromosomiques: - Cartographie des gènes Mutagénèse Etude de la régulation des gènes (délétion/duplication) 66 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Chapitre 10 : Epigénétique Des effets spectaculaires de l’épigénétique : toutes ces souris sont génétiquement identiques. Les variations de coloration sont dues aux différents degrés d’expression du gène agouti. Une souris qui a une forme mutante du gène Mestsoumis àl’empreinte parentale (droite) ne retrouve pas ses petits et ne les protège pas comme la souris sauvage (gauche). 67 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 L’inactivation du chromosome X chez les mammifères conduit à des chats calico : Des clones qui ne se ressemblent pas : Cloner votre animal favori pour 32 000 $ cela n’en vaut pas la peine les clones ne se ressemblent pas ! Si l’on change la régulation épigénétique on change la destinée des cellules : 68 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Tout est dans les gènes? Croisement entre une jument et un âne : mule Croisement entre un étalon et une ânesse : bardeau Pourtant même identité génétique ! Différents exemples des effets de l’épigénétique: - I. Empreinte génomique parentale Inactivation de l’X «Silencing» des séquences répétées Activation/inactivation des gènes homéotiques Influence du régime alimentaire sur l’expression des gènes Vieillissement Mais c’est quoi l’épigénétique? 69 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 En 1942 Waddington propose le terme d’épigénétique pour rendre compte des relations génotype et phénotype Le paysage épigénétique En 1994 R. Holliday élargit la notion d’épigénétique : "Étude des changements dans l'expression des gènes qui sont héritables lors de la mitose et/ou de la méiose, et qui ne résultent pas de modifications de la séquence de l'ADN" 70 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Où agissent les processus épigénétiques ? Essentiellement sur la configuration de la chromatine. Le support de l’information génétique ce n’est plus l’ADN c’est la chromatine ! 2 facteurs interviennent : les marques épigénétiques. Ces marques ne serviraient à rien s’il n’y avait pas de lecture, donc le 2ème agent est composé des lecteurs des marques. Il vous faut garder en mémoire la compaction de la chromatine : 1 mètre 60 d’ADN dans un noyau de quelques microns! Les marques épigénétiques conduisant àl’expression ou àla répression des gènes : - Mééthylation de l'ADN Modifications post-traductionnelles des queues des histones : méthylation, acétylation… Variants d'histones : isoformes non alléliques des histones Association avec des ARN non codants 71 Analyse génétique II. Daniel Locker Semestre 5 Méthylation de l’ADN : Elle conduit à l’inactivation des gènes La répartition de la méthylation dans le génome Importance du phénomène : Le syndrome de Rett est associé chez l’homme à une mutation dans le gène MeCP2 (Xq28) qui code une protéine reconnaissant les îlots CpG méthylés. Développement 72 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 apparemment normal jusqu’à l’âge de 6 à 8 mois. Absence d’un développement normale du langage. Mouvements répétitifs des mains (lavage, torsion). Démarche instable ou mal assurée. L’empaquetage de la chromatine dépend de quatre phénomènes épigénétiques : 1234- La méthylation de l’ADN Les complexes remodelant la chromatine Les modifications des queues amino-terminales des histones et les variants d’histones Les ARN non codants 73 Analyse génétique A. Daniel Locker Semestre 5 Les complexes remodelant la chromatine 74 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 75 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 B. Les modifications des queues amino-terminales des histones et les variants d’histones 76 Analyse génétique 1. Daniel Locker Semestre 5 Quelles sont les conséquences de ces modifications ? La méthylation peut être simple, double ou triple, et on cherche la différence entre ces différents types de méthylation. 