proposition de these
PROPOSITION DE THESE
Prévalence et biodiversité d’Anoxybacillus flavithermus associé à l’industrie
des Poudres LAItières (Lait, lactosérum)
Acronyme du projet : ANOPLAI
Présentation de l’établissement porteur : Laboratoire universitaire de biodiversité et d’écologie microbienne
(LUBEM) EA 3882, UMT SPORE-RISK « Risques associés aux bactéries sporulées », Université de Bretagne
occidentale
Ecole Doctorale : SICMA/EGAAL
Financement
: Région Bretagne (50%) – Quimper Bretagne Occidentale (50%)
Responsable du projet (directeur de thèse)
- Ivan Leguérinel - LUBEM Quimper , UMT Spore-Risk -ivan.leguerinel@univ-brest - Tél : 02 98 64 19 37
Co-encadrantes
doivent être envoyées à cette adresse email avant le 21 Avril
- Postollec Florence /Adria Développement, Institut technique agro-industriel (ACTIA), UMT Spore-Risk
Résumé du projet
Les industriels ont besoin d’informations sur les microorganismes d’altération qui contaminent leurs produits
et tout particulièrement ceux qui sont susceptibles de persister et de se développer dans leurs installations.
Pour la filière laitière des poudres, Anoxybacillus flavithermus apparaît progressivement comme l’un de ceux-
ci. Ce projet de thèse a pour objectif de caractériser la diversité des comportements de l’espèce Anoxybacillus
flavithermus en lien avec cette persistance. Le projet ANOPLAI est découpé en trois étapes : i) Etat des lieux
au niveau de la filière laitière (poudres), ii) Caractérisation de la diversité des comportements phénotypiques
iii) Etude des mécanismes de la sélection/adaptation. Ce projet vise à renforcer les connaissances sur la
diversité et les comportements de ce modèle bactérien, afin de mieux comprendre les stratégies de
persistance dans les installations industrielles, mais se propose aussi d’utiliser des outils innovants que sont le
séquençage haut débit et l’analyse des génomes en association avec les phénotypes observés pour dégager
des liens et commencer à les expliquer au niveau moléculaire.
Hypothèses, questions posées, identification des points de blocage
Les industriels de la filière laitière ont besoin de connaissances approfondies sur les microorganismes sporulés
thermophiles qui arrivent à survivre, se développer voire persister lors des procédés de transformation du lait
en poudres. C’est l’ensemble du cycle (Germination, croissance, formation de biofilm, sporulation) qui est à
l’origine de ces phénomènes. Les principaux genres et espèces concernés sont Geobacillus stearothermophilus
et Anoxybacillus flavithermus. Le travail de thèse portera principalement sur cette dernière. En effet, A.
flavithermus peut être considéré comme un modèle de bactérie d’altération thermophile. De plus, la diversité
est présente au sein même des espèces bactériennes et certains groupes génotypiquement définis (ou
certaines souches) présentent des particularités phénotypiques qui les avantagent lors de procédés
spécifiques. Les objectifs de ce projet sont d’améliorer la connaissance de ces stratégies afin de limiter la
présence au niveau industriel de cette espèce méconnue qui représente tout à la fois un contaminant présent,
un modèle de bactérie thermophile à cycle de vie complexe et un germe potentiellement responsable
d’altérations.
Approches méthodologique et technique envisagées
i-Etat des lieux de la filière laitière (poudres)
Le premier objectif sera d’établir la prévalence d’Anoxybacillus flavithermus (et Geobacillus
stearothermophilus) au sein de l’industrie des poudres laitières en France. Pour cela, 3 campagnes de
prélèvement seront mises en place. La première sera réalisée au niveau national auprès des industriels
producteurs, uniquement sur les produits finis. Puis, deux ou trois sites industriels « positifs » seront
sélectionnés et de nouveaux prélèvements effectués plus largement (matière première, produits finis et cours
de fabrication, environnement industriel). Une troisième série sera également effectuée pour étudier la
persistance de souches au sein des unités de production. Un test génétique de détection des espèces A.