2. Modification des histones et reconnaissance de la marque A chaque fois, on a le marqueur et le lecteur. Les variants d’histones : 77 Analyse génétique C. Daniel Locker Semestre 5 Les ARN non-codants Les ARN non codants tiennent un rôle de plus en plus important dans régulations épigénétiques et ils sont nombreux ! - ARN interférents (siRNA) Micro ARN (miRNA) ARN double brin (dsRNA) ARN hétérochromatique (shRNA) Produits de transcription des séquences répétées (ALU, LTR) 78 Analyse génétique III. Daniel Locker Semestre 5 La chromatine est dynamique : la variégation chez la drosophile. w+ w+ X 2/3 E 1/3 H Répression Expression 79 Analyse génétique IV. Daniel Locker Semestre 5 Exemples Deux exemples de phénomènes épigénétiques chez l’homme : - Inactivation du chromosome X Empreinte parentale L’inactivation de l’X connue sous le nom de lyonisation. Mary Lyon chercheur britannique ayant proposé l’hypothèse suivante en 1961 : - Tôt dans l’embryogénèse du sexe féminin, un X est inactivé L’inactivation se fait au hasard dans chacune des cellules A peu près tous les gènes de l’X inactivé sont réprimés L’inactivation est permanente et maintenue lors des mitoses Mary Lyon propose l’explication suivante : d’une manière aléatoire, l’un des deux chromosomes X est inactivé à un stade précoce du développement. Cette inactivation est ensuite maintenue dans toutes les cellules filles. On obtient ainsi des mosaïques. Bertram et Barr en 1948 : observation des cellules en interphase de l’homme et de la femme : 80 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 81 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 L’inactivation inactivation de l’X ne se fait pas toujours au hasard : ex chez les marsupiaux, le chromosome X inactivé est toujours celui du père. L’empreinte parentale : Le même gène, suivant s’il provient du père ou de la mère, il peut être réprimé ou exprimé différemment. L’Empreinte parentale chez les mammifères ou les génomes ont un sexe ! La parthénogénèse n’est pas viable chez les mammifères. Le génome paternel est nécessaire pour le développement du placenta. Le génome maternel est nécessaire pour le développement de l’embryon. Les conséquences de l’empreinte parentale : une entorse aux lois de Mendel chez l'homme. 2 syndromes neurologiques distincts suivant qui du père ou de la mère transmet une délétion du chromosome 15 : Angelman et Prader-Willi. Cette délétion comprend une région soumise à l’empreinte parentale. Ces deux syndromes sont soumis aux mêmes gènes, mais suivant les inhibitions, on obtient l’un ou l’autre des syndromes. 82 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Au niveau moléculaire, on a des problèmes au niveau compaction et méthylation de l’ADN. L’empreinte parentale pose des problèmes notamment dans les expériences de clonage des mammifères. Elle peut rendre compte de la faible efficacité du clonage. Elle rend douteuse la réussite de telles expériences dans un proche avenir. 83 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Clonage par transfert de noyau ou de cellules adultes. Etape mal comprise : - Déprogrammation de l’épigénome Remise en place des marques épigénétiques On ne métrise pas du tout la déprogrammation des cellules somatiques pour leur redonner la totipotence des cellules embryonnaires, et on ne sait pas remettre en place les marques épigénétiques. Le différentiel qui fait que la souris va du jaune à l’agouti, c’est la méthylation : Les souris jaune ont un locus agouti hypométhylé, les brunes une locus agouti hyperméthylé. On s’est posé la question de savoir si l’alimentation pouvait orienter des différenciations. On a observé qu’effectivement, on obtient des différences, les souris qui ont mangé des donneurs de groupement méthyle sont plus claires que celles qui n’en ont pas mangé, et les souris plus claires, dans leur descendance, elles auront tendance à avoir des souris plus claires. La modification épigénétique faite par la nourriture est transmissible à la descendance. 84 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Distribution de la couleur pour des descendants de mère alimentée : Avec un régime pauvre en donneurs de groupement méthyle (blanc) ou riche en donneurs de groupement méthyle (noir). Ces résultats sont étudiés dans l’optique de transmettre une résistance à un insecte sur des générations. Le passage à travers la lignée germinale d’une marque épigénétique montre que le profil de méthylation n’est pas complètement effacé lors de la gamétogenèse. Alors s’agit-il d’une hérédité des caractères acquis ? Retour vers Lamarck ? Non, car tout ceci concerne certains gènes, soumis à ces lois, mais ça ne concerne pas tous les gènes. Quand on fait de la fécondation in vitro, on joue sur le milieu extérieur, puisque l’on prélève les gamètes. On peut donc se demander si c’est innocent au niveau de l’épigénétique, et bien non, il y a forcément modifications, de par ses différences de milieu extérieur. Conclusion 1 : l’épigénétique permet d’obtenir des phénotypes différents sur les mêmes bases génétiques. 85 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Conclusion 2 : Un nouveau dogme de la Biologie Moléculaire est proposé ! Pour terminer, le 20ème siècle s’est ouvert par la découverte des lois de Mendel. Dans la deuxième moitié du siècle des notions du type : « si nous connaissons les gènes de l’homme, nous connaitrons la nature de l’homme » ont vu le jour. Le paroxysme fut atteint avec le projet HUGO de séquençage du génome. Le gène était mis à toutes les sauces. Le 21ème siècle sera celui de la compréhension de la relation génotype-phénotype. 86 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Chapitre 11 : Recherche des gènes de maladie chez l’homme Comment identifier les gènes impliqués dans des maladies ? - Trouver des familles (ou populations ou individus) où la maladie ségrège (ou est présente) Trouver le gène candidat Confirmer le gène candidat La stratégie est toujours identique. I. Analyse des familles Principe : transmission plus fréquente de la maladie avec un marqueur génétique. II. Analyse des malades C’est l’étude des haplotypes. Malades non malades 87 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Principe : la maladie apparaît avec une fréquence plus élevée pour un allèle spécifique d’un marqueur donné. A1 B2 C1 D3 E4 15 haplotype [A1B2 C1D3E4] m 15 A2 B3 C2 haplotype [A2B3 C2D2E1] D2 E1 Allèle de la maladie m Ces études sont basées sur le déséquilibre de liaison Chez les malades, on aura 90% de C2 et 10% deC1, idem pour D2 et D3. Plus on s’éloignera de la mutation, plus on aura d’équilibre entre les allèles. Approche positionnelle : Le clonage positionnel identifiera un gène à partir d’une localisation approximative sur les chromosomes. Cette approche est utilisée lorsque la nature du produit du gène candidat est inconnue. Le gène candidat sera identifié par la combinaison de sa localisation, son expression et sa qualité chez les malades. Les différentes étapes : 1. 2. 3. 4. 5. Collection d’un grand nombre de famille avec des malades Identification d’une région candidate la plus petite possible par cartographie génétique Rechercher à partir de la séquence du génome humain les gènes de la région Identifier les candidatspotentiels Confirmer le gène candidat Identification de la région candidate : La carte génétique Les marqueurs utilisés : RFLPs, SSLPs, SNPs Analyse de liaison (Lodscores) Carte des Haplotypes 1 cM = 1 million de paires de bases. 88 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Exemple de la recherche du gène de la mucoviscidose Localisation du gène : Les chercheurs prennent des marqueurs, sur chaque paire d’autosome, et ils vont chercher une liaison. Les enfants malades peuvent récupérer n’importe quelle liaison allélique : on exclue ce gène. La première liaison trouvée est présentée ici : On a dans toutes ces descendances une ségrégation préférentielle. 89 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 On va faire des blots de recherche. Si un gène est exprimé dans la maladie, il l’est dans les tissus malades. On peut alors déterminer le lieu de la maladie. 90 Analyse génétique Daniel Locker Semestre 5 Différences suivant l’expression de l’ARNm et suivant les malades et les non malades. Pour environ 65% des malades, on a une délétion ΔF508, qui fait disparaître un résidu phénylalanine. Cette délétion maintient le cadre de lecture, on a perdu un acide aminé, mais pas de décalage. La différence entre l’allèle des bien- portants et l’allèle des malades est représenté par ces 3 nucléotides. 91 Analyse génétique III. Daniel Locker Semestre 5 Une des retombées de ce type de travail : le test génétique Oligo 12 Sonde ΔF508 N sans Δ Δ Oligo Δ ΔF508 N sans Δ Δ On savait que les malades avaient un excès de chlore dans les sueurs, et donc on a étudié le canal chlore. 92 Analyse génétique IV. Daniel Locker Semestre 5 Confirmation du gène candidat Le système qui démontre définitivement que le gène étudié est celui impliqué dans la mucoviscidose, on prend des cellules de malades, et par transgénèse on apporte les gènes complémentaires de la mucoviscidose, et on regarde si ça permet de contrer les effets du canal chlore, et rétablir un canal chlore correct. Recherche des mutations chez les malades. Utilisation des souris transgéniques Ko du gène : phénotype ? On regarde alors si l’on rétablit chez le petit animal les mêmes caractères, par un équivalent. On casse le gène chez la souris, et on regarde le phénotype. Ca pose un problème de fond, car chez un petit mammifère, on n’a pas forcément les mêmes symptômes que chez l’homme. La souris régénère très rapidement ses muscles, ce qui annihile des maladies comme la dystrophie de Duchesne. Le meilleur modèle de cette maladie est le chien. 93
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