flavithermus et G.stearothermophilus, développé précédemment dans le cadre d’un programme régional, sera
utilisé. Les sporulés thermophiles, obtenus par culture (2ème campagne), seront confirmés par PCR spécifique
de ces deux espèces et séquençage de l’ADNr 16S. Un outil de typage par PFGE sera développé pour éliminer
les isolats redondants. De plus, les souches retenues seront placées dans les groupements (rep- PCR ou
M13RAPD) déjà proposés dans la littérature. Un panel final de 50 souches d’A. flavithermus sera constitué,
pour moitié des souches ainsi isolées et pour moitié de souches de collection (souche type, souches
séquencées ou caractérisées, souches de l’environnement).
Cette première partie de la thèse permettra de répondre à la question de la prévalence d’Anoxybacillus
flavithermus dans les unités françaises de fabrication de poudre laitières (en comparaison avec Geobacillus),
si cette espèce est déjà détectable dans les matières premières et si elle se concentre à certaines étapes.
ii-Biodiversité et diversité des comportements phénotypiques
Un certain nombre de caractères ont déjà été proposés pour expliquer la sélection et la persistance
d’Anoxybacillus flavithermus dans les installations laitières aussi baserons nous principalement la
caractérisation des souches isolées sur ces aspects : résistance des spores et cellules végétatives aux
traitements thermiques et de sanitation, adaptation au milieu lait, capacité à adhérer et à former du biofilm
rapidement, rapidité de sporulation en biofilm à températures élevées (50- 60°C). De plus, les limites de
croissance (température, pH, aw) seront évaluées. Par ailleurs, l’altération due à Anoxybacillus flavithermus
n’a été que peu décrite alors que cette espèce possède des enzymes souvent thermostables et actives à haute
température susceptibles d’altérer la qualité des produits finis (protéases, estérases et lipases). Ces activités
seront donc recherchées. Cette étape devrait permettre la mise en évidence la spécificité des souches laitières
et/ou des comportements différents de souches particulières ou de groupes de souches. Des souches
altérantes/potentiellement persistantes seront décrites.
iii- Mécanismes de la sélection/adaptation : validation et génome total
Deux groupes de 3 souches chacun seront choisis représentant les 2 comportements « extrêmes » sur la base
de l’analyse réalisée aux étapes précédentes. La validation des travaux se fera pour un scénario d’intérêt. Ce
scénario sera discuté avec les industriels et permettra de valider le comportement (inactivation et/ou
croissance) pour une succession d’étapes procédés et sanitation proche d’un process industriel. Enfin, le
génome total de ces 6 souches sera séquencé par séquençage haut débit. La comparaison du génome de ces
souches aux comportements très différents sera utilisée pour rechercher des liens phénotype/génome
caractéristiques des souches persistantes et d’altération.
Contexte scientifique et partenarial
Ce projet de thèse s’inscrit dans l’axe « Risques sanitaires et d’altération associé à la physiologie des bactéries
sporulées du LUBEM (EA3882), et de l’unité mixte de technologie « Spore-Risk » reconnue par le Ministère de
l’agriculture, de l’agroalimentaire et de la forêt de l’agriculture (ACTIA 2014-2019). Depuis 2009, le LUBEM et
l’ADRIA Développement se sont associés en unité mixte de technologie, et se focalisent sur l’étude de
microorganismes sporulés à l’origine de risques sanitaires ou d’altération des produits alimentaires.
Profil du candidat (compétences scientifiques et techniques requises)
Titulaire d’un master 2ème année de Microbiologie, Biotechnologie, Ecologie microbienne ou d’un diplôme
d’ingénieur dans des spécialités similaires, le candidat devra posséder des compétences dans les domaines de
la physiologie microbienne et/ou de la microbiologie des aliments et maitriser les techniques de biologie
moléculaire et les outils de bio-informatique. Il aura un intérêt certain pour la recherche appliquée, au monde
industriel, en particulier aux industries alimentaires.
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